DD226593A1

DD226593A1 - METHOD FOR DETERMINING RNA OF VEGETABLE VIRUSES

Info

Publication number: DD226593A1
Application number: DD26226184A
Authority: DD
Inventors: Hans-Dieter Hunger; Robert-Matthias Leiser; Joerg Schubert; Gudrun Barchend
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-04-24
Filing date: 1984-04-24
Publication date: 1985-08-28

Abstract

Ziel der Erfindung ist es die Nachweisempfindlichkeit zu steigern. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen neuen Traeger mit bedeutend hoeherer Bindungskapazitaet einzusetzen. Erfindungsgemaess wird ein Traeger verwendet, der aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten mit 4,6-Dichlor 1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80 Vol.-%, aus 2,4,6-Trichlor-1,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 0,5-50 Vol.-%, aus Hologeniden in einer Menge bis zu 20 Vol.-%, aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten in einer Menge von 5-80 Vol.-%, und gegebenenfalls aus Puffersubstanzen bis zu 5 Vol.-% besteht. Die Erfindung wird in der phytopathologischen Analytik angewendet.The aim of the invention is to increase the detection sensitivity. The object of the invention is to use a new Traeger with significantly higher binding capacity. According to the invention, a carrier is used which consists of cellulose and / or cellulose derivatives with 4,6-dichloro-1,3,5-triazine groups in an amount of 1-80% by volume, of 2,4,6-trichloro-1 , 3,5-triazine groups in an amount of 0.5-50 vol .-%, of halides in an amount up to 20 vol .-%, of cellulose and / or cellulose derivatives in an amount of 5-80 vol. -%, and optionally from buffer substances up to 5 vol .-% consists. The invention is used in phytopathological analysis.

Description

Verfahren zum Nachweis von RNS pflanzlicher Viren Anwendungsgebiet der Erfindung Method for detecting RNA of plant viruses Field of application of the invention

Das Verfahren dient dem Nachweis von viralen Ribonukleinsäuren, freier viraler Nukleinsäure (RNS) und replikativer Formen der Virus-RNS, Viroiden und Virusoiden in aus Pflanzen oder anderem Material bzw· Säften gewonnenen Extrakten durch Bindung der nachzuweisenden RNS an einen neuen Flächenträger und nachfolgender Hybridisierung mittels markierter komplementärer Desoxyribonukleinsäure (cDNS), klonierter cDNS (Rekombinanten-cDNS), doppelsträngiger RNS (dsRNS), einsträngiger Virionen-RNS (ssRNS) bzw. komplementärer RNS (cRNS) und der RNS replikativer Intermediate als molekulare Hybridisierungssonden·The method is used for the detection of viral ribonucleic acids, free viral nucleic acid (RNA) and replicative forms of virus RNA, viroids and virusoids in extracts from plants or other material or juices extracts by binding the RNA to be detected to a new surface carrier and subsequent hybridization means labeled complementary deoxyribonucleic acid (cDNA), cloned cDNA (recombinant cDNA), double-stranded RNA (dsRNA), single-stranded virion RNA (ssRNA) or complementary RNA (cRNA) and the RNA of replicative intermediates as molecular hybridization probes

Characteristic of the known technical solutions

Hybridisierungsverfahren wurden in letzter Zeit häufig in Zusammenhang mit molekularbiologischen Untersuchungen zwecks Nachweises viraler und viroidaler RNS beschrieben (vgl· Lit· 1-9)· Diese Verfahren basieren entweder auf einer Hybridisierung in flüssigen Medien mit anschließendem Test auf Resistenz der Hybride gegen Abbau durch S^-Nuklease bzw, darauf, daß die nachzuweisende Nukleinsäure an einen festen Träger gebunden und mit einer entsprechend markierten Nukleinsäure hybridisiert wird· Als feste Träger sind insbesondere Nitrozellulose und DBM-Papier beschrieben. Die Nachteile der Flüssighybridisationsverfahren bestehen in einem hohen Aufwand an Material und Arbeitszeit sowie ihrer Kompliziertheit, der Hybridisierungsverfahren mit Nitrozellulose (NC) und DBM-Hybridization methods have recently been described frequently in connection with molecular biology studies for the detection of viral and viroidal RNA (see Lit. 1-9). These methods are based either on hybridization in liquid media followed by resistance to hybrids against degradation by S ^ -Nuclease or, that the nucleic acid to be detected is bound to a solid support and hybridized with an appropriately labeled nucleic acid. As solid supports in particular nitrocellulose and DBM paper are described. The disadvantages of the liquid hybridization processes are a high expenditure on material and working time and their complexity, the hybridization process with nitrocellulose (NC) and DBM-

