DD149159A1 - Verfahren zur herstellung von influenzavirus-subeinheiten-impfstoff - Google Patents

Abstract

Spaltung und Trennung von Influenza-Vollvirus in Untereinheiten und Herstellung eines Subeinheiten-Impfstoffs. Selektive Gewinnung der Protextiv immunogen wirksamen Huellproteine Haemagglutinin und Neuraminidase von Influenzaviren durch Einwirken einer Protese mit nachfolgender Trennung von der restlichen Virussubstanz. Die immunogenen Huellproteine Haemagglutinin und Neuraminidase von Influenzaviren lassen sich selektiv von Vollviruspartikel mit einer Protease (z.B. BROMELAIN) freisetzen und dann von der restlichen Virussubstanz abtrennen (z.B. durch Ultrazentrifugation), um aus ihnen unter Zugabe von einem Adjuvans einen Subeinheiten-Impfstoff zur Immunprophylaxe der Influenza herzustellen. Anwendungsgebiet: Entwicklung und Produktion von inaktiven Influenzavirusimpfstoffen.

Description

Titel der Erfindung

Verfaliren zur Herstellung von IniQusnsavirus-Subeinheiten-iliapfstoff

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von inaktiven Influenzavirus-Isipfstoffen, die nur die protektiv imniunogen wirksamen Strukturproteine (Hüllproteine) Hämagglutinin und Neurarninidase von humanen oder animalen Influensaviren enthalten, zur parenteralen Anwendung beim Menschen, wobei von einem nach einem bekannten Verfahren hergestellten, gereinigten Yiruskonaentrat mit einem Gehalt an viralem Protein av/ischen 2 und 40 reg/ml ausgegangen wird. Die Anwendung der Erfindung ist möglich in allen Einrichtungen und Betrieben, die auf dem Gebiet der Entwicklung und .Herstellung von Vixus-Iifflpfstoffen arbeiten, und ist besonders zweckmäßig in Produktionsbetrieben, die Influensa-Impfstoffe herstellen.

Charakteristik der bekannten lösungen

Bekannt ist, daß

-» für die protektiv iisnimogene Wirkung inaktiver Influenzavirus--Impfstoffe von den 8 bekannten Strukturproteinen.des Influenza-Virus nur die beiden Eüllproteine Häraagglutinin und Keuraoinidase verantwortlich sind, wehrend die internen Proteine einschließlich des Virusgenoras keine protektiv immunogene ΐ/irkung entfalten,

-' alle nicht zur protektiven Immunität führenden Bestandteile des Influensavirus (nicht protektiv imniunogen. v/irksame Proteine, Lipide) und, soweit sie im Impfstoff vorhanden sind, organische Bestandteile aus dem jeweiligen Vermehrungssubstrat für das Virus .(k₄B_s Ei-Protein) und diebische Zusätze zur Inaktivierung des ·

Virus-Genoms (ζ.Β_β Formalin) Ballaststoffe darstellen, die bei der parenteralen Anwendung zu unerwünschten lokalen und/oder systemischen Real?;- , tionen führen, .

'-' proteolytische Enzyme und/oder Detergentien das Influenzavirus teilweise oder ganz in seine Struktureinheiten zerlegen«

Der EisJQgel der bekannten Verfahren zur Herstellung von inaktiven Influenzavirus-Irüpf stoff en, in denen kein vollständiges Virus mehr vorliegt, besteht darin, daS

- Spalt-Impfstoffe (split-Impfstoffe), die durch Behandlung des Influenzavirus mit Reagensien hergestellt werden, die den lipid-Anteil der Virushülle herauslösen oder Spalt-Impfstoffe, bei deren Herstellung das Vollvirus durch Detergentien in Untereinheiten zerlegt Yard, diese aber nicht weiter aufgearbeitet und getrennt werden, außer den protektiv immunogen wirksamen Strukturproteinen Kämagglutinin und Neuraminidase noch die internen Proteine einschließlich des Virusgenoms enthalten, und letzteres eine Inaktivierung erfordert, um die Vemiehrungsfähigkeit auszuschließen,

- nach Behandlung des Influenzavirus mit proteolytischen Enzymen ein Gemisch aller Strukturproteine vorliegt, aus dem die beiden Hüllproteine, die die Bestandteile von Subeinheiten-Impfstoffen darstellen sollen, jeweils mit geeigneten Methoden isoliert werden müssen,

- daß es möglich ist, mittels eines besonderen Eetergens die beiden Hillproteine Häsagglutinin und Neuraminidase selektiv vom Viruskörper (core) abzulösen« _o

Ziel der Erfindung . · . .

