DD231189A3

DD231189A3 - Mittel zur behandlung von erkrankungen, die mit veraenderungen im lungensurfactant verbunden sind, sowie verfahren zur herstellung desselben

Info

Publication number: DD231189A3
Application number: DD26898184A
Authority: DD
Inventors: Burkhardt Lachmann; Wilfried Rattke; Regina Draheim; Peter Boyde; Heinrich Poetter; Rolf Illhardt
Original assignee: Dresden Arzneimittel
Priority date: 1984-11-01
Filing date: 1984-11-01
Publication date: 1985-12-24

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Veraenderunen im pulmonalen Surfactant-System einhergehen. Die Gewinnung erfolgt durch Ausruehren von zerkleinerter Lunge bzw. eines waessrigen Lungenextraktes mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lipidloesungsmittel. Nach Abtrennung der ungeloesten Bestandteile wird das Loesungsmittel abgedampft und der loesungsmittelfreie Wirkstoff erfindungsgemaess mit Alkohol ausgeruehrt, die alkoholunloeslichen Bestandteile abgetrennt und der Alkohol entfernt. Der loesungsmittelfreie, gereinigte Wirkstoff wird in waessriger Phase emulgiert und lyophilisiert. Das Mittel kann in Form von Aerosol oder als Bolus ueber die Atemwege in einer Dosis von 1-500 mg/ml physiologischer Traegerfluessigkeit appliziert werden. Es kann bei allen Atemwegserkrankungen, die mit einer Stoerung des Surfactant-Systems verbunden sind, angewendet werden. Das Verfahren fuehrt zu einem Mittel mit den Hauptinhaltsstoffen 40-75% Phospholipid. 10-40% Cholesterol und 5-30% Neutrallipide. Der Proteingehalt betraegt weniger als 1,5%.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Surfactant aus der Lunge von Säugetieren. Der von Alveolarzellen des Typs Il gebildete Wirkstoff kann zur kausalen Therapie des durch Surfactantmangel bedingten Atemnotsyndroms bei Neugeborenen und Erwachsenen angewendet werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits vorgeschlagen worden, ein wirksames Surfactant-Substitutions-Präparat dadurch herzustellen, daß man zerkleinerte Lunge oder einen wäßrigen Lungenextrakt ausrührt und den erhaltenen Extrakt zur Trockne einengt. Das so erhaltene Präparat enthält neben den Phospholipiden als Hauptkomponente auch Neutraliipide, Cholesterol, freie Fettsäuren und geringe Mengen (um 1 %) Protein. Das Präparat zeigt jedoch im Tierexperiment bei der intratrachealen Instillation in einigen Fällen Unverträglichkeitsreaktionen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein natürliches Surfactant aus Säugerlunge mit hoher Wirksamkeit und ausnahmslos guter Verträglichkeit bei intratrachealer Applikation für die Behandlung des Atemnotsyndroms bei Erwachsenen und Neugeborenen bereitzustellen und dafür ein einfaches, in den technischen Maßstab umsetzbares Verfahren mit leicht zugänglichen Hilfsstoffen anzugeben.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß das in vorgeschlagener Weise durch Überführung des komplexen Wirkstoffgemisches aus einer wäßrigen Phase zerkleinerter Lunge bzw. aus einem wäßrigen Extrakt zerkleinerter Lunge, in eine einheitliche Lösungsmittelphase, die mit Wasser nicht mischbar ist, gewonnene Surfactant einer anschließenden Alkoholextraktion unterworfen wird.

Aus der alkoholischen Phase kann ein biologisch gut wirksames und bei intratrachealer Applikation ausnahmslos gut verträgliches Surfactant gewonnen werden. Dazu wird Surfactant-Substanz, die entsprechend dem vorgeschlagenen Verfahren gewonnen wurde, in einem Temperaturbereich, der zwischen -10⁰C und +60⁰C liegen kann, mit einem hochtourigen Rührwerk so ausgerührt, daß auf 1 g dieser Substanz 1 bis 20 ml, vorzugsweise 3 ml, Alkohol kommen. Als Lösungsmittel sind Methanol oder Ethanol verwendbar. Die alkoholische Phase wird über Filter oder durch Zentrifugation und das Lösungsmittel ausgetrieben.

