DD225841A3 - Verfahren zur herstellung eines mittels zur behandlung von erkrankungen, die mit veraenderungen des pulmonalen surfactant-systems einhergehen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Veraenderungen des pulmonalen Surfactant-Systems einhergehen, insbesondere des Atemnotsyndroms Neugeborener und Erwachsener. Die Gewinnung erfolgt erfindungsgemaess durch waessrige Extraktion zerkleinerter Saeugerlunge und anschliessende Bindung des Wirkstoffes an ein unloesliches Adsorbens, insbesondere Kieselgel oder aktivierte Silikate. Die Elution von Adsorbens wird mit organischen Loesungsmittel bzw. Gemischen davon durchgefuehrt. Nach Einengen des Eluates zur Trockne wird der Wirkstoff in waessriger Loesung emulgiert und lyophilisiert. Das Mittel kann in Form von Aerosol oder als Bolus ueber die Atemwege in einer Dosis von 1-500 mg/ml physiologischer Traegerfluessigkeit appliziert werden. Es kann bei allen Atemwegserkrankungen, die mit einer Stoerung des Surfactant-Systems verbunden sind, angewendet werden. Seine Hauptinhaltsstoffe sind 20-75% Phospholipide, 10-40% Cholesterol und 5-30% Neutrallipide. Der Proteinanteil des Mittels betraegt weniger als 0,5%.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Surfactant aus der Lunge von Säugetieren. Der von Alveolarzellen des Typs Il gebildete Wirkstoff kann zur kausalen Therapie des durch Surfactantmangel bedingten Atemnotsyndroms eingesetzt werden. Das Herstellungsverfahren ist in der pharmazeutischen Industrie anwendbar.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Hyalinmembran-Erkrankung (HMD) beruht auf einem Mangel an Alveolar-Surfactant in der Lunge und bedingt dadurch die Ausbildung von Atelektasen. Eine medikamentöse und kausale Behandlungsmöglichkeit wird in der Verabreichung von Lungen-Surfactant in die Trachea gesehen. Tierexperimentelle und erste klinische Versuche an Neugeborenen wurden sowohl mit natürlichem Surfactant als auch mit dessen Hauptbestandteil Dipalmityllecithin, vorwiegend in Kombination mit Phospatidylglycerol, durchgeführt. Das natürliche Surfactant wird von einigen Autoren (MORLEY, CN., et.al.: The Lancet 1 (1981), S. 64-68) wegen ungenügender und stark variierender Aktivität als unzureichend für einen therapeutischen Einsatz betrachtet. T. FUJIWARA entwickelte ein halbsynthetisches Surfactant, das aus einer Mischung von natürlich vorkommendem Surfactant aus Säugerlungen und synthetischen Phospholipiden besteht. An 10 frühreifen Neugeborenen mit HMD wurden gute Behandlungserfolge erzielt (FUJIWARA, T. et.al.: The Lancet 1 (1980), S.55-59).

Die Gewinnung von Lungen-Surfactant kann aus Lungenhomogenat (V. NEERGARD, K.: Verh. Dtsch. Ges. inn. Med. 41 (1929), S.249; CLEMENTS, J.A.: Proc. Soc. exp. Bio). (N. Y.) 95 (1957), S. 170), durch pervasale Ausspülung (BONDURANT, S.; D.A. MILLER, J.Appl. Physiol. 17 (1962), S. 167) oder broncheale Spülung (CLEMENTS, J.A.: Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 95 (1957), S. 170) erfolgen. Für eine therapeutische Nutzung des Wirkstoffs kommt nur die Isolierung aus stark zerkleinertem Lungengewebe in Betracht. Der dabei gewonnene Extrakt enthält allerdings nicht nur die Komponenten des oberflächenaktiven Systems, sondern auch in Abhängigkeit von den angewandten Extraktionsbedingungen, lösliche und emulgierbare Bestandteile der Lunge und des in der Lunge enthaltenen Blutes.

