CZ397991A3 - Cyclic anti-aggregation peptides - Google Patents

Description

Vynález se týká nových peptidů, které inhibují agregaci destiček, farmaceutických prostředků s jejich o&sahem a metod pro použití těchto peptidů. Zvláštní pozornost je věnována metodě , využívající kombinaci vynalezených peptidů s fibrinolytickými látkami.

Dosavadní stav techniky

Vzniku krevní sraženiny předchází složitý proces. Sraženina se skládá ze shluku krevních destiček propíjených polymerní fibri· novou sítí. Proces srážení normálně začíná po poranění tkáně a má za následek zpomalení nebo zastavení průtoku krve cévou. Další faktory s odlišnou etiologii, jako je aterosklerotická plaka, zánět cév /flebitida/ a septikemie, mohou také iniciovat tvorbu sraženiny. V některých případech je nevhodný vznik sraženiny a následující omezení průtoku krve příčinou mozkové mrtvice, plicní embolie nebo poruchy srdeční činnosti.

Krevní destičky mají klíčovou úlohu v tvorbě sraženiny.

V současné době se v antitrombotické léčbě používají látky, které ovlivňují arachidonát - prostaglandinový systém s destiček a endoteliálních buněk, jako jsou např. analogy prostacyklinu, inhibitory cyclooxygenázy, inhibitory syntézy tromboxanu a antagonisté tromboxanového receptoru. Dále se používají látky s· protisrážlivým účinkem, jako je heparin. Všechny tyto látky inhibují jednu nebo obě rozeznatelné fáze agregace destiček. V prvotní fázi, která je odpovědí na chemické podněty, jako je adenosin difosfát /ADP/, kolagen, noradrenalin nebo trombin, je zahájena aktivace destiček. V následující druhotné fázi, která je spuštěna samotnými destičkami, se syntetizuje tromboxan Ag /TxA₉/ a uvolňuje se další ADP ze zásobních granulí destiček, což dále aktivuje destičky.

Prostacyklin, který se také nazývá prostaglandiii I₂ /PGIg/ , ^a stabilní analogy PGI₂ inhibují jak primární, tak sekundární fázi agregace destiček. Podávání těchto analogů Jtyrlo však provázeno nežádoucími změnami krevního tlaku.

Viz Aiken a další, Prostaglandins 19, 629, 1980.

Inhibitory cyklooxygenázy a třomboxan syntetázy blokují vznik TxA₂· Antagonisté TxA₂ blokují účinky TxA₂ tím, že se váží na receptor pro TxA₂· Tytu způsoby léčby účinkují jenom na druhotnou fázi aktivace destiček. Použití inhibitorů cyklooxygeázy bylo provázeno ulcerogenezí a potlačením: syntézy prostaglandinu.

Heparin brání aktivaci fibrinogenu trombinem, čímž je znemožněna aktivace receptorů GPIIb - lila trombinem. Takto je inhibována jen prvotní fáze agregace destiček, zatímco aktivace destiček jinými způsoby, jako např.kolagenem,' ADP a noradrenalinem, je ovlivněna málo.

Inhibitory cyklooxygenázy, analogy prostaglandinu a heparin inhibují agregaci destiček nepřímo, tím že inhibují prvotní nebo druhotnou fázi aktivace destiček a. fibrinogenu. Vyvstává tedy potřeba selektivních terapeutických prostředků, které by blokovaly agregaci destiček přímo, bez ohledu na to, zda se jedná o prvotní nebe druhotnou fázi aktivace destiček.

Agregace destiček je zřejmě hlavně zprostředkována GPIIb-IIIa receptorovým komplexem destiček. Von Willebrandův faktor, což je plasmatický protein, spolu s fibrinogenem se váže na GPIIb -lila; receptory, vytváří příčné vazby mezi přilehlými destičkami a tím ovlivňuje agregaci destiček. Dalšími bílkovinami, které se váží na GPIIb-IIIa jsou fibronektin, vitronektin a trombospondin. Pibronektin se nachází v plasmě a je také strukturální bílkovinou intracelulární matrix. Vazba mezi strukturálními bílkovinami a GPIIb-IIIa může způsobit adhezi destiček k poškozeným cévním stěnám.

Důležitost GPIIb-IIIa receptorů pro agregaci destiček

- 3 byla prokázána metodami, které blokují receptor. Coller a další, Blood 66, 1456-9, 1985, ukázali, že protilátky k tomuto komplexu inhibují agregaci destiček vyvolanou· podáním ADP v pokusech na psech.

Peptidové fragmenty lidského plasmatického fibronektinu a syntetické peptidy obsahující RGD sekvenci podporují vazbu buněk a zesilují fagocytozu, jak je doloženo v U.S Patent 517686, U.S. Patent 4 589 881, U.S.Patent 4 661 111 a U.S. Patent 4 61 4 517. Lineární a·, cyklické peptidy obsahující RGD sekvenci byly také popsané v WO 39/0515 0 , PCT US88/04403.

Bylo zjištěno, že peptidy obsahující RGD sekvenci inhibují agregaci' destiček. V práci Nievelsteina a dalších, Thromb. and Hemostasis, 53, 2133, 1987 je uvedeno, že peptidy, obsahující RGDS inhibují trcmbinem indukovanou agregaci destiček a jejich adhesi k fibronektinu. Tyto peptidy mohou interagovat s GPIIb-IITa komplexem. U.S. Patent 4 683 291 popisuje peptidy obsahující Arg a Lys i RGD sekvenci, které inhibují vazbu fibrinoger.u na destičky a brání agregaci destiček. Nevýhodou těchto peptidů je jejich malá stabilita v plasmě a nízká účinnost. EP 0 275 748 uvádí lineární tetra- až hexapeptidy cyklické hexa- až o

Ktareptidy >re se vezou

GPIIb-IITa receptor a inhibují agregaci destiček. Tyto cyklické peptidy mají mezi dvěma cysteinylovými zbytky disulfidový můstek. Další lineární a cyklické peptidy jsou popsány v EP-A 0 341 9¹·5· Tyto cyklické struktury obsahují di sulfidový kruh tvořený dvěma alifatickými aminokyselinovými zbytky, které mají sulfhydrylové skupiny.

Zde popisovaný vynález předkládá cyklické sloučeniny, jejichž cyklická struktura zahrnuje homodetický peptid, v němž je kruh utvořen pept.idovou vazbou, nebo heterodetický peptid, jehož kruh tvoří alkylenový, sulfidový nebo dlsulfidový můstek. Tento vynález dále přináší cyklické sloučeniny, v nichž se jednotka 3-Gly-Asp-Q, která bude později uvedena -viz vzorec I, vícekrát opakuje. -Je pozoruhodné, že syntéza tak neobvyklých kruhových struktur poskytla {armakologicky aktivní sloučeniny. Bylo také zjištěno, že protiagregační akti vita není podmíněna ani koncovou aminoskupinou, ani koncovou

karbonylovou skupinou. Sloučeniny, které jsou předmětem tohoto vynálezu jsou odolné vůči štěpení proteázami plasmy a selektivně inhibují jenom vazbu k fibrinogenověrnu receptoru, aniž by měly vliv na ostatní integrinové receptory, jako je vitronektin nebo fibronektin. Výhodou, vynalezených sloučenin je tedy jejich schopnost inhibovat agregaci destiček bez toho, aby ve větší míře inhibovaly adhesi destiček k jiným integrinovým receptorům.

V současné době léčba oklusí tepen a trombózy hlubokých žil zahrnuje použití fibrinolytických látek pro rozpuštění krevní sraženiny nebo vmetku, aby se obnovil nebo zlepšil krevní oběh. Fibrinolytické. látky, jako je tkáňový aktivátor plasmino.genu /tPA/ , urokináza /UK/, pro-Urokináza /pUK/ a streptokináza /SK/, stejně jako mutací změněné bílkoviny nebo deriváty, jsou\prot,e,olytické enzymy , které způsobují hydrolýzu fibrinu na. specifických místech a tak umožňují rozštěpení fibrinové sítě. V živém, organismu proteolyticky aktivují plasminogen v krvi za vzniku plasminu. , který způsobí rozpuštění fibrinové sraženiny. Štěpení fibrinu na menší peptidy vede k rozpuštění krevní sraženiny nebo vmetku. Tato léčba je však komplikovaná tím, že se cévy mohou znovu ucpat vytvořením druhotní krevní sraženiny.

Pro. obnovení průtoku krve v cévě ucpané krevní sraženinou se nejčastěji používá fibrinolytické terapie. Faktory, které jsou odpovědné za iniciaci vzniku krevní sraženiny však fibrinolytická terapie nemůže ovlivnit. Z tohoto důvodu se často⁷ používá hepari^i, aby se zabránilo opakovanému ucpání cév.

U pacientů, k^ří mají velmi silně zúžené tepny, je riziko opakované trombózy po obnovení krevního oběhu velmi vysoké.

Viz Gold a další, Circ., 73, 347-52, 1986. Navíc byl pozorováno, že při použití SK a tAP může dojít k zvýšené agreagaci destiček.. Viz Ohlstein a další, Thromb. Res., 4, 575-85, 1987.

Léčba vyššími dávkami tPA cením a není doporučována cév. Ukazuje se tedy, že by zabránila opakovanému nolytické terapii.

může být provázena systémovým krvájako prevence opakovaného ucpání je potřeba vypracovat metodu, která tvoření krevní sraženiny po fibriλ ., - 5 V

U.S. Patent 917 122 popisuje antagonisty TxA^ pro použi ti v metodě , sloužící inhibici opakovanému ucpání cév po obnovení krevního oběhu a snížení dávky tPA nutné pro fibrinolyzu. Yasuda a další, Glin. Res., 34, 2, 1986, ukázali, že opakovanému ucpání cév krevní sraženinou z fibrinu a destiček po rozpuštění sraženiny tPA může být zabráněno myší monoklonální protilátkou k GPIlb-IlIa u psů. Tento vynález popisuje metodu , která brání opětovnému ucpání cév; podáváním peptidů, které inhibují přímo; agregaci destiček.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je sloučenina obecného; vzorce I:

! \

Z,-A'-A-(B<-ly-Asp-Q)_n-tí-Z₂ ../--(i) kde k' je buč nepřítomen, nebo představuje Asn, Gin, Ala nebo Abu

A je buč nepřítomen, nebo představuje B- nebo L-amir.okyselim;, 3 to Arg, HA.rg, (Kej) Arg, (M₂)Arg, Abu, Ala, Gly, His, Lys nebo její <x-R^z substituovaný derivát, dále pak Dtc, Tpr nebo. Pro;

Bi znamená B- nebo L-aminokyselinu, a to Arg, HA.rg, NArg, (Me₂)Arg, (Et_o)Arg, Lys, nebo její (X-R/ substituovaný derivát ;

Q je buč nepřítomen , nebo předsavuje B- nebo L-aminokyselinu, .a· to Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4^zW)Phe, HPhe, Phg, Pro, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Cys, (Alk)pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle nebo Nal, neb· její X-R^z substitueva ný derivát;

M je buč nepřítomný, nebo znamená B- nebo L-aminokyselinu, a to Glu, Phe, Pro, Lys, Ser anebo, je-li n rovno 1, 3-Gly-Glu-Q;

W je buč halogen nebo Alk;

- 6 •V'

CO-

Zg znamená

b)ⁿ

R

Y nebí

kdeZ- a Z_o jsou spojen movalenI 12 tni vazbou mezi L a L ;

L¹ a X nebo 7y a Zg jsou kovalentní vaz ba mezi aminokoncovým zbytkem a karboxykoncovým zbytkem;

ΙΛ znamenají -S- nebo -(CHg)_O-; je R^R^N nebo H; .. je H, C0NR,R_o nebo COJR-;

Rg jsou H, Alk nebo (CHg) Ar;

Rg- jsou H, Alk, (CH₂)_DAr anebo dohromady znamenají

-(CHj.-nebc ;

- 7 v •i

R^ je H nebo Alk;

R₅ je R_n, R_nCO, R^OCO, R_{] 1}0CH(R₁₁ ')CO, R_j jNHCH tR^^CO, R^SCH(R^^CO, R^SO^ nebo R^SO;

Rg je Alk, OAlk, halogen nebo X;

Ry je H, Alk, CAlk, halogen nebo Y;

Rg a Rg* jsou H, Alk, (CH₂) Ph, (CH₂)_pNph,anebo dohromady představují nebo ;

je H, Alk nebo Y;

je H nebo Alk;

R,.a R. * jsou H, C^^alkyl, C₃_yCyfcloalkyl, Ar,

Ar-C₁_galkyl, Ar-C₃_yCyfeloalkyl;

Ar je fenyl nebo fenyl substituovaný jednou nebo dvěma • q. alkylovými', triflubrbmetylovými , hydroxy-, C, _K· i -y ¹ alkoxy- nebo halogenovými skupinami; n. je 1 nebo 2:

q je 0 nebo 1;

p je 0, 1, 2 nebo 3 a farmaceuticky aktivní soli výše zmíněných látek;

podmínkou je, aby když n rovná se 1 a Z, je X-Cys, X-Pen nebo X-APmp, Z₂ není Cys-Y, Fen-Y nebo A?mp-Y.

Tento vynález se také týká farmaceutického, prostředku, inhibujícího agregaci destiček a tvorbu krevní sraženiny, který obsahuje sloučeninu vyjádřenou obecným vzorcem 1 a farmaceuticky vhodný nosič..

Součástí vynálezu je metoda, která zabrání agregaci des· tiček v organismu savce, u kterého hrozí agregace destiček. Metoda spočívá ve vnitřním podání účinného množství sloučeniny obecného vzorce I.

Hodnotu vynálezu je nutno také posuzovat a toho hlediska, že poskytuje metodu bránící opakovanému ucpání tepny nebo žíly po trombolytické léčbě organismu savce. Metoda ř

spočívá v interním podání účinného množství fibrinolytické látky a sloučeniny, připravené dle obecného vzorce I. Tyto látky_? v kombinaci se známými fibrinolytickými látkami, jako je streptokináza /SK/, urokináza /UK/, pro-urokináza /pUK/ a tkáňový aktivátor plasminogenu /tPA/, nebo varianty či mutanty těchto látek,účinně brání opakovanému vytvoření krevní sraženiny.

Vynález se také týká farmaceutických přípravků určených pro- rozpuštění krevní sraženiny a obnovení krevního oběhu; navíc přípravky- brání opakovanému ucpání tepny nebo žíly savce. Přípravek se skládá z fibrinolytické látky, ze sloučeniny dle obecného vzorce I a z farmaceutického nosiče.

Vynález také představuje sestavu, 'obalu obsahuje fibřinolytickcu látku a ného vzorce I, a používá se při metodě která ve společném sloučeninu obectrombolytieké terapie.

Podrobný popis vynálezu

Předmětem vynálezu jsou cyklické sloučeniny, podobné peptidům, které obsahují sekvenci Gly-Asp. Vynalezené látky- inhibují agregaci destiček a předpoklá se, še interagu; s GPIIb-IITa receotorem a dalšími adhesními bílkovinami.

LA

Vynález se týká sloučenin, které, jak už bylo dříve řečeno, jsou peptidy obecného vzorce I.

B značí Arg nebo HArg, nebo ot-p/ substituovaný derivát Arg nebo HArg. Nejvhodnější v pozici 3 je MeArg.

V pozici A je nejvhodnější Dtc, Tpr nebo Pro, když A* značí Asm, Gin, Ala nebo Abu.

V představuje CONH_n nebo CO?K.

preferevjtné 12

V jedné subgenerické skupině sloučenin L' al oředstavují 8.

obě

- 9 Pro Z₉ je vhodné bu3

-^R7 nebo Pes.

-Hir

Pro Z₁ je vhodné buá nebo Cys..

-COPro RgS. Ργ je vhodné H.

Je vhodné, aby A* nebylo přítomné.

A je Sar nebo není přítomno.

V jiné preferované subger.erické skupině sloučenin jsou Z,a Z₂ dohromady· kovalentní vazba.

Je vhodné, aby A a A* nebyly přítomné, n bylo 2 a Z, a Z^ byly dohromady kovalentní vazba.

Pro. Q se hodí· Ser,/Me/Ser, Thr, Tyr, Phe· nebo Nal, je-li n rovno 2. Nejvhcdnější pro 1 je Phe.

o

V jiné subgenericke skupině sloučenin je L i ΙΛ CH?»

Ve vzorcích zde uváděných znamená X u Χ-Cys, X-Pen a. X-APmp aminoskupinu těchto aminokyselin. Podobně Y, je-li použito u Cys-Y, Pen-Y a APmp-Y, se týká substituovaných kjarbcxylových skupin těchto aminokyselin. Když Z^ a Z^ nejsou arylové zbytky, rozumí se, že mohou mít jedno nebo dvě chirální centra a že tento vynález zahrnuje každou jednotlivou neracemickou sloučeninu, kterou lze syntetizovat a oddělit konvenčními postupy.

Když Zj nebo Z₂ jsou fenyl, v pozici 1 je alkylenová nebo merkapto skupina., v pozici 2 je amino/karboxylová skupina, mohou být substituované v 3., 4. nebo 5. pozici Rg nebo R^. Když Z, nebo Z₉ jsou naftyl, merkapto nebo alkylenová skupina může být v pozici 1 nebo 2, amino/karboxylcvá skupina má orto polohu a naftylevý kruh může být substituovaný v kterékoliv pozici.

Het představuje substituovaný heterocyklus, pyridin, pyrol, pyrolidin, imidazol, tríazol, thiophen, furan a thiazol. Tyto heterocykly tvoří makrocyklický kruh uvnitř peptidu prostřednictvím, dvou substituentů v orto. poloze. Například je heterocyklické karboxylová kyselina, která, je připojena k peptidu prostřednictvím karboxylu a: k Z₂ skrze můstek v orto: poloze, podle definice I? . Podobně, Z2 může být heterocyklický amin, který je připojen k peptidu prostřednictvím aminu a k Z, skrze můstek, v orto poloze, který je označen L^.

Alkyl o 1 až 4 atomech uhlíku zde zahrnuje methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl a isobutyl. Ar představuje fenyl nebo fenyl substituovaný jedním nebo dvěma alkyly 0 1 až 4 atomech uhlíku, tři fluor ome tyl, alkoxy nebo halogenovou skupinu.