Die Erfindung hat das Ziel, in einem einfachen technologischen Prozess 'unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms einen Influensavirus-Subeinheiten-Impfstoff herzustellen, d«h« einen Impfstoff, der als protektiv iicrauTiogen wirksames Prinzip nur die Hüll proteine Häjaagglutinin und lieuraminidase enthält, und der daher frei von Ballaststoffen einschließlich des Virusgenoms ist, die unerwünschte Reaktionen hervorrufen können, und der wegen seiner guten lokalen und systemischen Verträglichkeit auch bei Kindern und bei Risikopersonen, bei denen die Anwendung von Vollvirus-Impfstoffen oder Spalt-Impfstoffen kontraindiziert, die Erzeugung einer Immunität aber wünschenswert ist, zur Immunisierung gegen Influenza eingesetzt werden kann» - -

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die auf der Oberfläche des Influerisavirus-Partikels befindlichen Glykoproteine Hämagglutiiiin und ^euraminidase unter Erhaltung ihrer protektiv iramunogenen Y/irksamkeit selektiv abzulösen, von den übrigen Virusbestandteilen abzutrennen und aus ihnen unter Zusatz von Adjuvantien einen Impfstoff (Subeinheiten-Impfstoff) herzustellen« Es wurde gefunden, daß

- sich die Bullproteine des Influensavirus Häraagglutinin und Ileuranjinidase im geeigneten pH-Eereich durch Enzymeiß.virkung selektiv von der Virusoberfläche abtrennen lassen,

- die übrige, in ihrer Struktur erhalten gebliebene Virussubstans (core) sich rückstandslos aus dem Reaktionsgemisch entfernen läßt, z.B. durch Sedimentation in der Ultrazentrifuge,

- die Hüllproteine Hämagglutinin und Keuraminidase angereichert werden können, z.B, durch Ultrazentrifugation,

Die erfindungsgemäße Technologie ermöglicht es somit, einen inaktiven Impfstoff zur Iramunprophylaxe der Influenza herzustellen, der

- in seiner protektiv immunogenen Y/irksamkeit Vollvirus- und/oder Spalt-Impfstoffen gleichwertig oder überlegen ist,

- in seiner lokalen und systemischen Verträglichkeit Vollvirus- und/oder Spalt-Irnpf stoff en überlegen ist,

- im Gegensatz zu Yollvirus- und/oder Spalt-Icipfstoffen auch bei Kindern und Risikopersonen angewendet werden kann,

- der sich durch eine außerordentlich hohe Stabilität hinsichtlich des Gehaltes an hämagglutinierender Aktivität auszeichnet.

AusfüfcruTigsbeispiele

1«1« Viruskonzentrat mit 2 - 40 mg Virusprotein/ml 1_e2« dazu je 1/10 des Gesamtvoluaens

Puffer, pH 7,2

Che laplex-»Lösung

-Mercaptoäthanol

1«3β dazu 0,2 - 2,0 mg Enzym (ζ,B. Broinelain aus Ananasstengeln) pro mg Virus protein

1,4« Inkubation bei 37°C für 16-30 Std. unter Rühren 1₆5_e Zentrifugation für 90 min bei 100 000 χ g

1_e6* Überstand-im Saccharosegradienten (5 - 60 %) 4 - 18 Std, bei 100 000 x zentrifugieren·

1_β7· Fraktionieren zur Gewinnung von "Fraktionen mit hohem Hämagglutinin- und Ueuraminidase-Gehalt

1_Ö8* Adsorption von Kämagglutinin und Neuraminidase an A1(OH)_-Gel und Sedimentation des Komplexes durch Zentrifugation; gegebenenfalls Adsorption und Sedimentation 2 - 4mal v/iederholen

1,9, Einstellung des Al(OH)--Virusprotein-Komplexes auf einen bestimmr· ten Häaagglutiningehalt durch Verdünnen mit gepufferter Kochsalzlösung,

2_e Säulen-Verfahren (solid-phase-Verfahren) 2«1« entsprechend 1.1« 2,2. entsprechend 1«2« 2*3» 0,2 - 4,0 mg Enzym pro rag Virusprotein auf einen geeigneten Träger aufbringen, z,B« Glas, Polystyrol-Latex, Ionenaustauscherharze, Agarose, Zellulose

2«4« Einbringen des Enzym-TrägeriDaterials (solid-phase) sowie des Gemisches nach 2,2, in eine geeignete Säule

2,5« Inkubation der Säule bei 37°C unter Vibration für 16-30 Std.