Die so erhaltene trockene Substanz zeigt folgende Zusammensetzung:

Tabelle 1	45-65%
Phospholipide	10-25%
Neutraliipide	10-25%
Cholesterol	0,5-1,5%
Protein	2-5%
freie Fettsäuren

Die Phospholipide liegen dabei in folgenden Verhältnis vor:

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Tabelle 2

Phosphatidylcholin 50-60%

Phosphatidylglycerol 2-3%

Phosphatidylethanolamin 10-20%

Phosphatidylserin 1—2%

Sphingomyelin 10-25%

Phosphatidylinosit 0,5-1 %

Folgende analytische Methoden wurden zur Ermittlung der analytischen Ergebnisse verwandt:

Der Phospholipjdgehalt wurde nach einer von BARTLETT (N. ZÖLLNER und D. EBERHAGEN: „ Untersuchung und Bestimmung der Lipide im Blut"; Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1965) veröffentlichten Methode (s = ±2%) bestimmt. Als Vergleichssubstanz diente Kaliumhydrogenphosphat. Der Gehalt an Cholesterol wurde mit einer kolorimetrischen Methode bestimmt wobei neben dem Cholesterol auch der Cholesterolester erfaßt wird (s = ±4%). Die Neutrallipide ließen sich mit der Triglycerid-Bestimmungsmethode des 2. Arzneibuches der DDR, Methode 1A. 1.1. erfassen. Der Proteingehalt wurde nach einem von HESSE und LINDNER (Zeitschrift für AIIg. Mikrobiologie 11 [1971], S.585-594; ebenda 15 [1975], S. 559-561) beschriebenen Verfahren bestimmt, das sich besonders gut zur Ermittlung von Proteinkonzentrationen in wäßrigen Emulsionen eignet (s = 3%). Die Bestimmung der einzelnen Phospholipide wurde nach dünnschichtchromatographischer Trennung entsprechend P.GENTER und Mitarbeiter (J. of Chromatography 206 [1981], S.200-204) kolorimetrisch (siehe N.ZÖLLNER und

D. EBERHAGEN: „Untersuchung und Bestimmung der Lipide im Blut"; Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1965) durchgeführt (s = ±3% für die Hautkomponenten). Als Vergleichssubstanz diente Kaliumhydrogenphosphat. Der Elutionsverlust der Phospholipide liegt innerhalb der Streuung. Die Ermittlung des Gehalts an freien Fettsäuren erfolgt nach dünnschichtchromatographischer Trennung und Elution im Gaschromatographen (s = ±10%).

Durch das erfindungsgemäße Präparat wird die Oberflächenspannung einer wäßrigen Phase verändert. Die Messung der Oberflächenspannung und die Aufnahme der Hysteresekurven erfolgte mittels einer WILHELMY-WaageTyp ATF 01 (Hersteller:

Fa. E. Biegler, 301 Mauerbach, Österreich) nach bekanntem Verfahren.

Substanzeinsatz: 5μΙ 60 mg Phosphoiipid/ml

Ergebnis Fig. 1: Substanz vom Beispiel 5

Fig. 2: Substanz vom Beispiel 6 (Phospholipidfraktion)

Fig.3: Substanz vom Beispiel 6 (Surfactant) Ordinate: Oberflächenspannung Abszisse: relative Oberfläche:

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Präparate zeigten bei der in vivo-Testung an Tiermodellen eine hohe Wirksamkeit und waren bei intratrachealer Instillation ausnahmslos gut verträglich. Die Nachweise erfolgten an folgenden Tiermodellen:

1. Einfluß von Surfactant beim Erwachsenen-Atemnotsyndrom (vgl. Tab. 6):

Der Einfluß einer Surfactant-Instillation beim Erwachsenen-Atemnotsyndrom wurde an Meerschweinchen untersucht. Vor Erzeugung der akuten respiratorischen Insuffizienz wurden die Tiere nach allgemeiner Anaesthesie tracheotomiert, ein Katheder zur Blutentnahme in die A.carotis eingeführt und druckkonstant mit reinem Sauerstoff beatmet Das akute Atemnotsyndrom wurde bei den Tieren durch 8malige bronchiale Auswaschung des Surfactant mit warmer physiologischer Kochsalzlösung erreicht. Die Spülvolumina entsprachen der Vitalkapazität der Tiere. Am Ende der Spülprozedur lag die arterielle Sauerstoffspannung bei diesen Tieren, trotz Beatmung mit Spritzendrucken von +30cm H₂O, Positive-Endexpiratory-Pressure (PEEP) von 8cm H₂O und reinem Sauerstoff, unter 60mm Hg. 10 und 40 Minuten nach der letzten Lungenspüiung erhielt die Hälfte der Tiere je 1 ml Surfactant tracheal instilliert Die Blutgasanalysen erfolgten 5,15 und 30 Minuten nach der jeweiligen Surfactant-Gabe. Ein optimales Surfactant führt unter absolut gleichen Beatmungsbedingungen zu einer unmittelbaren Erhöhung der arteriellen Sauerstoffspannung um durchschnittlich 200mm Hg.

2. Einfluß von Surfactant auf unreife Lungen (vgl. Tab. 6):

Zur Testung des Einflusses vom Surfactant auf unreife Lungen wurden unreife Kaninchenneugeborene durch Hysterotomie am 27. Schwangerschaftstag geboren (Gesamtschwangerschaftsdauer: 31 ± 1Tag). Die Tiere wurden unmittelbar nach der Geburt tracheotomiert und ein Teil erhielt über die Trachealkanüle durchschnittlich 60 μΙ Surfactant in die Trachea instilliert; unbehandelte Schwestertiere des gleichen Wurfes dienten als Kontrollen. Anschließend wurden die Tiere in einem durckkonstanten Ganzkörperplethysmographen (38°C) piaziert und mit reinem Sauerstoff bei kontinuierlicher Registrierung von Beatmungsdruck und Atemvolumen beatmet. Von den Primärdaten erfolgte die Berechnung der Thorax-Lungen-Compliance. Bei einigen Versuchen wurden alle Tiere nach der Geburt für 10-15 Minuten beatmet, und erst dann erhielt ein Teil der Tiere Surfactant über die Trachea instilliert.

3. Prüfung auf Veträglichkeit nach trachealer Instillation an juvenilen Ratten (vgl. Tab. 6):

Die Prüfung auf Verträglichkeit an juvenilen Ratten erfolgt im Konzentrationsbereich der therapeutischen Dosis (200 mg Phospholipid/kg Körpergewicht) bis zur dreifachen therapeutischen Dosis. Pro Ratte (ca. 50g Körpergewicht) werden 10-30 mg Phospholipid eingesetzt. Es werden sowohl weibliche als auch männliche Tiere zur Verträglichkeitstestung verwendet, wobei bei einem Versuch (n = 10) nur Ratten gleichen Geschlechts ausgewählt werden. Methodik:

10 ca. 50 g schwere Ratten (männlich oder weiblich) werden mit Ether narkotisiert, anschließend erfolgen Halsschnitt sowie dumpfe Präparationen der Trachea. Nach der Präparation wird die Ethernarkose vertieft und zwar so, daß die Tiere weiterhin gleichmäßig durchatmen. Mit einer gebogenen 20iger Kanüle werden jeweils 10-30mg Phosphalipid/0,3ml physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Nach erfolgter Injektion wird der Schnitt vernäht. Der Beobachtungszeitraum beträgt zwei Wochen, wobei nach 72 Stunden der Endbefund festgestellt wird.

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Pro Testserie (50-60 Tiere) werden fünf Kontrolltiere mitgeführt, denen jeweils 0,3ml physiologische Kochsalzlösung injiziert werden. Des weiteren ist es möglich, nach Lösen der getrockneten erfindungsgemäßen Substanz oben angeführter Zusammensetzung in einem Lipidlösungsmittel, vorzugsweise Chloroform, wobei 0,1 bis 1,0g Substanz pro ml Lipidlösungsmittel gelöst werden, eine Acetonfällung der Phospholipidfraktion vorzunehmen. Die Fällung wird bei -20⁰C bis +20°C, vorzugsweise bei+5°C durchgeführt. Das Volumenverhältnis chloroformige Wi rkstofflösung zu Aceton liegt zwischen 1:1 und 1:8, vorzugsweise bei 1:4. Nach Abtrennung der Mutterlauge durch Filtration oder Zentrifugation und Waschen der festen Phase mit Aceton, das vorzugsweise auf - 10⁰C bis -20⁰C temperiert werden sollte, wird die Phospholipidf raktion getrocknet. Die so erhaltene nahezu weiße Substanz, die zu 70 bis 90% aus Phospholipiden besteht und keine biologische Aktivität in o. a. Modellen zeigt, kann dem durch Alkoholextraktion gewonnenen Surfactant zugesetzt werden. Dadurch erfolgt eine weitere Verbesserung der Stabilität und Emulgierbarkeit der Präparation.

