DD141528A1 - Verfahren zur kultivierung von hefen - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Methanol betrifft das Gebiet der technischen Mikrobiologie. Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch verbesserte Wachstumsbedingungen im Fermentor kürzere Durchflußraten und höhere Ausbeuten zu erzielen sowie die Ökonomie dieser Verfahren noch dadurch zu verbessern, daß die Kultivierung unter ungeschützten Bedingungen und ohne Zusatz von Wuchsstoffen durchgeführt wird. Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß die Methanol utilisierende Hefe gemeinschaftlich mit einer zweiten Hefe kultiviert wird, die selbst kein Methanol utilisiert, weswegen ein zweites Substrat, wie z.B. Kohlenhydrate, insbesondere Saccharose, n-Paraffine, Alkohole, Fettsäuren oder technische Produkte, die diese Substanzen enthalten, zugegeben wird. Dieses Substrat wird von der Methanol utilisierenden Hefe nicht oder nur schlecht utilisiert. Es wird so dosiert, daß seine Restkonzentration im Fermentationsmedium nahe 0 ist. pH-Wert und Temperatur werden so gewählt, daß sie am Rande des Optimums der Methanol-Hefe liegen, d.h. Temperatur > 36 °C. Die Erfindung betrifft das Anwendungsgebiet der Zellsubstanzsynthese,

Description

Verfahren zur Kultivierung von Hefen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Methanol als C-Substrat. Die Erfindung kann angewandt werden auf Permentationsprozesse, die diskontinuierlich und kontinuierlich betrieben werden

Sie gehört in die IPK C 12 B - 1/20.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Methanol sind in großer Zahl bekannt. Charakteristisch für diese Verfahren ist, daß Wuchsstoffe zum Permentationsprozeß hinzugesetzt werden müssen und dieser unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muß. Beides wirkt sich jedoch nachteilig auf die Ökonomie der Verfahren aus. Außerdem weisen Methanol utilisierende Hefen meist relativ geringe Wachstumsgeschwindigkeiten auf.

So wird nach der GB-PS 1 342 744 eine Hefe der Art Candida mit Methanol bei einem pH-Wert von 4,0 bis 5,0 und einer Temperatur von 30 bis 40 ⁰C unter Zusatz von Hefeextrakt oder Thiamin-hydrochlorid und Biotin kultiviert

Nach der GB-PS 1 423 642 wird eine Hefe der Art Candida alcomigas (PERM P-1973) mit Methanol bei 30 ⁰C und pH 4,7 unter sterilen Bedingungen unter Zusatz von Biotin und Thiamin-hydrochlorid diskontinuierlich kultiviert.

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In einem bereits vorgeschlagenen Verfahren (WP C 12 D/173 437) wird die Kultivierung von langsam wachsenden Methanol utilisierenden Hefen beschrieben. Es handelt sich dabei um die Kulturen der Art Hansenula sp. II G 53/2, Candida boidini Ramirez und Pichia pinus (Holst) .Pfäff II 21£ f, die bei einem pH £ 4,0 und bei einer Temperatur von 28 bis 30 ⁰C ohne Zusatz von Wuchsstoffen gezüchtet werden können. Unter unsterilen Bedingungen beträgt die Bakterieninfektion £ 20% der Zellzahl.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Kultivierungsbedingungen Methanol utilisierender Hefen so zu gestalten, daß der Fermentationsprozeß ungeschützt und ohne Zugabe von Hefeextrakt oder anderen wachstumsfördernden Substanzen durchgeführt werden kann und daß gleichzeitig die Wachstumsgeschwindigkeit· der Methanol utilisierenden Hefe und die Ausbeute an HTS/g utilisiertem Methanol erhöht wird,