Tento vynález zahrnuje sloučeniny, vnichž je kterákoliv peptidové vazba -CCNK- nahrazena isosterickcu vazbou. Příkladem isosterických vazeb jsou: -NHCO-, -CH»CH-, -C^Cl·^-, -COCH₂-, -C00-, -CHCKCK?-, -CF^NE,-, -CSNH- a -CH?S-.

Specifickými sloučeninami' toho vynálezu jsou: cyklo -(S, s) -Mba -Arg-Gly-Asp-Cy s -NH,:

N*-Ac -cyklo , s) -Cys-Arg-Gly-Asp-Man; cyklo φ, S )-Mba -MeArg-Gly -Asp-Man j cy kl o -{S, 3 )-Mba -Me Arg -Gly -A s p -Pc s -NH ₂; cyklo - (S, S) -Mba -Sar -Arg-Gly-Asp-Man; cyklo- (S,S^-Mba -Sar-Me Arg-Gly-Asp-Man; cyklo- (S, S) -Mba -Arg-Gly-Asp-Man;

<eyklo-(S,s)-Mba-D-MeArg-Gly-Asp-Man; cyklo- (s,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-N-Me-Man;

N.^Ac-cyklo - (s, S ) -Cys -Me Arg-Gly-Asp- 2R, 3S Fcs'-NH₂ i N *A c -cy kl o - (3, S) -Cy s -Me Arg -Gly -A s p - 2R, 3 R Pc s -NH ₂ ;

N*Ac -cyklo - (3, S )-Cys -Arg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly -Asp-Ser-Cys -NH₂; N*Ac-cyklo-(S,3)-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₀. N**Ac-cyklo - (S ,3) -Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-MeArg-Gly-Asp-SerCys-NH_O;

N^t*Ac-cyklo-(s,S^-Cys-MeArg-Gly-Asp-3er-Arg -Gly-Asp-SerCys-NH₂;

N*Ac-Cy klo -(s,S)-Cy s-Arg-Gly-Asp-Ser-Lys-Gly-Glu-Ser-Cys -NH₂;

cyklo-(_i1^a,6^? -Gly-Arg-Gly-Asp-3er-Glu-NH₂;

cyklo- (1^a,6p -Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-Glu-NH₂ j cyklo-(1,8)-Arg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe;

cykle- (1 ,8 )-MeArg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe;

cyklo - (1 ,10)-Fro-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Prc-Arg-Gly-Asp-D-Phe;

cyklo - (1 ,6 )-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-D-Pro;

cyklo - (1 ,6 )-Fro-Gly-Arg-Gly-Asp-D-Pro j yklo- (1,6 )-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-?ro·;

'-o· cyklo·- (1 ,6)-Pro-Arg-Gly-Asp-Gly-D-Pro; cyklo- (1 ,6) -Pro-Arg-Gly-Asp-Gly-D-?he; cyklo-(I ,5) -D-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser; cyklo-(1,5 -Ala-A.rg-Gly-Asp-D-Ser a cyklo-(1 ,3)-11^-(/-(2- (?-amide-feny l) e Gly-Asp-ami d oenzo.

;o yj -Mí

Preferovanými sloučeninami tohoto.· vynálezu jsou: cyklo -(S,S)-Mha-Me Arg-Gly-As p-Man; cyklo-(S,SJ-Mba- Sar-MeArg-Gly-Asp-Man; N,^w‘Ac-cyklo-(s,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pcs a cy kl o (1 ,8) -Me Arg -Gly -A s p -Phe -Arg -Gly -A s p -Phe.

Pro popis peptidů je použiv šloví.

:o běžně zavedeného názvoAminokyselina třípísmenný kód jednopísmenný kód

alanin		Ala	Δ
arginin		Δ r σ	j-ť
kyselina	asparagová	Asp	D
cystein		Cys	v
glutamin		fi η
kyselina	glutamová	Glu	ΤΛ
glycin		Gly	G

jednopísmenný kód aminokyselina třípísmenný kód

histidin	His	H
isoleucin	Ile	-r
leucin	Leu	L
lysin	lys	K
methionin	Met	i/;
fenylalanin	Phe	y
prolin	Pro	p
serin	Ser	i?
threonín	Thr	rr
tryptofan	Trp	ν,τ
tyrosin	Tyr	. .. Y
valin	Val'	v
asparagin nebo kys.elina asparagová	A sx	3
glutamin nebo.	Glx
kyselina glutamová
Podle zavedených konvencí	se amino	konec peptidu píše
nalevo a karboxy konec napravo.	. Není-li	řečeno jinak, u
všech chirálních aminokyselin	/AK/ se předpokládá L-kon-
figurace. Další zkratky mají následujíc	í význam:

L-penicilamin či dimetylcystein kyselina 2-amino:-3,3-eyklopentametylen-3-merkaptopropionová kyselina 5,5-dimetylthiazolidin-4-karboxylové kyselina thiazolidin-4-karboxylové ky s e1i na 3-merkaptopro pionové kyselina 3,3-cyklopentametylen-3-merkaptopropionov kyselina 3-merkapto-3-metylcutanová 3-fenylcystein, racemický v poleze 3 (2P,33)-3-fenylcystein (2R, 3P)-3 -fenyl cystein

2-měrkaoto-anilin

Pen

APmp

Dtc

Tpr

Mpa

Pmp

Mdp

Pes (3S)Pcs (3R)Pcs

Man

Mba	kyselina 2-merkapto-benzoová
HArg	homoarginin
NArg	norarginin
(Meg)Arg	N' ,Ν’’-dimetylarginin
(Etg)Arg	N',N-dietylarginin
Nva	norvalin
N.le	norleucin
«K-MeAsp	N^-metylasparagová kyselina
Nal	beta-2-naftylalanin
Phg	fenylglycin
HPhe	homofenylalanin
Abu .	kyselina 2-aminomáselná
(Alk) Tyr	O-C, .alkyl-tyrosin I **4·
(Alk )3er	0-C, _^alkyl-serin
(Alk)Thr	0-C, _4alkyl-threcnin
(Alk)Cys	S-Cý^alkyl-cystein
(Alk)Pen	S-C. .alkyl-pěnicilamin
(4 'w) Phe	fenylalanin, substituovaný v pozici 4 fen, kruhu zbytkem. W
t-3u	terciární butylový radikál
3c c	t-butyloxykarbonylový radikál
Fmoc	fluorenylmetoxykarbonylový radikál
PÍ;	fenylový radikál
Cbz	karbobenzyloxy radikál
3rZ	0-bromobenzyloxykarbonylový radikál
C1Z	o-chlorobenzyloxykarbonylový radikál
Bzl	benzylový radikál
4-M3zl	4-metylbenzylový radikál
Ac	acetyl
Alk	alkyl s řetězcem 0 1 až 4 atomech uhlíku
Nph	1 - nebo 2- naftyl
cHex	cyklohexyl
DCC	dicyclohexylkarbodiimid
DMAP	dimetylaminopyridin
DIE A	diisopropyletylamin
EDC	N-etyl-N,(dimetylaminopropyl)-karbodiimi
HOST THE	1-hydroxybenzotriazol tetrahydrofuran
DMF	dimetylformamid

PPA cyklický anhydrid kyseliny 1-propanfosfonevé

DPPA difenylfosforylazid

BOP benzotriazol-1-yloxy-trisfdimetylamino)fosfonium hexafluorofosfát

HP kyselina fluorovodíková

TPA kyselina trifluoroctová

Pro vytváření peptidových vazeb se nejčastěji používají karbodiimidy, aktivované anhydridy a estery nebo acylhalidy, a to zejména reagencie EDC, DCC,DPPA, PPA, BOP, H03T, N-hydroxysubcinimid a c.xal ylchlcrid.

<X.-R^Z substituované deriváty aminokyselin, které jsou pře mětem. tohoto, vynálezu a označují se (cKr-R^AA, představují aminokyseliny s jednou substitucí na «X-aminoskupině skupinou R^?, přičemž R* je bu3 Alk nebo benzyl. R* je přednostně metyl N^-metylarginin a K^-metylglycin, označované (ťk-Me)Arg a (<X.-Me) Gly, se zde také označují jako: MeArg a Sar /sarkosin/ podle dřívějších konvencí. Všechny ostatní W-o<-substi tuované aminokyseliny budou mít ve svém názvu označení o<-. Ty amine kyseliny, které jsou slkylované na merkaptanoyé, guanidinové nebo hydroxylové skupině toto označení postrádají. (o(-Me)Ser je ty^-metylserin, lbe Ser je Q-metylserin, (o<-Me ,St) Ser je N*-metyl,Q-etylserin a ,Et£) Arg je

N*-metyl-N' N”-dietylarginin.

Peptidy jsou přednostně připravovány na pevné fázi metodou Merrifielda /J.Am.Chem.Soe., 85, 2149, 1964/, metody pro výstavbu peptidového řetězce v roztoku však. mohou také být úspěšně použity. Metody pro syntézu na pevné fázi a v roatoku je možno kombinovat, t.j. například připravit di'-, tri-, tetra-, nebo pentapeptidy syntézou na pevné fázi a pak bučí spojeny , nebo dále modifikovány syntézou v roztoku. Většina peptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu byla připravena podle metod Ali a další, J.Med.Chem. 29,

984, 1986 a J.Med.Cem., 30, 2291, i 987 .

Reaktivní funkční skupiny bočních řetězců každé aminokyseliny nebo peptidu jsou vhodně chráhěny metodami běžně požívanými v oboru chemie peptidů. Boc, Cbz nebo Fmoc skupiny mohou být užity pro chránění aminoskupiny, zejména pro p(-aminoskupinu. Pro ochranu oť-amino skupiny je nejčastěji používána Boc skupina. Postranní karboxy,lový řetězec Asp nebp Glu může být chráněn t-3u, cHex nebo benzyl esterem. Sezylová skupina nebo vhodně substituovaná benzylová skupina se používá pro ochranu merkaptoskupiny cysteinu nebo jiných zbytků obsahujících thiol, ale také hydroxylu šeřinu nebo threoninu. Tosylcvá skupina se užívá pro ochranu imidazolylove skupiny His. Tosyl nebo nitroskupina se používá pro ochranu guanidinového dusíku Arg. Vhodně substituovanou karbobenzyloxy skupinu nebo benzylovou skupinu je možno použít pro ochranu hydroxylové skupiny Tyr, Ser nebo Thr, nebo pro £-amihoskupinu lysinu. Ftalamidová skupina'může být také použita pro ochranu č-aminoskupiny lysinu. Karbobenzyloxy nebo benzylová chránící skupina může být vhodně substituována v orto i para poloze chloro, bromo, nitro nebo metylovým radikálem, čímž je modifikována reaktivita chránící skupiny. Cystein a další aminokyseliny obsahující síru mohou být také chráněny vytvořením disulfidu s thioalkylovou nebo tnioarylovu skupinou. 3 výjimkou skupiny Boc, nejlepšími chránícími skupinami jsou ty, které nelze odstranit mírným okyselením. Tyto chránící skupiny je možno odstranit katalytickou hydrogenací, sodíkem v kapalném amoniaku, působením HF nebo podobnými metodami.

Při syntéze na pevné fázi je peptid vystavěn postupně od karboxylového konce směrem k aminokonci. Syntéza na pevné fázi je zahájena tím,že se kovalentně připojí karboxy konec chráněné aminokyseliny na vhodnou pryskyřici, jako je benzhydrylaminová pryskyřice /3HA/, metylbenzhydrylamincvá pryskyřice /MBHA/, chlorometylová pryskyřice /CMR/, hydroxymetylová pryskyřice /KMR/ nebo SASRINová pryskyřice, jak je uvedeno v U.S.Patentu č. 4 244 946. 3HA nebo MBHA pryskyřice je použita, jako nosič v případě, že má být na karboxylovém konci peptidu karboxamid. CMR nosič se běžně užívá, jestliže na karboxylovém konci výsledného peptidu má být karboxylová skupina, karboxamid nebo ester.

Jakmile se první chráněná aminokyselina naváže na vhodnou pryskyřici, aminoskupina.se zbaví chránící skupiny mírným okyselením a volná karboxylová skupina druhé chráněné aminokyseliny s;e naváže na aminoskupinu první aminokyseliny.

Tento proces se provádí postupně,bez. izolování'meziproduktů, až po získání požadovaného peptidu. Hotový peptid pak může být odblokován a odštěpen z nosiče.

Přidáním alkalie ve vodném roztoku alkoholu k peptidu na CMR nosiči se peptid od nosiče odštěpí a. aminokyselina na karboxylovém konci peptidu bude mít volnou karboxylovou skupinu. Přidá-li se k peptidu na CMR nosiči amoniak nebo •alkylaminy v alkoholovém rozpouštědle, má výsledný peptid karboxamid nebo alkylkarboxamid na karboxylovém konci.

Má-li být výsledkem ester, přidá se tidem příslušný alkohol, jako například m propyl-, butyl-, nebo benzylalkohol, v př k CMR nosiči s etyl-, etyl-, ítomnosti trie pep.amiaíl*., a,.v.y.íleony. pe.pt^.c , OsaC.z. .vd—* v.vpen

Estery peptidů zahrnuté v tomto vynálezu mohou být připraveny konvenčními metodami z výchozí karboxylové kyseliny. Běžně se k karboxylové kyselině přidává alkohol za přítomnosti kyselého katalyzátoru. Další metoda spočívá v tom,že se karboxylová kyselina přemění na aktivovaný acylový meziprodukt, jako je halid kyseliny, a přidá se alkohol, nejlépe v kombinaci s louhem.

Metody pro přípravu C-koncových esterů peptidů, které zároveň nevedou k esterifikaci karboxylové skupiny postranní ho řetězce kyseliny asparagové, jsou poněkud pracnější, ale také se v peptidové chemii běžně používají. Jako výchozí látka se například vezme ester C-koncové aminokyseliny nebe dipeptidu a syntézou v roztoku je připojen zbytek kyseliny asparagové, jehož postranní řetězec je vhodně chráněný. Karboxylová skupina postranního řetězce je pak selektivně zbavena chránící skupiny a navázána na chlorometylovou pryskyřici. Aminoskupina je uvolněna a peptidový řetězec je vybudován syntézou na pevné fázi. Když je pak odštěpen produkt z nosiče pomocí HF, vzniklý peptid má karboxylovou kyselinu na postranním řetězci a na. C-konci ester. Je také možno zahájit postup syntézy alkylamidem vhodně chráněné aminokyseliny nebo dipeptidu a výsledkem bude C-kcncovj' alkylamid peptidů..

Aby bylo možno^ tímto procesem, získat estery a substituované amidy, je vhodné chránit 4-karboxylovou skupinou kyseliny asparagové benzylestery anebo benzylestery substituovanými halogenem nebo alkylovou skupinou. Je-li aminoskupina chráněna skupinou 3oc, je možno odstranit benzylesterovou chránící skupinu hydrogenaci a navázat CMH nosič.

Jestliže Z? nemá zbytek karboxylové kyseliny anebo na aminokyselině /nebo dipeptidu/, která má být připojena ke kyselině asparagové před navázáním na pryskyřici je benzylová skupina nebo substituované benzylová chránící skupiny /například pro hydroxylovou, thiolovou nebo aminoskupinu/, je vhodné chránit karboxylovou skupí nu·postranního řetězce-kyseliny. ··· asparagové t-butylesterovou skupinou nebo jinou skupinou nestálou v kyselém prostředí. V tomto případe je aminoskupina kyseliny asparagové chráněna skupinou nestálou v zásaditém prostředí, jako například fluorenylmetoxykarbonylovou skupinou /Fmoc/. Potom co se v roztoku naváže kyselina asparagové na anilin, amin nebo aminokyselinu /či dipeptid/, t-butyl ester je odstraněn hydrolyzou v mírně kyselém prostředí a karboxyl postranního řetězce je připojen, na pryskyřici běžnými metodami. Fluorenylmetoxykarbonylová skupina je pak odstraněna v mírně zásaditém prostředí a je zah éjena syntéza peptidů na pevné fázi. Tato metoda je nejvýhodnější v případě,že koncový zbytek Z? je substituovaný nebo nesubstituovaný c-merkaptoarylamin, který nemá karboxylový substituent.

Ne jvhodn nsím z pa sobem pro od je vystavit pryskyřicí štěpení peptidů z nosiče působení bezvodé HF v přítomnosti' látky vázající kationty, jako například anisol nebo dimetoxybenzen. Tato metoda zároveň odstraní všechny chránící skupiny s výjimkou thioalkylové skupiny chránící síru a odštěpí peptid z pryskyřice. Peptidy uvolněné tímto způ sobem z CMR nosiče jsou karboxylová kyseliny, peptidy odštěpené z BHA pryskyřice jsou ve formě karboxamidu.

V jedné preferované subgenericke skuoině látek znamenej 1 2

L a L obě S. Cyklické disulfidové sloučeniny obecného vzorce I jsou vytvořeny z lineárního peptidu dle vzorce II !-T

Z, -A -A - (3 -Gly. -As p -Q )_n -M-í

II kde A', A, 3, Q, M a n mají stejný význam, jako je uveden při popisu obecného vzorce I.

Z₁ značí

neb·

coS-

R_{1 o}.„-UHet *\C0-

nebe «Ο

.R přičemž chemicky reaktivní centra jsou chráněna dříve popsaným způsobem, a na atom síry u Z. a Z_o jsou navázány nebo

12· i z

T.T a T jsou odstranitelné skupiny, jako je thioalkyl, thioaryl, substituovaná benzylová skupina nebo vodík. Vhodnými' odstranitelnými skupinami jsou vodík, ^alkylthioskupina, zejména etylthioskupina, benzylová a 4-metylbenzylová skupina.

Nejvýhodnější je, když je T a T vodík nebo jedna ze skupin

2

T a T je vodík a druhá je ^alkylthioskupina.

Disulfidová vazba může být vytvořena dvěma metodami. Jestliže jsou v lineárním peptidu aminokyseliny obsahující síru chráněny rozdílnými skupinami, takovým způsobem,že může vzniknout monomerkaptan, je možno provést cyklizací basicky katalyzovaným nukleofilním odštěpeny chránící skupiny druhé aminokyseliny obsahující síru. Nejlepšími odstranitelnými chránícími skupinami jsou thioalkyl.ová nebo thioarylová skupina. Je možno například chránit jednu aminokyselinu obsahující síru thioetkylovou skupinou a druhou chránit substituovanou benzylovou skupinou. Působením HF na takovýto, peptid se odstraní benzylová skupina z jedné aminokyseliny, kdežto druhá aminokyselina bude chráněna jako etyldisulfíd. Tento merkapto/éisulfid se v zředěném roztoku o pH 7 až 8 míchá, thicetylová skupina se odstraní a z lineárního peptidu vznikne cyklický.