Papier in ihrem relativ hohen Preis, der geringen Kapazität der MC und ihres Unvermögens, Nukleinsäuren mit niedrigem Molekulargewicht zu binden, bzw. der komplizierten Aktivierung des D3M-Papiers·Paper in its relatively high price, the low capacity of the MC and its inability to bind low molecular weight nucleic acids or the complicated activation of the D3M paper ·

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, den Nachweis über Vorkommen von Virionen-RNS, freier viraler RNS oder deren replikativen Formen, Viroiden und Virusoiden in Extrakten pflanzlicher oder anderer Herkunft zu führen, wobei im Vergleich zu Verfahren, die auf anderen Trägern bzw. Flüssigkeitshybridisierungen beruhen, der Nachweis wesentlich billiger, in kürzerer Zeit, in größerem Umfang und mit höherer Nachweisempfindlichkeit geführt werden kann.The aim of the invention is to demonstrate the presence of virion RNA, free viral RNA or their replicative forms, viroids and virusoids in extracts of vegetable or other origin, wherein compared to methods based on other carriers or liquid hybridizations, the detection can be performed much cheaper, in a shorter time, on a larger scale and with higher detection sensitivity.

Darlegung des Wesens Presentation of the essence der the Erfindunginvention

Die Erfindung verkörpert ein billiges, einfaches und äußerst empfindliches Verfahren hoher Nachweissicherheit zur Bindung von in pflanzlichen und anderen Extrakten enthaltenen phytoviralen bzw. phytoviroidalen RNS. Die vorgelegte Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß zu analysierende Proben durch geeignete Verfahren, aufgeschlossen werden, der so gewonnene Extrakt unmittelbar oder ggf· nach partieller Reinigung und ggf. nach Spaltung der Nukleoproteide und ggf. notwendiger Konzentrierung der Nukleinsäuren und ggf. notwendiger Denaturierung der phytoviralen bzw. phytoviroidalen RNS direkt auf den Träger aufgetragen wird. Der Träger besteht aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten mit 4,6-Dichlor - 1,3,5 triazin-Gruppierungen in einer Menge von 1-80 Vol%, aus a^ö-Trichlor-ljS.S-triazin-Gruppierungen in einer Menge von 0,5-50 Vol%, aus Halogeniden in einer Menge bis zu 20 Vol%, aus Cellulose und/oder Cellulosederivaten in einer Menge von 5-80 Vol% und gegebenenfalls aus Puffersubstanzen bis zu 5 Vol%. Der Flächenträger besitzt eine wesentlich höhere RNS-3indungskapazität als die anderen beschriebenen Trägersysteme und ermöglicht dadurch die Analyse von ungereinigten Pflanzenextrakten·The invention embodies a cheap, simple and extremely sensitive method of high detection reliability for the binding of phytoviral or phytoviroidal RNA contained in plant and other extracts. The presented invention is characterized in that samples to be analyzed are digested by suitable methods, the extract thus obtained directly or, if necessary, after partial purification and optionally after cleavage of the nucleoproteins and possibly necessary concentration of the nucleic acids and possibly necessary denaturation of the phytoviral or phytoviroidal RNA is applied directly to the carrier. The carrier consists of cellulose and / or cellulose derivatives with 4,6-dichloro-1,3,5-triazine groupings in an amount of 1-80% by volume, from a ^ ö-trichloro-ljS.S-triazine groupings in one Amount of 0.5-50 vol% of halides in an amount up to 20% by volume of cellulose and / or cellulose derivatives in an amount of 5-80% by volume and optionally from buffer substances up to 5% by volume. The surface support has a significantly higher RNA-binding capacity than the other described support systems and thereby allows the analysis of unpurified plant extracts ·

