DD225708A1 - Verfahren zur verbesserung der adhaerenzeigenschaften von glas- oder plastoberflaechen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung duenner, homogener Filme reaktiver Substanzen auf Glas- oder Plasteoberflaechen. Erfindungsgemaess werden die Glas- oder Plasteoberflaechen sorgfaeltig gereinigt und aktiviert. Auf die aktivierten Oberflaechen wird ein Film ausgewaehlter reaktiver Substanzen aufgezogen und anschliessend mit Zellen beschichtet. Anwendung finden die erfindungsgemaess behandelten Oberflaechen in der klinischen Diagnostik, in der Mikrobiologie und in anderen Disziplinen, in denen Beurteilungen und Messungen an Einzelzellen, besonders auch bei solchen hoher Eigenbeweglichkeit, vorgenommen werden muessen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung dünner, homogener Filme reaktiver Substanzen auf Glas- und/oder Plasteoberflächen, die auf physikalisch-chemischer Grundlage die Adhärenz von Zellen, die sonst auf diesen Oberflächen schlecht oder nicht haften, bewirken, wobei eine homogene Zellverteilung erzielt wird. Die Erfindung ist in die IPK C12M einzuordnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Beschichtung von Glas- und Plastoberflächen mit reaktiven Stoffen zur Vermittlung der Adhäsion von Partikeln ist seit 1975 bekannt. MAZIA et al. (1975) und SANDERS et al. (1975) beschrieben die Herstellung von Poly-L-Lysinfilmen für die elektronenmikroskopische Technik. TSUTSUI et al. (1976) benutzten für die gleiche Aufgabenstellung neben Poly-L-Lysin PoIy-L-Argininsulfat und Protamin. Für eine ausreichende Filmbildung werden relativ große Mengen an Polyaminosäuren (0,1 % bzw. 2%Protamin) benötigt, da die Träger nicht speziell vorbehandelt wurden. PENA und HUGHES (1978), HUGHES et al. (1979) und HUGHES et al. (1980) verwenden zur Beschichtung von Oberflächen andere Proteine, wie Fibronektin und Antikörper, um eine Haftung von Zellen zu ermöglichen. ALPIN und HUGHES (1981) setzten Lektine (Concanavalin A und Ricin) dafür ein. Um eine entsprechende Filmbildung zu erreichen, wurden die Glasträger zunächst mit 3-Aminopropyltriäthoxysilan silanisiert, die eingeführten Aminogruppen mit Glutaraidehyd funktionalisiert und dann das Protein kovalent gebunden. US-Patent 3910819 beschreibt den Einsatz polymerer polyquarternärer Amine zur Stimulation der Adhäsion tierischer Zellen und zur Wachstumsstimulation bei der Zellzucht. Ausgewählte polymere polyquarternäre Aminoverbindungen linearer Struktur werden entweder vor der Zellzucht mit den Zuchtgefäßen in Kontakt gebracht oder in geringen Mengen, die das Zellwachstum nicht hemmen, dem Kulturmedium selbst zugesetzt. Für Erythrozyten wird beschrieben, daß diese sehr fest an so vorbehandelten Glasoberflächen anhaften und ihre freie Deformierbarkeit verloren geht. In den Ausführungsbeispielen wird nicht aufgezeigt, daß man mit den fixierten Zellen chemische oder biochemische Reaktionen durchführen kann, die in ihrem Ablauf und in ihrer Quantität denen an freien Zellen entsprechen; vielmehr muß wegen der Zytostimulation ein abweichendes Verhalten angenommen werden. Auf die Homogenität der Filme wird daher auch kein besonderer Wert gelegt.

Ziel der Erfindung

Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, Glas- und Plasteoberflächen durch entsprechende Aktivierung zu einer homogenen Filmbildung mit reaktiven Substanzen zu befähigen, eine einfache und zuverlässige Herstellung solcher homogener Filme zu . ermöglichen, bei geringem Substanzeinsatz eine gute Haftung der Zellen bei homogener Zellverteilung zu erreichen, die adhärierenden Zellen in ihren Eigenschaften im Hinblick auf chemische, biochemische und biologische Reaktionen gegenüber den nativen freien Zellen nicht zu verändern und die Reaktionen — ein- oder mehrstufig — mit den homogenen immobilisierenden Zellen zu ermöglichen.