Jestliže lineární peptid obecného vzorce II je zbaven chránících skupin a vznikne tak dimerkaptan, je možno použít oxidační činidlo k převedení dimerkaptanu na disulfid. Takovými činidly jsou hexakyanoželezitan alkalických kovů, zejména hexakyar.oželezitan draselný a sodný, plynný kyslík, dijodometan nebo jód. Působí-li na sloučeninu obecného vzorce II oxidační činidlo, dojde k její cyklizací. Reakce probíhá ve vhodném inertním rozpouštědlu, jako je vodný roztok metanolu nebo voda, ve značném zředění, pri teplotách cd 0 do 40°G. Hodnota pH je většinou udržována mezi 7 a 8, Cyklizací je mc-žnc provést, když je peptid vázán na pryskyřičný nosič nebo dokud jsou ostatní funční skupiny ještě chráněny, je však lépe použít volný peptid, zbavený chránících skupin.

Předmětem vynálezu je také proces pro přípravu sloučeniny obecného vzorce III

Z, -A'-A-(3-Gly-Asp-Q/ -M-Z

III kde A*, A, 3, Q, M, Zp a n mají stejný význam, jako bylo?

uvedeno u vzorce I. Proces zahrnuje:

a/ oxidativní cyklizaci sloučeniny vzorce II ž A'-A-(3-Gly-Asp-Q) -Mkde A', A, 3, Q, V, Z,, Z₉ a n mají stejný význam, jako byl , χ, 2 uvedeno u vzorce I a T a T jsou H, nebo b/ nukleofilní cyklizac působením zásady. A * u vzorce I a pro T¹ skupina a druhé H.

sloučeniny obecného vzorce II a n značí totéž jako je

Jinou subgenerickou skupinou sloučenin jsou homodetické peptidy, v nichž Z, a Z₉ jsou dohromady kovalentní vazUa.

Tyto peptidy jsou připraveny z lineárního, peptidů obecného vzorce IV, kde k', A, 3, Q, M a n značí totéž jako? u vzorce I.

H-[A'-A-(3-Gly-Asp-Q-)_n.-Mj-OH IV

Tyto lineární peptidy se připravují takovým způsobem, že se uvolní a cyklizuje koncová aminoskupina a koncová, karboxyskupina peptidů, zatimco karboxyl postranního řetězce Asp zůstává chráněn. Cyklizace lze pak dosáhnout běžnými činidly, používanými pro vytvoření peptidové vazby, jako jsou karbodiimidy nebo aktivované anhydridy. Příkladem takových reagencií jsou difenylfosforylazid, kyseliny 1-propanfosfonové ,

DCC/H03T. Je zřejmé

Činidle 3CP, cyklický ankydid že koncová aminoskupina peptidu IV, označená jako H-jHN-AA-J, a koncová karboxyskupina, označená jako QrAA-COj-OH, se mohou navázat na kterýkoliv zbytek peptidu, t.j, A*, A, 3, C-ly, Asp, Q nebo M, protne vytvoření jakékoliv peptidové vazby v cyklických peptidech může být uskutečněno v posledním kroku přípravy stejného konečného, produktu.

Když jsou v peptidu přítomny Asp nebo Glu, je možno cyklizaci' uskutečnit bud skrz /3-karboxyskupinu postranního řetězce Asp nebo ^-ka^boxyskupinu postranního řetězce Glu, nebo koncové karbox(skupiny aminokyseliny. V případě Asp je nejlepší cyklizace přes koncovou karboxyskupinu, kdežto u Glu je lepší cyklizace přes f-karboxyskupinu. Metody, použitelné pro cyklizaci přes kteroukoliv z těchto karboxyskupin, js-ou běžně dostupné, jak je zde uvedeno.

Jestliže jsou Z, a Z₂ spojeny alkylenovým můstkem, kyselina Z,-Z₉ se zvlášt zakoupí nebo syntetizuje a inkorporuje se do peptidu jako poslední aminokyselinový zbytek při syntéze. Lineární peptid je vystavěn bud syntézou v roztoku nebo na pevné fázi a cyklizován stejným způsobem, jako je uvedeno shora pro případ, kdy jsou Z₁ a Z₉ kovalentní vazba. Kyselina 2-aminokorková a 1 -( 2 -kar boxy fenyl) -2 (2 -aminofenyl)etan představují Z^-Z₂, spojené alkylenovým můstkem.

CtiliJ. liD

Tento vynález se také týká procesu pro- přípravu sloučeniny obecného vzorce V /-_s

Z₁ _ δ ' _a - ( 3-Gly - A s p -Q )_p -M -Z ₂

Pří tomto procesu dochází k:

i/ cyklizaci sloučeniny obecného vzorce:

když a Z₂ jsou dohromady kovalentní vazba;

kde H- a OH- představují amino; a karboxylové skupiny kterýchkoliv sousedních zbytků cyklického;· peptidu a A*, A, 3, Q, M a n mají stejný význam, jako bylo výše uvedeno, a všechny reaktivní skupiny jsou libo?volně chráněné, ii/ odstranění chránících skupin.

Koncová aminoskupina peptidu je modifikována alkylaci nebo; acetylací podle běžně užívaných postupů. Tyto modifikace je~ možno uskutečnit s aminokyselinou před její inkorporací do peptidu nebo s peptidem po tom, co byla ukončena syntéza a kon cová aminoskupina uvolněna, ale před odatraně mni οΗτήμπ. c ± cm skupin.

V typickém případě se na volné aminoskupině provede acetylace za použití acylhalidu nebo anhydridu odpovídající alkylové nebo arylové kyseliny v přítomnosti terciárního aminu. Monoalkylace se nejlépe provede redukční alkylaci aminoskupiny odpovídajícím alifatickým aldehydem nebo ketonem v. přítomnosti mírného; redukčního činidla, jako je kyanoborohydrid litný nebo; sodný. Dialkylaci je možno provést působěním nadbytku haličů v přítomnosti zásady.

'seuskutečnu je ,>

Syntéza peptidů v r o ztoků/ζΰ’ ~ použití běžných metod pro tvorbu amidových vazeb. V typickém případě se chráněná 30C-aminokyselina, která má volnou karboxylovou skupinu, naváže na chráněnou aminokyselinu, která má volnou aminoskupinu, za použití vhodného karbodiimidového činidla, jako je N.,N^z-dicyklohexylkarbodiimid /DCC/, nejlépe v přítomnosti katalyzátoru, jako například 1 -hydroxybenzotriazol<c/HOBT/ nebo dimetylaminopyridinUz/DMAP/. Další vhodné metody zahrnují vytvoření aktivovaných esterů, anhydrid! nebo halidů kyselin na volné karboxylové skupině chráněné 3CC-aminokyseliny. a následnou reakci s volným aminem chráněné aminokyseliny, nejlépe v přítomnosti zásady. Například, chráněná 3oc-aminokyselina nebo peptid je v bezvodém rozpouštědle, jako je metylenchlorid nebo tetrahydrofuran /THF/, v přítomnosti zásady, jako je N-met.ylmorřclin, LMAP nebo trialkylamin, vystaven působení isobutylchloroformátu, aby vznikl aktivovaný anhydrid, který potem reaguje s volným aminem druhé chráněné aminokyseliny nebo peptidu. Peptid vytvořený těmito metodami může být selektivně zbaven chránících skupin za použití konvenčních postupů na amino nebo karboxylovém konci a pak navázán na jiné peptidy nebo aminokyseliny pomocí podobných metod.

£X-p/ substituované deriváty aminokyselin, které jsou předmětem tohoto vynálezu a zahrnují deriváty Arg, HArg,

Arg, (Et^fkrg, Ala, Gly, His, Abu, Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (é/V^Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, ^Al^Thr,

Cys, (Alk)Cys, Pen, (Alk)Pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile,

Hle a Hal se připravují metodami běžnými v chemii. Substituent r' může být Alk nebo benzyl. Typické metody pro přípravu těchto derivátů jsou uvedeny v U.S. Patentu č. 4 637 75θ;

Cheung a další, Can.J.Chem., 55,906, 1977; Freidinger a další,

J.Crg.Chem., 48, 77, 1982; a Shuman a další, Peptides:

Proceečings cf the 7th American Peptide Symposium, Rich,D.,

Gross, F., Fds, Pierce Chemical Co., Rockford, 111., 617, 1981, jež zde tímto citujeme. V typickém případě se roztok Cbznebo -Boc-aminokyseliny v DMF/1HF kondensuje s příslušným alkylhalidem, jako je metyl nebo etyljodid, v přítomnosti zásady, jako je natriumhydrid nebo kaliumhydrid. Je možno tQem přidat korunkový ether, jako je 13^/q^nka-6 s natrium hydrři pro-usnadnění reakce. Obecně řečeno,[v tomto procesu a v následujících aminoskupina funkční skupinu, jako je hydroxyl, merkaptan, amino, guanidino, indolyl,' pak je tato skupina chráněna, tak , jak bylo dříve popsáno. Například, na 3oc-Tyr (3žl) se působí r.atriumhydridem a metyljodidem rozpuštěnými v THF/DMF při 0°C a směs se míchá při pokojové teplotě 24 hod. Výsledným produktem je 3oc-(cK-Me)Tyr(3zl).

Alternativní postup aminokyseliny reaguje se spočívá v tom, že volný amin vhodným aldehydem, jako je acetaldehyd jako je nebo benzalčehyd, v přítomnosti redukčn natrium kyanobc-rohydrid. Výsledkem toho ího činidla to postupu j e mono -aIky 1 a oe :uz zá se zejména oro přípravu CK-benzy- 24 lovaných aminokyselin. o<-Benzy lované aminokyseliny mohou také sloužit jako meziprodukty v přípravě X-methylaminokyselin Například, «-methylarginin se- připraví ve třech krocích:

1/ reakcí ArgfTos) s benzaldehydem a natrium kyanoborohydridem v methanolu za vzniku (°t-Bzl)Arg(Tos);

2/rpdukcí benzylovaného produktu směsí formaldehydu a kyselinymravenčí, kdy produktem je (<X-3zl, <x-Me)Arg(TosJ ;

3/ odstraněněním benzylcvé skupiny katalytickou hydrogenaci (5% Pd/C v ledové kyselině octové/HCl) ; produktem je MeArg(Tos^.

<X-p/ substituované deriváty aminokyselin mohou být také připraveny redukcí oxazolidinonů připravených z Fmoc- nebo Cbz-aminokyselin. V typickém případě se Fmoc- nebo Cbz-aminokyselina zahřívá s příslušným aldehydem, jako je acetaldehyd nebo benzaldehyč, v přítomnosti kyseliny toluensulfonové v toluenovém roztoku; výsledkem je 5-oxo-oxazolidin substituovaný v poloze 2. Redukce tohoto oxazolidinonu triethylsiT&nem a TFA v chloroformu přímo poskytne Cbz- nebo Fmoc-tx. substituo · vanou aminokyselinu. Použije-li se- formaldehyd, oxazolidinon není substituován v poleze 2 a vzniknou <x--me thy lamin oky seli ny.

Adiční soli kyselin a peptidu se připraví standardním způ sobem ve vhodném rozpouštědle a nadbytku kyseliny chlorovodíkové, bremovodíkové, sírové, fosforečné, octové, maleinové, jantarové nebo methansulfonové. Zvláště se osvědčila sul s kyselinou octovou. Některé ze sloučenin tvoří vnitřní soli nebo zwitteriony, které mohou být přijatelné. Kationové soli se připraví tak, že na výchozí sloučeninu působí nadbytek alkalického činidla, jako je hydroxid, uhličitan nebo alkoxid, které obsahuje příslušný kation; je také možno použít vhodný organický amin. Farmaceuticky přijatelné soli mohou obsahovat <t 4- 4-t-j.

například kationy Li , Na', Ca

4-4Mm a NH

Tento vynález se týká farmaceutického prostředku, který obsahuje peptid obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutické prostředky²peptidů, připravených výše popsanými způsoby, další peptidový nebo polypepti dc vy deri- 25 vátů fibronektinu, fibrinogenu nebo Von Willebrandova faktoru mohou být připraveny jako roztoky nebo lyofilizované prášky pro parenterální podání. Prášky mohou být upraveny přidáním vhodného ředidla nebo jiného farmaceuticky přijatelného nosiče před použitím. Tekutý přípravek je,obecně řečeno, pufrovaný, izotonický, vodný roztok. Vhodným rozpouštědlem je například normální izotonický fyziologiký roztok, standardní 5% dextrosa ve vodě nebo pufrovaný roztok octanu amonného. Takováto léková forma je zvláště vhodná pro parenterální podávání, může však být také použita pro orální podání, v inhalá toru pro odměřené dávky, nebo v rozprašovači pro vdechování. Může být žádoucí přidat polyvínylpyrolidon, želatina, hydroxycelulosa, arabská, guma, polyethylenglykol, mannitol, chlorid sodný nebo citrát sodný.

Pro orální podávání je možno tyto peptidy upravit ve formě kapslí, tablet, emulse nebo sirupu. Farmaceuticky přijatelné pevné nebo. tekuté nosiče mohou být přidány pro zlepšení nebo stabilizaci přípravku, anebo k usnadnění přípravy. Pevné nosiče zahrnují škrob, laktosu, dihydrát síranu vápenatého, terru albu, magnesiumstearát, kyselinu stearovou, mastek, pektin., arabskou gumu, agar nebo želatinu. Tekuté nosiče zahrnují sirup, podzemníccvý olej, olivový olej, fyziologický roztok a vodu. Nosič může obsahovat materiál, umožňující pozvolně uvolňování, jako je glycerylmonostearát nebo glyceryldistearát, a to bu3 samotný, nebo v kombinaci s voskem. Množství pevného nosiče se liší, nejlepší je od 20 mg do 1 g na dávkovou jednotku. Farmaceutické prostředky se připravují metodami běžnými ve farmacii, což představuje mletí, míchání, granulaci' a kompresi pro tabletovou formu, anebo mletí, míchání a plnění v případě tvrdých želatinových kapslí. Použije-li se kapalný nosič, preparát je ve formě sirupu, elixíru, emulze, nebo vodné či nevodné suspenze. Takovéto tekuté lékové formy mohou být podávány per os přímo nebo plněny do měkkých želatinových kapslí.

Pro rektální podávání se peptidy tohoto vynálezu mohou kombinovat s přídavky, jako je kakaové máslo, glycerin, želatina nebo polyethylenglykoly, a tvarovat do formy čípků.

Tento vynález také poskytuje metodu pro inhibici agregaci krevních destiček 'a tvorby krevní sraženiny v organismu savce, zvláště člověka, což zahrnuje vnitřní podání peptidu obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelného nosiče. Tato· terapie je indikována v případech akutního infarktu myokardu /AIM/, trombóz hlubokých žil, plicní embolie, disekující aneurysma, přechodný ischemický záchvat/PIZ/, mrtvice a další poruchy související s infarktem, a dále u nestabilní angíny. Chronické nebovakutní stavy hyperagregace, jako je roztroušená intravaskulární koagulace /RIK/, septokemie, chirurgický nebo infekční šok, pooperační nebo poporodní trauma, chirugické kardiopulmonární obchvaty, nekompatibilní krevní transfuze, odtržení placenty, trombotická trombocytopenická purpura /TTP/, účinky hadího, jedu a poruchy imunity mohou být k této. léčbě citlivé. Navíc mohou peptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu být použity v metodě pro prevenci metastatických stavů.

Peptid se podává pacientovi buč orálně nebo parenterálně takovým způsobem, aby koncentrace účinné látky v plasmě byla dostatečně vysoká pro inhibici agregace destiček. Farmaceutický prostředek obsahující peptid se podává v dávce od 0,2 do 50 mg/kg způsobem, který vyhovuje stavu pacienti Pro akutní terapii je nejlepší parenterální aplikace. V případech, kdy hyperagregace přetrvává déle,je nejúčinnější intravenózní infuse peptidu v 5% roztoku dextrosy ve vodě nebo fyziologickém roztoku, i když postačí intramuskulární injekce bolusu.

V případech, kdy je agregace destiček chronicky zvýšená ale stav není fcritický, je vhodné podávat orálně kapsle nebo >odání bolusu čo svalu.

tablety, případně je možné injekční podání bol;

Peptid je podáván jedenkrát až čtyřikrát denně v množství od 0,4 do 5 0 mg/kg, čímž se dosáhne d<

mg/kg/den.

bii žně od 0,4

Tento vynález dále i -e zet osu,.

.tera zabraňuje opakovanému ucpání tepny nebo žíly po fibrinolytické terapii, čehož se dosáhne vnitřním podáním peptidů obecného vzorce I a fibrinolytické látky. 3ylo zjištěno, že podání peptidů při fibrinolytické terapii buč úplně zabrání opětovnému ucpání cév nebo ucpání oddálí.

V textu, popisujícím tento vynález, je termín fibrinolytická látka používán tak, že znamená jakoukoliv přírodní látku nebo syntetický produkt, které přímo či nepřímo způsobují rozpuštění sraženiny fibrinu. Známou skupinou fibrinolytických látek jsou aktivátory plasminogenu. Užitečnými aktivátory plasminogenu jsou například anistyťiasa, urokinasa /UK/, pro-urokinasa /pUK/, streptokinasa /SK/, tkáňový aktivátor plasminogenu /tPA/, stejně jako jejich pozměněné formy a varianty, které si uchovávají aktivitu aktivátoru olasminov genu. Tyto změny spočívají chemické modifikaci nebo v přidání, ubrání nebe záměně jedné nebo více aminokyselin, nebo v tom, že jedna nebo více funkčních oblastí bylo přidáno,vypuštěno nebo změněno, jako například kombinací aktivního místa jednoho aktivátoru plasminogenu s oblastí pro vazbu fibrinu jiného aktivátoru plasminogenu nebo molekuly vázající fibrin.

