DD208675A1

DD208675A1 - Verfahren zur bestimmung von dehydrogenasen und deren substraten

Info

Publication number: DD208675A1
Application number: DD24096082A
Authority: DD
Inventors: Peter Mohr; Bernd Ebert; Thomas Hanke; Karl-Heinz Kallies; Manfred Winkler; Dieter Plaschnick
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1982-06-22
Filing date: 1982-06-22
Publication date: 1984-04-04

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Dehydrogenasen und deren Substraten. Anwendungsgebiet dieses Verfahrens sind die Medizin, die Nahrungsgueterwirtschaft, die mikrobiologische Industrie, die Landwirtschaft und d. umweltschutz. D. Ziel der Erfindung besteht darin, die bisher bekannten Nachweisverfahren so weiterzuentwickeln, dass die Auswertung ueber eine Farbreaktion im sichtbaren Spektralbereich erfolgen kann. Das Bestimmungsverfahren wird mit einem Teststreifen durchgefuehrt, d. aus einer inerten Unterlage u. einer in einem transparenten Material wie Gelatine oder Zelluloseacetat oder in nicht transparentem Vliesmaterial wie Zellulose geloesten Farbschicht nach WP G 01 N/236500/4 besteht. Auf diese Farbschicht wird erfindungsgemaess eine Reagenzschicht aufgebracht, die ein reduziertes Pyridin-Nucleodit und je nach Verwendungszweck eine bestimmte Dehydrogenase bzw. ein bestimmtes Substrat enthaelt. Ggf. wird zwischen diese Farb- und Reagenzschicht eine weitere inerte Schutzschicht aufgetragen. Nach Durchfuehrung des Tests erfolgt eine qualitative, halbquanitative (mittels Farbkomparator) bzw. quantitative (kolorimetrisch) Auswertung.

Description

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Prof. Dr. Mohr

Dr. Sbert

Kailies

Dr. Winkler

Plaschnick

"Verfahren zur Bestimmung von Dehydrogenasen und deren Substraten" ; .

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Dehydrogenasen, deren Substraten und den hieraus gebildeten Produkten. Eine Anwendung des analytischen Prinzips ist in der Medizin für diagnostische und Kontrollzwecke (z. B. für die Bestimmung von Laktatdehydrogenase, Glutamatdehydrogenase, Laktat, Glukose, Alkohol) sowie in der Nahrungsgüterwirtschaft, der mikrobiologischen Industrie, der Landwirtschaft und im Umweltschutz möglich.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Dehydrogenasen katalysieren die Umsetzung ihrer Substrate nach folgendem Prinzip:

Substrat + UAD⁺ / UADH + Produkt

Z. B. katalysiert das Enzym Laktatdehydrogenase bei Anwesenheit von UAD⁺ eine Umwandlung von Laktat in Pyruvat bzw. in Anwesenheit von UADH eine Umwandlung von Pyruvat in Laktat:'"

Laktat + NAD⁺ _ΉΜΜ _{+ Pyravat}

+ H⁺ (1a)

Die Reaktionsrichtung wird bei (la) wie auch bei anderen De-

hydrogehäsen durch" den pH des Reäktioiismilieus bestimmt. Die

Tatsache, daß alle durch. Dehydrogenasen katalysierten Reak- tionen mit einer Oxidation von JTADH (bzw. ITADPH) oder einer Reduktion von 3JAD"⁷" (bzw, iTADp") verknüpft sind, ist für die Entwicklung zahlreicher, optisch auswertbarer Tests zum Hachweis von Dehydrogenasen, deren Substraten und Produkten genutzt worden~(J. G. Meyer-Bertenrath: Enzymdiagnostik, Theorie und Praxis enzymatischer Analysen; Die Medizinische Verlagsgesellschaft, Marburg - Lahn 1976). Derartige Tests werden normalerweise in wäßriger Lösung bei einem geeigneten pH als sogenannte Küvettentests durchgeführt, wobei man die Tatsache "nutzt, daß NADH bzw. ITADPH bei 340 nm'ein Adsorptionsmaximum aufweisen, während die oxidierten Derivate ClTAD , HADP~) zwischen 300 - 400 mn. nicht absorbieren. Durch eine geeignete Verknüpfung von Dehydrogenase-katalysierten Reaktionen mit anderen, von ITicotin-amid-adenin-dinucleotid-unabhängigen Reaktionen konnten weitere Tests entwikkeit und in die Praxis eingeführt werden, wie bsw. für die Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase·(GOT). deren Prinzip nachfolgend als Modellbeispiel erläutert werden soll: GOT katalysiert die Reaktion von Aspartat mit ^.-Ketoglütarat zu Glutamat und Oxalacetat (2). Oxalacetat wiederum wird in Gegenwart von ITADH durch Malatdehydrogenase zu Mal at und HAD"¹" umgesetzt (3) :

1-Aspartat + ««v-Ketoglutarat ^ Oxalacetat +

L-Glutamat_ . ' (2)

Oxalac-etat + UADH + H⁺

ITAD⁺ (3)

Da alle Reaktionen streng stöchiometrisch ablaufen, ist die zeitliche Abnahme der Extinktion bei etwa 340 nm (Abnahme der iTÄDH-Xonzentration) ein Maß für die GOT-Aktivität in der Probe. Weitere Kombinationen von Reaktionen, die letztlich immer

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wieder mit einer durch. Dehydrogenasen katalysierten Reaktion abschließen, sind möglich und haben auch eine praktische An-7/endung gefunden.