Durch seine Struktur ist das Trägermaterial mechanisch äußerst stabil und dadurch für eine Lagerung der aufgetragenen Testproben und für Mehrfachhybridisationen gut geeignet· Mach Fixierung der Nukleinsäureproben auf dem Träger wird dieser in geeigneten, beschriebenen Systemen zur Hybridisierung mit in verschiedener V/eise markierten molekularen Sonden (komplementäre Nukleinsäurestränge) gebracht· Nach Ablauf der Hybridisierungszeit wird das Trägermaterial in geeigneten Salzlösungen bei bestimmten Temperaturen gewaschen· Der Nachweis erfolgter Hybridisierung erfolgt ζ·Β· autoradiographisch· Durch Direktmessungen oder enzymatisch.Due to its structure, the support material is mechanically extremely stable and thus well suited for storage of the applied test samples and for multiple hybridizations. Mach fixation of the nucleic acid samples on the support is carried out in suitable systems described for hybridization with variously labeled molecular probes (complementary nucleic acid probes) After completion of the hybridization time, the support material is washed in suitable salt solutions at specific temperatures. The detection of successful hybridization is carried out by autoradiography.

Das Verfahren gliedert sich in folgende Schritte: 1· ExtraktgewinnungThe procedure is divided into the following steps: 1 · extract extraction

Sie wird unter Einsatz mechanischer Walzenpressen, von Preßzangen, Homogenisatoren oder Reibschalen durchgeführt· Ggf, schließt sich eine Grobreinigung durch Zentrifugation oder Filterung an.It is carried out using mechanical roller presses, pressing tongs, homogenizers or friction plates. If appropriate, a rough cleaning is followed by centrifugation or filtration.

2· Spaltung der Nukleoproteide und Konzentrierung Spaltung und Konzentrierung der RNS sind nur in besonderen Fällen erforderlich· Der Preßsaft wird dann in einem entsprechenden Verhältnis mit Phenol oder Phenol/Chloroform oder Phenol/Chloroform/SDS oder SDS oder Guanidylhydrochlorid bei einer bestimmten Temperatur versetzt· Nach erfolgter Spaltung wird aus dem Teil der Suspension, der die phytovirale bzw· phytoviroidale RNS enthält letztere ausgefällt und in einem geeigneten Puffer aufgenommen (z.B. TE-Puffer). Diese Schritte dienen auch einer Reinigung des Extraktes. Die partielle Reinigung und Konzentrierung kann auch alternativ entsprechend dem DDRV/P C 12 N/ 256 361 2 erfolgen·2 · Cleavage of the nucleoproteins and concentration Cleavage and concentration of the RNA are only required in special cases. The pressed juice is then mixed in a corresponding ratio with phenol or phenol / chloroform or phenol / chloroform / SDS or SDS or guanidyl hydrochloride at a certain temperature Successful cleavage is precipitated from the part of the suspension containing the phytoviral or phytoviroidal RNA latter and taken up in a suitable buffer (eg TE buffer). These steps also serve to purify the extract. The partial cleaning and concentration can alternatively also be carried out according to the DDRV / PC 12 N / 256 361 2 ·

3, Denaturierung der phytoviralen bzw, phytoviroidalen RNS Macht sich eine Denaturierung der RNS erforderlich, so wird diese ζ·Β· durch Behandlung mit Glyoxal, Glyoxal/DMSO, Formaldehyd/Formamid, Methylquecksilberhydroxid oder thermische Behandlung erreicht·3, Denaturation of the phytoviral or phytoviroidal RNA If it is necessary to denature the RNA, this is achieved by treatment with glyoxal, glyoxal / DMSO, formaldehyde / formamide, methylmercury hydroxide or thermal treatment.