Jinou variantou jsou molekuly tPA, v nichž bylo pozměněno ' jédho·' hebb’víoé'''glýkbsyl'gčnťoh mísťi JTe jvýhbáhě'jšími^;'ákti'vá tory plasminogenu jsou modifikace tPA, u nichž je pozměněná primární sekvence aminokyselin v oblasti růstového faktoru tak, aby se zvýšil poločas aktivátoru plasminogenu v plasmě. Varianty růstového faktoru tPA jsou popsány Robinsonem a'dalšími, EP-A 0 297 539 a 3rownem a dalšími, EP-A 0 240 334 a G3 8815135.2. Jinými variantami jsou hybridní bíloviny, jako jsou ty popsané v EP 0 028 489, EP 0 155 387 a EP 0 297 882, které zde tímto citujeme. V našem vynálezu preferujeme použití hybridní bílkoviny anistreplasy. Fibrinolytické látky mohou by ícicvonv sou me

4- /-i <9 z genového inženýrství.

:e jsou or .na

Užitečné lékové formy tPA, SK, VK a pUK jsou například popsány v EP-A 0 211 592 /U.S.Ser.7o. 890 432/, German Patent

Application Nc. 3032606, E?-A 0 092 132 a U.S. Patent 4 568 543, mít lékovou formu vodného pufrovaného izotonického roztoku, jako je octan sodný nebo amonný, nebo adipat pufrovaný na pH 3,5 až 5,5· Dále se může přidat polyvinylpyrolidon, želatina, hydroxycelulosa, arabská guma, polyethylen, glycol, mannitol a chlorid sodný. Směs se může lyofilizovat.

Farmaceutický prostředek může být upraven tak, že peptid tetu* a fibrinolytické látka^ve stejném obalu, lepší je však použít oddělených obalů. Když jsou obě účinné látky v roztoku, mohou být obsaženy v systému pro infuse či injekce, uzpůsobeném pro simultánní nebo následné podání.

Tato terapie je indikována v případech infarktu myokardu, trombózy hlubokých žil, plicní embolie, mrtvice a dalších poruch souvisejících s infarktem. Peptid se podává bu3 zároveň s parenterálni aplikací tPA nebo jiné fibrinolytické látky, anebo jeho podání aplikaci tPA těsně předchází či následuje.

Po obnovení průtoku může být prospěšné pokračovat s podáváním peptidu ještě nějaký čas, aby se v největší možné míře zamezilo opětovnému ucpání cév. Účinná dávka tPA, SK, UK nebo pUK je cd 0,5 úo 5 mg/kg a účinná dávka peptidu je od 0,1 do 25 mg/kg..

Aby bylo možno podávat inhibitor a fibrinolytickou látku zároveň nebo odděleně, zhotoví se souprava, která obsahuje v jednom obalu, jako je krabice či jiná schránka, jednotlivé lahvičky, sáčky, nebo podobné nádoby, z nichž každá obsahuje účinné množství inhibitoru pro parenterálni podání, jak bylo dříve popsáno, a účinné množství tPA nebo jiné fibrinolytické látky pro parenterálni podání, jak bylo zhora uvedeno. Takováto souprava může obsahovat obě farmaceuticky účinné látky v oddělených nádobách nebo ve stejné nádobě, třeba v lyofilizované formě, a nádoby s roztoky pro rozpuštění preparátu. Toto uspořádání může být obměněno tak, že lyofilizovaná látka a reztok na její rozpjštění jsou umístěny ve dvou komorách jedné nádoby, aby bylo možno je smíchat před použitím. Fibrinolytické látka a peptid mohou být plněny zvlášt do dvou nádob nebo lyofilizovány pohromadě a výsledný prášek se plní do jedné nádoby.

Když jsou obě účinné látky připraveny ve formě roztoku, mohou být plněny do systému pro infuse či injekce, uzpůsobeném pro simultánní nebo následné podání.Například inhibitor agregace destiček může být ve formě vhodné pro intravenózní injekci nebo v infusním-sáčku spojeném hadičkami v sérii s druhým sáčkem, obsahujícím fibrinolytickou látku. Použije-li se takovýto: systém, může pacient dostat nejprve injekci bolusu peptidu nebo jeho- infuzi a potom infuzi fibrinolytické látky.

Farmakologické aktivita peptidů byla stanovena v následujících testech:

Inhibice agregace destiček in vivo

Inhibice tvorby krevní sraženiny je sledována in vivo tak, že se registruje systemický a hemodynamický účinek infu· ze peptidů u psů v narkóze podle metody popsané Aikenem a dalšími, Prostaglandins, 19, 629-43, 1980.

Tnhibice a.^σηe^íraca éest^ č^Ak

Dospělým psím míšencům bez premedikace byly odebrány vzorky krve, ke kterým byl přidán citrát, aby se zabránilo ko· agulaci. Plasma obohacená destičkami /POD/ byla připravena centrifugací při 150 x g 10 min při teplotě-místnosti.

Promyté destičky byly připraveny centrifugací POD při

800 x g 10 min. Takto získaný buněčný pelet byl dvakrát pro++ myt Tyrodovym pufrem o pH 6,5 bez Ca a znovu suspendován v Tyrodově pufru o pH 7,4 s f,8mM Ca výsledná suspense měla 3 x 10 buněk/ml. Ve všech testech agregace destiček byly peptidy přidány 3 min před přidáním agc-nisty. Konečná koncentrace agonisty byla 0,1 jednotka trombinu/ml a 2 mM ÁDP /Sigma/. Agregace byla měřena v Chrono-Log Lumi-Aggre-. gcmetru. Transmi. tance světla naměřená 5 min po přidání agonisty byla použita pro výpočet procent agregace podle vzorce b agregace = [(90-CP.) + 0-1 x 1 00 kde CR je odečet ze záznamu, 90' je základní linie a 10 je odečet blanku POD, Hodnoty IC^q byly stanoveny vynesením inhibice agregace v procentech proti koncentraci peptidu.

V testech byla použita základní koncentrace peptidu 200 mM a sestupná řadp koncentrací ředěním na polovinu, aby byla získána odpovídající závislost účinku na dávce.

Stabilita peptidu v přítomnosti proteas v plasmě byla ověřována inkubací peptidu v POD po 3 hod před přidáním agonisty; v běžně prováděných testech agregace trvala preinkubace jenom 3 min.

Sloučeniny uvedené v Příkladech 1 - 21 se vyznačují hodnotou ICpjg od 0,1 do 50 yúM v testu agregace psích krevních destiček stimulované ADP. Sloučeniny uvedené v Příkladech 22, 24, 25 a 23 mají IC^ větší než 200 Je s výhodou, mají-li sloučeniny hodnotu ΙΟ^θ menší než 1 0 ýtM.

Následující příklady nemají sloužit k omezení vynálezu, ale mají ilustrovat , jak se dají připravit a užívat sloučeniny, které jsou předmětem vynálezu. Mnohé další možnosti :retme nao:

tomu. kdo má zkušenosti tomto cooru.

Příklady provedení vynálezu

V následujících příkladech je teplota uváděná,ve stupních Celsia. Analýza aminokyselin byla provedena na Dionex autoion 100. Analýza obsahu peptiéu se zakládá na analýze aminokyselin. Hmotnostní spektrum bylo stanoveno- pomocí hmotnostního spektrometru VG Zab, ostřelováním rychlými atomy. Chromatografie na tenké vrstvě byla prováděna na deskách s tenkou vrstven /0,25 mm/ silakagelu. ODS značí oktadecylsilylsilikagelový 'chromatografický nosič. Zkratky představující eluční činidlo jsou n-3uC-H; n-butanol, HOAc: kyselina octová, H_OC: voda, EtCAc: ethylacetát., i-PrcH: isopropanol, vsokotlaká kaoalinová ^r sel mm

Dynem a CA: ny:

/UP-rr/ jhromatonrafie£býia prováděná na gradientovém chromatografic.emuzbeckman j /AS q

- 31 za použití izokratického nebo plynulého^- gradientu. Syntéza peptidů na nerozpustném nosiči byla prováděna pomocí automatizovaného syntetizátoru /3eckman 990/. Údaje c čistotě peptidu jsou založeny na integraci chromatogramu HPLC.

MeArg byl připraven metodou popsanou Alim a dalšími, U.S. Patent 4 687 758, 1987.

Příklad 1

Příprava cyklo (3,S)- (2-merkapto)benzoyl-arginyl-glycyla s par ty1-cy s t e i námi du /cyklo-(S,3 ) -Mba-Arg-Gly-A sp-Cy s-KH ₂/

Cbecný postup syntézy peptidu na nerozpustném nosiči benzhydrylaminové pryskyřici

Amidy peptidů byly aminové pryskyřice jako kyseliny byly přidávány syntetizovány za použití benzhydrylnerozpustného nosiče. Chráněné aminopostupně od karboxylového konce až po dosažení požadovaného složení. Alfa-amineskupina byla chráněna t-butyloxykarbonylovou skupinou /3oc/. Funkční skupiny postranního řetězce byly chráněny následujícími skupinami: arginin a histidin tosylovou /Tos/; cystein a 3-fer.yicystein p-methylbenzylevou /M3zl/ nebo ethylthiovou^- /SSt/; serin a threonin benzyletherovcu /3zl/; lysin p-chlorkarbobenzoxy /ClZ/; kyselina glutamcvá a asparagová benzylesterovou /C3zl/ nebo cyklchexylesterovcu /C-cHex/';' tyrosin p-bromkarbobensoxy / 3rZ/. 3oc skupina byla odstraněna působením 50% kyseliny trifluoroctové./TFA/ v methylenchloridu. Sůl aminu a·-TFA byla neutralizována působením 1% diisopropylethylaminu /PISA/ v rcethylenchleridu. Aminekyseliňy byl navázány k narůstajícímu peptidu za použití tří ekvivalentů 3cc-aminekyseliny, tří ekvivalentů 1 -hvdrexybenzstriazelu /HC3t/ v DMF a tří ekvivalentů dic.vklehexylkarbcdiimidu /DCC/ v methylenchl»ridu. Ukončení kepulační reakce byl© svěřen© nih tem a reakce byla opakevána, jak byl· petřeba. byl následující:

1. premýt methylenchloridem 1 x

2. promýt 50% TFA 1 x

3. odstranění chránící skupiny 50% TFA 1 x yórinevým tesCelkcvý postup min min min

4.	promýt methylenchloridem	6	X	1	min
5.	neutralizovat pomocí 1% DIEA	3	X	2	min
6.	promýt methylenchloridem	4	X	1	min
7.	promýt dimethylformaůidem	2	X	I	min
8.	Boo-e.minokyselina + H03t v KIF	ponechat
9.	DCC v methylenchloridu	2	hod
1 0.	promýt dimethylformamidem	2	X	1	min
1 1 .	promýt methylenchloridem	3	X		min

Při navázání prvního ;$-koncového zbytku na 3HA pryskyřici se syntéza začíná u pátého kroku. Pro navázání všech následujících aminokyselin, začíná syntéza prvním krokem.

a/ kyselina 2-S-ethylmerkaptobenzocvá

K 50 ml hexanu promytého argonem bylo přidáno 3,7 ml /5 0 mmol/ a 4,0 ml /50 mmol/ sulfurylchloridu; roztok byl 30 min míchán. Po přidání 100 ml toluen - byla ihned přidána kyselina

2-merkaptobenzoová /7,71 g, 50 mmol/. Reakční směs byla míchá· na 3 hod. při teplotě místnosti a pevný produkt byl vy srážen. Sedlina byla odfiltrována, usušena a chromatografována na si1. Li O h /361/ žlutohnědého pevného produktu.

b/ cyklo- S-3 -Mba -Are-^ly-Aso-Cys-NH^

Chráněný meziprodukt peptid-pry skyři ce, Mba(3Et)-Arg(To£pGly-Asp O-Bzl -Cys 4-M3zl -M3HA, byl syntetizován na nerozpustném nosiči 4-methylbenzhydrylaminové pryskyřici za použití automatizovaného syntetizátoru /Beckman 990/v mnežství 1 mmelu .. Všechny aminokyseliny byly na aminoskupině chráněny t-butyloxykarbonylem a byly postupně navazovány pomocí N,N-dicyklohexylkarbodiim:du/1-hydrcxybenzotriasolu DCC/HCBt způsobem popsaným Ailem a dalšími, J.Med.Cem.,

91, 1937' a J.Med.Chem. 29, 984, 19S6. Fo připojení on o o o poslední aminokyseliny se peptid cd zbavil chránících skupin postranníhc bezvodého v nřítnennsti ar.i s •ice oddělil op nemoc \ ^V Λ / V

Λ

- 32 -3j

Po odpaření HF ve vakuu byl zbytek promyt bezvodým etherem, surový peptid byl extrahován 0,2 M kyselinou octovou a extrakt byl zředěn na 2 1 deicnizovanou vodou. pH vodného roztoku bylo upraveno na hodnotu 8-9 koncentrovaným amoniakem. Roztok byl probublán dusíkem, aby se odstranil ethylmerkaptan. Proces cyklizace proběhl za 24 - 48 hod. Reakční směs byla Ivofilizována a výtěžek byl 320 mg pevné látky. ChromatoíDracenymi tážemi středníhc iku /1 v/r ril/HjL ~ OJX TFA/ poskytla částečně purifikovaný produkt. Další čištění pomocí filtrace na gelu Sephadex G-25 v 0,2 M kyselině octové poskytne neřadovanou sl

583; TLC R_f p C ZR /η-ν’.γ.Γ /n-3uCH: HCAc iCučeninu. MS^FASj : EtOAc ·:’:; /sloupec Vyčac UV detekce oři

H„0

2,2

Λ * ’/ΐ'-· pfa+ΛΓ’ + ·*»? Ί /^ O — o T 7ij ΤΈ¹ —⁴ J b. Z*' 0-* V V i 4 —b V -i. -b- X / A a V X j .i. /V k* slounGc Vvda

μ.

ΤΆ r UV sbnah nentidu .7;

minozyseiin: aso /o ch / m_v / - « , -» / J w. '.V J

Příklad 2 inyl-argmyl-gjycy±

Příprava N -ucetyl-cyklc-(s, S )-cy s asparty1- (2-měrkapto^fenylamíd /cyklo-(s,s)-Áe-Cys-Arg-GlyAsn-Van/ a/ 2 - (/-methylbenzyl^thioanilin /Van-4-V3sl/

K roztoku 2-thioanilinu /5 7 ml, 42 mmel/ v ethanolu /50 ml/ byl přidán triethylamin /5,9 ml, 423 mmol/ pod argonem. o<-3rcmc-p-xylen. /7,78 g, 42 mmol/ v ethanolu /5 9 ml/ byl pak přidán po kapkách. Reakční směs se míchala 1 hod, byl zahuštěna , e vakuu, na malý ob jez., zředěna bezvodým etherem a filtrována, aby se odstranil triethylaminhydrobromid. Filtrát byl vysušen a produktem byl žlutý olej /5 g, 523/.

~ ^J -.j ,ν_?Λ _ .. p. _{z ;} ... .* _f _ . v „ ij .. ..a . .. ... ... / , . V ,vJ . -z ρ v) -<,· - ,d v . v· · * * ♦·» '' j' Έ tk p f' γ v f ' 7 f² f* TI) * £· x <'· b/

Fmoc -As p (C -t -3u) -Man (4 -MBzl)

-χFmoc-Asp(0-t-Bu) /5,0 g, 122 mmol/ byl rozpuštěn v THF /50 ml/, N-methylmorfolin /1,3 ml, 118 mmol/ byl pak přidán a roztok byl ochlazen pod argonem v lázni s ethanolem a ledem po dobu 10 min. Potom byl přidán isobutylchloroformat /1,6 ml, 123 mmol/, reakční směs byla míchána 5 min 3 pak následovalo přidání rozteku Man(4-M3zl) /2,8 g, 122 mmol/ v THF /50 ml/. Chlazená reakční směs byla míchána 40 min a při teplotě místnosti 4 hod. Vysrážená aminová sůl byla zfiltrována a filtrát byl odpařen za vzniku olejovitá

-)· J. 1 -. _T ej oyi respu:

.en v í- 1 k · · 1 o r. o + 4 + , I ' / 1 ··> Λ ,-, η / *czv

M HCl /2 x 50 ml/, nasyceným roztokem soli /1 x 50 ml/, 10% roztokem uhličitanu sečného /1 'x 50ml/ a nasyceným roztokem soli x 50 ml/.

atka byla usušena bezvodým ha_obu a zahuštěna, na oranžový cl

Krystalizací z methanolu byl získán požadovaný 26%/j teplota tán;

nrodukt

129-13 bílá pevná 1

K~C

-ko /t qt í-?

- Λ-ν. / ... , j í_?, , c/ Fmoc-Asp~Man(é -Mozl)

O o '0‘rr Λλ O \ ./'ČO *0 í A ~Λ·.ί* Ί V / ’♦ «-/*>* v.. J. *.* U Ό · - ra y l x/ - i 1 ·- xX - - l —f **- —/zu j f _? y v methylenchloridu /50 ml/ byli nosti 45 min. Rozpouštědlo bylo odpařeno a produkt byl vysrážen přidáním etheru. Sraženina byla usušena na vzduchu a výtěžek byla oílá pevná látka /2,23 g, 70/-·/; teplota tání 1 55 ~1 56°C.

d / Fmo c - A s p ( 0 - Bz 1 -prý s ky ř i c e^) -Ma n. (/- -M3z l) g/ a 50% TFř q' i. íb r í> -/n -. ý p r

i. X J.

u e iii -i b υ

K naboctnare a ₅Cy by] r; —/ prožité hydr o xyBf·. hýlové pryskyřici ^J- p V £ £ — 2 3 Γ> -Λ’οίΤίζ' 4 “V 4^· 2.^ z * ra / *, - V >

fa '*· w ··*· ·! · ,/ v cooxanu /25 ml/’. Reakční ta CH_?01_o, směsí hy i roxym.e tkvi -v á.

směs byla míchána 18 hed s postupně promynjj Z^“J ,-pu.pTT τ . 1 ... ,-τρτ ^,x>’7 upv c Zv óq ·» -· ' - ’^r-.' · <·*q

- ra.