Eine Möglichkeit zur Gewinnung dieses oberflächenaktiven Materials zur Behandlung der HMD ist in der DE-OS 3021006 beschrieben. Durch Elektrolytlösung wird aus Saugerlunge ein rohes Material gewonnen, dem zur Erreichung eines Phospholipidgehaltes von 75-95,5% die erforderliche Menge Phospholipid zugesetzt wird. Der Proteingehalt beträgt 0,5-5,0%. Nach der Abtrennung von Zellbruchstücken bei 500-1 500 UPM wird das rohe Wirkstoffgemisch durch Zentrifugation bei 12000-16000UPM und 0-10⁰C als Sediment erhalten. Die weitere Aufarbeitung erfolgt durch mehrfache Wiederaufnahme der Lipide in Natriumchloridlösung und Abtrennung durch hochtourige Zentrifugation. Nach Dialyse, Extraktion mit Aceton und Aufnahme der Phospholipide in einem Chloroform-Methanol-Gemisch sowie Abdampfen des Lösungsmittels wird ein Wirkstoffgemisch erhalten, dem dann in Bezug auf den Phosphatgehalt im molaren Verhältnis 1:0,65:0,12 Dipalmityllecithin und Phosphatidylglycerol zugesetzt wird.

Auch andere in der Literatur beschriebene Verfahren (BROWN, E. S., et. al.: J. Appl. Physiol. 14(1959), S. 717; JOBE, A.: Biochem. Biophys. Acta 489 (1977), S.440-453; KING, R. J.; J.A.CLEMENTS: Am. J. Physiol. 223 (1972), S.707-714; BERGEN, P., et.al.: IRCS Med. Sei. 9(1981), S. 283-284) zur Gewinnung von natürlichen Surfactant basieren auf der Extraktion oder dem Spülen von Säugerlunge mit Elektrolytlösungen und der anschließenden Trennung durch mehrfache Zentrifugation bei unterschiedlichen g-Zahlen und Temperaturen, wobei die Abtrennung der Phospholipide die Anwendung hoher g-Zahlen und Dichtegradienten erfordert, was bei der Maßstabsvergrößerung hohe Aufwendungen mit sich bringt.

SCARPELLI, E.M., etai. (I. Appl. Physiol. 23 (1967), S.880-886) gewannen ein Roh-Surfactant durch Extraktion von Hunde-und Kaninchenlunge mittels isotonischer Natriumchlorid-Lösung und anschließende mehrstufige Zentrifugation. Für analytische Zwecke wurden die Bestandteile des Surfactant durch Gelfiltration über Sephadex G 200 getrennt. Auf Grund der unterschiedlichen Partikelgrößen und der oberflächenaktiven Eigenschaften führt die Gelfiltration zu hohen Materialverlusten und erscheint für präparative Zwecke nicht geeignet.

MORLEY, C. J., et. al. (The Lancet 1 (1981), S. 64-68) verabreichten Neugeborenen mit HMD ein synthetisches Lungensurfactant, bestehend aus einer Mischung von Dipalmityllecithin und Phosphatidylglycerol im Verhältnis 7:3, dessen Wirkung jedoch unzureichend ist.

Die Herstellung eines synthetischen, proteinfreien Surfactant, bestehend aus Dipalmitoyllecithin und Hexadekanol wird von Clements im US-Patent 4312860 beschrieben.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, aus Säugerlunge ein natürliches Surfactant mit hoher Wirksamkeit für die Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Veränderung des pulmonalen Surfactant-Systems einhergehen, insbesondere des Atemnotsyndroms bei Erwachsenen und Neugeborenen durch ein einfaches, in den technischen Maßstab umsetzbares Verfahren mit leicht zugänglichen Hilfsstoffen zu finden. Dieses neue Therapeutikum besitzt außerordentliche medizinische und humanitäre Bedeutung.

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Es bestand daher die Aufgabe, ein technisch einfaches, reproduzierbares Verfahren zu entwickeln, welches zu einem neuen, natürlichen Surfactant spezieller Zusammensetzung führt und zur Behandlung des Atemnotsyndroms geeignet ist. Ferner war eine für die medizinische Anwendung geeignete Zusammensetzung des Mittels anzugeben.