Das so erhaltene getrocknete Gemisch zeigt folgende Zusammensetzung (Methodik entspricht dem bereits dargestellten Verfahren):

Tabelle 3	60-75%	60-70%
Phospholipide	5-15%	2-4%
Neutrallipide	10-20%	5-10%
Cholesterol	0,5-1,5%
Protein	2-5%	1-3%
freie Fettsäuren	Die Phospholipide liegen dabei im folge	10-20%
	Tabelle 4	2-3%
Phosphatidylcholin
Phosphatidylglycerol
Phosphatidyl-
ethanolamin
Phosphatidylserin
Sphingomyelin
Phosphatidylinosit

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Präparate zeigten bei der in vivo-Testung an den bereits dargestellten Tiermodellen eine hohe Wirksamkeit (vgl. Tab. 5 und Tab. 6) und waren bei intratrachealer Instillation ausnahmslos gut verträglich (vgl. Tab. 6).

Es wurde weiterhin gefunden, daß die alkoholische Extraktion der Surfactant-Substanz mehrfach erfolgen kann, dazu wird der in Alkohol unlösliche Rückstand erneut unter den für die Extraktion angeführten Bedingungen mit Ethanol oder Methanol ausgerührt. Mit dem nun zurückbleibenden unlöslichen Material kann eine dritte Ausrührung analog zur ersten und zweiten durchgeführt werden. Das erhaltene Material hat im wesentlichen die Zusammensetzung des ersten Extraktes, jedoch nimmt der Phospholipidgehalt nach der 3. Extraktion drastisch ab, während der Cholesterolgehalt in der Folge der Extraktionsschritte ständig ansteigt. Mit der 2. und 3. Extraktion läßt sich jedoch noch gut wirksames und bei der intratrachealen Instillation ausnahmslos verträgliches Material herstellen.

Auch die Acetonfällung der Phospholipidfraktion ist in analoger Weise durchführbar und führt ebenfalls zu Ergebnissen, die mit den bereits berichteten übereinstimmen.

Herstellung des pharmazeutischen Mittels

Aus dem erhaltenen natürlichen Surfactant wird durch die im Folgenden beschriebenen Verfahren ein pharmazeutisches Mittel hergestellt.

Die Substanz wird nach Lösung in halogenierten Kohlenwasserstoffen oder geeigneten Alkoholen über Glasfilter und Filterpapier vorgeklärt und anschließend über lösungsmittelstabile Membranen sterilfiltriert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels unter Vakuum wird der erhaltene Rückstand mit Wasser zur Injektion oder sterilen wäßrigen Lösungen emulgiert, in Glasgefäße abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert. Eine andere Möglichkeit, ein pharmazeutisches Mittel zu erhalten besteht darin, das erhaltene natürliche Surfactant—unter Umgehung der Sterilfiltration in organischen Lösungsmitteln — gleich in Wasser oder wäßrigen Lösungen zu emulgieren, wobei die oben aufgeführten Lösungen und Zusätze hier ebenfalls zutreffen, und die Emulsion zu autoklavieren. Nach Abkühlung kann, falls nötig, nochmals emulgiert werden. Anschließend wird die Emulsion in Glasgefäße abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.