γ·Ή· ,-·. o,4. _{o r}.4 ‘••σ ......u ·,·' - -

- 34 e/ N^-acetyl -cy klo(S, 3 ) -Sy s-Arg-Gly-Asp-Man

Chráněný meziprodukt peptidu navázaného na pryskyřici,

Na -Ac -Cys(SEt)-Arg^Tos)-Gly -Asp (0-3zl-pryskyřice)-Man (4-M3zl), byl připraven z Asp(0-3zl-pryskyřice)-Man 4-M3zl pomocí metody použité u Příkladu 1b, postupným připojením 3oc-Gly, 3oc-Árg(Tos) a 3oc-Cys(3EtPo připojení poslední aminokyseliny byla koncová 3cc skupina odstraněna pomocí TEA a peptid tyl acetylován za použití směsi acetanhydridu /’0 ekv/ a diisopropylethylaminu /10 ekv/ v dimethylformamidu. Peptid byl pak odštěpen z pryskyřice, cyklizován a izolován stejným způsobem, jaký byl uveden

Pnnlaou i O.

mg surového peptidu. Chromatografii sa středního tlaku na sloupci 0D3 s ./· ou lír./ Uy Λ sískán požadovaný peptid /24 mg/. M3/FA3 [m+hJ -7 .v ’ * U · Τ’* e ' > ♦ < - * · ' · * ^J t > / * ♦ .^U.V. . ♦ .i νΛ L· ♦ i.A V · w w. · » · · » · · · / 1 “Τ

6S, ^T4PT, ,9 /sloupec.

Vydac 218 Tp CD3, 10% acetonitril/H^O - 0,1% TEA, UV detekce oři 220 nm/

A:acetcnitril, 3:H₉C-0.1 % TPA, 0 .bs si Cb^ť m

n^ ’ ,-' -> /

ΤΤ,ΓΛ Q ť J J. ci		7	18	Tp ODS,	£y\5	í3	i en*t
1 -	7	0%	A	během 15	Hí i	n	Uv
du 4	z	» 0	·	Analýza	-· *3	Τ';	0-
A v» ·-»	7	u			/
		J	··; /	J h. / y J ,·

rroprava cy kl o (3,3 ) - (2 -m e r k aptc)oenzoyl-( N*-m e t hy l) a r g i n glvcyl-aspartyl - [2 -merkapto)fenylami du MeArg-Gly-Asp-Man/ yklo-Qs,3)-MbaChráněný meziprodukt peptidu navázaného na pryskyřici, Mba (SEt)-MeArg (Tos) -Gly-Asp(C-3zl-pryskyřice)-Man (4 -M3zl) , byl oři praven odštěpen, a cvklizován stejným způsobem jako v 1,0 mmolovén množství. Po ukončení cyklizace in^ho roztoku sloupcem Amber!i tu XAD-2 0,¹ j ΤΕΛ/ byl roztok koncentrován surového nectidu. Chrcmuto

V X Γ* Ί lí j H C í \;pr_ ,. pr r c· 9 &yp»

S ΐ Ρ Γ I' O Tíc. sX^o.ocí ODS s c bvú C n p..'norr ‘-‘,/ CJ - K.· X- - i s. V_ ',, V - k»- V

-Το produkt/14 mg/. MS(FAB) m/e [M+hJ⁺ 6 02,3; TLC: P_f 0,63 , /n-3uCH:H0Ac:H₂0:EtOAc 1:1:1:1/; HPLC k* 3,2 /sloupec Vydac

218 TP ODS, 20/ acetonůtril/HjC - 0,1/ TFA, detekce při 220 nm/, k' 2,3, /sloupec Vydac 218 TP ODS, gradient, A: acetonitril, 3: H₂0 - 0,1% TFA, 20-50% A. během 10 min, detekce při 220 nm/; obsah peptidu 79%. Analýza aminokyselin:

Asp /í ,00/, Gly z 1,2 i/,

Příklad 4

Příprava cyklo-(S,S^-^-merkaptoJbenzoyl-CN^Xethyl^arginyl glycyl-aspartyl-(2-merkaptc )fenylamidu /cyklo(S,S)-moaMeArg-Gly-Asp-ManJ a/ 3oc-Asp(O-cHex )-Man(4-M3zl)

1/ bvO

Z ·* -V / 4 ;c-Asp(C-eHex^, /3’, 5 í v THF /500 ml/ a N-methylmcrfolinu /13,1 g, 120 s po ksr?kác*h dsodvtyΣco^o^c·x /1 τ/ »

Peakční směs byla několik minut míchána a pak byl přidá / D ZN /-«-)* ,. , y , - v

Ί ·*- ,·· . Λ-, — · ν'- *· ·ψ· · Λ ··»· */ 4· -. ·. .·» 4” ·- . ·> --.- » ,- χ f-Ostok Man 4-M3sl /22 0,n 96 mmolz' v THF

Po skončení reakce byla rí byl usušen. Odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu /500 ml/ a postupně promyt 5% vodným roztokem kyseliny citrónové /3 x 150 ml/, vodou /1 x 4 00

IáX / /1

On roztokem NaHCG^ ve vodě

400 ml/, vodou / 1 x 400 ml/ a nasyceným roztokem soli /1 x 300z' . Roztek byl vysušen bezvodým íyCC-,^ Bylo získáno 53 g požadované sloučeniny.

• fí i +

Itrovan.

V Asp(o-cHex )-Man (4-Masl)

3oc-Asp(C-cHex)-Man(4-M3zl) /52 g/ byl smíchán s 50% TFA z nx 1/y 4. en c hl oxd d sn /4 00 nl/ 3 ocnschár* 41 nln oři Xeplotd x r t/Ίx 4 * · P c ·’ x o ti ?· X x d 4 o b'/ o o d X— x o d ns τ* a x o v /ně k x 4 7 1 · •πη + ·-> ’-vf ”··γ ί ^τ Ί Fj 5' r. τ ’ 'p .. '''/ ν» ή / ο τη ο ’yy *r ο Λ' ο + >- ·<η y ς y y~vy Π^-1 TD Λ *

Produkt byl vysrážen jako TFA sol fř^ Hýíím etho u. Sraženin: *'·. y Ί jj ’ 1 S' 1 ί* Γ· p ^{Cl r}' 3 y '7 i; A -; * V γ + ρ ·τ / p-y ,-r * o ; _ -> 9 γ,,ο γ y ό Ί ό ·+· , ' - OO/ / c/ 3oc -Gly-As O-cHex )-Man (4 -M3zl) •’S·

Ke studenému roztoku Asp(O-cHex) -Man(4-IvBzl} /46,7 g,

86,4 mmol/ v DMF /100 ml/ byl přidán diisopropylethylamin /15 ml, 86,1 mmol/. Potom byl přidán N-hydroxybenzotriazol /14,0 g, 104 mmol/ a dále 3oc-Gly /16,6 g, 34,8 mmol/. Reakční směs byla několik minut míchána v chladu a pak byl přidán N-ethyl-N'-(dimethylaminoprcpyl^karbodiimid /18,2 g, y mmol/. Reakční směs byla nenechána oři teolctě nosti a míchána 18 hod. Reakční směs byla zahuštěna na malý objem a nalita do 1,5 1 10% roztoku K_oC0, ve vodě. Vysrážený v /v

-Ρ ·4 Ί 4·· preduki byl shromážděn filtrací a promyt vedou čo neutrálního pH. 3ylo získáno p0,6 g požadované sloučeniny, d/ Gly-Asp(0-cHex)-Man(4-M3zl)

Sloučenina,zisuana postupem, popsaným v rriKlacu 4< /11 ,7 g, 20 mmol/, byla smíchána s 80 ml 5 0% TFA/CH₉C1₉ jak je uvedeno u Příkladu 4b. Výtěžek byl požadovaný /12,4 g/.

/ 2oc-Ke-Arg(T5s)-51y-As_?(c-c.%x)>;_arY4-X2;l)

z Příkladu	4d /12,4 g, 20 mmol/
>Λ Ο ζ :l-. f _ , ~ «li ,	20 mmol/. Potom byl
následovaný	3oc-N -MeArg (Tes)
směs byla	míchána několik minu

g, 22 mmol/. Reakční

DMF byl při dán HC3t /7 /!0,i g, e.c a pak byl po částech přidán EDC /4, směs byla ponechána při teplotě místnosti a míchána 18 hod. Reakční směs byla zahuštěna na malý objem a nalita do 10% rozteku K?CO^ ve vodě. Vysrážený produkt by a promyt vodou do neutrálními požadované sloučeniny.

-•'.TJ ’rut .ονο¹/ X 4 4 Ί O ,'*' i i · v ^v b i. ¢- tž ik ·- - i U- C— >

/ MeArg(Tcs) -Gly-Asp(C-cHex) -Man (4 -MDzl) é v P^iklriáv Z⁷,⁷ .c, -^,5 λ /n ji/ ...:/3 0 ml/ jako v Příkladu -'-b.

O z Πρ <

g/ Mba(SEt )-MeArg(Tos) -Gly-AspfO-cHex') -Manf-4 -K3zl)

Ke studenému roztoku sloučeniny^Příkladu 4f /20 mmol/ v DMP /20 ml/ byl po kapkách přidán DIEA /3,5 ml, 22 mmol/. Potom byl postupně přidán Mba(SEt) /4,6 g, 22 mmol/, SBC /4,2 g, 22 mmol/ a 4-N,N-dimethylsminopyridin /DMAP/ /2,9 lni cfcúns g, 24 mmol/. Reakční směs byla při teplotě místnosti

dalších	24 hod. Pa
22 mmcl	, DMAP /2,9
míchání	pokračoval
Reakční	směs byla
roztok	byl postupu

O >

Í1 Mba(3Et) via úplná.

* O U U O v ·-«. J U. ig. v -·- j prcmyvan vocou, citrónové ve vodě, vodou a nasyceným nické extrakty byly usušeny bezvodým ^koncentrovány na řevný zbytek /\ 9 silikagelu v 101 Me0H/CH_oCl cenina /9,0 ,;/.

T O 57. + fi T o rn z v q o Ί η s <^·... *-* — >· - -_v· £ rj, Ί n v ·η r* τ, Ί' n tf o rn Γ: r» d \T r j . rf- / * w. . <i j. kZ Cd. L* kz p.. J. C.a .u .i. .! i f i.U byla. získána Dožadovaná slouy/ (-...V! r-q O \ ’Π-.ο _Γΐη ,_r

^... -.-i· --*~ ---v. ·— 2—:

·,+ -· A klaou 4;

susooent oezvooenc lobu ’ hod. HP byl

TO- r* τ + /> V , « ... .·_· .. kz X·.miklv ethvlmerim o z fi rr oři O^C do -dobu ' hod. HP byl odstraněn při 0“C ve vakuu a odparek byl promyt etherem. Výtěžkem bylo 5,0 g žlutohnědé pevné látky. Fevná látka byla rozpuštěna ve vodě /16 1/ a pH roztoku bylo upraveno byl probubláván dusíkem, aby se odstraní kaptan. Po 7 dnech byl vodný roztok přečištěn na sloupci Amberlitu X.AD-2 /501 nethanol/HpO . Pc lyofilizací byl výtěžek 3,2 g. Látka byla déle purlfikována rychlou chromatograf i í /za středního tlaku na sloupci 0D3 s obrácenými fázemi ,/p * o /. / q r~ * Ύ*D / D * T/ f- ~J Ί' 4> ν’ c2\p A-v Π 5

-/r. - .., . .. if.u/ ijj ... -jásteen?

rurlfokovaného materiálu. Konečná puriřik&ce pomocí gelové filtrace na Sephadexu G-15 v 0.2 M uyselině octové ooskj pO.v‘ňGOV’:):'.Cz;< 3 1 <·.<·/ v’ Ώ... Ώ J / í > ,T/ «

Příklad 5

Příprava cyklo (s, 3)- (2 -merkapto)benzoyl-(N^-methyl)argi nyl-glyeyl-aspartyl- (3-fenyl)cysteinamidu /cyklo-(S,3)-Mba· MeArg-Gly-Asp-Pc.s/ r-,-Ρ 'c-kyo, October 24-26, ’?28,

stein byl	připraven	poď
Peptide Cí	lemistry,	ed .M
mne sium or	i P^ V Ť- 3 G	Chem

.n P.esearcii Foundation,

Minoh-shi, Csaka, page s 247-^2. Pomocí standardních metod _a 3.(4-methoxyfenyl)-N-(t-butoxykarbonyl)-3-fenylcystein. Chráněný meziprodukt peptid-pryskyři c e , Mbaf SFt) -Arg (To s ) -Gly -Asp (C -3z 1) -Pc s( 4 -Μ 3z l) -Μ ΞΗΑ, byl syntetizovaný na pevném nosiči 4-methylbsr.shydrylaminové pryskyřici. Všechny aminokyseliny byly chráněny t-butyloxykarbonylem na sninoskupíně a byly postupně připojovány ryl·

1, x , \T V

-di cyklohexylkarbcdiímid/:-hydroxy· oer.zono azo.

/Τ'Γ’Γ’ /nT;^ '·“! 4- / -η ·η V '->**· r> ·»-· z Ο 7 O Π Π Λ7 Ρ'~· “fy·“! Ο τ> 1

Po připojení poslední aminokyseliny byl peptid odštěpen z. pryskyřice za odstranění chránících skupin postranních řetěz

r. Y -*? et r·, 51 p / V- _řS ,₇ - > T.T1? / ) Λ -t· Ί / ” 7 Tvrv -·' -f- ηττ· p -t + “ o r* “ ς ·^Λ·^Ί ' ] / y p/ý yj ΡΊ ·ρ p Τ'Γ rT~ p VBKW S Θ f' 3 ·* ii ♦ párek promyje bezvodým etherem, surový peptid se extrahuje 0,2 M kyselinou octovou a extrakt se zředí deionizcvanou vodou, na 2 1. pH vodného roztoku se uprav?' na hodnotu. 7-3 koncentrovaným amoniakem a roztok se 24 - 48 hod probublává dusíkem. Po lyofilizaci reakční směsi byl získán surový kter>v byl podroben chromatografii za středního produkt, tlaku na sloupci s obrácenými fázemi /acetonitríl/H_oO-0.1 %

TFA/, aby byl získán požadovaný produkt.

-V ,x, -3 ’říprava cyklo-fd ,3 )-Mba-cfí-Arg-Gly-Asp-Mar ./ 5c c-A sp( cil-xx Ξ:ΐ) a N-methylmorfolinu /13,1 g, 120 mmol/ v THF /500 ml/ byl po kapkách přidán isobutylchlorofcrmat /15,6 ml, 1,2 mmol/, Reakční směs byla několik minut míchána a pak byl přidán roztok Man 4-3zl /22,0 g, 96 mmoV v THF /500 ml/. Reakční směs byla 18 hod míchána při teplotě místnosti. Po ukončení reakce /monitorováno pomocí TLC/ byla sůl aminu odfiltrována a filtrát byl vysušen. Odparek byl rozpuštěn v erby i a četa tu , liny citrónové ve vod<^: vodným roztokem NaHCC-, /1 x 3' a postupně promyt 5b roztokem kvsex 150 ml/, on n-m / vodou /1 x 400 ml/, x 400 ml/ a nasyceným solný:

ternem :ztí rozpouštědle byl vysušen pmocí bezvodého K„C( a koncentrován. Výtěžek Dožadovaného nroduktu bvl ^c u - v zU!

?,f η trován >/ Asp(C-cHox) -ksn(^z ~V3~l) ' c-r· lUl-ó, •Af -L i .

3cc~Asp( 1-cHex )-kan (b-kbzl) , /1/ /52 5Z'fi> roztokem TFA v methylenchloridu /400 ml/ a nenechán 45 min pri teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo .-a,

O ď v o V qy *1 y. o £ / η 't AZGC díi OC V έπ Z ’CG t 1 dik c č u >··, r·. '' <* rt /·· rt -¹ 'v·* /··. ^ ί c- - .· rp ip * r·. τ ·; y ⁴· ' o · r '^z * ” ^x

- ⁷ ..... ‘ ' j ~ b c - - ^x - 'L ním etheru, pevná látka byla usu:

p a / ίρ,ατ-ιώ r-p. 7. on e nu kem byla bílá pevní tka /4 6,7

G ly - A s p(0 -c He x)-kan(< < - 2z l) e studenému rozteku sloučeniny z Příkladu 6b /46,7 g, a' z r^.TT.,si / _v /1 ee -e / Κ-Π a/v, ητρΛ mmol/, aby bylo pH upraveno na neutrální.

/ c -,.-1 pr 1 z . > -- , „C , ,

Po oři dání HC 31 '14,0 g, 1 04 mmol/ by cřid in mo c

-m_v /! U r rr 04 3

- -O / > , P o , ¹ , Reakční směs byla v chladu několik minut míchána a pak byl po částech přidán RFC /’8,2 g, ^Ί4 , 9 mmol/. Reakční směs byla míchána 13 hod pri teplotě místnosti, pak byla zahuštěna na malý objem a nali⁺a do 1,5 i 10b rozteku k₉10-. ve vodě. Vysráž^ný produkt byl získán filtrací a pro.myt sčeníny byl 5C,6

V Ό 1 · < .4 · '</ .

d/ Gly-Asp C-cHex -Man 4-M3zl /80 ml/

Působením 5 0½ TFA[na sloučeninu, z Příkladu 6c /2,92g, 5 mmol/ podle postupu popsaném v Příkladu 6b bylo získáno 2,93 g /98%/ pzadované sloučeniny.

e/ 3oc-Arg(Tos)-Gly-Asp(0-cHex)-Man(4-M3zl) roztoku sioucenin, íklaču 6d mmol/ v DMF /4 ml/, vychlazeném na 0°C, byl přidán DIEA. /410^.1, 2,3 mmol/, aby se upravilo pH na neutrální. Po přidání “v *1 / r,·, τ 1 4 sy c* 4· X 'O >4 ·? H /n, .3 Λ Pt t sy mmol/. Reakční směs byla. míchána sa chladu, několik pak byl po částech přidán ESC /493 mg, 1 ,32 mmol/.

3 ¹ } minut a

Pspkfr směs byla nenechána oři teolotě místnost:

í chána 18 hod. Reakční směs pak byla· odpařena, odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu a postupně promyt vedou /1 x/,

I0% K_OCC₇ /2 x /, vodou /1 x/ a nasyceným solným roztokem /'' x/. Sthylacetátový' extrakt byl vysušen, bezvodým K₉CO,, zahuštěn. Výtěžek byl 1,91 no šacované '/ Arg(Tos) -Gly-Asp(C-cHex) -Man(4-M3z!)

