DD225788A1 - Mikrotest zur durchfuehrung analytischer bestimmungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung findet Anwendung in klinisch-chemischen Laboratorien u. a. der Medizin, Biologie, Chemie und Pharmazie. Ziel der Erfindung ist ein einfaches und schnelles Testverfahren fuer eine Vielzahl von klinisch-biochemischen Substanzen unter Einsatz geringster Mengen an Untersuchungsmaterial. Erfindungsgemaess wird das Ziel dadurch erreicht, indem in einer Kapillare die Reagenzien a, b,...n jeweils durch eine hydrophobe, inerte Fluessigkeit, deren Dichte sich von Wasser wesentlich unterscheidet, getrennt wird, tiefgefroren oder lyophilisiert und mit dem biologischen Untersuchungsmaterial versehen wird. Die Kapillare wird anschliessend einseitig verschlossen, der Inhalt gemischt, inkubiert, zentrifugiert und das Reaktionsprodukt mit bekannten Methoden gemessen.

Description

Titel der Erfindung;

Mikrotest zur Durchführung analytischer Bestimmungen

Anwendungsgebiet:

Dia Erfindung betrifft einan Mi"krotast zur Durchführung analytischer Be Stimmungen» Die Anwendung kann vor allem in "klinischchemischen Laboratorien in der Medizin, aber auch in Laboratorien anderer 'Wiseenschaftsa^eige erfolgen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung: Die Methoden zur "klinisch-biochemischen Diagnostik sind in einer Seihe von Standardwerken, darunter im Arzneibuch der DIE, Band Diagnostische Laboratoriumsmethoden, dargestellt. Bei einer Vielzahl von Methoden wird im Prinzip durch Zusammenfügen von verschiedenen Reagenzien eine chemische Reaktion in Gang gesetzt, die anschließend photometrisch bzw. mit anderen Meßverfahren gemessen ^rd.

Aufgrund der großen Bedeutung von klinisch-chemischen Analysen •surde eine Tielzahl von Verfahren entwickelt, um einfach und schnell die verschiedenen klinisch-chemischen Parameter bestimmen zu können. Dazu gehören einerseits die verschiedenen Analysenautomaten, die an hohe Kosten gebunden sind, und andererseits die Papier- und Tablettenteste, die meistens nur halbquantitative Aussagen erlauben. Daher werden immer neue Versuche unternommen, die klinisch-biochemische Analytik bei ausreichender Präzision effektiver zu gestalten.

Solche Versuche·sind in der Offen!egungsschrift DS 30 44 335 A 1 (BED, 24. 6. 82) oder dem US Patent 2Tr. 3 992 158 (16. 11. 76) oder dem US Patent lir. 4 323 536 ( 6. 2. 80) dargelegt.

Während in der oben genannten Offen!egungsschrift ein Verfahren zur Durchführung analytischer Bestimmungen nach dem Prinzip des Zentrifugalanalysers beschrieben wird, beinhalten die beiden US-Patents Verfahren zur Durchführung analytischer BeStimmungen nach dem Prinzip von Filmtesten.

Das in der oben genannten Offenlegungsschrift genannte Verfahren beruht darauf, daß unter der Mnwir kung von Zentrifugal "kraft eine Probelösung mit einem löslichen Reagenz zusammengebracht wird, diese durch eine Vielzahl "kleiner Hohlräume geschleudert wird, bis die Reaktionslösung in eine Meßkammer eintritt, in der die Messung vorgenommen wird.

Das in den beiden US-Patent en genannte Verfahren beruht darauf, daß die für dis Bestimmung einer Substanz notwendigen Reagenzien in mehreren voneinander getrennten Schichten (reagent layes) auf einem Filmstreifan angeordnet werden. 2&ne aus porösem Material bestehende Schicht (spreading layer) garantiert den Xontakt -zwischen der su untersuchenden Flüssigkeit und den Reagenzien. Nach diesem Prinzip wurden Te st elemente für Mnzel- bzw. Mehrfachbestimmungen entwickelt.

Zi el der Srfi г*Д

Das Ziel der Erfindung besteht darin, einen einfachen und schnellen Mikrotest zur Durchführung analytischer Bestimmungen für eine Vielzahl von klinisch-biochemischen Substanzen wie u. a. Eiweiß, Hb, Albumin, !,abtat, Ammoniak, Glukose zu entwickeln. Dieser Mikrotest sollte ferner wenig Untersuchungsmaterial benötigen und so neben einer beträchtlichen Sationalisierung auch eine "Kostensenkung mit sich bringen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, unter Vermeidung der Nachteile der bekannten Lösungen einen Test auf der Mikrobasis zu entwickeln.

Srfindungsgeaäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, indem die notwendigen Reagenzien in eine kapillare gegeben werden, wobei die einzelnen Reagenzien zur Verhinderung der chemischen Reaktion getrennt werden durch eine hydrophobe, inerte Flüssigkeit, die ein von Wasser unterschiedliches spezifisches Gewicht aufweist.

ITach Zugabe der Erobenlösung erfolgt die Mischung dar Heal* an den und damit dar Start dar Re aid; ion. Nach der Mischung erfolgt die Trennung von wäßriger Lösung und hydrophober Flüssigkeit mittels Zentrifugation und die Messung der wäßrigen Lösung, Der Mikrotest !sann in Kapillaren mit zylindrischem, oder rechteckigem Querschnitt durchgeführt werden, in die eine definierte Menge Reagenz a pipettiert wird. Aufgrund dar Kapillarwirkung wird die Flüssigkeit hineingesaugt. Anschließend wird eine inerte hydrophobe Flüssigkeit in die kapillare gegeben. Die hydrophobe Flüssigkeit weist ein von Wasser unterschiedliches spezifisches Gewicht auf und reagiert nicht mit den Reagenzien a, b, ... n. Als hydrophobe Flüssigkeiten können z. B. Paraffine, Alkane, öle und andere Substanzen eingesetzt werden. Je nach Anza.hl der beteiligten chemischen Re akt an de η können die Reagenzien b, c, ... η zugegeben werden. Die Trennung der einzelnen wäßrigen Lösungen erfolgt jeweils mit hydrophober Lösung. Die Reagensien bestehen entweder aus einzelnen Substanzen oder Subst ansgemischen entsprechend der bekannten ,!Torschrift (u. a. Arzneibuch der DDE) für die einzelnen klinisch-chemischen Parameter. ITach Hinzufügen das biologischen Materials wird ein Snde der Kapillare verschlossen und die Reaktion durch Mischung des Kapillarinhaltas ausgelöst. Die Kapillare wird bei der für den jeweiligen klinisch-chemischen Parameter notwendigen Temperatur inkubiert. Zur Trennung von hydrophober Lösung und Reaktionslösung wird anschließend zentrifugiert (5000 - I5OOO g; 2 - 5 min) ^d die Reaktionslösung fotometrisch, nephalometrisch, fluorometrisch, und elektrochemisch.

Sine weitere Möglichkeit der Erfindung ist, die gefüllte Kapillare entweder in tiefgefrorenem Zustand aufzubewahren oder zu trocknen. Die Trocknung erfolgt durch Lyophilisation. Somit kann der Mikrotest gleichfalls auch als Trockentest Anwendung finden. Sine weitere Möglichkeit besteht darin, den Mikrotest zur Durchführung mehrstufiger analytischer Bestimmungen einzusetzen, indem Reagenzien so angeordnet werden, daß nur die gewünschten Reaktanden miteinander gemischt werden.

Mit dem arfindungsgemäßen Mikrotest zur Durchführung analytischer Bestimmungen ergeben sieb folgende Vorteile:

- Alle notwendigen Reagenzien werden vorpipettiert, so daß sich die eigentliche Messung auf die Zugabe der Probelösung, den Start der Reaktion durch Mischung des Kapillarinhaltes und die Messung beschränket. Dadurch gestaltet sich die Messung einfach und schnell,

- Dia Vorfertigung der Kapillare ist industriell wie im Labor möglich. Da Kapillaren ein preisgünstiges Einwegmaterial darstellen, ergibt sich eine Materialeinsparung sowie Einsparungen an Arbeitsschritten wie Glaswäsche,

- Die gut bekannten Seaktiоnsbedingungen für die Bestimmung einzelner Substanzen "können beibehalten werden, d. h. die Adaptation von Methoden auf den Kapillartest ist ohne großen Aufwand möglich.

- Ss !sonnen die in den Laboratorien vorhandenen Geräte (Fotometer, Zentrifugen) ohne größere Umrüstungen eingesetzt werden.

- Da das Gesamtvolumen der Kapillaren 20 - 30/Ul nicht übersteigt, sind nur geringe Mengen von Reagenzien und biologischem Untersuchung s mat er i al no twendig,

Der Kapillartest ist sowohl als Einzeltsst im Hotfall, Nacht- und Bereitschaftsdienst ausführbar, bietet aber auch die Möglichkeit zum Einsatz automatisierter Analysensjsterne und damit der Durchführung hoher Analjsanzahlen.