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Kultivierungsbedingungen Methanol utilisierender Hefen so zu gestalten, daß unter ungeschützten Bedingungen diese Hefen einen Wachstumsvorteil gegenüber unerwünschten Infektionen erhalten. Dieses Ziel wird überraschend dadurch erreicht, daß man die Kultivierungsbedingungen der Methanol utilisierenden Hefe gegenüber den bekannten Verfahren folgendermaßen verändert: 1· Erhöhung der Fermentationstemperatur auf die für die entsprechende Hefe noch optimal mögliche Temperatur»

2. Senkung des pH-Wertes des Fermentationsmediums auf einen für die entsprechende Hefe noch minimal möglichen Wert, mindestens jedoch auf pH 3,6 bis 4,0«

3. Zugabe eines zweiten C-Substrates und einer dieses C-Substrat aber kein Methanol utilisierenden Hefeart und gemeinschaftliche Kultivierung. Dieses zusätzliche C~Substrat ist so au s zuwähl en j. daß die Methanol utilisierende Hefe dieses nicht, oder schlechter als die zweite Hefeart utilisieren kann,, so -daß jede Mikroorganismenart ihr

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bevorzugtes Substrat hat.

4. Die Dosierung des zweiten C-Substrates muß so erfolgen, daß die aktuelle Restkonzenti-ation dieses Substrates wachstumsstimulierend für die zweite Hefekultur ist, während die Methanoldosierung so* erfolgen muß, daß die Methanolrestkonzentration über der wachstumslimitierenden Methanolkonzentration liegen muß, jedoch nicht auf die zweite Hefeart wachstumsinhibierend wirkt.

Bei der gemeinsamen Kultivierung des Methanol utilisierenden Mikroorganismus und des das zweite C-Substrat utilisierenden Mikroorganismus unter den angegebenen Kultivierungsbedingungen wird die Wachstumsgeschwindigkeit der Methanol utilisierenden Hefe um ca. 20% erhöht. Darüberhinaus wurde überraschenderweise gefunden, daß der Zusatz von Wuchsstoffen, wie Thiamin und Biotin oder Hefeextrakt, wie er für die bekannten Verfahren der Kultivierung von Methanol utilisierenden Hefen erforderlich ist, bei der erfindungsgemäßen gemeinsamen -Kultivierung mit nicht Methanol utilisierenden Hefen nicht erforderlich ist, Bei Einhaltung der angegebenen Kultivierungsbedingungen treten auch im kontinuierlichen ungeschützten Prozeß praktisch keine Infektionen von Bakterien auf, d.h. der Anteil der Bakterien in der Kulturflüssigkeit ist < 10%. Als zusätzliche C-Quelle für die Begleithefe eignen sich alle C-Quellen, die von der Methanol utilisierenden Hefe nicht oder nur schlecht utilisiert werden können, z.B. Kohlenhydrate, insbesondere Saccharose, Fettsäuren, Alkohole, wie n«Paraffine, oder technische Produkte, die diese Verbindungen enthalten, wie Sulfitablaugen, Melasse, Schlempe, Molke. Als Hefe, die auf diesem zweiten Substrat gemeinsam mit der Methanol utilisierenden Hefe kultiviert werden soll, eignen sich alle Hefearten, die unter den angegebenen Kultivierungsbedingungen noch ein gutes Wachstum haben, wie z.B. Candida, Saccharomyces, Hansenula.

Folgende Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1:

Der Methanol utilisierende Hefestamm Hansenula polymorpha (KT2) wurde im kontinuierlichen Prozeß gemeinsam mit dem Hefestamm Candida utilis unter folgenden Bedingungen kultiviert:

Temperatur 41 ⁰C

pH-Wert 3,9

Die Nährlösung enthält pro 11:

10	H3PO4 (85%-ig)	2,8	g	• •	g
	K2SO4	2,0	g	g
	NH4Cl	1,0	g	g
	MgSO4	0,8	g	g
	Spurenelementlösung	4,5	ml	g
15	Methanol	30,0	g	g
	Saccharose	10,0	g	g
	Spurenelementlösung	pro 1 1	g
	CuSO4 . 5 H2O	1,6	g
	CoSO4 . 7 H2O	0,4	ml
20	MnSO4 . 4H2O	2,5
	H3BO3	0,5
	PeSO4 . 7 H2O	4,1
	Na2MoO4 . 2 H2O	0,4
	ZnSO.	2,6
25	NaCl	5,0
	Ca(NO3)2 . 4 H2O	4,7
	HpSo4 cone.	10

