DD226593A1

DD226593A1 - Verfahren zum nachweis von rns pflanzlicher viren

Info

Publication number: DD226593A1
Application number: DD26226184A
Authority: DD
Inventors: Hans-Dieter Hunger; Robert-Matthias Leiser; Joerg Schubert; Gudrun Barchend
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-04-24
Filing date: 1984-04-24
Publication date: 1985-08-28

Abstract

Ziel der Erfindung ist es die Nachweisempfindlichkeit zu steigern. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen neuen Traeger mit bedeutend hoeherer Bindungskapazitaet einzusetzen. Erfindungsgemaess wird ein Traeger verwendet, der aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten mit 4,6-Dichlor 1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80 Vol.-%, aus 2,4,6-Trichlor-1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 0,5-50 Vol.-%, aus Hologeniden in einer Menge bis zu 20 Vol.-%, aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten in einer Menge von 5-80 Vol.-%, und gegebenenfalls aus Puffersubstanzen bis zu 5 Vol.-% besteht. Die Erfindung wird in der phytopathologischen Analytik angewendet.

Description

Verfahren zum Nachweis von RNS pflanzlicher Viren Anwendungsgebiet der Erfindung

Das Verfahren dient dem Nachweis von viralen Ribonukleinsäuren, freier viraler Nukleinsäure (RNS) und replikativer Formen der Virus-RNS, Viroiden und Virusoiden in aus Pflanzen oder anderem Material bzw· Säften gewonnenen Extrakten durch Bindung der nachzuweisenden RNS an einen neuen Flächenträger und nachfolgender Hybridisierung mittels markierter komplementärer Desoxyribonukleinsäure (cDNS), klonierter cDNS (Rekombinanten-cDNS), doppelsträngiger RNS (dsRNS), einsträngiger Virionen-RNS (ssRNS) bzw. komplementärer RNS (cRNS) und der RNS replikativer Intermediate als molekulare Hybridisierungssonden·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Hybridisierungsverfahren wurden in letzter Zeit häufig in Zusammenhang mit molekularbiologischen Untersuchungen zwecks Nachweises viraler und viroidaler RNS beschrieben (vgl· Lit· 1-9)· Diese Verfahren basieren entweder auf einer Hybridisierung in flüssigen Medien mit anschließendem Test auf Resistenz der Hybride gegen Abbau durch S^-Nuklease bzw, darauf, daß die nachzuweisende Nukleinsäure an einen festen Träger gebunden und mit einer entsprechend markierten Nukleinsäure hybridisiert wird· Als feste Träger sind insbesondere Nitrozellulose und DBM-Papier beschrieben. Die Nachteile der Flüssighybridisationsverfahren bestehen in einem hohen Aufwand an Material und Arbeitszeit sowie ihrer Kompliziertheit, der Hybridisierungsverfahren mit Nitrozellulose (NC) und DBM-

Papier in ihrem relativ hohen Preis, der geringen Kapazität der MC und ihres Unvermögens, Nukleinsäuren mit niedrigem Molekulargewicht zu binden, bzw. der komplizierten Aktivierung des D3M-Papiers·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, den Nachweis über Vorkommen von Virionen-RNS, freier viraler RNS oder deren replikativen Formen, Viroiden und Virusoiden in Extrakten pflanzlicher oder anderer Herkunft zu führen, wobei im Vergleich zu Verfahren, die auf anderen Trägern bzw. Flüssigkeitshybridisierungen beruhen, der Nachweis wesentlich billiger, in kürzerer Zeit, in größerem Umfang und mit höherer Nachweisempfindlichkeit geführt werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung verkörpert ein billiges, einfaches und äußerst empfindliches Verfahren hoher Nachweissicherheit zur Bindung von in pflanzlichen und anderen Extrakten enthaltenen phytoviralen bzw. phytoviroidalen RNS. Die vorgelegte Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß zu analysierende Proben durch geeignete Verfahren, aufgeschlossen werden, der so gewonnene Extrakt unmittelbar oder ggf· nach partieller Reinigung und ggf. nach Spaltung der Nukleoproteide und ggf. notwendiger Konzentrierung der Nukleinsäuren und ggf. notwendiger Denaturierung der phytoviralen bzw. phytoviroidalen RNS direkt auf den Träger aufgetragen wird. Der Träger besteht aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten mit 4,6-Dichlor - 1,3,5 triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80 Vol%, aus a^ö-Trichlor-ljS.S-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 0,5-50 Vol%, aus Halogeniden in einer Menge bis zu 20 Vol%, aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten in einer Menge von 5-80 Vol% und gegebenenfalls aus Puffersubstanzen bis zu 5 Vol%. Der Flächenträger besitzt eine wesentlich höhere RNS-3indungskapazität als die anderen beschriebenen Trägersysteme und ermöglicht dadurch die Analyse von ungereinigten Pflanzenextrakten·