Es wurde überraschend gefunden, daß durch Bindung des aus Lunge extrahierten Surfactant an ein unlösliches Adsorbens, insbesondere Kieselgel oder aktivierte Silikate und anschließende Elution mit für Phospholipide geeigneten Lösungsmittel auf einfache Weise ein Surfactantpräparat gewonnen werden kann, daß eine hohe pharmakologische Wirksamkeit bei der Behandlung des Atemnotsyndroms aufweist.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Extraktion des Surfactant aus zerkleinerter Säugerlunge, vorzugsweise Rinder- oder Schweinelunge, durch Lösungen von Mono- oder Disacchariden, vorzugsweise durch isotonische Glukose- oder Saccharoselösung der — wie literaturbekannt — mittels Elektrolytlösung,z.B. isotonische Natriumchloridlösung.

Nach Abtrennung von Zeilbruchstücken durch Zentrifugation bei niedrigen g-Zahlen in bekannter Weise wird das Wirkstoffgemisch an Kieselgel oder aktiviertem Magnesiumsiiikat adsorbiert. Die reversible Bindung von wirksamen Surfactant an Kieselgel war nicht zu erwarten, da in der Literatur ausdrücklich darauf hingewiesen wird, daß die physikalischen und chemischen Eigenschaften dieses Vielkomponentengemisches eine irreversible Bindung an feste Chromatographiematerialien bewirken und somit eine Isolierung von biologisch aktiven Surfactant auf diese Weise nicht durchführbar ist (KING, R. J.:

Federation Proceedings 33 [1974], S.2238-2247). Nach Auswaschen von nicht adsorbiertem Material mittels destilliertem Wasser oder Aceton wird der aktive Wirkstoff durch ein Lösungsmittelgemisch, vorzugsweise nach FOLCH mit Chloroform/ Methanol vom Adsorptionsmittel abgelöst und durch Eindampfen im Vakuum oder durch Trocknen mittels Einleitung von Stickstoff gewonnen.

Erhalten wird ein natürliches Surfactant mit einem Phospholipidgehalt zwischen 20 und 75%, vorzugsweise 40-50%. Das Präparat zeichnet sich durch einen niedrigen Proteingehalt (< 0,5%) aus. Der niedrige Proteingehalt erscheint im Hinblick auf mögliche Nebenwirkungen von Surfactant-Präparaten bedeutsam, da durch den Extraktionsvorgang sowohl Serumproteine als auch organspezifische Proteine in den Extrakt gelangen, die antigene Eigenschaften bei Verabreichung am Menschen aufweisen können (BERGMANN, K.-CH.; LACHMANN, B.: Z. Erkr. Atm.137 [1972], S.55-60; MORLEY, CN., et.al.: The Lancet, 1 [1981], S. 64-68).

Aus dem erhaltenen natürlichen Surfactant mit einem Phospholipidgehalt zwischen 20 und 75% wird durch die im Folgenden beschriebenen Verfahren ein pharmazeutisches Mittel hergestellt.

Die Substanz wird nach Lösung in halogenierten Kohlenwasserstoffen über Glasfilter und Filterpapier vorgeklärt und anschließend über lösungsmittelstabile Membranen steril filtriert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der erhaltene Rückstand mit Wasser zur Injektion oder sterilen wäßrigen Lösung emulgiert, in Glasgefäße abgefüllt, tiefgefroren und lyophylisiert.

Als wäßrige Losungen können dabei isotone Natriumchlorid- oder Calciumchloridlösungen bzw. isotone Lösungen von Mono- und Disacchariden eingesetzt werden. Zum Homogenisieren eignet sich vorteilhaft ein Ultra-Turrax. Außerdem ist ein Zusatz von geeigneten Mitteln zur Verbesserung der Emulgierfähigkeit, Erhöhung der Stabilität und Pufferung zur Erhaltung bestimmter pH-Bereiche möglich.