4. Applikation der Proben auf den Träger4. Application of the samples to the carrier

Die wie oben beschrieben vorbereiteten Proben werden mit einem geeigneten Auftragspuffer (z.B. 1M-Phosphatpuffer pH 5,5 gemischt und mit einem Dosierer auf den Träger gebracht. Nach erfolgter Applikation werden die RNS durch lh Inkubation bei Zimmertemperatur auf dem Träger fixiert.The samples prepared as described above are mixed with a suitable loading buffer (e.g., 1M phosphate buffer pH 5.5 and applied to the carrier with a doser.) After application, the RNAs are fixed on the carrier by incubation at room temperature for one hour.

5. Hybridisierung5. Hybridization

Der Träger eignet sich für Hybridisation sowohl in Formamid-, als auch in Salzsystemen ZoB. (SSC).The carrier is suitable for hybridization in both formamide and in salt systems ZoB. (SSC).

Die für die Hybridisierung erforderlichen molekularen Sonden werden z.Bo durch nick-translation klonierter cDIMS, Kinasemarkierung von cRNS, ssRNS, dsRNS oder durch Komplementärstrangsynthese (cRNS bzw. cDNS) durch entsprechende Synthetasen mittels radioaktiver Nukleotide markiert.For example, the molecular probes required for the hybridization are labeled by nick-translation-cloned cDIMS, kinase labeling of cRNA, ssRNA, dsRNA or by complementary strand synthesis (cRNA or cDNA) by means of corresponding synthetases by means of radioactive nucleotides.

6. Nachweis erfolgter spezifischer Hybridisierung6. Detection of specific hybridization

Der Nachweis erfolgt autoradiographisch mit anschließender Messung der Schwärzungsintensität des photographischen Materials bzw. durch Direktmessungen mit geeigenten Geräten bei Verwendung radioaktiv markierter Sonden bzw. durch Messung der Änderung der Farbintensität von Substraten bei enzymatischen Reaktionen wenn biotinmarkierte Sonden verwendet wurden. Dabei werden als Nullwert die Meßwerte gewählt, die für gesunde Kontrollproben erzielt wurden. Proben, deren Meßwerte signifikant höher als die der gesunden Kontrollen liegen, werden als RNS phytoviraler oder -viroidaler Herkunft enthaltend eingestuftThe detection is carried out autoradiographically with subsequent measurement of the blackening intensity of the photographic material or by direct measurements with appropriate equipment using radioactively labeled probes or by measuring the change in the color intensity of substrates in enzymatic reactions when biotin-labeled probes were used. In this case, the measured values selected for healthy control samples are selected as the zero value. Samples whose readings are significantly higher than those of the healthy controls are classified as containing RNA of phytoviral or viral origin

AusführunpsbeispieleAusführunpsbeispiele

1. Nachweis von tobacco rattle virus (TRV) mit RekombinantencDNS in Kartoffeln.1. Detection of tobacco rattle virus (TRV) with recombinant cDNA in potatoes.

Die Rekombinanten-cDNS von TRV wurde, wie in der Patentschrift UdSSR unter dem Titel "Methode zur Diagnose von mit dem tobacco rattle virus infizierten Kartoffeln. Rekombinante DNS für die Synthese von Sonden. E.coli-Stämme, die Plasmide enthalten als Produzent der diagnostischen Sonden.·· von den Autoren Leiser, Schubert, Zacharjev, Atabekov, Skrjabin und Baev beschrieben, gewonnen.The recombinant cDNA of TRV was synthesized as described in the USSR patent entitled "Method of Diagnosing Potato Rattle Virus-Infected Potatoes." Recombinant DNA for Probe Synthesis E. coli strains containing plasmids as the producer of the diagnostic Probes. ·· Written by the authors Leiser, Schubert, Zacharjev, Atabekov, Scriabin and Baev.