Durch seine Struktur ist das Trägermaterial mechanisch äußerst stabil und dadurch für eine Lagerung der aufgetragenen Testproben und für Mehrfachhybridisationen gut geeignet· Mach Fixierung der Nukleinsäureproben auf dem Träger wird dieser in geeigneten, beschriebenen Systemen zur Hybridisierung mit in verschiedener V/eise markierten molekularen Sonden (komplementäre Nukleinsäurestränge) gebracht· Nach Ablauf der Hybridisierungszeit wird das Trägermaterial in geeigneten Salzlösungen bei bestimmten Temperaturen gewaschen· Der Nachweis erfolgter Hybridisierung erfolgt ζ·Β· autoradiographisch· Durch Direktmessungen oder enzymatisch.

Das Verfahren gliedert sich in folgende Schritte: 1· Extraktgewinnung

Sie wird unter Einsatz mechanischer Walzenpressen, von Preßzangen, Homogenisatoren oder Reibschalen durchgeführt· Ggf, schließt sich eine Grobreinigung durch Zentrifugation oder Filterung an.

2· Spaltung der Nukleoproteide und Konzentrierung Spaltung und Konzentrierung der RNS sind nur in besonderen Fällen erforderlich· Der Preßsaft wird dann in einem entsprechenden Verhältnis mit Phenol oder Phenol/Chloroform oder Phenol/Chloroform/SDS oder SDS oder Guanidylhydrochlorid bei einer bestimmten Temperatur versetzt· Nach erfolgter Spaltung wird aus dem Teil der Suspension, der die phytovirale bzw· phytoviroidale RNS enthält letztere ausgefällt und in einem geeigneten Puffer aufgenommen (z.B. TE-Puffer). Diese Schritte dienen auch einer Reinigung des Extraktes. Die partielle Reinigung und Konzentrierung kann auch alternativ entsprechend dem DDRV/P C 12 N/ 256 361 2 erfolgen·

3, Denaturierung der phytoviralen bzw, phytoviroidalen RNS Macht sich eine Denaturierung der RNS erforderlich, so wird diese ζ·Β· durch Behandlung mit Glyoxal, Glyoxal/DMSO, Formaldehyd/Formamid, Methylquecksilberhydroxid oder thermische Behandlung erreicht·

4. Applikation der Proben auf den Träger

Die wie oben beschrieben vorbereiteten Proben werden mit einem geeigneten Auftragspuffer (z.B. 1M-Phosphatpuffer pH 5,5 gemischt und mit einem Dosierer auf den Träger gebracht. Nach erfolgter Applikation werden die RNS durch lh Inkubation bei Zimmertemperatur auf dem Träger fixiert.

5. Hybridisierung

Der Träger eignet sich für Hybridisation sowohl in Formamid-, als auch in Salzsystemen ZoB. (SSC).

Die für die Hybridisierung erforderlichen molekularen Sonden werden z.Bo durch nick-translation klonierter cDIMS, Kinasemarkierung von cRNS, ssRNS, dsRNS oder durch Komplementärstrangsynthese (cRNS bzw. cDNS) durch entsprechende Synthetasen mittels radioaktiver Nukleotide markiert.