K sloučenině z Příkladu 6e /1,9 g, 2,1 mmol/ byl přidán 50% TFA /10 ml/ podle postupu uvedeném u Příkladu 6b. Výtěžek požadované sloučeniny byl 1 ,59 g/.

g/ Soc -Sar-Arg^Tos ) -Gly-Asp(O-cHex ^-Man^4-M3zl)

K roztoku sloučeniny z Příkladu 6f /0,8 g 2,3 mmol/ v DMF /2 vychlazeném na 0^vC, byl přidán DIEA. /153 ^.1/, aby se dosáhlo neutrálního pH. Po přidání H03t /143 mg, 2,76 mmol/ byl přidán 3oc-Sar /183 mg, 2.53. Reakční směs byla několik minut míchána a pak byl po částech přidán prs byl

O /1 p£ f rr ? -r 1-.-.1 / W/.W sn-Sq Kvl « teplotě místnosti. Potom byla směs odpařena, zbytel rozpuštěn v ethylacetátu a postupná ^zchána 13 h

0% K_oC0₃ /2 χ/ , vodou /1 x/ a nasyceným solným roztokem /1 x/. Ethylacetátový extrakt byl vysušen bezvodým K₉CO^, zfiltro.vén a zahuštěn. Výtěžek požadované látky byl 0,78 g, h/ Sar-Arg^Tos) -Gly-Asp(O-cHex')-Man(4-M3zl')

K sloučenině z Příkladu 6g /780 mg, 0,8 mmol/ byl přidán 50/ TFA /5 ml/ podle postupu uvedeném v Příkladu 6b. Výtěžek požadované látky oyl 500 mg.

i/ Mba(SEt)-Sar-Arg(los)-Gly-Asp(C-cHex)-Man(4-K3zl)

Ρ -γη η ρ Ρ;p ÍT¹ ΠΡ / *5

κ.· u. '..a t t vnoř¹:

n roztoku sloučeniny v DMF /2 ml/, vychlazeném .Příkladu 5 h /0,85 g, 0,5 mmol/ μ-/,

0^vC, oyl přidán DSEA / — nd /

osazeno ne	•j	ρ p rsll Op p.·^· ;.. > _> y. ; í A W 3 0.	idání HC3t	/248 s.
byl přidán	Mbs(3?	t) /334· mg,	0,55 mmol/.	Reak —
yla nakcii	k ninut	nechána a n	P V ρ,’, ? Π P P 7Cíli. ij , u. ·_	ástech
/353 mg,	p tx ς - 5 z s	ol/. Reakční	směs byla	při
stnosti mí	r* V. ρ p cq *	8 hod. Srne s	byla pak cc	o?e řgna
byl rozruš	těn v e	thylacetátn	a postupně	prpTV

citroncvcu /2 x ,7 v o /7 x/, Ethylacetátový zfiltrovsn o d e _σ 5 - O * i v: v er· /p v / /1 v / el·, wcpi ? rnn n /’· v /a ne sv n ervrr ν'ν’Λυ /0

V w — ··.··· f ..

solný:

extrakt byl vysusen bez

Ί vytezek pozaoovane sloučeniny oyl

CJ.

cyklo(S, S )-Mba -Sar-Arg-Gly -Asp-Man.

Chráněný lineární peptid z příkladu 6i /423 mg/ byl vystaven působení bezvodého HF /70 ml/ v přítomnosti ani selu /7 ml/ 1 hod při 0°C. HF byl pak odstraněn ve p

p <3-•-O-v·» o V □v’' v»p 0 A* p en ususena ve vanu. oyio váného peptidu, Peptid by) purifikeván na Sephadexu G-'3 v

-^•pp fi ' “*

... ... _(J ...- - — - ,J --..... - — . · h-P řc ky.

etn^rem. cmes oyia surového eykliangelovou filtrací ;r;ě octová/vodě.

tu — ;· ρ Ρ. st I'. ^r~

A - ¹ · * · o ^J * O ’Ύ' <r ’

U- ib V C A. / i iúg/

C / 3 i'· r.2 t <~X

Ultrasphere ODS, lOiamx 25 cm, 20% acetonitril/voda - 0,1% kyselina triflurcctová, UV detekce při 220 nm/ a výtěžkem byla přečištěná požadovaná sloučenina /6,0 mg/. MS /FA3/ m/e 65,1 £m+hJ⁺; HPLC v.' 6,6 /5 p Altex Ultrasphere ODS,

4,5 ma x 25 cm, gradient, A: acetonitril, 3; veda -0,1% kyselina trifluroctová, 10%-50% acetonitril za 20 min,

UV detekce při 220 nm/, k^# 6,9 /Altex Ultrasphere ODS.

2C% acetonitril/voda-Q,1 % trifluoroctové kyselina, UV detekce při 220 nm/. Analýza aminokyselin: Asp /1,00/,

Gly /1 ,03/, Arg /1,11/.

cyklo-(3,S )-!'ba-Sar

2/ -.r-pc-y2:_y__A5-^_>cH?xy-;_a~(.·_·.:_3:;ρ sloučeniny z Příkladu čd /0,6 g, 1,0 mmol/

- ~ z , >j aoy se up v · — Z z nvm CT ' mmc.

.azerém ns 0^0, byl oři dán DIFA /13 0 j ;ra v 11 a hodnota pH na neutrální. Po 3t /16 mg, 1,2 mmol/ byl přidán 3oc-MeÁrg (Tes) ' 1 ’·-η·-ΐ ς₇.Χ, bvla několik ' T-; *- -j.<_? a psk byl přidán FDO /210 mg, 1,2 mmol/. Reakční směs byla potom 18 hod míchána při teplotě místnosti. ?c usušení byl odparek rozpuštěn v ethylacetátu a postupně promyt vodou :z /i / / i- | wv/v.

z : χ/, Kyselinou novou /2 x/ a nasyceným solným roztokem /1 x/_e Fthylacetátový extrakt byl vysušen bezvodým Na^SO., zfiitrován a zahuštěn. Výtěžek činil 780 mn /36'%/ požadované sloučeniny.

b/ MeArg(Tcs)-Gly-Asp(C-cHex)-Man(4-M3zl) sloučenině z Příkladu ?a /759 mg, 0,56 mmol/ byl přidán 5 0% TFA /4 ml/ podle postupu popsaném v Příkladu 6b a byla získána nožedovar.á sloučenina.

c/ 3oc-3ar-MeArg (Tos) -Gly -Asp^O-cHex') -Man(4-IA

K roztoku sloučeniny z Příkladu 7b /0,3 g, 0,86 mmol/ v 2 ml DMF, vychlazeném, na 0°C, byl přidán BIEA /153 ul/, aby se dosáhlo neutrálního pH. Po přidání H03t /143 mg, 1.03 mmol/ byl přidán. 3oc-3ar /183 mg, 0,95 mmol/. Reakční směs byla několik minut míchána a oak bvl nřidán EEC /186 mg, 0,95 mmol/. Reakční směs byla míchána 18 hod oři teolc· tě místnosti. Reakční směs byla odpařena a odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu a postupně promyt vodou /1 x/, ί ν' /V X g v 0 g / X / . V O vO U / X / , ' / O 1 / ί X i vodou /3 x/ a nasyceným roztokem soli /1 x/. Ethylacetátový ex vysušen bezvodým Νο~30„, sfíltrován a byl 0.65 g požadované sloučeniny d/ Sar-KeArg ('.

(Tes-Gly-Asp (θ-cHex) -Han(4-M3zíj z Příkladu 7c /650 -g, 0,8 mmol/ oyl ml/ podle postupu uvedeném u Příkladu ek činil aio dožadované sloučeniny.

K sloučenině přidán 5 0/ TF1 /5 6b. Výtěžek v.,,_; e/ Mba(_3Et) -3ar-HeArgt?os>Gly-Asp(C-eKex) -Van( 4-H3zl) ’

K roztoku sloučeniny z Příkladu 6d /0 v umr /a mí/, vyeniazenem n~

0,6 mmol/, aby se dosáhlo neutrálního pH. Po přidt /150 mg, 0,55 mmol/ byl přidán lúba(SEť) /394 mg, 0,55 mmol/. Reakční směs byla několik minut míchána a pak byl pc částech přidán EBC /260 mg, 0,55 mmol/. Reakční směs byla míchána 18 hod při teplotě místnosti a pak odpařena. Odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu a postupně promyt vodou /1 x/, 10/ KgCOg /2 x /, .vodou /1 x/, 5/ kyselinou citrónovou /2 x/, vodou /3 x/ a nasyceným solným roztokem /1 x/. Ethylacetátový extrakt byl vysušen bezvodým Na^SO,, sfiltrován a sconcentrován· Vvtěžek činil. 0.4ο ,0 nošado — va né slouče n i ny.

j

f/ cyklo-(3,S )-ICoa-3ar-MeArg-Gly-Asp-Kían.

Chráněný lineární peptid z Příkladu 7d /450 mg/ byl uveden do reakce s bezvodým HF /10 ml/ v přítomnosti 1 ml ani sólu při 0°C. Za 1 hod byl HF odstraněn ve vakuu a odparek byl rozetřen s etherem. Pevná látka byla usušena ve vakuu. Výtěžkem byl surový cyklizovaný peptid /263 mg/. Další čištění probíhalo gelovou filtrací na Sephadexu G-'5 v 1 i kyselině octové/vodě. Příslušné.frakce byly spojeny a lyofilizovány. Výtěžkem byl částečně purifikcvaný peptid. Alikvot /65 mg/ tco.oto produktu byl dále purif i kován pomocí

W P 11 i *! t Ω V ’'Ί C T\O 1 Λ .r pr. γ '5 pr Ů C ··» Q + Π i i AjL· / J La Λ -U v d A X C a. <2 či- p - i tf i tí χ-z· IzO j ; V ά.-i-i A i- > ok. | J ) CÁ wV * nitril/voda-3,1 % kyselina trifluorcctcvá, UV detekce při 220 nm/, Výtěžek požadované sloučeniny činil 6,0 mg.

-:/e £73,£ OVV

A / Di rp 4- <· a ••-P . r j V.-.. . ; ...

* nf' ·” f;· k η /5 n Áltex Ultrsrsphe:

'í ráčetem^-

K £ ng acetonitril za 20 min. UV detekce oři 220 nm/, k /Áltex Ultr p << p v» λ

v... ,

V /

XV S Θ i mi noxy seno

Aso z ' / ΠΊ /*; ,'D P ·' ' i z . , W v/

Příklad 8

Příprava cyklo-(3,3 )-Uba-Arg-Gly-Asp-Uan a/' ·' Moa (3St )-Arg (.Tes) -Gly-Aspf D-cHex/-Uan(4 -i.Szl)

K roztoku sloučeniny z Příkladu 6f /0,80 g. m ·-? hv nv ^Ί v PUF /2 ml/, vychlazeném na O'C, oyl přidán PÍPA, aoy oyic

O I ¹ < p V ú¹ p h' rt O ^Χ V· P ~l rp */ _e pn + ~ΐ~τ; “? ρ, η H rjy, 1 /330 0,^7 m.ol/_? reakční sse-s bvla několik rin n;ícká~

n.3 Ό3^Ίκ*' byl p^iior FOO ‘•⁴O f

17 mmol/ a 4-dimethvl;.i.j.nopyrioin /?!- mg/. Peakční směs by p g> -? * p p * q t ě místnosti a r o^J s ethylacetátem a postupně promyt vosou ,· ‘ x/, .2 x/, vodou χ..'. a. kysel'.nou cUouosvoo. ,0 r? » t e· />. m o

'...i ·. 7 i .<-A · V /3 yJ a nasyceným solným roztokem /1 x/. Ethylacetátový extrakt byl vysušen bezvodým Na_?SC^, zfiltrován a zahuštěn. Výtěžek činil 0,41 g požadované sloučeniny.

b/ cyklo-(3,S )-Mba-Árg-Gly-Asp-Man

N.a chráněný lineární peptid Příkladu 3b /223 mg/ bylo s-ůsobeno bezvcčvn! H;

> -» ·+ Θ. τ*- v~> « ,- v zaústí * ml anisolu ¹ HF odpařen za vakua oři C^v C a odparek byl rozetřen s etherem. Pevná látka byla usušena ve γ W ' J * VY O — O ~ ’ T¹ γ ,áí V <> -,7 Z JV C'. γ Í-- '* P * TO O p 7- 1 ) _# olikvc:

zrn *7 ilte x

.....

O C* -r;- í Q -. q -. ρ + θ *’ 4* ν» η Ί ’ ·· r· p ? ' ·?m. _y i-ί j u- ,'v c* n: v . - -χ ~ 1 u. m. / vj c* 0 » · /v trifluoroctové kyselina.

v cetexce pri z2s nm/. vytez^em bylo 5,0 my čištěné požadované sloučeniny. M3 /FA3/ n/~

533 · (M+íí ; T1C R^, 0.63 /n-3uCK:HCAc :H_OC: EtOAc

- 7 7 7 r-u . xip «_Λ. u n . r-.-r-r-. e - n i c . e; . t η . i n /. uo* ~ v* ' · j · ·- ' · .....·'-'-·---* ^; .,/..·.· v . V, , ,,X /9 p £ U^ Ť ^Q ΘΤ¹''-' Ό3 j 3 1 ^ΟΊη u j 1~ · O (j 3 0*3 Ί '3 ;

VO d 2. “ 0 ♦ ό V R V S⁰*! ^Ί* ^3 j 0-I — £·. ?<·. 2Qpt ^χ τ'7 ? γ^τ 9 Q τγ* *7 ’?V rir»² ?7ⁿ •^rr / > ~ 6- /P i > AV -‘,-ηγ I”¹ ? Ά·',^·»·» ϊ - v ...... .... , ... „ , .· „ /-* A ...... - - u.. ...

, -·.· / 5

Π.Ί ,, /1 ?. Q / J v, ~ /« Y Λ / •~J , · ,.00/ · *D4<, ' γ. n >lod 9

Příprava cyklo-(s, S^) -Mba -3-MeArg-Gly-Asp-Man &/ 3oc-3-MeArg(Tcs) -Gly-Asp(G-cHex)-Man(4-M3zl_/) _;j. s-íkladu 7 d ,ml/, vvcniazenén na 2,2 mmol/, aby bylo pH upraveno na neutráln byle přidáno 202 mg, ',5 nsmňu HC3t a následovalo 3,663

FIFA /130/ul, ’ - -.....-^j-·^{4 Jvj} - .....- -·-£'» -' -y· m;p. b U>

'C^; m-m,· v •y, i .3

.. _r. X _o . Ί _o /. u. ... ... 4 _Λ ,-.η - 4. , . 4 _r Λ _o 4

pak odpařena. Odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu a postup ně promyt 1 x vedou, 2 x K₉C0₉, vodou 1 x, 2 x 54> kyselinou citrónovou, 3 x vodou a 1 x nasyceným roztokem soli. Ethylacetátový extrakt byl usušen bezvodým Na₉SC_z, zfiltrován £- 4 a koncentrován. Výtěžek činil 506 mg požadované sloučeniny.

b/ D-MeArg(Tos^-Gly-Asp(C-cHex)-Van(4-M3zl

K sloučenině z Příkladu la /7 CO mg, 0, ^c-nmc2/ bylo přidáno 5ml 5 0/ TFA podle postupu popsaného v Příkladu 6 b. Výtěžkem bylo 658 mg požadované .sloučeniny.

c ZMoafSF^D-VeArgfTcs^-Gly-AspfO-cHex)-Man(4-M3zl) y v τ + A l·’ η ί £ Π Ρ - p* - y 1 i-r. -v, ,/-s “5 ·, - “t fy -,» X ,·> rt - rr *. · - ol·,'·'! c ] O rc o 4 ~.“i r\*r-r·· μ.,3 ,- ^ατ-ά 1 O Λ Λ Qc ΡΤΡ * q X-»r a pH upraveno na neutrální. Potom byl mmolu mba(oE^, reakční směs byla ně oak bylo přidáno 274 mg. *,42 mmelu EDC a 174 ·; 4 'z 4 v·, ♦ A 4.

^Ai*Ó 5 ^u-o J ‘ Ϊ » . Z }- c.· a jn ·η / ?· mmolu 4-dimethylaminopyrid:nu. Reakční směs byla míchána

-o oro pu. o í o.·:. :

..V - -Λ.

, Iv. z-j C-- *3 j · X J J

V A · A-· r <- A I O Ά A , i .’· * ** V» **-· ά A τ a -(0 < V Λ J .o o J. .u i. 'J Vx _ ’-.· - v.a»- v ·-·- u , A vedou a ; x nasyceným solným roztokem. Ethylacetátový extrakt byl vysušen bezvodým Na₉3C,, zfiltrován a zskuštěn.

Výtěžek činil C.

j: z požadované d/ cyklo-(s,3 )-Mba-E-MeArg-Gly-Asp-Man

K 07 0 r-í?

*V. , s.. ..._c»r·» o η λ-λ .4q 2.1 Π ° é^xx í ho P ^btiÓU 2 íkladu 9c bylo oři O^C přidáno 10 ml bezvodého HF v přítomnosti 1 ml ani so.

Po 1 ho-íbyl HP odstraněn ve vakuu a oy n- b-n zbytek rozetřen s etherem. Pevná látka byla usušena ve vakuu. Výtěžek mg surověno c-'i':

V. V< · který byl purifikev

J-. . _ . - ~ . . .. _c. ' lx Ávseltn^ octcvé/Dod* i S 0' v a n ého Όe P t i — í ra Serhadexu 'Siics pyly _n -(„„Z·.··!.· -ί. XX-r-.-rl - ι eP^jf bj c! -bj .....J i. -.r.-c-u U_t> _ .