0,5 g Pflanzenmaterial werden in einer Reibschale unter Zusatz von 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) homogenisiert und das Homogenat wird 5 min in einer Tischzentrifuge, z.B. TH 12, VSB Zentrifugenbau Engelsdorf, in 1,5 ml Zentrifugenbechern (nach Eppendorf) zentrifugiert. 250,ul des Oberstandes v/erden mit 250,ul eines Gemisches aus 1 Teil Phenol mit 0,1% 8-Hydroxychinlin, äquilibriert mit 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1 Teil Chloroformgemisch (24 Teile Chloroform : 1 Teil isoAmylalkohol) gemischt, angereicht mit 1 % SDS und nach kräftigem Schütteln 5 min auf 65°C erwärmt. Nach Brechen der Phasen durch Zentrifugation wird die wässrige Phase abgenommen, zweimal mit Chloroformgemisch ausgeschüttelt, durch Zugabe von konzentriertem Natriumazetat auf eine Endkonzentration von 0,3 M gebracht und mit 3 Volumen 96%igen Alkohols versetzt. Die RNA werden durch zehnminütiges Abkühlen des Probenröhrchens auf -70°C gefällt. Der Alkohol wird anschließend abgesaugt, die Probe zweimal mit 70%igem Alkohol nachgewaschen und nach Abtrocknen des Alkohols in 4 .ul destilliertem Wasser aufgenommen. Die Probe wird auf eine Endkonzentration von 1 M Glyoxal, 50% DMSO und 10 mM ^Na2/3^P04^P^{H 7}»0) in 16yUl Gesamtvolumen gebracht und die RNS 1 h bei 50°C mit anschließendem Abschrecken im Eisbad denaturiert, 1/Ul der denaturierten Probe wird mittels einer Mikroliterpipette auf den Flächenträger aufgetragen. Nach dem Auftragen aller Proben einschließlich Proben gesunder Kontrollpflanzen wird das Material lh bei Raumtemperatur fixiert. Die Absättigung der freien Bindungskapazität des Papiers erfolgt durch Behandlung mit 10% Ätholamin pH 7,0. Anschließend erfolgt eine Vorhybridisierung des beladenen Trägers in einer Lösung aus 50% Formamid, 5fach Denhardts-Puffer, 0,1 % SDS und 5fach SSPE unter Zusatz von 10 ,ug/ml Vorhybridisierungslösung denaturierter unspezifischer DNS bei einer Temperatur von 42⁰C. Nach 18 h wird die Lösung gegen eine Lösung, bestehend aus 50% Formamid, 2-fach Denhardt-Puffer, 0,1 % SDS, 5-fach SSPE und 10 ,ug/ml Hybri-0.5 g of plant material are homogenized in a mortar with the addition of 0.5 ml of 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) and the homogenate is 5 min in a benchtop centrifuge, eg TH 12, VSB centrifuge Engelsdorf, in 1 , Centrifuge 5 ml centrifuge cups (Eppendorf). 250 μl of the supernatant are mixed with 250 μl of a mixture of 1 part phenol with 0.1% 8-hydroxyquinoline equilibrated with 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 1 part chloroform mixture (24 parts chloroform : 1 part isoamyl alcohol), mixed with 1% SDS and after vigorous shaking for 5 min at 65 ° C heated. After the phases have been broken by centrifugation, the aqueous phase is taken off, extracted by shaking twice with a chloroform mixture, brought to a final concentration of 0.3 M by addition of concentrated sodium acetate and mixed with 3 volumes of 96% strength alcohol. The RNA is precipitated by cooling the sample tube to -70 ° C for ten minutes. The alcohol is then sucked off, the sample washed twice with 70% alcohol and taken up after drying of the alcohol in 4 .ul distilled water. The sample is brought to a final concentration of 1 M glyoxal, 50% DMSO and 10 mM ^Na 2/3 ^P0 4 ^ P ^{H 7} »0) in 16yUl total volume and the RNA denatured for 1 h at 50 ° C with subsequent quenching in an ice bath, 1 / μl of the denatured sample is applied to the surface support by means of a microliter pipette. After applying all samples, including samples of healthy control plants, the material is fixed at room temperature for 1 h. The saturation of the free binding capacity of the paper is carried out by treatment with 10% ethanolamine pH 7.0. Subsequently prehybridization of the loaded carrier is effected in a solution of 50% formamide, 5X Denhardt's buffer, 0.1% SDS, and 5X SSPE with the addition of 10 ug / ml denatured non-specific DNA prehybridization solution at a temperature of 42 ⁰ C. After 18 h is the solution against a solution consisting of 50% formamide, 2-fold Denhardt buffer, 0.1 % SDS, 5-fold SSPE and 10 μg / ml hybrid.

disierungslösung denaturierter unspezifischer DNS ausge-denaturing non-specific DNA.