Wesen der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, mit welchem ausgewählte Substanzen durch spezielle Verfahrensschritte auf Glas- oder Plastoberflächen als homogene Schicht aufgetragen werden können. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Glas- oder Plastoberfiächen zunächst sorgfältig gereinigt und aktiviert, ein Film reaktiver Substanzen aufgezogen und anschließend mit Zellen beschichtet wird.

Die Aktivierung der Oberfläche ist Voraussetzung für eine anschließende homogene Beschichtung und damit für eine homogene Zellverteilung. Sie erfolgt durch Vorreinigen der Unterlagen mit warmem Wasser, das geringe Mengen an oberflächenaktiven Stoffen enthält und anschließende Aktivierung mit Chromschwefelsäure, einer Lösung von 50% KOH und 10% Weinsäure, heißer Sodalösung u.a., durch sorgfältiges Spülen mit destilliertem Wasser und sofortigem Aufbringen des reaktiven Stoffes. Handelt es sich bei den aufzubringenden reaktiven Stoffen um solche, die in Wasser oder wäßrigen Lösungen unlöslich sind, ist eine Umstimmung der aktivierten Oberfläche von Wasser auf z. B. organische Lösungsmittel erforderlich. Diese Umstimmung erfolgt stufenweise, indem die aktivierten Oberflächen Lösungen abnehmender Polarität, z. B. wäßrigen Alkohollösungen steigender Konzentration bis hin zum absoluten Alkohol, ausgesetzt werden, wobei anschließend die Behandlung mit den aufzubringenden reaktivben Stoffen, die in Äther, Chloroform u.a. gelöst vorliegen, erfolgt. Wesentlich für die Erzielung eines homogenen Films ist der Umstand, daß die aktivierten Unterlagen unter keinen Umständen mit Stoffen in Kontakt gebracht werden, die ebenfalls aufziehen können, z. B. Spuren von Fett, die durch das Anfassen mit den Fingern aufziehen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei Kombination geeigneter Reinigungs- und Aktivierungsschritte eine Vielzahl von Stoffen mit Adhärenseigenschaften sich als homogene Filme auf Glas- und Plasteoberflächen aufziehen lassen, sich daran Zellen binden und mit den so immobilisierten Zellen Reaktionen durchgeführt werden können, wobei die nativen Eigenschaften der Zellen im Hinblick auf diese Reaktionen unbeeinflußt bleiben. Die Immobilisierung der Zellen erfolgt derart, daß an diesen Zellen chemische, biochemische oder biologische Reaktionen ungestört ablaufen können, so daß diese direkt, z.B. durch mikroskopische Beobachtung, oder indirekt durch Photometrie, Radioaktivitätsmessung u.a. erfaßt bzw. gemessen werden können. Anwendung finden erfindungsgemäß hergestellte homogen immobilisierte Zellen in der klinischen Diagnostik, in der Mikrobiologie und-in anderen Disziplinen, in denen Beurteilungen und Messungen an Einzelzellen, besonders auch bei solchen hoher Eigenbeweglichkeit vorgenommen werden müssen. Die sehr schonende, aber gleichzeitig hinreichend feste Immobilisierung gestattet die Durchführung von Mehrschrittreaktionen an den so immobilisierten Zellen, wobei sonst übliche Zentrifugationsschritte als einfache Waschschritte ausgeführt werden können, was zu einer wesentlichen Arbeitsvereinfachung und Zeiteinsparung bei der Durchführung solcher Reaktionen führt

In den nachfolgenden Ausführungsbeispielen wird die Erfindung und ihre Anwendung näher erläutert.