Die pH-Regelung erfolgte mit 2,5%-iger NH.OH Lösung, Die Fermentation fand in einem 12 1 Rührkessel statt, Die Restkonzentration an Saccharose betrug ^ 0,01 g/l, die Methanolrestkonzentration betrug 0,85 g/l. Es wurden folgende Ergebnisse erreicht:

=16,7 g-HTS/1

— 5 —

-s- 211271

Das entspricht einem berechneten oi _χ = 2,36 g Methanol/ g HTS, bei einem X ^= 2,5 g Saccharose/g HTS.

Wird hingegen mit der gleichen Nährlösung und mit einem Zusatz von 0,5 g Hefeextrakt/l ohne Zuckersubstrat unter den für die Hefe KT2 optimalen Bedingungen von 38 ⁰C und pH 4,5 mit der Hefe KT2 kontinuierlich unter sterilen Bedingungen kultiviert, so werden maximal erreicht:

/U = 0,11 h"¹ χ = 10 g HTS/1

ώ I = 3,0 g Methanol/g HTS

Jim

Unter den gleichen Bedingungen wie b., jedoch ohne Zusatz von Hefeextrakt findet kein Wachstum statt.

Unter den gleichen Bedingungen wie b., jedoch unter ungeschützten Bedingungen tritt eine starke bakterielle Infektion auf.

Beispiel 2:

Die Methanol utilisierende Hefeart Torulopsis norwegica (MH20) wurde im kontinuierlichen Prozeß gemeinsam mit der Hefe Candida utilis unter folgenden Bedingungen kultiviert: Temperatur 38 ⁰C

pH-Wert 4,0

Nährlösung wie Beispiel 1a Substrat " 30 g/l Methanol

10 g/l Saccharose Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

- -6 -

-«- 211271

-1

/^umax⁼ °,166

x =15,8 g HTS/1

Die Restkonzentration an Saccharose betrug έ 0,01 g/l. Die Restkonzentration an Methanol betrug 0,93 g/l#

b..

Wird hingegen mit der gleichen Nährlösung und einem Zusatz von 0,5 g/l Hefeextrakt und einem Substratangebot von 30 g Methanol/l unter den für.die Hefe MH20 optimalen Bedingungen von 35 ⁰C und pH = 4,3 kontinuierlich fermentiert, so werden maximal erreicht:

/U = 0,102 IT¹ χ = 9,7 g HTS/1

Unter den gleichen Bedingungen wie 2 a«, jedoch ohne Zusatz von Hefeextrakt findet kein Wachstum statt.

Claims (4)

1. ν,

   Patentanspruch

   1. Verfahren zur Kultivierung von Hefen auf Methanol, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung gemeinschaftlich mit einer kein Methanol utilisierenden Hefe und einem von dieser Hefe utilisierbaren Kohlenstoffsubstrat bei einer Temperatur von ^ 36 C und einem pH-Wert £ 4,0 unter vorzugsweise ungeschützten Bedingungen durchgeführt wird.

   2. Verfahren nach Punkt 1, dadurchgekennzeichnet, daß als Kohlenstoffsubstrat für die kein Methanol utilisierende Hefe Kohlenhydrate, insbesondere Saccharose oder n-Alkane, Fettsäuren, Aldehyde verwendet werden.
2. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des Kohlenstoffsubstrates für die kein Metha-
3. 1.5 nol utilisierende Hefe 10 bis 100 Gew,% des Methanols beträgt.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß die kein Methanol utilisierenden Hefen vorzugsweise den Gattungen Candida, Hansenula, Saccharomyces angehören.