32 tauscht· Diese Lösung enthält ebenfalls l,ug P-markiert Rekombinanten-TRV-cDNS (Aktivität ca. 0,25 MBq). Nach der Hybridisierung werden die Flächenträger viermal bei Raumtemperatur jeweils 30 min in einer Lösung aus 3-fach SSG und O₁I % SDS gewaschen, luftgetrocknet und 2-5 Tage autoradiographiert· Die Auswertung der Röntgenfilme erfolgt visuell oder, nach Zerschneiden der Filme in Bahnen, mit einem Extinktionsregistriergerät.32 exchanges · This solution also contains l, ug P-labeled recombinant TRV cDNA (activity about 0.25 MBq). After hybridization, the surface carriers are washed four times at room temperature for 30 min in a solution of 3-fold SSG and O ₁ l % SDS, air-dried and autoradiographed for 2-5 days. The X-ray films are evaluated visually or after the films have been cut into lanes , with an extinction recorder.

2. Nachweis von barley stripe mosaic virus (BSMV) in Gerste mit cDNS2. Detection of barley stripe mosaic virus (BSMV) in barley with cDNA

Die Aufbereitung der Proben erfolgt wie unter 1. beschrieben, Denaturiert wird die Virus-RNS durch Aufnehmen der im Alkohol gefällten Probe in einem Sndvolumen von 10 Ml, enthaltend 1 M Glyoxal und 10 mM Na_o/,P0_A (pH 7,0), einstündiges Erhitzen auf 50 C und anschließendes Abschrecken auf 0 C. Die Hybridisierung, Waschung und Auswertung erfolgt wie unter 1. beschrieben. Die molekulare Sonde wird jedoch wie folgt gewonnen: an isolierter RNS von BSMV wird mit Hilfe von AMV-reverse trans-The preparation of the samples is carried out as described under 1. The virus RNA is denatured by taking up the sample precipitated in the alcohol in a Sndvolumen of 10 Ml, containing 1 M glyoxal and 10 mM Na _{o /} , P0 _A (pH 7.0) , heating to 50 C for one hour and then quenching to 0 C. The hybridization, washing and evaluation are carried out as described under 1.. The molecular probe is, however, obtained as follows: isolated RNA from BSMV is amplified by AMV reverse transcription.

32 criptase und oligo-dT als Primer sowie P-raarkierten alpha-Desoxyribonukleotidtriphosphaten ein reverses Transkript produziert, das für die Hybridisierung eingesetzt werden kann.32 criptase and oligo-dT as primers and P-labeled alpha-deoxyribonucleotide triphosphates produces a reverse transcript that can be used for hybridization.

3. Nachweis von cucumber mosaic virus (CMV)-satelliten RNS (CARNA 5) in Tabak mit dsRNS3. Detection of cucumber mosaic virus (CMV) satellites RNA (CARNA 5) in tobacco with dsRNA