6. Nachweis erfolgter spezifischer Hybridisierung

Der Nachweis erfolgt autoradiographisch mit anschließender Messung der Schwärzungsintensität des photographischen Materials bzw. durch Direktmessungen mit geeigenten Geräten bei Verwendung radioaktiv markierter Sonden bzw. durch Messung der Änderung der Farbintensität von Substraten bei enzymatischen Reaktionen wenn biotinmarkierte Sonden verwendet wurden. Dabei werden als Nullwert die Meßwerte gewählt, die für gesunde Kontrollproben erzielt wurden. Proben, deren Meßwerte signifikant höher als die der gesunden Kontrollen liegen, werden als RNS phytoviraler oder -viroidaler Herkunft enthaltend eingestuft

Ausführunpsbeispiele

1. Nachweis von tobacco rattle virus (TRV) mit RekombinantencDNS in Kartoffeln.

Die Rekombinanten-cDNS von TRV wurde, wie in der Patentschrift UdSSR unter dem Titel "Methode zur Diagnose von mit dem tobacco rattle virus infizierten Kartoffeln. Rekombinante DNS für die Synthese von Sonden. E.coli-Stämme, die Plasmide enthalten als Produzent der diagnostischen Sonden.·· von den Autoren Leiser, Schubert, Zacharjev, Atabekov, Skrjabin und Baev beschrieben, gewonnen.

0,5 g Pflanzenmaterial werden in einer Reibschale unter Zusatz von 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) homogenisiert und das Homogenat wird 5 min in einer Tischzentrifuge, z.B. TH 12, VSB Zentrifugenbau Engelsdorf, in 1,5 ml Zentrifugenbechern (nach Eppendorf) zentrifugiert. 250,ul des Oberstandes v/erden mit 250,ul eines Gemisches aus 1 Teil Phenol mit 0,1% 8-Hydroxychinlin, äquilibriert mit 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1 Teil Chloroformgemisch (24 Teile Chloroform : 1 Teil isoAmylalkohol) gemischt, angereicht mit 1 % SDS und nach kräftigem Schütteln 5 min auf 65°C erwärmt. Nach Brechen der Phasen durch Zentrifugation wird die wässrige Phase abgenommen, zweimal mit Chloroformgemisch ausgeschüttelt, durch Zugabe von konzentriertem Natriumazetat auf eine Endkonzentration von 0,3 M gebracht und mit 3 Volumen 96%igen Alkohols versetzt. Die RNA werden durch zehnminütiges Abkühlen des Probenröhrchens auf -70°C gefällt. Der Alkohol wird anschließend abgesaugt, die Probe zweimal mit 70%igem Alkohol nachgewaschen und nach Abtrocknen des Alkohols in 4 .ul destilliertem Wasser aufgenommen. Die Probe wird auf eine Endkonzentration von 1 M Glyoxal, 50% DMSO und 10 mM ^Na2/3^P04^P^{H 7}»0) in 16yUl Gesamtvolumen gebracht und die RNS 1 h bei 50°C mit anschließendem Abschrecken im Eisbad denaturiert, 1/Ul der denaturierten Probe wird mittels einer Mikroliterpipette auf den Flächenträger aufgetragen. Nach dem Auftragen aller Proben einschließlich Proben gesunder Kontrollpflanzen wird das Material lh bei Raumtemperatur fixiert. Die Absättigung der freien Bindungskapazität des Papiers erfolgt durch Behandlung mit 10% Ätholamin pH 7,0. Anschließend erfolgt eine Vorhybridisierung des beladenen Trägers in einer Lösung aus 50% Formamid, 5fach Denhardts-Puffer, 0,1 % SDS und 5fach SSPE unter Zusatz von 10 ,ug/ml Vorhybridisierungslösung denaturierter unspezifischer DNS bei einer Temperatur von 42⁰C. Nach 18 h wird die Lösung gegen eine Lösung, bestehend aus 50% Formamid, 2-fach Denhardt-Puffer, 0,1 % SDS, 5-fach SSPE und 10 ,ug/ml Hybri-