Tabelle 5 Chemische Zusammensetzung (in %)	Phospholi-	PC	PE	PG	Sph	PS	Pl	Protein	Neutral	Chol	freie Fett
	pidgesamtge-								lipide	esterol	säuren
	haltdc	41,2	8,1	0,7	7,5	0,2	0,8	0,6	17,3	14,2	2,4
	62,4	36,5	7,7	0,8	8,6	0,4	0,4	1,6	17,6	16,9	3,1
Beispiel 1	56,1	34,6	7,9	1.5	6,1	1,2	0,5	0,8	13,3	14,6	2,4
Beispiel 2	55,6	39,4	9,5	1,0	5,7	0,2	0,6	n.b.	10,8	15,1	2,3
Beispiel 3	58,5	38,3	7,5	0,0	8,9	0,8	0,5	1,5	15,9	16,0	3,3
Beispiel 4	59,8	48,4	9,7	0,0	12,5	0,7	0,5	1,5	2,2	9,1	2,5
Beispiel 5	74,7	40,5	8,7	0,0	9,9	0,4	0,3	1,3	8,1	12,4	2,8
Beispiel 6*	64,4	34,0	3,6	0,9	11,3	3,8	1,3	n.b.	4,2	15,5	4,6
Beispiel 6	67,0	37,5	8,9	1,1	7,3	1,7	0,5	0,9	12,5	16,7	2,7
Beispiel 7	60,2	30,1	11,3	1,0	7,5	0,6	0,4	n.b.	17,0	23,8	n.b.
Beispiel 8	53,4	22,9	15,0	1,2	6,0	1,8	0,5	n.b.	20,3	22,1	n.b.
Beispiel 9	48,6	43,7	15,5	1,3	12,9	1,5	0,5	1,2	3,3	10,4	n.b.
Beispiel 10	77,6
Beispiel 11

Phospholipidfraktion

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Tabelle 6 Biologische Wirksamkeit und Verträglichkeit

Verträglichkeit Compliance (ml/cm H₂O kg'¹) Arterielle Sauerstoffspannung (mm Hg) beim

Beatmungsdruck: 25 cm H₂O experimentellen Atemnotsyndrom durch Lungen-30 min nach Surfactant-Instillation spülung vor und nach Surfactant-Installation η vor Installation 30 min nach η

2. Instillation

Beispiel 1	1,0	1,4 ±0,3	5	53±4	365 ±44	5
Beispiel 2	1,0	1,2 ±0,4	6	65±6	223 ± 31	4
Beispiel 3	0,9	1,6 ±0,4	7	61 ±8	306 ± 28	5
Beispiel 4	1,0	1,6 ±0,3	6	nicht bestimmt
Beispiel 5	1,0	1,1 ±0,4	4	48±5	254 ±73	6
Beispiele*	1,0	0,2 ±0,1	5	54±8	125 ±38	4
Beispiel 6	1,0	1,4 ±0,3	7	52±4	283 ±51	4
Beispiel 7	0,9	1,3 ± 0,2	6	56 ±10	311 ±61	5
Beispiele	1,0	1,8 ±0,4	6	46±6	243 ±45	5
Beispiel 9	1,0	1,6 ±0,4	7	71 ±15	286 ±38	4
Beispiel 10	1,0	1,3 ±0,6	5	nicht bestimmt
Beispiel 11 *	1,0	0,3 ±0,1	4	nicht bestimmt
Kontrolltiere	1,0	0,07 ± 0,04	62	49±5	98 ±74	28

Auswertung der Verträglichkeit:

Die Verträglichkeit ist der Quotient aus Anzahl der überlebenden Tiere pro Gesamttierzahl (n = 10), d. h. 1,0 bedeutet ein Überleben aller 10 Tiere. Die Substanz wird als verträglich bezeichnet, wenn mindestens 9 Tiere überleben.

Beispiel 1

Frische Rinderlunge wurde von Fettgewebe, größeren Tracheateilen sowie anhaftendem Blut befreit und dabei zerteilt. Anschließend erfolgt eine Zerkleinerung der Lungenstücke in einem Fleischwolf mit 4-mm-Lochscheibe, und die so gewonnenen 65,0 kg Lungebrei wurden in 5 Portionen a 13,0 kg mit je 15,61 Chloroform 30min bei Raumtemperatur ausgerührt. Nach dem Abfiltrieren der Lunge erhielt man zwischen 10,5 und 11,51 Chloroformextrakt. Die 5 Extrakte wurden vereinigt, im Rotationsumlaufverdampfer konzentriert und unter Stickstoff zur Trockne eingeengt. Es wurden 254g Rohrsurfactant erhalten. 55g davon wurden mit 105 ml Ethanol 96%, bei Raumtemperatur mittels eines Ultra-Turrax 5 min ausgerührt. Die Temperatur stieg dabei auf 62⁰C an. Der unlösliche Rückstand wurde abfiltriert und der klare Ethanolextrakt am Rotationsumlaufverdampfer konzentriert, und unter Stickstoff das Lösungsmittel völlig ausgetrieben. Es konnten 11,9g Reinsurfactant erhalten werden.