řadované slou f rjJ , rp T A

/n-3uCH:HCAc:H_o0:EtCAc 1:1:1:1/, R^, 0,68 /n-3uOH:HOAc:1UO á I č pyridin 15:5:10:10/; HPLC k* 6,7 /5 ji Altex Ultrasphere

CCS, gradient, A: acetonitrii 3: voda-0,1 % kyselina trifluoroctová, 10-50% acetonitrilu za 20 min. UV detekce při' 220 nm/, k' 6,1 /5 [/ Altex Ultrasphere CCS, 21 % acetonitril/voda-0,1 % kyselina trifluoroctová, UV detekce při 220 nm/; analýza aminokyselin: Asp /1,00/, Gly /1,21/,

Příprava cyklo-(3,s)-Uba-MeArg-Gly-Asp-N-Me-Va a/ 2-N-Vethylaminofenylli sulfid roztoku 8,0 g, C ml ethanolu bylo přidánc 14

3-me t hy1be nz o t h i a z o 1u g, 0,56 mmolu pevného hydroxidu draselného. Reakční směs byla '0 hod vařena, pod zpětným chladičem a pak ponechána při teplotě místnost: přes noc. Rozpouštědlo bylo odstraněno a odparek oyl po z z. ZL η inΘ z i £* t ry 2 3c θ * á w nt v c 'ι r z *h ok ^y č v cks r z — ného o pH 15. Vodná fáze byla okyselena koncentrovanc-u HCl . , ...

X. U- X luz ·. r iid » v , 'ýtěžkem byly 3 g volného thiolu ve formě olí Ozpuštěn v ethylacetátu a roztok byl 40 min probublávén vzduchem,. Organický roztok byl zahuštěn a výtěžek činil 2,55 g požadované sloučeniny ve formě b/ N-MeMan (4-M3zl)

K roztoku 2,65 g, w «i. vá ib J. U oučeniny z Příkladu ve +

ethanolu bylo pc částech přidání ihydroboritanu sodného. Tím bylo dosaženo úplné redukce

K reakční směsi byl pak přidán roztok 3,5 g, 19,2 mmolu tx-oromxylenu v ethanolu a sm*s byla přes noc míchána při byl ·, τ /i y\ .y . ·, r·· -v-j -· — .--- *-> » ., j _Λ .. v Juu oyrafován na l '.·-1 ·

cz^z 3oc-Asp(0-cHex )-N-MeMan 4-M3zl

Ke studenému roztoku 1,4 g, 4,5 mmolu 3oc-Asp(G-cHex) a 0,59 ml, 5,3 mmolu N-methyImorfolinu v 20 ml THF bylo po kapkách přidáno 0,69 ml, 5,3 mmolu isobutylchlorcfornátu. Reakční směs byla několik minut míchána a pak byl přidán roztok 1,0 g, 4,1 mmolu'N-Me-Man 4-M3zl ve 3 ml THF. Reakční směs byla míchána 18 hod oř’ tabletě místnosti. Po skončení reakce byla sůl aminu odstraněna filtra cí a filtrát byl vysušen. Odparek byl chromatografován na silikagelu v 20-30% ethylacetátu/hexanu. Výtěžek činil 0,95 g požadované sloučeniny.

d/ Asp (C-cHex) -N-MeMan(4 -M3zl)

K 0,88 g, 1,6 mmolu Sce-Asp^O-cKex)-H-Me-man^4-M3zl) methylenchloridu a směs ě místnosti. Rí

X p pQ	1 ,6	mm
byl přidán 503	roz	+ rs n v, \J Xx
byla ponechána		min
bylo odstraněno	a	40
a by se cd st ran i		c oy
etheru.. Sraženi	na	byl

r hi v y yr» 1 t h ry”¹ —-J n -rp ·

Produkt byl vysrážen .oan:

•t o'? ,r .o τγ í/ 3oc-Oly-Asp(0-cHex)-N-Me-Man(4-M3zl) sloučeninv *· ~ J by

Ke studenému roztoku 880 mg, 1,6 mmolu Příkladu 1 Od v 5 ml DM? bylo přidáno 285 )ul byle dosaženo neutrální pH. Po přidán?' 300 mg, 1 HO3t bylo přidáno 340 mg, 1,92 mmolu 3oc-01y. Reakční směs byla několik minut v chladu míchána a pak bylo přidáno 375 mg, 1,92 mmolu FDO po částech. Reakční směs byla míchána 18 hed při teplotě místnosti a potem usušena Odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu a postupně promyt 1 x vodou, 2 x 103 K..CO-,, ⁷ x vodou a 1 x nasyceným solný: roztokem. Ethylacetátový extrakt byl vysušen, bezvodým

O Q Q ^r“ ’Γ*ί i v* q V '^{v 1}1 V * n r p/z ?¹ τ'- n 9 O ý'. y ₄— r,ρ-, -p „ a tg , . , 92 mmolu iovane slon:

4?

f/ Gly-Asp (θ-cHex) -N-MeMan (4-M3zl)

Κ ^!,3 g, 1,3 mmolu sloučeniny z Příkladu 1 Oe bylo přidáno 10 ml 5 0// TFA podle postupu popsaném v Příkladu 6b a byla tak získána požadovaná sloučenina, g/ 3oe-MeArg(Tos )-Gly-Asp(c-cHex) -N-MeMan(4-M3zl)

Příkladu 1Of vychlazeném na 0^vC, byle přidáno 330 pil DIrA, aby bylo dosaženo neutrální pH. Po přidání 312 mg, 2,1 mmolu bylo přidáno 3 ? .0 m r, 2,1 mm cl u 3c c —1^ —Me —4 rg s. e akční sm^ s by 2 η n ěkc 2 i k minut míchána a pak byle přidáno 400 mg, 2,13 mmolu FDC.

Reakční	směs by
usušena.	0 >3 Μ v* Φ
! X V 0 O 0	u. 2 x :

7? ·>· . smnosmi a nax nyiaceratovy extraxr oy... vynucen oezvcoym /a, t 4- X χ η μ v > v S .·% ti isiauo.Riny ay - > ,

Λ/ MeArgpcs )-Gly -A_Sp(C-cHex 4 -M3zl)

Fi ... <Z coule postupu popsaném v rrixlaou co. vytezex pozaaovsne ·> z ~p T? ''i '

O ž'.. » v·' /1/» sloučeniny oyl , i/ Moa(3Et)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Q-cHex)-NMeMan

K roztoku ,1 ,3 g, 1,4 mmolu slcučenihy z Příkladu 1 Oh 2 ml DMF, vychlazeném na 0°C bylo přidáno 25 0 pl 3ΙΞΛ , ^by bylo dosaženo neutrálního pH. Potom bylo přidáno 550 mg, co lu Mba(SEt), reakční směs byla několik minut míchána, rpp-,Α 7.1 C ·ηρ· 1 Si R^O 3 007 i ě 5 i 3^0 ’,Γ ’ ve

2,3

Vu-,τΊ u. j _ <

j , .· - ,A 4-dime thy i aminopyridir.ť Reakční směs byla míchána 12 hod

4* o 1 'i

Π.'* 5 ΐΏC S * 2 '3 rijk ^?7 M;'* * Γ; t. ?· 0*^1 MOZMuŠÍ. íp v ethylacetátu a postupně promyt 1 χ vedou, t x v ou ou , x o... i.y s e11ne o o / to.;.o v on, o x ,-..4 ou o x nasycenýw. solným roztokem. Fthylscetamcvý extrakt byl vy i. X ί V /V' Ji Λ V L·

ZV:

icentrován. výtěžek }/ cyklo-fs, S^-Mba-MeArg-Gly-Asp-N-metían

K 800 mg chráněného Unárního peptidů z Příkladu 1Oi bylo přidáno 10 ml bezvodého HF a 1 ml anisolu při 0°C. Po hod byl HF odstraněn při 0°C ve vakuu a zbytek byl rozetřen s etherem. Pevná látka byla usušena ve vakuu. Výtěžek činil

628 mg surového cyklizovaného peptidů. Peptid byl přečištěn chromatografií na ODS silikagšlu v 20/ acetonitrilu/ vodě0,1% TFA 20 mg ncíl byl ořečištsn ocmocí HPLC /5 μ Altex /

Ultrasphere ODS, 10 mm x 25 cm, 18% acetonitril/voda-0,1 % trifluoroctová kyselina, UV detekce při 220 nm. Výtěžkem bylo 5 mg čisté požadované sloučeniny. ’.'3 /FA3/ m/e 616,2 [h+h]⁺; TLC Rx. 0,32 /n-3u0H:H0Ac:H₂0:EtCAc ^1^:1/, R„ C,77 /n-3uCH: HOAc:HCAc:H₂C·:pyridin 15:5:10:10/; HPLC k' 10,5 /5 ρ Altex Ultraspfeere ODS, gradient, A: acetonitril 3: vcda-0,1/ triky tekce při 220 nm , k acetonitril/voda -0,1/ při 220 nm/. Analýza am )

4- 4

1Tma i i-’

-i r·.

fluorcctová Kyselina, UV detekce v «5C.' i n · / ⁿ·^ / m v /· /

P-ri / V Ί o /A

Příorava N**A

-cyklo -(3,3 )-Cys -MeArg-C-ly-Asp-( 2R, 3S )?cs-NH,

Pryskyřice s chráněným pentapeptidem 3cc-Cys(3Et)HeArgfTos )-Gly-Asp( 0-cHex)- (2R,3S) -?-phenylcysteir.(4H3zl) Me3RA byla připraveny podle Příkladu 1 v 0,5 mmolárním množství. Po odstranění N-terminální 3oc skupiny 50% TFA v methylenchloridu a neutralizaci výsledné soli s TFA 7% DIEA v methylenchloridu byl peptid navázaný na pryskyřici acetylov.án 0,47 ml acetanhydridu a 0,86 ml DIEA v methylenchloridu /2 0' ml/ 4 0 min.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice za současného odstranění chránících skcupin retezcu píiscoenim í v iii ί Λ π ežvodého k-palného HF v přítomnosti 1 ml anísoli dobu 50 min. Po odstranění HF ve vakuu byla pryskyřice % v-> gir,- 4· *“ V - ·· 7 ~ Ή ,7. ·>·> π ·Ο. 11 c; ’; o p T> ? Ί > _# Γ7Ύ y il' *

pak extrahována 1% kyselinou octovou/vodou /2 x 30 ml/ a 2 x 30 ml 103 kyselinou octovou/vodou. Spojené extrakty byly sředěhy deicnizovanou vodou na 1 1. Hodnota pH vodného rozteku byla upravena na 7,65 přidáním koncentrovaného amoniaku. Cyklizace bylo dosaženo probubláváním inertním plynem, například argonem, v němž volná sulfhydrylová skupina vytvořená odštěpením chránící V3zl skupiny síry vytěsnila SEt skupinu chránící druhou síru. Proces cyklizace trval 28 - 72 hod. ^ostok byl podroben. chromáicgrafi i na OES silikagelu ss neužití stupňového gradientu a/ voda b/ 123 aeetonitril-C, Π TFA-voda. Odpovídánjící frakce byly spojeny, vysušeny a odnarsk byl lycfilizcván

i.,, ~ n/e 682.

[>Hj ; TI /n-3uCH:H0Ac :HyO: pyridin 15:5:10:10/; HPLC k' Altex Ultrasphere OES ,οτ-, ή + ι

U’*z - p Ί i*’· 7 ^νϊ “i. Ί *ý Γ' i

VC tová, 0-503 * ,-·» o n Altex Ult z z _ ..

za θ pr. ,ο.^Vi

r. rl o » fy

T*r' ., u v

T*·.

} _; - z , z , vcca- 0,‘ ,·. kyselina trifluoroctová, UV detekpři. 220 na/. Analýza aminokyselin: Asp /0,97/, Oly /1,00/, ·,·ο /^{1 ηη} / .''a ao / ΛΛηνΙ _ΓΊ7<5 /0 ίϊ' d ' ! - - z ! - Z - , , p - ·>· -.J - z . · y /'£>' LA << t i- kz

C'

Příklad 1 2

Příprava N*Ac-cyklo-(S,S) -Cys -Ve Arg-Gly-Asp-(2R, 3P)Pcs -NE,

Pryskyřice s chráněným pentapeptidem Boc-Cys(SEt) VeArg(Tos)- Gly-Asp (θ-cHex )-(2R,BRpl-fenyleysteir^áVazl)Ve3HA byla připravena podle Příkladu 1 v množství. 0,5 mmol. Po odstranění N-terminální Bcc skupiny 503 TFA v methylenv metný· chloridu a neutralizaci výsledné soli s Ί GPChl CTÍ ČU D*’1 pr? p*t d - ΡΛϊ V 3 2 3 Ώ V Π3 2 Τ’V 2 kVT* 1 2 i

:.l DTE A ve 2 0 ml methylenchlc • .o + c p V ». * / rp Ά · < <,n P £, . wx-s.·*♦./ ·> J idu po dobu j / 3.

;etvlován •^1 ;-p 2

a ·< x ur· v

..ti: ί i« po dobu .iiπ,

Po odstranění HF ve vakuu byla pryskyřice promyta ethyletheren a usušena na vzduchu. Potom byla pryskyřice extrahována 2 x 30 ml 1# kyselinou octovou/vodou a ještě 2 x 30 ml 101 kyselinou oetovou/vodou. Spojené extrakty byly zředěny na 1 1 deionizovanou vodu. Hodnota pH vodného roztoku byla upravena na 7,6 přidáním amoniaku. Cyklizace bylo dosaženo probubláváním roztoku argonemj argon odežene ethanthiol uvolněný tím, že volná sulfhydrylcvá skupina Pes nukleofilně vytěsní SEt skupinu, která chrání sulfhydrylovou skupinu cysteinu. Po 72 hod byl roztok chromatografován na ODS silikagelu, v postupném . I) · * 'J

a /	vod
ce	byl
y, - y	r> --- .4»
ÍJJ	A L. u
	tn ,* /
	f Λ o/
	/’
* ·	/λ
5	/3 μ
	, 2
A	~Λ “ V J
.... 4	,-, T 7
... ~	Λ . »
0 s	tekc

dající frakce byla spojeny, k by

z. ι

.... ·. v.

<·*·· 2 <. * ·, Λ

\.z L. u v '« » / ' 1 · ' ' ) 'o C-.PZ [Io-hJ ; TLI lži τll . t.t A ; p . ;j C ► r-vy·

-z „t ... ... , ..1 U « - - p k,- « yy . ... ·.> -..

fcvSGiif-B tri ίΊν.ΟΖ acetonitrii/voda · 'χ 4 ’ 9 · ’ i ent ' ·»» · Λ i ’ ' ~/, lys /0,33/, /3-/0-5-122

Příklad 1 3

Příprava N^Ac-cyklo-/S,3/-Cy 5er-Cys -NH,-,

Pryskyřice s chráněným dekapeptidem 3cc-Cys/M3zl/-Arg /Tos/-Gly-Asp/0-cHe x/-Se r/3z1-Cy s/SEt/-Me 3HA byla připravena podle Příkladu 1 v množství 1 mmolu. Po odstranění N-terminální Soc skupiny pomocí. 5 0/ TFA v methyl enchloridu a neutralizaci vzniklé soli TFA přidáním 7/ ΙΤΕΑ v methylenchloridu byl peptid vázaný na pryskyřici acetylován 40 min v přítomností '0,95 ml acetanhydri du a ¹ ,72 ml DIEA v 3 0 ml DME τ V~i τ p ⁴ ρ p Ot, Píi ΠΤ ' C i .

y .λ S J‘.·. ·.. ni - v ·..? ·.·... L il. s < - s .. ... . - * jPo odstranění HF ve vakuu byla pryskyřice promyta ethyletherem a usušena na vzduchu. Pryskyřice byla extrahována 2 x 30 ml 1% kyselinou octovou/uodou a pak 2 x 30 ml 10% kyselinou octovou/vodcu. Spojené extrakty byly zředěny deionizovanou vodou na objem 21. Hodnota pH vodného roztoku byla upravena na 7,65 přidáním amoniaku a reakční směs byla 72 hod probublávána argonem. Roztok byl chromatografován na ODS silikagelu

-vod:

Μ ητν'¹'* r* <. u íj·^ v b v 1 1 v n-fi 1 i 2 o v án z jveho gradientu: a/ voda o/ aceton: tni-o.' % ideiící frakce bvly s:

. — _v ra - - - >-· V ... — j cnpařeny a ocparez uy± xyoiííizovhh z kyseliny octové/vody. Výtěžek činil 300 mg, 80% Částečně čištěného peptidu. Podíl ¹72 mg byl purifikcván icexu v systému vá/voda. Odpovídající frakce byly spojeny a lycfilizovány. Výtěžkem byle 74 mg požadované sloučeniny. MS /:.-.2/ m/e •094,3 [i.’.+h]⁺,· TLC R^ 0,25 /n-3uCH: HCAc :H_o0 :P+CAe 1:1:1:'

XD - Ί *7 771,. Γ'.τι „ χτ·*- '· .-. . '7 7 ♦ — ra 4 .. 1 r * IX · 1 » * C ·· * l.TPT ' 7 Í7

- -Π ·' 7 - · » *- - » - i* · --p V . ra. ._Λ - 1 .··--·· V * ¹ / J -*·*· ’w -- I í s

Altex Ultrssphere 0Γ3

V“,· o o Ί t 7 mv *' >-·o 1 τ -^Λ ·>»r- · -J- i·, , gram

Τ V ^τ P rara ra ,3 /5 u Altex Ultra5uher

T-C % kv ;riflucrcctová “, σ - , O O V ' n’ detekce

-V z ... . .

Příklad

Příprava N*Ae-cyklo-/3,S/-Cy «ralDfir*· «.KTU ‘-Ol j. x, _ i .T-ry

-Arg -Gly -A s p -Ser -Arg -0-1 y -A 3 p

Pryskyřice s chráněným dekapeptidem 3oc-Cys/SEt/-Arg/Tos/^z m -,, _£ c ηK „.ujav .''-Oqt, zn-Ί /„i™, /σ>π<? /_ηι _v -i n/Π-^ρυ r> i /_ ,χ -— j w. K# / j a -β Λ z »-D x· ra / Ty Lt Λ, / z* „. / - w’ / vl -X- »·»«m y / vD L« . . v> Λ., ·/ ^4. / x—'ra /

0ys/4M3zl/-Me3HA byla připravena podle Příkladu 1 v množství ,0 mmolu. Po odstranění H-terninální 3cc skupiny působením

TFA v rnoAhvlsschlorió-j. s zíící vvsledri > 3 -t rn xp r.

'TI?