disierungslösung denaturierter unspezifischer DNS ausge-

32 tauscht· Diese Lösung enthält ebenfalls l,ug P-markiert Rekombinanten-TRV-cDNS (Aktivität ca. 0,25 MBq). Nach der Hybridisierung werden die Flächenträger viermal bei Raumtemperatur jeweils 30 min in einer Lösung aus 3-fach SSG und O₁I % SDS gewaschen, luftgetrocknet und 2-5 Tage autoradiographiert· Die Auswertung der Röntgenfilme erfolgt visuell oder, nach Zerschneiden der Filme in Bahnen, mit einem Extinktionsregistriergerät.

2. Nachweis von barley stripe mosaic virus (BSMV) in Gerste mit cDNS

Die Aufbereitung der Proben erfolgt wie unter 1. beschrieben, Denaturiert wird die Virus-RNS durch Aufnehmen der im Alkohol gefällten Probe in einem Sndvolumen von 10 Ml, enthaltend 1 M Glyoxal und 10 mM Na_o/,P0_A (pH 7,0), einstündiges Erhitzen auf 50 C und anschließendes Abschrecken auf 0 C. Die Hybridisierung, Waschung und Auswertung erfolgt wie unter 1. beschrieben. Die molekulare Sonde wird jedoch wie folgt gewonnen: an isolierter RNS von BSMV wird mit Hilfe von AMV-reverse trans-

32 criptase und oligo-dT als Primer sowie P-raarkierten alpha-Desoxyribonukleotidtriphosphaten ein reverses Transkript produziert, das für die Hybridisierung eingesetzt werden kann.

3. Nachweis von cucumber mosaic virus (CMV)-satelliten RNS (CARNA 5) in Tabak mit dsRNS

Die Vorbereitung der Proben und Sondengewinnung erfolgt wie bei Rosner u.a·, 1983 (10), beschrieben. Alternativ dazu ist dies entsprechend DD VVP C 12/N/ 256 351 1 möglich. Die Flächenträger werden nach Fixierung der RNS bei 60°C vorvorhybridisiert in 2-fach SSC, 0,2 % SDS und 1-fach Denhardts-Puffer (2 h), vorhybridisiert in 2-fach SSC, 0,2 % SDS, 1-fach Denhardts-Puffer und 10,ug/ml unspezifischer RNS (6 h)· Die Hybridisierung erfolgt während 18 h in einer Lösung gleicher Zusammensetzung wie die Vorhybridisierungslösung jedoch unter Zugabe der radioaktiv markierten molekularen Sonde. Nach der Hybridisierung werden die Träger bei 60 C in der Vorhybridisierungslösung (2 h) und dreimal in einer Lösung aus 2-fach SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat jeweils 30 min gewaschen. Anschließend werden die Filter getrocknet

und autoradiographiert. Die Auswertung erfolgt wie unter 1. beschrieben.

4. Nachweis von best cryptic virus (dsRNS-Virus) mit dsRNS Die Gewinnung von Sonden und die Nachweisverfahren unter Verwendung von Nitrocellulose sind in der Patentanmeldung "Verfahren zur Bestimmung der RNS pflanzlicher Viren mit Doppelstrang-RNS-Genom oder ihrer Transkripte mittels molekularer Hybridisierungssonden; von den Autoren Leiser, Schubert, Kühne und Kleinhempel beschrieben» Im gegebenen Fall wird als Träger jedoch speziell der beschriebene Flächenträger verwendet, auf welches die Proben appliziert wardem Hybridisierung und Nachweis erfolgen wie unter 3 beschrieben.

5. Nachweis von TRV mit Rekombinanten-cDNA in Kartoffeln Vom wie unter 1. gewonnenen Extrakt wird l,ul direkt auf den Flächenträger aufgetragen. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung erfolgt wie unter 1. beschrieben.

6. Nachweis von BSWV in Gerste mit cDNA

Die Gewinnung der Probe und das Aufbringen erfolgt wie unter 5. beschrieben. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung wie unter 2. beschrieben.