Eine andere Möglichkeit, ein pharmazeutisches Mittel zu erhalten besteht darin, das erhaltene natürliche Surfactant — unter Umgehung der Sterilfiltration in organischen Lösungsmitteln — gleich in Wasser oder wäßrigen Lösungen zu emulgieren, wobei die oben aufgeführten Lösungen und Zusätze hier ebenfalls zutreffen, und die Emulsion zu autoklavieren. Nach Abkühlung kann falls nötig nochmals emulgiert werden. Anschließend wird die Emulsion in Glasgefäße abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der nachfolgenden Beispiele erläutert, ohne diese dadurch einzuschränken.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Von 4,5kg frischer Rinderlunge wurden größere Blutgefäße, Tracheateile und anhaftendes Fettgewebe entfernt und die Lunge dabei zerteilt. In einem Fleischwolf mit 4-mm-Lochscheibe erfolgte nach dem Waschen der Lungestücke, wobei diese vor allem von anhaftendem Blut befreit wurden, die Zerkleinerung des Lungegewebes. Der so erhaltene Lungebrei wurde in Portionen zu 500g mit je 2,01 Saccharoselösung (114g/l) 10min lang intensiv geschüttelt. Durch Filtrieren über ein Plastesieb und anschließendes Zentrifugieren des Fi It rats bei 500g und 20°C erhielt man 15,41 wäßrigen Extrakt.

7,01 dieses Extraktes wurden mit 420g Kieselgel für die Säulenchromatographie 60min bei 2O⁰C gerührt. Nach 16stündiger Standzeit bei 4°C wurde der klare Überstand abgehebert und verworfen. Das Kieselgel mit adsorbiertem Surfactant wusch man nach Absaugen des restlichen Überstandes mit 11 destilliertem Wasser auf einer G2-Fritte. Die Elution des Surfactants erfolgte mit 1,51 Chloroform/Methanol-Gemisch (2:1). Die Chloroformphase wurde abgetrennt und zur Trockne unter Stickstoff eingeengt. Im Ergebnis wurden 515mg Substanz erhalten.

Beispiel 2

8,4i des in Beispiel 1 beschriebenen wäßrigen Extrakts wurden mit 500g Florisil® 30min bei 20⁰C gerührt. Nach 16stündiger Standzeit bei 4°C wurde der klare Überstand abgehebert und verworfen. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Es konnten 600mg Substanz erhalten werden.

Beispiel 3

2,5kg Lungebrei, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde lyophilisiert und nach 3wöchiger Kühllagerung, wie ebenfalls im Beispiel 1 beschrieben, zu einem wäßrigen Extrakt aufgearbeitet. Dabei wurde das Lungenlyophilisat entsprechend seines ursprünglichen Frischgewichts eingesetzt. Als Extraktionsmittel diente in Abweichungen vom Beispiel 1 Glucose-Lösung

7,11 des wäßrigen Extraktes wurden mit 420g Kieselgel für die Säulenchromatographie 60 min bei 20⁰C gerührt. Nach Aufarbeitung des Adsorbats entsprechend der in Beispiel 1 dargestellten Variante konnten 310mg Substanz erhalten werden.

Beispiel 4

36,0kg frische Rinderlunge wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben, zu Lungebrei verarbeitet. Je 500g dieser zerkleinerten Lunge wurden jeweils mit 2,01 isotonischer Natriumchloridlösung 60 min bei 20⁰C intensiv gerührt. Nach Filtrieren über eine Dederongaze und anschließendes Zentrifugieren des Filtrats bei 500g und 20⁰C konnten 1201 wäßrigen Extrakts gewonnen werden.

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Jeweils 3Ol Extrakt wurden mit 2,5kg Florisil® 60 min bei 20°C gerührt. Nach dem Absitzen des Adsorptionsmittels wurde der Überstand (jeweils 26-281) abdekantiert und erneut mit 2,0kg Florisil⁶ 60min bei 20°C gerührt. Die einzelnen Florisiladsorbate wusch man mit je 5I destilliertem Wasser und eluierte mit je 6,41 Chloroform/Methanol-Gemisch (2:1).

Die Ghloroformphasen wurden vereinigt und nach Einengen unter Stickstoff konnten 12,2g Substanz gewonnen werden.