Ausführungsbeispiele

A: Trägeraktivierung und Beschichtung

Beispiel 1:

Mit Wasser von ca. 40⁰C, das eine geringe Menge an oberflächenaktiver Substanz enthält (z. B. 1 ml Fit/l Wasser), werden Glasobjektträger zunächst vorgereinigt und mit Wasser nachgespült. Anschließend läßt man das Wasser ablaufen. Die Aktivierung der vorgereinigten Objektträger erfolgt durch eine Lösung von 50% KOH und 10% Weinsäure oder durch eine Lösung von Chromschwefelsäure (110g Kaliumbichromat in 200ml Wasser gelöst und mit 11 konzentrierter Schwefelsäure versetzt), die man bei 50 bis 70⁰C 2 Stunden einwirken läßt. Die so aktivierten Objektträger werden mit einer Zange dem Aktivierungsbad entnommen, mit Leitungswasser kurz abgespült und sorgfältig mit destilliertem Wasser nachgespült. Sowohl das Leitungswasser als auch das destillierte Wasser müssen frei von Stoffen sein, die ebenfalls aufziehen können; ein Berühren mit den Fingern ist unbedingt zu vermeiden. Es kommt sonst zum Ausbleiben einer homogenen Beschichtung. Die so aktivierten Objektträger werden noch feucht 10 Minuten in einer Lösung von 0,05% Poly-Dimethyldiallylammoniumchlorid (MG 15000 bis 20000) in destilliertem Wasser getaucht, danach 3 χ abgespült und anschließend an der Luft getrocknet. Derartig beschichtete Objektträger behalten ihre Zellbindungsfähigkeit über 6 Monate bei. Diese geht auch nicht verloren, wenn die Objektträger heißluftsterilisiert werden.

Beispiel 2:

Analog Beispiel 1 vorgereinigte und aktivierte Objektträger werden 20 Minuten in eine Lösung von 0,015% Cetyltrimethylammoniumbromid in destilliertem Wasser gebracht, anschließend 3x mit destilliertem Wasser abgespült und an der Luft getrocknet. Die beschichteten Objektträger behalten ihre Zellbindungsfähigkeit über mindestens 5 Monate

Beispiel 3:

Nach Beispiel 1 vorgereinigte und aktivierte Objektträger werden zunächst kurz in 50%iges Äthanol getaucht und anschließend für ca. 1 Minute in absolutes Äthanol eingestellt. Danach werden sie in reines η-Hexan überführt und im Anschluß daran werden sie in eine Lösung von 0,015% Hexadecan in n-Hexan 10 Minuten eingestellt. Nach 3x Spülen mit η-Hexan werden sie an der Luft getrocknet. Die so beschichteten Objektträger behalten ihre Bindungsfähigkeit für i. b. Zellen mit hydrophober Oberfläche für ca. 3 Monate bei.

Beispiel 4:

Mikrotiterplatten nach Takätsy aus Polystyrol werden mit warmem Wasser, das geringe Mengen an oberflächenaktiven Substanzen enthält, vorgereinigt. Anschließend werden sie in eine Lösung von 50% KOH und 10% Weinsäure getaucht und 3 bis 5 Stunden darin belassen. Es folgt eine sorgfältige Spülung der Platten mit destilliertem Wasser, wobei Hautkontakt unbedingt zu vermeiden ist. Sofort im Anschluß an die Spülung werden die aktivierten Platten in eine Lösung von 0,02% PoIy-Dimethyidiallylammoniumchlorid in destilliertem Wasser eingetaucht und 20 Minuten darin belassen. Anschließend werden die Platten sorgfältig mit destilliertem Wasser gespült und luftgetrocknet. Die so behandelten Platten behalten ihre Zellbindungsfähigkeit ca. 1/2 Jahr bei

B: Zellbindung und Reaktionsdurchführung

Beispiel 5:

Auf nach Beispiel 1 beschichtete Objektträger werden 20μ,Ι einer Blutzellsuspension mit 3 χ 10⁶ Zellen/ml aufgetropft und 10 Minuten bei 4°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die nach dieser Zeit nicht adhärierenden Zellen werden durch kurzes Eintauchen in gepufferte Kochsalzlösung (PPS) abgespült. Anschließend werden die adhärierten Zellen mit 10μ TRIC-markiertem Kaninchenanti-Humangammaglobulin (1:50 verd.) überschichtet und 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Zur Entfernung des ungebundenen Antikörpers werden die Objektträger 3x3 Minuten in PPS, das 0,02% NaN₃ enthält, gespült. Anschließend wird unter dem Fluoreszenzmikroskop der prozentuale Anteil der B-Lymphozyten bestimmt.