Ausführungsbeispiele;

Der Mikrotest wird am Beispial der Proteinbestimmung (Messung im sichtbaren Bereich des optischen Spektrums) und am Beispiel der Laistat bestimmung (Messung im UV) näher erläutert.

1. Ausführungsbeispiel

Die Brot einbe st j-mrn-mg erfolgte mit der Biuret methode entsprechend der "A3 der DDE (DL)** - DDS S3, Akadamie-7erlag, Berlin 1983

Für die Beziehung zwischen eingesetzter Probenmenge und Extinktion wurde ein "Korrelationskoeffisient von r = 0.9983 erhalten. (n = 6, IK = 2,7 %)» Fügt man dem 'Testansatz Hesan (Uvasol, Merck) als hydrophobe Flüssigkeit hinzu, wird diese Korrelation nicht verändert (r = 0.9998, η = 6, YK- 4,5 fa). In Gl as kapillar en werden 23 au. Biuret lösung und etwa 3 Зезгап pipettiert.

Danach erfolgt die Zugabe von 5 діі Serum (1 : 10 verdünnt) und das Zuschmal ζ en von einem Kapillar ende.

Für die Mischung des Kapillarinhaltes und damit den Start der B.eaktion wurde ein feiner Stahlstift in die Kapillare eingeführt, der mit Hilfe eines Magneten von außen auf- und abwärts bewegt

Nach 30 min Inkubation "bei Zimmertemperatur worden die Kapillaren für 2 min in einer Hamatokritzantrifuge (12000 g) zentrifugiert.

Die Kapillare wurde an der Grenzschicht Hexan - wäJ3rige Lösung sowie am zugeschmolzenen. Ende durchtrennt und die wäßrige Reacti onslö sung in einer Mikroküvette bei 546 nm gemessen. Ss wurde eine lineare Beziehung·zwischen Probenmenge und Extinktion erhalten (r = 0.9966, η = 10, TK = 5,5 %)·

2. Ausführungsbeispiel

Die LaktatbeStimmung wurde als optischer Test nach Arzneibuch der DDH mit folgenden Volumina durchgeführt!

Sljcinpuffer/Hydrazin-Gemisch 15/ul, NAD (1 : 1,53 verdünnt) 2ді1, LDH (1 : 15 verdünnt) 2 діі, Perchlorsäure ZxH (nur Leerwert) und L-aktat-Standard 2 /al (nur Erobenwert).

Die Trennung der verschiedenen Reagenzien in der Kapillare erfolgte durch Hexan. Die Mischung erfolgte mit einem Stahlstift und Magneten; nach einer Stunde Inkubation bei 25°C wurden die Kapillaren zentrifugiert (2 min, 12000 g) und das Hexanende bzw. das sugeschmolzane Ende der Kapillaren abgetrennt. Aus der Kapillare wurden 15/Ul Prüf- bzw. Leeransatz entnommen und bei 340 nm gemessen. Ss resultiert eine Gerade zwischen eingesetzter Laktatmenge und Extinktion mit einem Korrelationskoeffizienten von r = 0,9918 (n s 6, VT = 13,8 %).

Claims (2)

1. Srfindungsansprach

   1. Mi"kratest zur Darchführung analytischer Bestimmungen, insbesondere zur Ermittlung Klinisch-biochemischer Parameter durch Mischen von biologischem Untersuchungsmaterial und den Reagenzien a, b, ... n, inhibieren und die Messung der Eeakfcionslösung, gelssnnzeichnet dadurch, daß in einer Kapillare die Eeagenzien a* b, ... η jeweils durch eine hydrophobe, inerte Flüssigkeit (1 < Dichte [[g/13 ^O getrennt werden, anschließend tiefgefroren oder lyophilisiert werden oder zu den so vorbereiteten kapillaren das biologische Untersuchungsmaterial gibt, die kapillaren einseitig verschlieBt, mischt, inkuoiert, zentiäfugiert und mit bekannten Methoden mißt.

   Z. Mikrotest nach Binlrt 1, gelssnnseichnet dadurch, daE die Fapillaren zylindrischen oder rechtecMgen Verschnitt aufweisen.
2. 3. Müsrotest nach Rmkt 1, gelcsnnzeichnet dadurch, daB die lyophilisierten Kapillaren als Troclcentest eingesetzt werden.