Beispiel 5

Aus 9,35kg frischer Rinderlunge wurden entsprechend des Beispiels 1 in 500g Portionen, die mit je 2,Ol isotonischer Natriumchloridlösung bei 20⁰C intensiv gerührt wurden, 31,71 wäßrigen Extrakts gewonnen. 23,01 dieses Extrakts wurden mit 1,5kg Florisil® 60min bei 20⁰C gerührt. Nach dem Abtrennen des Überstands wurde das Surfactant-beladene Florisil® in 2 gleiche Portionen geteilt. Die eine Hälfte wurde mit 41 Leitungswasser die andere mit 31 Aceton gewaschen. Jeder Teil wurde anschließend mit 21 Chloroform-Methanol-Gemisch (2:1)eluiert, die Chloroformphasen wurden abgetrennt und unter Stickstoff zur Trockne eingeengt. Das mit Wasser gewasche Adsorbat lieferte 1,0g, das mit Aceton gewaschene Adsorbat 0,62 g Substanz.

Beispiel 6

8,Ol des unter Beispiel 5 gewonnenen Extrakts wurden mit 1,2kg Kieselgel 60min bei 20⁰C gerührt. Nach Abtrennen des Überstands wurde das Surfactant-beladene Kieselgel mit 4I Leitungswasser gewaschen und mit 21 Dichlormethan-Methanol-Gemisch (2:1) eluiert. Die zur Trockne eingeengte Dichlormethanphase lieferte 422mg Substanz.

Beispiel 7

Aus9,0l wäßrigen Extrakt, der wie im Beispiel 5 beschrieben hergestellt worden war, konnten nach Ausrühren mit 2 kg Kieselgur, Waschen des Adsorbats mit 101 Leitungswasser und Elution des Surfactant-Materials durch öOminütiges Rühren in 2,81 Chloroform/Methanol-Gemisch (2:1) 600ml Chloroformphase erhalten werden. Diese wurde unter Stickstoff zur Trockne eingeengt und lieferte 1,3g Substanz.

Beispiel 8

Aus 3,01 wäßrigen Extrakt, der wie im Beispiel 5 beschrieben hergestellt worden war, konnten nach Ausrühren mit 0,68kg Kieselgel, das bereits im Beispiel 5 verwendet worden war und durch Behandlung mit 2 N NaOH regeneriert werden konnte.

Waschen des Adsorbats mit 2I Aceton und Elution des Surfactant-Materials durch 60minütiges Rühren in 1000ml Chloroform/ Methanol-Gemisch 960ml Chioroformphase erhalten werden. Diese wurde unter Vakuum zur Trockne eingeengt und lieferte 0,6g Substanz.

Beispiel 9

9,0kg Lungebrei, der wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, wurde in 18 Portionen zu 0,5kg mit je 2,01 isotonischer Kochsalzlösung durch lOminütiges kräftiges Schütteln extrahiert und die Lungerückstände über Plastesieb und Dederongaze abgetrennt. Die erhaltenen 341 Extrakt wurden auf eine mit 2,0kg Florisil® gefüllte Säule (Durchmesser 15cm, Füllhöhe 25cm) aufgetragen.

Anschließend wurde mit 10,01 destilliertem Wasser gewaschen und der Wirkstoff mit 7,51 Chloroform-Methanol-Gemisch (2:1) eluiert. Nach Absitzen über Nacht konnte die Methanolphase des Eluats abgesaugt werden. Die Chloroformphase wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt. 2,65g Surfactant konnten erhalten werden.

Beispiel 10

2,5g des erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoffes (38,2% Phospholipid) wurden in 25,0ml Chloroform (2. AB-DDR) gelöst, über Glasfaserfilterpapier (Schichtdicke 1,80mm) und Filtrierpapier vorfiltriert sowie anschließend über Glasfaservorfilter (Schichtdicke 450^m) auf Cellulose-Sterilfilter (0,2μπι Porendurchmesser, 90μσι Schichtdicke) sterilfiltriert. Nach Konzentration der sterilen Lösung am Vakuumrotationsverdampfer wurden durch Einleiten von sterHem Stickstoff bei gleichzeitiger Evakuierung des Gefäßes die Lösungsmittelreste ausgetrieben. Die so erhaltene Substanz wurde mit 20,0 ml sterilem Wasser mittels eines Ultra-Turrax emulgiert und die Emulsion so in 25ml Rollrandflaschen abgefüllt, daß 4 Flaschen 200mg Phospholipid und eine Restflasche nur 160 mg Phospholipid enthielten. Nach Einfrieren bei -50⁰C für 3 Tage wurden die Proben lyophilisiert, dabei wurde die Gegenheizung auf maximal 20⁰C eingestellt. Nach der Gefriertrocknung wurden die Flaschen mit Durchstechstopfen B 180 und Alu-Capsolut-Verschluß verschlossen.