Beispiel 2

55g des unter Beispiel 1 beschriebenen Rohrsurfactants wurden mit 165ml Ethanol 96% unter Kühlung mittels eines Ultra-Turrax 15min ausgerührt. Die Temperatur lag zwischen 6 und 30°C. Nach Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 konnten 13,9g Reinsurfactant erhalten werden.

Beispiel 3

Aus 12,0 kg Lungebrei, der entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurde, konnten nach 30 min Ausrühren mit 15,01 Chloroform bei Raumtemperatur 10,21 Extrakt gewonnen werden. Nach Abtreiben des Lösungsmittels blieben 50,24g Rohrsurfactant zurück. 20g dieses Rohrsurfactants wurden mit 80ml Ethanol für 5min bei -10⁰C ausgerührt. Es wurden nach Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 3,89g Reinsurfactant erhalten.

Beispiel 4

Aus 16,0 kg Lungebrei, der entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurde, konnten nach 30 min Anrühren mit 18,21 Chloroform bei Raumtemperatur 141 Extrakt gewonnen werden. Nach Abtreiben des Lösungsmittels blieben 63,1 g Rohrsurfactant zurück. 26g dieses Rohrsurfactants wurden mit 80 ml Ethanol für 5 min bei 15 bis 20⁰C ausgerührt. Es wurden nach Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 8,45g Rohrsurfactant erhalten.

Beispiel 5

Aus 125,0 kg Lungebrei, der entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurde, konnten nach portionsweisem Anrühren mit insgesamt 1501 Chloroform bei Raumtemperatur für jeweils 30min 102,61 Extrakt gewonnen werden. Nach Abtreiben des Lösungsmittels blieben 520g Rohrsurfactant zurück.

500g dieses Rohrsurfactants wurden mit 1500ml Ethanol für 15min bei 10 bis 20⁰C ausgerührt. Der erhaltene Extrakt wurde entsprechend Beispiel 1 aufgearbeitet. Es wurden 198g Reinsurfactant erhalten.

Beispiel 6

Aus 150g Reinsurfactant vom Beispiel 5 wurde nach Auflösen in 320ml Chloroform und Abkühlen auf O⁰C durch Zusatz von 960ml tiefgekühltem Aceton (-20°C) eine Phospholipidfraktion ausgefällt. Die Fällung wurde nach 3h Standzeit abfiltriert und getrocknet. Es wurden 97,0g Phospholipidfraktion erhalten.

12g dieser Phospholipidfraktion und 12g Reinsurfactant des Beispiels 5 wurden gemeinsam emulgiert und entsprechend Beispiel 12 zu einem pharmazeutischen Mittel verarbeitet.

Beispiel 7

39,4g Rohsurfactant aus Beispiel 4 wurden mit 117,6ml Methanol für 15 min bei 28-34⁰C ausgerührt. Nach Aufarbeitung gemäß Beispiel 1 konnten 13,83g Reinsurfactant gewonnen werden.

Beispiel 8

Aus 196,0kg Lungebrei konnten mit der im Beispiel 1 beschriebenen Methode 723kg Rohsurfactant gewonnen werden. 603g Rohsurfactant wurden mit 1809 ml Ethanol 15 min bei 15-20⁹C ausgerührt. Aus dem ethanolischen Extrakt wurden nach Abreiben des Lösungsmittels 240g Reinsurfactant erhalten. Es blieb ein in Ethanol unlöslicher Rückstand von 365g zurück.

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Beispiel 9

Die 365g Rückstand aus Beispiel 7 wurden erneut mit 1200 ml Ethanol unter den gleichen Bedingungen ausgerührt. Aus dem Extrakt erhielt man nochmals 59g Reinsurfactant. Es blieb ein in Ethanol unlöslicher Rest von 314g zurück.

Beispiel 10

Die 314g Rückstand aus Beispiel 8 wurden noch einmal mit 950ml Ethanol unter den Bedingungen von Beispiel 7 ausgerührt. Aus dem Extrakt erhielt man weitere 27,9 g Reinsurfactant.

