DD149679A1

DD149679A1 - Verfahren zur herstellung poroeser entym-polysstyrol-komplexe

Info

Publication number: DD149679A1
Application number: DD21999380A
Authority: DD
Inventors: Alfred Schellenberger; Jens Fischer; Klaus Haeupke; Gerhard Schwachula
Original assignee: Alfred Schellenberger; Jens Fischer; Klaus Haeupke; Gerhard Schwachula
Priority date: 1980-03-28
Filing date: 1980-03-28
Publication date: 1981-07-22

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung poroeser Enzym-Polystyrol-Komplexe fuer den grosztechnischen Einsatz in der Lebensmittelindustrie sowie in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Ziel der Erfindung ist es, oekonomisch guenstig Enzym-Polystyrol-Komplexe mit hoher Aktivitaet herzustellen, die den Anforderungen beim Einsatz in grosztechnischen Prozessen gerecht werden. Aufgabe der Erfindung ist es, den Prozesz der Copolymerenherstellung so zu beeinflussen, dasz ohne zusaetzliche Arbeitsschritte stark poroese Produkte entstehen. Erfindungsgemaesz wird das dadurch erreicht, dasz fuer die Herstellung des Copolymeren ein Verhaeltnis zwischen den Monomeren mit einer Vinylgruppe und den Monomeren mit mehreren Vinylgruppen von 8 :2 bis 9,5 :0,5 Gewichtsteilen eingesetzt und dasz ein porenbildender Inertstoff in einer Menge von 0,75 bis 0,90 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil der Monomeren verwendet wird. Als Inertstoffe finden aliphatische Kohlenwasserstoffe oder ein Aliphatengemisch mit einem Siedebereich von 80 bis 300 Grad C,insbesondere von 170 bis 225 Grad C, Anwendung. Die Copolymerisation wird in waeszriger Phase durchgefuehrt. Nach Funktionalisierung der Copolymeren an den aromatischen Kernen und der Aktivierung erfolgt die Enzymbindung.Das erfindungsgemaesz hergestellte poroese Copolymere ist fuer die Bindung von Glucoamylase besonders gut geeignet. Ihr Einsatz zur enzymatischen Hydrolyse von Staerke fuehrt zu qualitativ hochwertiger Glucose.

Description

-a- 219993

a) Titel der· Erfindung

Verfahren zur Herstellung poröser Enzym-Polystyrol-Komplexe

b) Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung poröser Enzym-Pölystyrol-Komplexe für den Einsatz in der Le-" bensmittelindustrie sowie in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Das poröse Trägermaterial eignet sich besonders für die Herstellung von Glucoamylase-Polystyrol-Komplexen, die beim. Einsatz in der Stärkeindustrie die Bildung qualitativ hochwertiger Glucose bewirken.

c) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

In den DD-PS 141 977 und 142 131

ein Verfahren zur Bindung von Enzymen an hochpolymere Träger auf Basis von vernetztem Polystyrol beschrieben und nachgewiesen, daß die Anwendung von Enzymen in immobilisierter Form eine technologisch und ökonomisch günstige Art der Durchführung biochemischer Reaktionen ist. Die DD-PS 144 558 beinhaltet ein Verfahren zur Steigerung der Aktivität von Enzym-Polystyrol-Komplexen durch Ultraschallbehandlung des Trägermaterials vor der Beladung mit Enzym. Die genannten Verfahren haben den Nachteil, daß die erzeugten Produkte beim Eineatz in technischen Prozessen, z. B. bei der Stärkekonvertierung, noch nicht zu befriedigenden Ergebnissen führen·

, -, λ λ η η . O "Λ (\ O

219993

. Die Ultraschallbehandlung des Trägermaterials bewirkt zwar eine Aktivitätserhöhung der Enzym-Träger-Komplexe, wirkt sich aber durch den zusätzlichen Arbeitsschritt ökonomisch ungünstig auf den Herstellungsprozeß aus.

d) Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ökonomisch günstig Enzym-Polystyrol-Komplexe mit hoher Aktivität herzustellen, die den Anforderungen beim Einsatz in großtechnischen Prozessen gerecht werden,

e) Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, den Prozeß der Copolymerenherstellung so zu beeinflussen, daß ohne zusätzliche Arbeitsschritte stark poröse Produkte entstehen. Diese Produkte müssen hohe Enzymaktivitäten binden können und so abriebfest sein, daß sie auch in gepackten Säulenreaktoren im technischen Maßstab eingesetzt werden können.