Beispiel 11

1,5g des erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoffes (40,0% Phopholipid) wurden mit 15,0ml destilliertem Wasser mittels eines Ultra-Turrax emulgiert und in einem Erlenmeyerkolben mit Außenschliff-Stopfen 15min autoklaviert. Nach Abkühlen der Emulsion wurde diese zur Verbesserung der Qualität nochmals 2 min unter sterilen Bedingungen mittels eines Ultra-Turrax emulgiert und die Emulsion so in 25ml Rollrandflaschen abgefüllt, daß 3 Flaschen 200mg Phospholipid enthielten. Nach Einfrieren bei -25°C für 4 Tage wurden die Proben lyophilisiert, dabei wurde die Gegenheizung auf maximal 20⁰C eingestellt.

Nach der Gefriertrocknung wurden die Flaschen mit Durchstechstopfen B 180 und Alu-Capsolut-Verschluß verschlossen.

Zur Bestimmung des Phospholipidgehaltes, der Proteinkonzentration, des Cholesterol- und Neutrallipidgehaltes wurden folgende analytische Verfahren angewendet.

Der Phospholipidgehalt wurde nach einer von BARTLETT (N.ZÖLLNER und D. EBERHAGEN: „Untersuchung und Bestimmung der Lipide im Blut"; Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1965) veröffentlichten Methode (s = ± 2%) bestimmt. Als Vergleichssubstanz diente Kaliumhydrogenphorphot. Ler Gehalt an Cholesterol wurde mit einer kolorimetrischen Methode bestimmt, wobei neben dem Cholesterol auch der Cholesterolester erfaßt wird (s = ± 4%). Die Neutrallipide ließen sich mit derTriglycerid-Bestimmungsmethode des 2.ArzneibuchesderDDR, Methode 1 A.1.1. erfassen. Der Proteingehalt wurde nach einer von HESSE und LINDNER (Zeitschrift für AIIg. Mikrobiologie 11 [19711, S. 585-594; ebenda 15 [1975], S. 559-561) beschriebenen Methode bestimmt, die sich besonders gut zur Ermittlung von Proteinkonzentrationen in wäßrigen Emulsionen eignet (s = 3%). Für das entsprechend den erfindungsgemäßen Beispielen gewonnene Surfactant wurde nach der o. g. Methodik folgende Zusammensetzung ermittelt:

Tabelle 1

Zusammensetzung	20-75%
Phospholipid	10—40 %
Cholesterol	5-30%
Neutrallipide	0,2-0,5%
Protein	0,5-5%
Wasser

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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Präparate zeigten bei der in vivo-Testung an Tiermodellen eine hohe Wirksamkeit, ohne daß weitere Zusätze notwendig waren. Der Nachweis erfolgte an 2 international anerkannten Modellen.

1. Einfluß von Surfactant beim Erwachsenen-Atemnotsyndrom (Fig. 1, Tabelle 2)

Der Einfluß einer Surfactant-Instillation beim Erwachsenen-Atemnotsyndrom wurde an Meerschweinchen untersucht. Vor Erzeugung der akuten respiratorischen Inzuffizienz wurden die Tiere nach allgemeiner Anaesthesie tracheotomiert, ein Katheter zur Blutentnahme in die A.carotis eingeführt und durckkonstant mit reinem Sauerstoff beatmet. Das akute Atemnotsyndrom wurde bei den Tieren durch 8malige bronchiale Auswaschung des Surfactant mit warmer physiologischer Kochsalzlösung erreicht. Die Spülvolumina entsprachen der Vitaikapazität der Tiere. Am Ende der Spülprozedur lag die arterielle Sauerstoffspannung bei diesen Tieren, trotz Beatmung mit Spitzendrucken von +30cm H₂O, Positive-Endexpiratory-Pressure (PEEP) von 8cm H₂O und reinem Sauerstoff, unter 60mm Hg. 10 und 40 Minuten nach der letzten Lungenspülung erhielt die Hälfte der Tiere je 1 ml Surfactant tracheal instilliert. Die Blutgasanalysen erfolgten 5, 15 und 30 Minuten nach der jeweiligen Surfactant-Gabe. Ein optimales Surfactant führt unter absolut gleichen Beatmungsbedingungen zu einer unmittelbaren Erhöhung der arteriellen Sauerstoffspannung um durchschnittlich 200mm Hg.