Beispiel 6:

Auf nach Beispiel 5 an Objektträger adsorbierte Blutzellen werden 20 μΙ von monoklonalem pan-T-Zell-Antikörper, 1:1 000 verd., aufgebracht, 10 Minuten bei 4°C inkubiert und der nicht gebundene Antikörper durch Spülen der Präparate in PPS (3x2 Minuten Einstellen in PPS) entfernt. Jetzt erfolgt die Inkubation der Präparate mit FITC-markiertem Ziege-anti-Mausgammaglobulin, 20μΙ, 1:20 verd., im Verlauf von 20 Minuten bei 4⁰C. Nach 3x Waschen der Präparate in PPS (je 2 Minuten) erfolgt die Bestimmung der prozentualen Anteile der T-Lymphozyten im Fluoreszenzmikroskop.

Die in den Beispielen 5 und 6 beschriebene Methode wurde am peripheren Blut von 10 Probanden mit der herkömmlichen Röhrchenmethode verglichen, die Ergebnisse in nachfolgender Tabelle zusammengestellt.

Tabelle:

Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der prozentualen Anteile von B- und T-Lymphozyten am peripheren Blut von 10 Probanden

B-Zellen T-Zellen

Objektträgertest nach 13,8 ± 2,9 72,2± 7,6

Beispiel 5 und 6

herkömmlicher 15,6 ± 4,1 68,5 ± 7,9

Röhrchentest

Beispiel 7:

Auf gemäß Beispiel 1 beschichtete Objektträger werden 30μΙ einerZellsuspension aus homogensiertem Gewebe (Lymphknoten) mit einer Zelldichte von 2 x 10⁶ Zellen/ml aufgebracht und 30 Minuten bei 4⁰C inkubiert. Danach werden die nicht adhärierenden Zellen durch 3maliges Einstellen der Objektträger in PPS (je 5 Minuten) abgespült. Die Zellen werden jetzt mit 20μΙ Kaninchenanti-Human Fab-Antiserum, 1:50 verd. 20 Minuten bei 4°C inkubiert und anschließend das überschüssige Serum durch 3x Einstellen in PPS (je 3 Minuten) abgespült. Es folgt die Inkubation der Zellen mit30p.l Ziege-anti-Kaninchenserum (1:30 verd.) innerhalb von 20 Minuten und anschließender Wäsche der Präparate mit PPS (3x5 Minuten). Im dritten Schritt werden die

Zellen mit 10/xl Peroxidase-anti-Peroxidaseantikörper-komplex vom Kaninchen (1:100 verd.) 20 Minuten inkubiert und zur Entfernung des überschüssigen Antikörpers durch Einstellen in PPS (3x5 Minuten) gespült. Der Nachweis der peroxidatischen Aktivität erfolgt durch Inkubation der Präparate mit 3,3'-Diaminobenzidin (0,5mg/ml) in Tris-Puffer, pH 7,6, in Gegenwart von 0,01 % H₂O₂. Je nach Peroxidaseaktivität der Präparate sind dafür Reaktionszeiten von 2 bis 5 Minuten erforderlich. Nach Abbrechen der Reaktion wird im Lichtmikroskop ausgewertet.

Claims (4)

1. Erfindungsansprüche:

   1. Verfahren zur Verbesserung der Adhärenzeigenschaften von Glas-oder Plastoberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß die Glas- oder Plastoberflächen aktiviert und mit reaktiven Stoffen adsorbtiv beschichtet werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung durch Vorreinigungen mit Wasser und anschließender Behandlung der Oberflächen mit Alkalien oder Säuren, die Oxydationsmittel enthalten, erfolgt.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Oberflächen ein Film reaktiver Stoffe.homogen aufgezogen wird.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß ais reaktive Stoffe Poly-quarternäre Ammoniumbasen polymerer Amine, höhere quarternäre Ammoniumbasen oder höhere Kohlenwasserstoffe verwendet werden.