Erfindungsgemäß lassen sich diese Copolymeren herstellen durch Umsetzung von Styrol und/oder einem substituierten Styrol und/oder anderen Monomeren mit einer Vinylgruppe . mit einer Divinylverbindung, wie z_e B. Divinylbenzol, und/ oder einer anderen Verbindung mit zwei oder mehr Vinylgruppen in Gegenwart eines Hilfsstoffes, der unter den Bedingungen der Polymerisation nicht reagiert, mit den Monomeren mischbar ist, das Polymere aber nicht löst. Die Struktur (ausgewiesen ζ. B. durch die spezifische Oberfläche, das Gesamtporenvolumen und die Porengrößenverteilung) des Copolymeren läßt sich durch das gegenseitige Massenverhältnis der monofunktionellen Monomeren (ζ. Β. Styrol), der polyfunktionellen Monomeren (ζ. Β. Divinylbenzol) und des Hilfsstoffes (z. B. aliphatischer Kohlenwasserstoff oder Aliphatengemisch im Siedebereich 80 bis 300 ⁰C, insbesondere 170 bis 225 ⁰C), steuern. Das Verhältnis zwischen den Monomeren mit e.iner und den Monomeren ·

mit mehreren Vinylgruppen soll in den Grenzen 8 : 2 und 9,5 J 0,5 Gewichtsteilen liegen und der inerte, porenbildende Hilfsstoff soll in einer Menge von 0,75 bis 0,90 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil der Monomeren eingesetzt werden.

Das so hergestellte Copolymere ist charakterisierbar

ρ durch eine spezifische Oberfläche von 50 1 5. m /g. Es läßt sich durch polymeranaloge Reaktionen an den aromatischen Kernen leicht funktional!sieren, wodurch sie als Träger für Enzyme geeignet werden. Durch die polymeranalogen Reaktionen bleibt der poröse Charakter prinzipiell erhalten, obwohl sich die einzelnen Meßwerte, durch die die Porosität charakterisiert wird, quantitativ in einer für Art und Umfang der Funktionalisierung charakteristischen Weise verändern.

Im Falle der als Beispiel herangezogenen Nutzung eines Trägerpolymeren auf Styrol-Divinylbenzol-Basis zur Immobilisierung von Glucoamylase kommen als polymeranaloge Reaktionen die Chlormethylierung des Copolymeren (z* B. mit Llonochlordimethyläther) und die Aminierung mit Ammoniak oder verschiedenen Aminen in Frage. Bei der Aminierung sei als eine Variante die Umsetzung mit Hexamethylentetramin (Urotropin), die llachaminiorung mit Ammoniak und die Zersetzung mit methanolischer Salzsäure als Mittel zur Herstellung eines Trägerpolymeren mit Aminomethylgruppen aus einem chlormethylierten Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren genannt« Bei diesen Reaktionen vermindert sich z. B. die spezifische Oberfläche des Ausgangspolymeren auf 50 %.

Es wurde festgestellt, daß auf dem erfindungsgemäß hergestellten Trägermaterial fixierte Glucoamylase bei der Hydrolyse einer mit Säure oder Alpha-Amylase vorhydrolysierten Stärke zu Glucose neben einem hohen Umsatz pro Zeiteinheit ein so reines Reaktionsprodukt erzeugt, daß keine Reinigungsoperationen (z. B. Umkristallisationen)

219993

• mehr nötig sind, bzw« der Umfang dieser Reinigungsoperationen geringer ist als bei einem Produkt, das durch Anwendung fixierter Glucoamylase auf einem bekannten Träger entstanden ist.

f) Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele demonstrieren die Herstellungsweise des Trägers und die Immobilisierung des Enzyms sowie die Prüfung der biokatalytischen Wirksamkeit des Träger-Enzym-Komplexes und geben die Konsequenzen an, die eine Abweichung von der erfindungsgemäßen Rezeptur für die Aktivität des Komplexes und andere anwendungstechnisch wichtige Eigenschaften hat.

Beispiel 1

Herstellung des erfindungsgemäßen Träger-Enzym-Komplexes:

Herstellung der Polymermatrix

In einem heizbaren Gefäß mit regelbarem Rührwerk und Rückflußkühler werden 500 ml Wasser vorgelegt und darin 20 g KaCl sowie 5 g MgSO^ · 7 H₂O aufgelöst. Dann wird durch Zugabe von 1,75 6 NaOH eine Mg(OH)₂-SuSpension hergestellt, zu der bei 65 ⁰C ein Gemisch aus 114,0 g Styrol; 25,3 g eines technischen Divinylbenzols, das 54,2 Gew.-$ Divinylbenzol und 38,5 Gew.-# Äthylvinylbenzol enthält; 112,5 S eines Gemisches aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen im Siedebereich 170 bis 225 ⁰C und 0,75 S Azobisisobutyronitril zugegeben wird. Dieses Gemisch wird durch Rühren zu Tröpfchen von etwa 0,35 mm mittlerem Durchmesser verteilt. Unter fortgesetztem Rühren wird 4 Stunden bei 70 ⁰C und dann 4 Stunden bei 190 ⁰C polymerisiert. Dann wird das Polymerisat durch Filtration abgetrennt, mit verdünnter Säure und mit Wasser gewaschen und in ein Filterrohr mit Dampfmantel gebracht. Sowohl der Mantel wie auch das Polymerisat werden dann so lange mit Wasserdampf von etwa 1,2 at Druck durchströmt, bis im Kondensat des Dampfes, der . das Polymerisat durchströmt hatte, keine organischen Stof-

-5 - 219993

fe mehr nachweisbar sind. Das nun kreidig weiß aussehende Polymerisat wird bei '90 ⁰C getrocknet und die Kornfraktion 0,2 bis 0,5 tnm zur weiteren Verwendung abgesiebt· Als Kontrolle für die Erreichung der gewünschten Struktur wird die spezifische Oberfläche des Polymerisats nach der von Haul und Dümbgen (Chem· Ing. Techn. .22,(1960), 349 ι (1963)j 586) angegebenen Methode gemessen. Sie

soll 50 i 5 ta /g betragen. ,_:,

Funktionalisierung der Polymermatrix

50 g des, wie oben beschrieben, hergestellten porösen Suspen sionspolymerisats werden mit 250 ml Monochlordimethyläther und 10 g Zinntetrachlorid 6 Stunden bei 58 ⁰C unter Rückflußkühlung gerührt. Dann wird das chlormethylierte Polymerisat abfiltriert und nacheinander mit Methanol und Aceton gewaschen. Das lufttrockene Material wird dann in ©in Gemisch von 360 ml Methanol und 60 g Hexamethylentetramin (Urotropin) gegeben und 8 Stunden bei 30 ⁰C gerührt. Dann wird es wieder abfiltriert, mit Methanol gewaschen und mit 400 ml 25 /Siger Ammoniaklösung 6 Stunden unter Rückflußkühlung gerührt. Nach erneutem Abfiltrieren und Waschen mit V/asser wird das Material schließlich mit einem Gemisch von 300 ml Methanol und I50 ml konzentrierter (mindestens 30 ^iger) Salzsäure 6 Stunden unter Rühren am Rückfluß gekocht. Es wird erneut abfiltriert und das nun mit Aminomethylgruppen substituierte Polymerisat mit Wasser säurefrei gewaschen.

Bindung des Enzyms an den Träger

1 g aminiertes Polymerisat wird mit 100 mg Benzochinon in 8 ml Methanol 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend gewaschen (J. Fischer, R. Ulbrich, A. Schellenberger (1978), Acta Biol. Med. Germ· ^2, 1413 - 1424). Das aktivierte Polymere wird dann 3 Stunden mit einer Glucoamylaselösung (58O U in 6 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7>0) gerührt und mit Phosphatpuffer - 1 M NaCl - solange gewaschen, bis im Waschwasser keine Enzymaktivität

£F_ Λ& φ w ^^

Hi · ^

mehr nachweisbar ist. Ausgewaschene Aktivität 17 U.

Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Träger-Enzym-Komplexes

Zur Aktivitätsbestimmung wird das Enzymharz mit 1 %iger Zulkowsky-Stärke in 25 mM Acetatpuffer, pH 4,5,bei 45 ⁰C gerührt. Die Aktivität (286 U/g Enzymharz) wird aus der gebildeten Glucosemenge berechnet..

Keinheit des erzeugten Produktes

Der Endwert der Hydrolyse von 30 %iger säureverflüssigter Stärke in Glucose beträgt bei Verwendung der immobilisierten Glucoamylase 97 bis 99 DS (maximal erreichbar 100 DE) und bei Einsatz der Enzym-Träger-Komplexe gemäß den im Stand der Technik angegebenen Verfahren 89 bis 91 DE,

Tabelle 1 zeigt die Aktivitäten von Aminomethylpolystyrol-Glucoamylase-Komplexen (Benzochinonaktivierung der Träge*) .

Zusammensetzung

Divinylbenzol Inertstoff Aktivität

Beispiel (Gew,-%) (Gew.-%) (U/g)

2	50	30	11,5
3	50	50	12,1
4	15	50	63,3
5	21,5	53	144,0

Tabelle 2 zeigt die Aktivitäten von Äthylendiaminomethylpolystyrol-Glucoamylase-Komplexen (Benzochinonaktivierung der Träger).