2. Einfluß von Surfactant in unreifen Lungen (Fig.2, Tabelle 3)

Zur Testung des Einflusses von Surfactant auf unreife Lungen wurden unreife Kaninchenneugeborene durch Hysterotomie am

27. Schwangerschaftstag geboren (Gesamtschwangerschaftsdauer: 31 ± 1 Tag). Die Tiere wurden unmittelbar nach der Geburt tracheotomiert und ein Teil erhielt über die Trachealkanüle durchschnittlich 60μ\ Surfactant in die Trachea instilliert; unbehandelte Schwestertiere des gleichen Wurfes dienten als Kontrollen. Anschließend wurden die Tiere in einem druckkonstanten Ganzkörperplethysmographen (38⁰C) plaziert und mit reinem Sauerstoff bei kontinuierlicher Registrierung von Beatmungsdruck und Atemvolumen beatmet. Von den Primärdaten erfolgte die Berechnung derThorax-Lungen-Compliance. Bei einigen Versuchen wurden alle Tiere nach der Geburt für 10—15 Minuten beatmet, und erst dann erhielt ein Teil der Tiere Surfactant über die Trachea instilliert.

In beiden tierexperimentellen Modellen konnten mit den getesteten Surfactant-Präparaten gute bis ausgezeichnete Ergebnisse erzielt werden.

Untersuchungen zur Verträglichkeit zeigen, daß bei Konzentrationen von 4mg/0,5ml/20g Maus und 8mg/10ml/20g Maus,

i. p. appliziert, in einem Beobachtungszeitraum von 7 Tagen alle Tiere ohne Befund sind.

Bei der Bestimmung der mikrobiellen Reinheit lassen sich im nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Präparat keine Mikroorganismen nachweisen.

Die Anwendung des erfindungsgemäß hergestellten Surfactant»Präparates erfolgt durch tracheale Instillation oder Tröpfcheninhalation mittels Verneblers bei allen akuten oder chronischen Lungenerkrankungen, die mit einem Surfactantmangel einhergehen. Die Therapie mit dem Surfactant-Präparat ist deshalb angezeigt beim Atemnotsyndrom der Erwachsenen, hervorgerufen durch

— Trauma (Schocklunge)

— Viruspneumonie

— Herzinfarkt

— akutes Nierenversagen

— Gasvergiftungen

— Verbrennungen

— Uberinfusion („Überwässerung")

— Arzneimittelvergiftungen

— Lungenkontusion

— Fettembolien

— Sepsis

— Aspirationspneumonie

— Künstliche Beatmung

— Sauerstoffvergiftung

— Bestrahlung

— Post-Perfusions-Lunge

und alle weiteren inneren und äußeren Noxen, die zu einem Lungenödem führen sowie bei Atemwegserkrankungen mit gestörtem bronchialem Surfactant, wie z. B. bei allen chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen (Asthma, chronisches Bronchitis etc.). Außerdem kann das Surfactant-Präparat sowohl zur Verbesserung des nichtciliaren Mucustransports als auch zur Unterstützung der lokalen Infektabwehr viraler und bakterieller Infektionen appliziert werden (Makrophagenstimulierung).

Es ist selbstverständlich, daß ein beim Erwachsenen Atemnotsyndrom einsetzbares Präparat auch beim Neugeborenen-Atemnotsyndrom als kausales Therapeutikum anwendbar ist.