7. Nachweis von cucumber mosaic virus-Satelliten RNS (CARNA 5) in Gurken mit dsRNS

Die Gewinnung der Proben und das Auftragen erfolgt wie unter 5. beschrieben. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung wie unter 3. beschrieben.

8. Nachweis von TRV mit Rekombinanten-cDNA in Tabak

Die Probengewinnung erfolgt wie im DDR WP C 12 N/256 351 2 dargelegt. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung wie unter 1· beschrieben₀

1· Gonda, T.3.: Symons,R.H. (1978): The use of hybridization analysis with complementary DNA to determine the RNA sequenze homology between strains of plant viruses: Its application to several strains of cucumoviruses. Virology 88, 361-370.

2. Gould, A.R.j Palukaitis, P.: Symons, R.H.: Mossop, D. (1978): Characterization of satellite RNA associated with cucumber mosaic virus. Virology 84, 443-355.

3. Gould, A.R. ; Symons, R.H_# (1977): Determination of the sequence homology between the four RNA species of cucumber mosaic virus by hydridization analysis with complementary DNA, Nucleic Acid Res. 4, 3787-3801.

4. Kümmert, 3, (1980): Synthesis and characterization of DNA complementary to carnation mottle virus RNA· Virology 105, 35-40

5. Kümmert, CJ.; Kettmann, R. (1978): Reverse transcription of turnip yellow mosaic virus RNA primed with carl-thyraus/DNA hydrolysate. Characterization of the purified cDNA product. Nucl. Acid Res· 5. 4423-4430.

6. Mossop. D.W. ; Francki,R.I. (1979); Comperative studies on two satellite RNAs of cucumber mosaic virus.

Virology 95, 395-404·

7· Owens, R.A.; Cress, D.S. (1980): Molecular cloning and charakterization of potato spindle tuber viroid cDNA sequences

Proc. Nat· Acad. Sei., USA 77, 5302-5306·

8. Palukaitis, P_e; Rakowski, A.G· ; McAlexander, D.; Symons, R.H· using: Rapid indexing of the sunblotch disease of avoca dos using complementary probe to avocado sunblotch viroid. Ann. Appl. Biol. 98, 439-449.

9. Taliansky, M.E·; Boykov, S.V.; Malishenko, S.I. ; Kasvan, V.M.j Atabekov, O.G. (1979): A study of barley stripe mosaic virus (33MV) genome. I. Determination of sequence homology between BSMV RNA species.

MoI. Gen. Genet. 175, 89-92

10. Rosner, Α.; Bar-3oseph,M.; Moscovitz, M.; Mavarach,M. (1983): Diagnosis of Specific RNA Sequences in Plant Extracts by Hybridization with a Polynucleotide Kinase-

32

Mediated, P-Labeled, Double-Stranded RNA Probe.

Phytopathology 73, 699-702.

Claims

Erfindunqsanspruch

1. Verfahren zum Nachweis von RNS pflanzlicher Viren, Viroide, Virusoide bzw. deren Abkömmlingen gekennzeichnet dadurch, daß der Pflanzenextrakt auf einen Flächenträger aufgetragen wird, der aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten mit 4-6-Dichlor-1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80 Vol%, aus 2,4,6-Trichlor-l,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 0,5-50 Vol%, aus Halogeniden in einer Menge bis zu 20 Vol%, aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten in einer Menge von 5-80 Vol% und gegebenenfalls aus Puffersubstanzen bis zu 5 Vol% besteht und daß der Nachweis der gebundenen RNS auf sich bekannte Weise durch Hybridisierung mit molekularen. Sonden erfolgt.
2. Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß der Flächenträger eine papierähnliche Matrix besitzt.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß die Cellulose und/oder die Cellulosederivate teilweise oder vollständig aus faserförmigen Partikeln bestehen.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 2 ader 3 gekennzeichnet dadurch, daß der Pflanzensaft bzw. Pflanzenextrakt in einem geordnetem System punktförmig auf den Flächenträger aufgebracht wird.
5. Verfahrennach Punkt 1 und 2 oder 3 gekennzeichnet dadurch, daß der gesamte Flächenträger mit dem Pflanzensaft bzw. Pflanzenextrakt inkubiert wird.
6. Verfahren gemäß 1·, gekennzeichnet dadurch, daß Extrakte, die entsprechende RNS enthalten, ohne vorherige Spaltung vorhandener Nukleoproteide auf den Flächenträger aufgetragen werden.