2,6« Gewinnen des Reaktionsgemisches 2.7· Zentrifugation des Reaktionsgemisches für 90 Eon bei 100 000 χ g

2»S« Einstellung des überstaiads (Kämagglutinin- und l-ieuraminidase-Gemisch) mittels gepufferter Kochsalz-Lösung auf einen bestinanten Häasagglutlningehalt unter Zugabe von Adjuvans.

3.1. entsprechend 1.1* 3e2, entsprechend 1_β2_Φ 3β3» 0,2 - 4,0 ing Enzym pro mg Virusprotein auf eine geeignete Membran

aufbringen ' '

3«4β Auftragen des Gemisches aus 3»2« auf die Membran 3,5« Inkubation der überschichteten Membran bei 37°C unter Vibra-. tion f-llr 16 ~ 30 Std*

3*6« Filtration des Inlcubationsgeinisch.es durch einen Membranfilter mit einer Porengröße, die nur für Substanzen in der Größenordnung der Hüllproteine Hämagglntinin und Neuraminidase durchlässig ist

3e7. entsprechend 2»8,

Claims (1)

1. - 6 - 2 I -7

   Patentansprüche·

   1· Verfahren zur Herstellung von Influensavirus-Sufceinheiten-Impf stoff gekennzeichnet dadurch," daß die protektiv immunogen wirksamen Struktur-'proteine Hämagglutinin und Neuraminidase mit einem geeigneten Enzym selektiv vom Yollvirus freigesetzt v/erden, von der nicht protektiv immunogen wirksamen Yirussubstanz' (cores) abgetrennt werden, angereichert werden, und unter Zugabe eines geeigneten Ad^uvans zu einem Impfstoff verarbeitet werden, der zur parenteralen Anwendung auch bei Kindern und Risikopersonen geeignet ist, und der sich durch eine Langaeitsta-

   . bilität hinsichtlich hätnagglutini er ender Aktivität auszeichnet.

   2« Verfahren nach''Punkt- 1, gekennzeichnet dadurch, daß Virusrnaterial in einem Percenter mit einem geeigneten Puffer und einem geeigneten Enzym versetzt und inkubiert wird, das Reaktionsgemisch zentrifugiert, der Überstand gradientenzentrifugiert und fraktioniert wird und die isolierten .protektiv imraunogen wirksamen Hüllproteine Kämagglutinin und Heuraminidase, an'ein geeignetes Adgoivans adsorbiert, als Ausgangsmaterial für die ImpfStoffherstellung verwendet werden«

   3e Verfahren nach Punkt 1. gekennzeichnet dadurch, daß Virusiaaterial,mit einem geeignetem Puffer vei^etzt, in eine, mit einem geeignetem Enzvffi-Trägeraiaterial gefüllte Säule eingebracht, inkubiert und das Re~ aktionsgemisch zentrifugiert wird und die gev/onnenen protektiv irsnunogen wirksamen Strukturpr.oteine, mit einem geeignetem Adjuvans versetzt, als Ausgangsmaterial zur liapf stoffhersteilung verwendet werden«

   4« Verfahren nach Punlct 1« gekennzeichnet dadurch, daß Virusmaterial mit einem geeignetem Puffer versetzt, auf eine mit einem geeignetem Enzym beschichtete Membran aufgebracht und inkubiert, das Reaktionsgemisch durch ein geeignetes Membranfilter filtriert wird und die isolierten, protektiv immunogen wirksamen Strukturproteine, mit einem geeignetem Adjuvans versetzt, als'Ausgangsmaterial zur ünpfstoffherstellung verwendet ?/erden«

   5β Verfahren nach Punkt "U, 2», 3. und 4« gekennzeichnet dadurch, daß als Enzym zur selektiven Abspaltung der protektiv immunogen v/irksamen Hüllproteine Haaagglutinin und lieuraminidase voa Vollviruspartikel von üdEluensaviren die pflanzliche Protease Bromelain verwendet vdrd«