Zusammensetzung Divinylbenzol Inertstoff Aktivität

Beispiel (Gew_e-%) (Gew,-%) (U/s)

7	50	30	8,0
8	50	50	15,2
9	15	. 50	51,0
10	. 21,5	53	130,4

21^993

Beispiele 2 bis 5

Die Beispiele 2 bis 5 (Tabelle 1) demonstrieren den Abfall der enzymatischen Aktivität des Träger-Enzym-Komplexes bei Abweichungen von der erfindungsgemäßen Rezeptur für die Polymermatrix.

In der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, werden Polymerisate aus den in Tabelle 1 angegebenen Gemischen von Divinylbenzol und Hilfsstoffen hergestellt, unter den ebenfalls dort angegebenen Bedingungen funktionalisiert, mit Enzym beladen und auf ihre Aktivität geprüft. Die Angaben der enzymatischen Aktivität in Tabelle 1 beweisen, daß alle anderen Rezepturen zu schlechteren Ergebnissen als die Rezeptur gemäß Beispiel 1 führen. Da3 nach Beispiel· 5 hergestellte Trägermaterial ist so porös, daß es zwischen den Fingern zerreibbar, also für praktische Zwecke nicht anwendbar ist.

Beispiel 6

Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Polymermatrix wird, wie dort beschrieben, chlormethyliert, aber dann folgendermaßen mit Äthylendiaminomethylgruppen substituiert: Das gemäß Beispiel 1 hergestellte chlormethylierte Polymerisat wird bei 60 ⁰C getrocknet und dann mit einem Gemisch von 375 g Äthylendiamin und 125 g Wasser 16 Stunden bei 95 ⁰C unter Rückflußkühlung gerührt. Dann wird es abfiltriert, nacheinander mit Wasser und mit Methanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Beladung mit dem Enzym erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die ebenfalls gemäß Beispiel 1 durchgeführte Aktivitätsprüfung ergibt einen Wert von 230 U/g. Die Reinheit des erhaltenen Produktes, bei der Hydrolyse von 30 %iger säureverflüssigter Stärke beträgt 98 bis 99 DE.

Beispiele 7 bis 10

Polymermatrices gemäß den Beispielen 7> 8, 9 und 10 werden

ir» der in Beispiel 6 beschriebenen V/eise mit Athylendiaminomethylgruppen substituiert und mit Enzym beladen. Tabelle 2 zeigt, daß auch bei diesem Trägertyp die Rezeptur für die Polymermatrix gemäß Beispiel 1 zu der höchsten enzymatischen Aktivität des Träger-Enzym-Komplexes und zu einem Produkt hoher Reinheit führt. Die mechanisch unzulängliche Variante gemäß Beispiel 10 bleibt für den praktischen Einsatz ausgeschlossen (Tabelle 2).

Claims

219993

Erf in dungs an spräche

1. Verfahren zur Herstellung poröser Enzym-Polystyrol-Komplexe durch Copolynierisation von Monomeren mit einer und Monomeren mit mehreren Vinylgruppen in Gegenwart eines Inertstoffes, Funktionalisierung des Copolymeren an den aromatischen Kernen, Alctivierung und Enzymbindung, dadurch gekennzeichnet, daß für die Herstellung des Copolymeren ein Verhältnis zwischen den Monomeren mit einer und den Monomeren mit mehreren Vinylgruppen von 8 : 2 bis 9»5 5 0,5 Gewichtsteilen gewählt und der Inertstoff in einer Menge von 0,75 "bis 0,90 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil der Monomeren verwendet wird, die Funktionalisierung des porösen Copolymeren mittels polymeranaloger Reaktionen und Aktivierung sowie Enzymbindung auf bekannte Weise erfolgen.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Copolymerisat aus Styrol, ÄthyIvinyIbenζöl und Divinylbenzol verwendet wird.
3. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Inertstoff ein aliphatischer Kohlenwasserstoff oder ein Aliphatengemisch mit einem Siedebereich von 80 bis y
wendet wird.

von 80 bis 300 ⁰C, insbesondere von 1?0 bis 225 ⁰C, ver-

Verfahren nach den Punkten 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Copolymerisation in wäßriger Suspension durchgeführt wird.

Verfahren nach den Punirten 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß durch polymeranaloge Reaktionen in das Copolymere Aminomethylgruppen oder Ithylendiaminomethylgruppen oder andere Polyalkylenpolyaminomethylgruppen eingeführt werden.

219993
6. Verfahren nach den Punkten 1 bis 5> dadurch gekennzeichnet, daß das mit Glucöamylase beladene funktionalisierte Copolymere zur enzymatischen Hydrolyse von Stärke oder deren Teilhydrolysaten verwendet wird.