7o Verfahren gemäß 1., gekennzeichnet dadurch, daß die an den Flächenträger zu bindenden RNS durch vorherige Spaltung der Nukleoproteide freigesetzt werden.
8. Verfahren gemäß 7«, gekennzeichnet dadurch, daß die Spaltung unter Verwendung von Phenol und/oder SDS und/oder Guanidylhydrochlorid erfolgt.
9. Verfahren gemäß 1., gekennzeichnet dadurch, daß die auf den Flächenträger aufzutragenden RNS ohne Denaturierung aufgetragen werden.
10. Verfahren gemäß 1., gekennzeichnet dadurch, daß die auf den Flächenträger aufzutragenden viralen und virusoidalen RNS nach Denaturierung aufgetragen werden. 11· Verfahren gemäß 10., gekennzeichnet dadurch, daß die Denaturierung der aufzutragenden RNS unter Verwendung von Glyoxal und/oder Formaldehyd und/oder Formamid und/ oder Methylquecksilberhydroxid und/oder Erhitzen erfolgt.
12. Verfahren gemäß 1., gekennzeichnet dadurch, daß für die Hybridisierung von molekularen Sonden an die auf dem Flächenträger gebundenen RNS Hybridisierungssysteme zur Anwendung gelangen, die HEPES, PIPES, Natriumphosphate, Tris, SDS, Natriumzitrat, Natriumchlorid, Rinderserumalbumin, Gelatine, Ficoll, PVP,EDTA, denaturierte niedermolekulare RNS und DNS, Formamid, Salzsäure und Natriumpyrophosphat enthalten.
13. Verfahren gemäß 1., gekennzeichnet dadurch, daß die an die auf dem Flächenträger gebundenen RNS zu hybridisierenden molekularen Sonden radioaktiv markiert sind»
14. Verfahren gemäß 1. und 13., gekennzeichnet dadurch, daß die an die auf dem Flächenträger gebundenen RNS zu hybridisierenden molekularen Sonden einst rängige Virionen-RNS bzw. deren Fragmente darstellen.
15. Verfahren gemäß 14·, gekennzeichnet dadurch, daß die Sonden replikative Intermediate darstellen.
16. Verfahren gemäß 14., gekennzeichnet dadurch, daß die Sonden doppelsträngige RNS darstellen.
17. Verfahren gemäß 14., gekennzeichnet dadurch, daß die Sonden cRNS darstellen.
18. Verfahren gemäß 14., gekennzeichnet dadurch, daß die Sonden cDNS darstellen.
19. Verfahren gemäß 14., gekennzeichnet dadurch, daß die Sonden Rekombinanten-cDNS darstellen.
20. Verfahren gemäß 14., 15·, 16., 17., 18., 19., gekennzeichnet dadurch, daß Teile der genomischen RNS als Sonden verwendet werden.
21. Verfahren gemäß 14., 15., 16., 17., 18., 19., 20., gekennzeichnet dadurch, daß die Sonden synthetisch hergestellt wurden.
22. Verfahren gemäß 1., 13«, gekennzeichnet dadurch, daß der Nachweis erfolgter Hybridisierung auf dem Träger· autoradiographisch oder durch Verfahren der Direktmessung der Radioaktivität erfolgt. . ' 23· Verfahren gemäß 1., gekennzeichnet dadurch, daß die Gewinnung des die RNS enthaltenden Extraktes durch mechanische Vorrichtungen wie Walzenpressen, Reibschalen, Homogenisatoren, Preßzangen, Rührer erfolgt und eine Grobreinigung durch Zentrifugation oder Filtration sich anschließen kann.