Beispiel 11

40 g Reinsurfactant von Beispiel 8 wurden in Chloroform auf 100 ml gelöst und die Lösung auf 8°C abgekühlt. Aus dieser Lösung wurde die Phospholipidfraktion durch Zusatz von 300ml tiefgekühltem Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt und getrocknet. Es wurden 16,9g Phospholipidfraktion erhalten.

Beispiel 12

20g erfindungsgemäßer Wirkstoff (Phospholipidgehalt: 60,1 %) wurden in 200ml Ethanol, unvergällt, gelöst, über eine G4-Fritte (aufgelegtes Glasfaserfilterpapier NK VIII) vorfiltriert und anschließend über Sartoriusfilter SM 116-07 sterilfiltriert. Nach Konzentration der sterilen Lösung am Vakuumrotationsverdampfer wurden durch Einleitung von sterilem Stickstoff bei gleichzeitiger Evakuierung des Gefäßes die Lösungsmittelreste ausgetrieben. Die so erhaltene sterile Substanz wurde mit 180ml sterilem Wasser mittels eines Ultra-Turrax emulgiert und die Emulsion so in 25-ml-Rollrandflaschen abgefüllt, daß 17 Flaschen je 400mg Phospholipid enthielten. Nach Einfrieren bei -5O⁰C für 3 Tage wurden die Proben lyophilisiert, dabei die Gegenheizung auf maximal 20⁰C eingestellt. Nach der Lyophilisierung wurden die Flaschen mit Durchstechstopfen B180 und AIu-Capsolutverschluß verschlossen.

Claims

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Erfindungsanspruch :

1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Veränderungen im pulmonalen Surfactant-System einhergehen, aus einem durch Extraktion zerkleinerter Lungen von Säugern mit einem nicht mit Wasser mischbaren Lipidlösungsmittel erhaltenen rohen Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, daß der lösungsmittelfreie, rohe Wirkstoff mit wasserlöslichem Alkohol extrahiert, der Extrakt von den alkoholunlöslichen Bestandteilen abgetrennt, anschließend das Lösungsmittel entfernt und der erhaltene, lösungsmrttelfreie, gereinigte Wirkstoff, gegebenenfalls durch Zusatz einer Phospholipidf raktion, in eine zur Applikation geeignete pharmazeutische Form gebracht wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit wasserlöslichem Alkohol mehrfach wiederholt wird.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlöslicher Alkohol, vorzugsweise Ethanol und/oder Methanol, verwendet wird.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktionstemperatur zwischen -2O⁰C und +6O⁰C, vorzugsweise zwischen +10⁰C und +30⁰C, liegt.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit Alkohol so durchgeführt wird, daß 1 g roher Wirkstoff mit 1 bis 30 ml, vorzugsweise 2 bis 10 ml, Alkohol ausgeführt wird.
6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte Wirkstoff mit einer Phospholipidf raktion im Verhältnis 10:1 bis 1:2, vorzugsweise 1:1, versetzt wird.
7. Verfahren nach Punkt 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Phospholipidfraktion verwendet wird, die durch Lösen des nach Punkt 1 gereinigten Wirkstoffs in einem Lipidlösungsmittel und Fällen mittels Aceton erhalten wurde.
8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Phospholipidfraktion verwendet wird, die durch Lösen von 0,05 bis 2g Wirkstoff je 1 ml Lipidlösungsmittel erhalten wurde.
9. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Phospholipidfraktion verwendet wird, die durch Fällen bei -20°C bis +40°C,vorzugsweise bei +2⁰C bis +10⁰C erhalten wurde.
10. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Phospholipidfraktion verwendet wird, zu deren Fällung ein Volumenverhältnis Wirkstofflösung zu Aceton von 1:0,5 bis 1:10, vorzugsweise von 1:3 bis 1:5 benutzt wird.
11. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in wasserlöslichem Alkohol, vorzugsweise Ethanol, gelöst, über geeignete Membranen oder Filterschichten sterilfiltriert, anschließend vom Alkohol befreit, emulgiert und lyophilisiertwird.
12. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß man den lyophilisierten Wirkstoff in einer physiologischen Trägerflüssigkeit so emulgiert, daß 1-500 mg, vorzugsweise 70-150 mg, Wirkstoff pro ml physiologischer Trägerflüssigkeit suspendiert werden.

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