Der Itfachteil der aufgeführten Verfahren besteht darin, daß die Auswertung im allgemeinen nur im ÜY-Spektralbereich. in Form von Küvettentests möglich ist.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Hachweisverfahren für Dehydrogenasen, deren Substrate und den hieraus gebildeten Produkten so weiterzuentwickeln, daß die Auswertung über eine farbreaktion im sichtbaren Spektralbereich erfolgen kann. Dabei soll die 'Testreaktion selbst in Lösung, vorzugsweise aber an festen bzw. in gelartigen Phasen durchgeführt werden. Gegenüber den eingangs geschilderten UV-Tests soll die Anwendung eines visuell auswertbaren Indikators auch die Entwicklung von qualitativ und über Farbkomparatoren halbquantitativ auswertbaren Hachweismethoden einschließlich Teststreifen ermöglicht werden.

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Darlegung des Wesens der Erfindung;

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Testsystem zu entwickeln, das den Nachweis von Dehydrogenasen, deren Substraten und hieraus gebildeten Produkten vorzugsweise an und in festen Phasen sowie gelartigen Systemen über, eine- Farbänderung im sichtbaren Spektralbereich erlaubt. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß auf eine inerte Unterlage ein in transparentem Material (z. B. Gelatine, Zelluloseacetat) gelöster Farbstoff als Schicht aufgetragen oder direkt in nicht transparentem Vliesmaterial (z. S. Zellulose) eingebracht wird. Diese Schicht wird im

die über zusätzliche" Verbindungen (Fixiermittel) chemisch stabilisiert werden und diffusionsfest sind. Durch HADH und

HADPH aber auch andere Reduktionsmittel kann der Farbbildner bei Einhaltung eines geeigneten pH-Regimes unter Pareänderung reduziert werden.

Die Spezifizierung des Tests erfolgt bei beiden Varianten erfindungsgemäß durch. Auftragen einer zweiten Schicht (wiederum transparentes oder Vliesmaterial), in die alle weiteren für den gewünschten Test erforderlichen Komponenten (reduziertes Pyridin-Uucleotid und bestimmte Dehydrogenasen baw. Substrate) eingebracht werden. Diese Schicht wird nachfolgend als Reagenzschicht bezeichnet.

Zur Optimierung der Testreaktion werden in beiden Schichten die erforderlichen pH-Bedingungen geschaffen, was beispielsweise durch Pufferung erfolgen kann. Zur Vermeidung von störenden Diffusionseffekten bzw. um Färb- und Reagenzschicht ohne Beschädigung trennen su können, empfiehlt es sich, gegebenenfalls zwischen Färb- und Reagenzschicht eine weitere inerte Schicht anzubringen, die im folgenden als Schutzschicht bezeichnet wird.

Das- erfindungsgemäße Testverfahren ermöglicht eine qualitative, halbquantitative (mittels Farbkomparator) oder quantitative Auswertung (kolorimetrisch) im sichtbaren Spektralbereich.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Beispiele näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Enthält die Reagenzschicht neben IAD⁺ eine Dehydrogenase

(z. B. Laktatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase), so erfolgt beim Auftragen einer Substrat-haltigen Probe (z. B, Laktat) entsprechend (1) die Bildung von HADH, welches wiederum den Farbbildner unter Abnahme der Farbintensität reduziert. Die Auswertung· des Tests kann kolorimetrisch (refiektometrisch oder im Durchlicht) gegen den imbehandelten, d. h. in seiner Farbe unveränderten Test bzw. visuell unter Verwendung eines

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Farbkomnarators erfolgen. Die Farbänderung ist in diesem Falle proportional der Substratkonzentration im Probenmaterial.

Beispiel 2

Enthält die Reagenz schicht nahen UAD*¹" ein für eine gegebene Dehydrogenase spezifisches Substrat, so erfolgt beim Auftragen der Dehydrogenase-haitigen Probe wiederum entsprechend (1) die Bildung von ITADH und nachfolgend eine Reduktion des farbstoffs. In diesem Falle v/ird die Dehydrogenase-Aktivität der Probe durch die zeitliche Änderung der Färbung des Teststreifens bestimmt.

Claims

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Erfindungsanspruch

Verfahren zum, Nachweis von Dehydrcgenasen, deren Substraten und d,en hieraus gebildeten Produkten mittels eines Teststrei-

fans, bestehend aus einer inerten Unterlage und einer in einem transparenten Material wie Gelatins oder Zelluloseacetat oder in nicht transparentem Vliesmateriai v/is Zellulose gelösten farbschicht, die aus semichinonbildenden Derivaten und einem Fixiermittel nach WP G 01 If/236 500/4 besteht, dadurch gekennzeichnet.,

daß auf diese Farbschicht eine Reagenzschicht, die reduziertes Pyridin-Nucleotid und je nach Verwendungszweck eine bestimmte Dehydrogenase bzw, ein bestimmtes Substrat enthält, und zur Vermeidung von störenden Diffusionseffekten bzw. zu ihrer Trennbarkeit zwischen diese ]?arb- und Reagenzschicht ggf. eine weitere inerte Schutzschicht aufgetragen wird und nach Kontakt mit einer substrat- bzw, dehydrogenasehaltigen Probe die Auswertung qualitativ, halbcuantitativ (mittels Parbkomparator) oder quantitativ (kolorimetrisch) erfolgt.