Die Verabreichung des Surfactant-Präparates erfolgt, bezogen auf den Phospholipidgehalt in Dosen von 1-500mg/ml, wobei für die Behandlung eines Erwachsenen 0,5g bis 20g, vorzugsweise 10 bis 15g, für die Behandlung eines Neugeborenen 0,1 bis 5,0g, vorzugsweise 0,2 g, Phospholipid benötigt werden.

Durch das erfindungsgemäiie präparat wird die Oberflächenspannung einer wäßrigen Phase verändert.

Methodik:

Die Messung der Oberflächenspannung und die Aufnahme der Hysteresekurven erfolgte gemäß des bekannten Verfahrens mittels einer WILHELMY-Waage (Typ ATF 01, Hersteller: Fa.E.Biegler, Mauersbauch, Osterreich).

Substanzeinsatz: 5μΙ (60 mg Phosphalipid/ml)

Ergebnis: Fig. 3, Substanz vom Beispiel 4

Ordinate: Oberflächenspannung

Abszisse: relative Oberfläche

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Tabelle 2

Arterielle Sauerstoffspannung (mm Hg) beim experimentellen Atemnotsyndrom durch Lungenspülung vor und nach Surfactant-Instillation Meerschweinchen PaO₂

Ausgangswerte 30 min nach 30 min nach

vor Lungen- nach Lungen- 1. Instillation 2. Instillation n

spülung spülung

Beispiel 1	nicht bestimmt	55 ±3	280 ± 33	305 ± 41	5
Beispiel 2	375 ±7	42 ±11	238 ± 96	340 ± 54	4
Beispiel 3	355 ±14	51 ±6	272 ± 52	315 ±62	4
Beispiel 4	335 ±8
Beispiel 5		46 ±2	225 ± 81	300 ± 61	6
Wasser gewaschen	315 + 6
Aceton gewaschen	nicht bestimmt	38 ±14	218 ±35	295 ± 38	3
Beispiel 6	320 ± 11	49 + 8	284 ±25	355 ± 46	5
Beispiel 7	370+15	60±17	252 ± 62	320 + 48	4
Beispiele	350 ±12
Beispiele	nicht bestimmt	61+15	90 ±51	113 ±87	23
Kontrollen	330 + 65
Tabelle 3			Compliance (ml/cm H2O ·	kg"1) bei einem Beatmungsdruck von
	Phospholipid-		+ 25 cm H2O	30 Minuten nach Geburt	η
	gehalt(%)

Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Beispiel 4 Beispiel 5

Wasser gewaschen Aceton gewaschen

Beispiele Beispiel 7 Beispiel 8 Beispiel 9

Kontrolltiere

23,0 40,0 21,5 25,0

34,2 40,1 21,2 40,0 50,0 38,2

1,006 1,605 1,199 1,531

1,273

1,138

1,012

1,189

nicht bestimmt

1,261

0,082

±0,727 ±0,508 ±0,24 xO,018

±0,33 ±0,23 ±0,023 ±0,41

±0,46 ±0,056

Claims (5)

1. -1- 257 641 6

   Erfindungsansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Veränderung im pulmonalen Surfactant-System einhergehen durch isotonische wässrige Extraktion zerkleinerter Lungen von Säugetieren und Abtrennung der Zellbruchstücke durch Zentrifugieren bei niedrigen g-Zahlen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt mit einem unlöslichen Adsorbens in Kontakt bringt, die nicht adsorbierten Materialien auswäscht, den Wirkstoff mit organischen Lösungsmitteln oder Gemischen davon ablöst, das organische Lösungsmittel entfernt und den erhaltenen Wirkstoff in eine zur Applikation geeignete pharmazeutische Form bringt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ablösung des Wirkstoffes von dem Adsorbens ein Lösungsmittelgemisch bestehend aus Methylenchlorid oder Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1 verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion der zerkleinerten Lunge mit isotonischer Glukoseoder Saccharoselösung erfolgt.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Adsorbens auf Kieselsäurebasis, bevorzugt aktiviertes Kicselgel oder Magnesiumsilikat einsetzt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß der isotonisch-wässrige Extrakt wiederholt mit frischem Absorbens in Kontakt gebracht wird.

   Hierzu 3 Seiten Zeichnungen