Die Vorbereitung der Proben und Sondengewinnung erfolgt wie bei Rosner u.a·, 1983 (10), beschrieben. Alternativ dazu ist dies entsprechend DD VVP C 12/N/ 256 351 1 möglich. Die Flächenträger werden nach Fixierung der RNS bei 60°C vorvorhybridisiert in 2-fach SSC, 0,2 % SDS und 1-fach Denhardts-Puffer (2 h), vorhybridisiert in 2-fach SSC, 0,2 % SDS, 1-fach Denhardts-Puffer und 10,ug/ml unspezifischer RNS (6 h)· Die Hybridisierung erfolgt während 18 h in einer Lösung gleicher Zusammensetzung wie die Vorhybridisierungslösung jedoch unter Zugabe der radioaktiv markierten molekularen Sonde. Nach der Hybridisierung werden die Träger bei 60 C in der Vorhybridisierungslösung (2 h) und dreimal in einer Lösung aus 2-fach SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat jeweils 30 min gewaschen. Anschließend werden die Filter getrocknetThe preparation of the samples and probe extraction takes place as described in Rosner et al., 1983 (10). Alternatively, this is possible according to DD VVP C 12 / N / 256 351 1. After fixation of the RNA at 60 ° C., the surface carriers are prehybridized in 2 × SSC, 0.2 % SDS and 1 × Denhardts buffer (2 h), prehybridized in 2 × SSC, 0.2 % SDS, 1 × Denhardts buffer and 10 μg / ml unspecific RNA (6 h) Hybridization is carried out for 18 h in a solution of the same composition as the prehybridization solution but with addition of the radiolabelled molecular probe. After hybridization, the slides are washed at 60 C in the prehybridization solution (2 h) and three times in a solution of 2-fold SSC, 0.1 % SDS and 0.1 % sodium pyrophosphate for 30 min each. Then the filters are dried

und autoradiographiert. Die Auswertung erfolgt wie unter 1. beschrieben.and autoradiographed. The evaluation is carried out as described under 1.

4. Nachweis von best cryptic virus (dsRNS-Virus) mit dsRNS Die Gewinnung von Sonden und die Nachweisverfahren unter Verwendung von Nitrocellulose sind in der Patentanmeldung "Verfahren zur Bestimmung der RNS pflanzlicher Viren mit Doppelstrang-RNS-Genom oder ihrer Transkripte mittels molekularer Hybridisierungssonden; von den Autoren Leiser, Schubert, Kühne und Kleinhempel beschrieben» Im gegebenen Fall wird als Träger jedoch speziell der beschriebene Flächenträger verwendet, auf welches die Proben appliziert wardem Hybridisierung und Nachweis erfolgen wie unter 3 beschrieben.4. Detection of best cryptic virus (dsRNA virus) with dsRNA The extraction of probes and the detection methods using nitrocellulose are described in the patent application "Method for the determination of the RNA of plant-derived viruses with double-stranded RNA genome or their transcripts by means of molecular hybridization probes; described by the authors Leiser, Schubert, Kühne and Kleinhempel "In the given case, however, the carrier described is used specifically the described surface carrier to which the samples are applied hybridization and detection carried out as described under 3.

5. Nachweis von TRV mit Rekombinanten-cDNA in Kartoffeln Vom wie unter 1. gewonnenen Extrakt wird l,ul direkt auf den Flächenträger aufgetragen. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung erfolgt wie unter 1. beschrieben.5. Detection of TRV with Recombinant cDNA in Potatoes From the extract obtained as in 1, 1 μl is applied directly to the surface carrier. Post-treatment of the filters, hybridization and evaluation is carried out as described under 1.

6. Nachweis von BSWV in Gerste mit cDNA6. Detection of BSWV in barley with cDNA

Die Gewinnung der Probe und das Aufbringen erfolgt wie unter 5. beschrieben. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung wie unter 2. beschrieben.The recovery of the sample and the application takes place as described under 5.. Post-treatment of the filters, hybridization and evaluation as described under 2.

7. Nachweis von cucumber mosaic virus-Satelliten RNS (CARNA 5) in Gurken mit dsRNS7. Detection of cucumber mosaic virus satellite RNA (CARNA 5) in cucumbers with dsRNA

Die Gewinnung der Proben und das Auftragen erfolgt wie unter 5. beschrieben. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung wie unter 3. beschrieben.The recovery of the samples and the application takes place as described under 5.. Post-treatment of the filters, hybridization and evaluation as described under 3..

8. Nachweis von TRV mit Rekombinanten-cDNA in Tabak8. Detection of TRV with recombinant cDNA in tobacco

Die Probengewinnung erfolgt wie im DDR WP C 12 N/256 351 2 dargelegt. Nachbehandlung der Filter, Hybridisierung und Auswertung wie unter 1· beschrieben₀ The sample is collected as described in the DDR WP C 12 N / 256 351 2. Post-treatment of the filters, hybridization and evaluation as described under 1. ₀

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Mediated, P-Labeled, Double-Stranded RNA Probe.Mediated, P-Labeled, Double-Stranded RNA Probe.

Phytopathology 73, 699-702.Phytopathology 73, 699-702.

Claims

Erfindunqsanspruch

1. A method for the detection of RNA of plant viruses, viroids, virusoids or their derivatives characterized in that the plant extract is applied to a surface carrier consisting of cellulose and / or cellulose derivatives with 4-6-dichloro-1,3,5-triazine Groups in an amount of 1-80% by volume, from 2,4,6-trichloro-l, 3,5-triazine groupings in an amount of 0.5-50% by volume, of halides in an amount up to 20 Vol%, from cellulose and / or cellulose derivatives in an amount of 5-80 vol% and optionally from buffer substances up to 5% by volume, and that the detection of the bound RNA in a known manner by hybridization with molecular. Probes are done.

2. The method according to item 1, characterized in that the surface carrier has a paper-like matrix.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the cellulose and / or the cellulose derivatives consist partially or completely of fibrous particles.

4. The method according to item 1 and 2 or 3, characterized in that the plant sap or plant extract is applied in an ordered system punctiform on the surface support.

5. Process according to item 1 and 2 or 3, characterized in that the entire surface carrier is incubated with the sap or plant extract.

6. Method according to claim 1, characterized in that extracts which contain corresponding RNA are applied to the surface carrier without prior cleavage of existing nucleoproteids.

7o Method according to 1., characterized in that the RNA to be bound to the surface carrier are released by prior cleavage of the nucleoproteins.

8. The method according to 7 «, characterized in that the cleavage is carried out using phenol and / or SDS and / or guanidyl hydrochloride.

9. The method according to 1, characterized in that the applied to the surface carrier RNA are applied without denaturation.

10. The method according to 1, characterized in that the applied to the surface carrier viral and virusoidal RNA are applied after denaturation. Process according to 10, characterized in that the denaturation of the RNA to be applied takes place using glyoxal and / or formaldehyde and / or formamide and / or methylmercury hydroxide and / or heating.

12. The method according to 1, characterized in that are used for the hybridization of molecular probes to the bound on the surface carrier RNA hybridization systems, the HEPES, PIPES, sodium phosphate, tris, SDS, sodium citrate, sodium chloride, bovine serum albumin, gelatin, Ficoll, PVP, EDTA, denatured low molecular weight RNA and DNA, formamide, hydrochloric acid and sodium pyrophosphate.

13. Method according to 1, characterized in that the molecular probes to be hybridized to the RNA bound on the surface carrier are radioactively labeled »

14. The method according to 1 and 13, characterized in that the attached to the surface carrier RNA to be hybridized molecular probes are single-stranded virion RNA or fragments thereof.

15. Method according to 14, characterized in that the probes represent replicative intermediates.

16. The method according to 14., characterized in that the probes are double-stranded RNA.

17. Method according to 14, characterized in that the probes are cRNAs.

18. Method according to 14, characterized in that the probes are cDNA.

19. The method according to 14., characterized in that the probes are recombinant cDNA.

20. Method according to 14, 15, 16, 17, 18, 19, characterized in that parts of the genomic RNA are used as probes.

21. The method according to 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, characterized in that the probes were prepared synthetically.

22. Method according to 1, 13, characterized in that the detection of successful hybridization on the carrier is carried out by autoradiography or by direct measurement of the radioactivity. , The process according to claim 1, characterized in that the extraction of the RNA-containing extract takes place by mechanical means such as roller presses, friction plates, homogenizers, pressing tongs, stirrers and a coarse purification by centrifugation or filtration can follow.