•thylenchlcridu byl peptid vázaný

Cl yCuV/iuv-ít·

Cl p + pd. r-; '^l- y '3 Λ-l:1 '-3 1 *“7 7

Ο Λ v- Ί ^T'^k*

071 ddžř chránících skupin z postranních řetězců působením 30 ml bezvodého kapalného HF v přítomnosti 3 ml anisolu při 0°C po dobu 50 min. Po odstranění HF ve vakuu byla pryskyřice promyta ethyletherem a usušena na vzduchu . Pryskyřice byla extrahována nejdříve 2 x. 30 ml 1% kyselinou· octovou/vodou a pak 2x30 ml 10% kyselinou octovou/vodou. Spojené extrakty byly zředěny deionizovanou vedou na objem 2 1. Hodnota pH vodného roztoku byla upravena na 7,65 amoniakem a reakční směs byla hod nrobublávána argonem.Potom byl roztok chrcmatografován na CD3 silkagelu za použití stupňového gradientu: a/ voda b/ 5% acetonitrii-0,11 TFA-voda. Odpovídající frakce byly spojeny, odpařeny a odparek byl lyofi linován z 1 1 kyseliny octové/vcdy. Výtěžek činil 830 mg, 801 částečně přečištěného peptidu. Podíl /172 mg/ byl purifikován zelovou filtrací na

Sephaoexu kyselině cetové/vodě: Cdpcv ce byly spojeny a 1; požadované látky. <F /n-BuCH: FD Ar. · - o•vany

X / 7>

··· pyri din vlo nv cm ^ ·' i o - - oce teni tri 1

2 0 mix, UV c.atakca rři sphere CD.

χχ aceton:tri2/ver

ΔΊ t i X ΤΤΡ,ί

4. _r< u η f\ O C7 u , í, 3 ~ f’ · .c . * '_;p.?

) /0 /j Aitex Citrasprere

0-p0x acetcnitril lltex Ultra.“

F’ R ; ·*: VP p - n IF ~ ·- ·*· ^v.....‘ J

220 nm/. Analýzy aminokyselin

UV detekce při Gly /2,07/, Cys /2,0?/, Ser /1 ,91/,

Příklad bi / 1 O f) / / i ,09/ <

Příprava nXůc-cyklo·-/S,3/-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly-Asp· Ser-Pen-NH₉

Pryskyřice s chráněným dekapeptidem 3oc-Cys/SFt/-Arg/Tc:

-·> /

Gly-Asp/C-cHex/-Ser/3zl/-Arg/To3/-Gly-Asp/G-cHex/-/ Cys/4MBzl/-Me3HA byla připravená podle v>ř.

cum onou ; v mne .I .-JΓ-J. .v zce szuniny oosooemm

01 TFA v methvlenchloridki a neutřel i žací vznikl é sol:

FIFA v methylenchloridu oyč p^m:

Fici acetylevár působením 0,94 ml neetarhydridu z 1, v 9 0 ml DV.F ro deou 7 mír.

'7..·.' 77 T T?

- 55 Peptid byl odštěpen z pryskyřice za odstranění chránících skupin postranních řetězců působením 30 ml bezvodého kapalného HF v přítomnosti 3 ml anisolu při 0°C po dobu 50 min.,Pc odstranění HF ve vakuu byla pryskyřice promyta efchyletherem a usušena na vzduchu. Pryskyřice byla extrahována 2 x 30 ml 1/ kyselinou octovou/vodou a potom ještě 2x30 ml ' 0% kyselinou octovou/vodc-u. Spojené extrakty byly zředěny deionizcvanou

vedou na objem 2 1.	Hodnota pH vodného rozteku	» 7 Ί 0 k«Z,> i.A	uoraven
V- p T £ „ κ A r· Y η fp r·, /	m amoniaku s. reakční směs	1 1 b·'- -	probublá
vána 72 hod argonem.	P.oztok. byl chromatografcv	án na	ΓιΤΡ Ο'Ί

gelu v stupňovém gradientu: a/ voda bz 6/ acetonitril-0, rr. χη ' v.

rek rvkce byl lycfiiizovan £ Vj

C\ · -^f ]' b -·· c¹ ’ y n k ,r r\ *ř rj i ·, Pt P ~^· i ’’ Y ’’-n / 'Ά7 r^· » Τ' - - iz 6 ó y·.

vou filtrací na Sephadexu G-T v bl kyselině octové /vodě.

bylo ~ po <· ΐ v ’ ' - t., ......u - V. r« o Ή ^Λ' 7 f³ ; ?

- - - 1/ ρ.-.^-'Ί ,6

220 nm/, ;/T^T O

-/vy:-., 5 *+ im £ θ V Q ή P 2 3. ? 6 , ·~· _L... Γ- j , - - „ .,

1:

---- ... _y...

;yc.p1 nox o pczsccvsne /n nt :~r._a;

» to*

X.. J tex titraspner? selina trifluoroctová ti ent, A: acetoni 5Ox acetcnitril

O Oi m/, k* /5 p. Altex Ultrasphere ODS,

Cys+Pen /1,66/, Ser /1 ,76/, Arg /2,16/.

Příklad ’ ‘S

50% TFA v. methylenchloridu a neutralizaci vzniklé soli TFA pomocí 7% DIEA v methylenchloridu byl peptid vázaný na pryskyřici acetylcvén působením 0,?4 ml acetanhydridu a 1,72 ml DIEA v 30 ml DMF po dobu 40 min.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice za odstranění skupin, chránících postranní řetězce, působením 30 ml bezvodého kapalného HF v přítomnosti 3 ml anisolu při 0°C po dobu 50 min.

Po odstranění HF vs vakuu byla pryskyřice promyta ethyletherem a usušena na vzduchu. Pryskyřice byla extrahována nejdříve 1% kyselinou octovou/vodou /2 x 30 ml/ a pak 2 x 30 ml '0% vsel to vou ./vodou.

zené extrakty byl v -j ¹ edeny dei ;ni~ zovanou vodou na 1,5 1. Hodnc-ts pH vodného rozteku byla upravena na 4 přidáním amoniaku a reakční směs byla 72 hod probublávána argonem. Roztek byl lyofilizován. Výtěžek Činil zoo e>7 surového r-etidu. Podíl 204 n~ bylo oa^k f⁴ kováno •'r-¹?·· Sephadexu G-t5 v *1 ky o jeny a lyzfiii....

mg čisté požadované sloučeniny. M3 /FA3/ n/e 1-03,3 Qí^hJ TLC P._x> 0,23 /n-3uGH:HCAc:H₂C:EtCAc 1:1:1 ^/, R^, 0,45 /n-3u.0H:HCAc:H₉C:pyridin 1 5 :^c-:' 0 : > 0/; HPLC k' 5,6 p Altex 1.1Ήη.ι?'’'ΡΓί c -,.,.-.^4 = —/, · <· c -1ni Ο'¹'/. Vfda —0, - » fluoroctová kyselina, 0-50% acetonitrii za 20 min, UV detekce při 220 nm/; k' 0,c /5 ρ Altex Ultrasphere ODS, 10% acetonitril/vcds-0,1% kyselina trifluoroctová, UV detekce při vou vídajíc ,kce byly

UČTU ' ' · 'U * octové/vcdě. Cdpc y

Výtěžkem bylo

220 nm/. Analýza aminokyselin: Asp

Htr Q / y fi /> / -7 β V» / £ p ^Λ / £ ν' fr / r Q, / ' yf \ y> t í J C- “t Z 5 Jf . / £ j V v z ) Λ n, / J / · /, Gly /2,06/,

Příklad 16

Příprava N°%c-cyklo-/3,3/-Cys-VeArg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly-NH^

Pryskyřice o navázaným chráněným dekapeptidem 3c c-Cys Ze L>Arg/Tos/-Gly -Asp/Ό -cHex/-3er/3zl/-Arg/Tcs/-01y -Asp/C-eHex/ ^η •-Ί ', ·· >·?.

• - ·-.... 7-,-.

pravena podl^ Příkladu

-.'O >·»Ό’ ái >0 c působením 0 idu c · +

U -!

: ni klk soli TFA pomocí 7'b DIEA v methylenchloridu byl peptid vázaný na pryskyřici acetylován acetanhydridem /0,94 ml/ a FIFA /1,72 ml/ v 30 ml DMF po dobu 40 min.

Peptid byl odštěpen z pryskyřice spolu s odstraněním skupin, chránících postranní řetězce, působením 10 ml bezvodeko kapalného HF v přítomností 1 ml ani sólu při 0^cC po dobu 50 min. Po odstranění HF ve vakuu byla pryskyřice promyta ethyletherem a usušena na vzduchu. Pryskyřice byla pak extrahována 2 x 30 ml 1 ·/ ky sátí nou cctovou/vodou a dále 2 x 30 ml ¹0/ kyselinou cctovou/vodou. Spojené extrakty byly zředěny d°ionizovanou vodou na objem 1,5 1. Hodnota pH vodného rosičku bylo upraveno na 7,6 amoniakem a reakční sm-s byla 7? hod probublávána argonem. Roztok byl ohromatograíován na ODS síliyce-í¹’! ο·ί'·η*Αι.·-^! v.·^J ! a.—· c- / U ·' .... -> i 7.

-----A - < .... _o. ........... VWA.V «.· ., /. í- ------ - , - --TFA-voda. Odpovídající frakce byly spojeny, odpařeny a odňala kyselina octová/vcda. Výtěžek oásteč ·- ř rt. 4 3 ·* rt rt y fj -g vyčištěného oeotidu činil ?/ r/l purifikcván gelovou filtrací na Sephadexu G-í5 v systému hs kyselina octcvá/vods. Odpovídající frakce byly spojeny a lycfi.izcP Λ •r /c- ' ~O · ΓΓ7 TJ · ''· ) A í_-’· --.j J - - 1:1:1:1/, R, n rt rt -C ·<- » h-bnCH :Rí :H_rG:py?ňdin 15:5:1 0:1 0/; HP k* 6,6 /5 ρ Altex Ultrasph v c c. ct * ₇ T R-t ₃ ce „on i trii za 2.0 zňn, UV detekce při 220 nm/, k

6,6 /? ρ Altex Ultrasphere CCS, éň acetonitril voda-0,1/ kyselina trifluoroctové, UV detekce při 220 ran/; analýza aminokyselin: Asp /2,00/, Gly /2,21/, Cys /1,45/, Ser /1 ,70/, Arg /1 /2/.

py. <;,ι .. Λ i 7

Příprava K^Ac-cykle-/3,3/-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Lys-Gly-Glu~· * - · ή íly-lsp, /-Ger.

O53 množství. Po odstranění N-konccvé 3oc skupiny působením 50% TPA v methylenchloridu a neutralizaci vzniklé TPA soli pomocí 1% DIFA v. methylenchloridu byl peptid vázaný na pryskyřici acetylován působením 0,94 mi acetanhydridu a 1,72 ml DÍLA v 30 ml DMF po dobu 40 mino

Peptid byl odštěpen z pryskyřice a chránící skupiny by! y o d s i y z o o s t r 4 c }. ”p? 2 l xi cezvc-dého kanalnéh?

dobu 5θ min. rc odstranění HF ve vakuu byla pryskyřice promyta ethyletherem a usušena ns vzduchu. Pryskyřice byla nej<9 -a Ρ v pi p χ 4 τ* ‘-i V· ρ γ o p. θ O Ρ p 7·. 1 kyselinou ;tcvcu/v;

x 30 ml :Oy kyselinou octovcu/vodou. Spojené extrakty byly zředěny neionizovanou vodou ns 2 1. Hodnota pH vodného roztoku byla upravena na probublávána argonem, ván na ODS silikagelu Cdnovídající frakce byl v Ivo f i 1 i z 0 ván z ¹ kyseliny částečně vyčištěného peptidu. Per .moniakem s reakční směs byla 72 hod Roztok byl lycfilizován a chromatografον systému acetcnitril-0,1 / TFA-voda, _vly spojeny, odpařeny a odparek byl j ..vCvé/kedy. Výtěžek činil 120 mg stí d nvT dále nurifikován íenhadexu. Q-’5 v iU uVi

4.

W,/ v* \7Pr f & ' ^ť u ’ * sV· ipcvídající frakce byly spojeny a :ova:

té čisté sloučenin /T? .· O / r- X / J .i./ )-1/

0 [m+Hp; TLC

Px. 0,38 /n-3uCK .BICAc :Η?0: pyri čin 15:5:10:10/; HPLC k' 9,4

p. Altex Ultrasphere CPS ,1/ kyselina triflouroctová, 5—50% acetonitril za 20 min_?

UV detekce při 220 nm/, k' 5,6 /5 p Altex· Ultrasphere ODS,

3/ aeetcnitri1/vcda-0,1 % kyselina trifluoroctové, UV detekce pn η η p V'tr co) Ί r, · Δ q n /1 ΟΠ / Q! V / 9 1 x / p

/n-3uCH:H0Ac:H_oC:EtCA<

Cy:

• ’ ρ τ / c _c ' 6 o / ) '- J / , -I....

/1

Τ-s /' / — : ' · 5 ^v -· ' 5

Příklad ‘8 ; _{r r} _o ? _y „_s n _3p _r. _p 2 p _;.y

Ό-.·· - o -, _: .-.v

Cl;

- d-1 Příkladu ’ v množství 1 mmolu. N-koncová 3oc skupina na glycinu a t-butylester na postranním řetězci kyseliny glutamové byly odstraněny působením 50% TFA v methylenchloridu. Vzniklá sůl TFA byla neutralizována 7/o DIFA v methylenchloridu a peptid vázaný na pryskyřici byl podroben cyklizaci mezi alfa aminem glycinu a gama karboxyskupinou kyseliny glutamové za použit?' mmolů činidla 30? a 6 mmolů FIFA v DMF. Úplnost cyklizace r-Co r.vSXe.-p U.-jí-níri.-v·'’::, fř^tpsr. ·“ - — ι-.,.-ι

.. v ......... .. - . . v. .. ... v,r ...

ipovídajíc’ lyofilizeván z *% kyseliny cctevé/vody. Výtěžek částečně vyčištěného' nectidu činil 1?7 mg. 1-0 mm cedil tohoto částečně nurifikovaného peptidu byl. dále čištěn HPLC /5 ju Altex Ultrasphere ODS, ',3- acetcnitri l/vod.a-0, Ve kyseliha trifluorcctová, UV detekce oři 220 nm/. Výtěžek čisté požadované sloučeniny

1 n-.r rp /T?V.p/ /o ' O p.i!₊ul⁺· Ρ Λ / ³ ΤΤ.Ο Ρ

L· -i. i i ~ j I i . Γλ-Ο/ iii/ tý o , j c- I .». i- J , - íjv i .p v , ‘r ~-x>

0,23 /n-3u0H:H0Ac:H_o0:Ft0Ac ' : 1 :1: / U r . η„γ.1Λί Ρ !Κ.ς.1Λ·1Α/. ΠΡΤ .-** k ' V <

0,46 /n-3uCH:H0Ac: /F p Altex Ultrasphere , --ρ >03, gradient. A: acetonitril 3:voda-0,1 % kyselina triflu pl Π * - ·.-, -, p v, r 1 -? C C’ f'¹ - . R *R

Q Z¹/ i- Ί ⁴ n v H~! +-noqr\bpnn T*'^. 1 , S,- - . M ----- ... _ Λ - ... V O Λ. V, , ' *» θ’ r> ? c · 0 v* c ' a / . ** v·:'. C \i . I^TV

P . Θ ; < C

T ·'

Příklad 1?

Příprava cyklc/1*,6 ^/-Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-Glu-NH₂

Pryskyřice s chráněným hexapeptidem 3oc-Gly-MeArg/Tos/Gly-Asp/3zl/-Ser/3zl/-Glu/t-3ut/-3HA byla připravena podle Příkladu 1 v množství 1 mmolu. N-koncová 3oc skupina na glycinu a t-butylester na bočním řetězci kyseliny glutamcvé byly odstraněny p°sebemíň 51.1 TFA v methylenchloridu. ’A-no<$ sil TFA byla neutralizována pomocí 7a DIFA v methylenchloridu a peptid vázaný na pryskyřici byl podroben cyklizaci mezi fa aminem gly činu a gama karboxy skupi r.cu

•.eliny glutarové působením 3 mmol! 30P činidla a 6 mmol! DIfA v DMF.

Peptid byl odštěpen ? pryskyřice a chránící skupiny 'byly od staněuy u stranních řet působením 30 ml bezvodého kapalného KF v přítomnosti 3 ml anisclu při CŤC pc dobu 51 min.

pryskyřice prcmyta ethyletherem ejprve extrahována 2 x ou a pak 2x30 ml 1 OA kyselinou odstranění HF ve valruu byla usušena na vzduchu.

v v kyselinou oc+cvou/v

Í-.J vod cvou/vodou . Ssečen“ extraktv bylv lyof i. linovány . VÝcěžck zurc u ctn_

Surový peptid byl purifikeván rychlou chromatografií na CDS silkagelu s obrácenými fázemi v 1,5a acetonitril/voda-0,1 a TFA. Odpovídající frakce tyly spojeny, odpařeny a odparek byl lyofilizován z “a kyseliny octové/vody. Výtěžek byl 356,3 mg částečně přečištěného peptidu. Podíl 66 mg částečně přečištěného peptidu byl dále purifikeván pomocí HPLC /5 μ Alte? Ultrasphere ODS, 23 acetonitrii/vcda-C,1 A kyselina trifluoroctová, UV detekce při 220 nm/. Výtažek požadované čisté sloučeniny činil 3' mg. UF ? FAA/ n/e 6'5 [UrijV ?'n-AuCK: UC Ac : H_OC : H⁺Ac 1 U : 1 : U-Á pyridin ’ = 0:1 i/: HPLC k ' .

J -> -- - -·· ·—^z - -4‘ -5 -> A.

Pz. F,7n /7 -Au OH : Η2Λ c :H₉ 2 : ^{z 7} /5 A Altex Ultraenh^ ~r

A: acetonitrii 3 A? untouitrii n.F 2 zh .Altex Ultraozhere ČPF 71i o oi z v á , U V 1 o t o k o ·n r' ~ ,. ' ’ z . . ... .· , - ..

ρ A~ τ?χ ν.~τ,ra s ::r.·? re .. , , kyselina triflucroctcvá , y, ’ t o z. o e o z ? koni trii/voda-0.

' : : . . krr-ri ar

Příklad 20

Příprava cyklo-/1,8/-Arg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly~Asp-Phe

Obecný postup pro syntézu komodětiekých peptidů na nerozpustném nosiči - metoda FMCC-5ASPIN

Cyklické homcdetické peptidy byly syntetizovány za použit pryskyřice SASPTN /Šachem/ jako pevného nosiče. Ckráněné amins kyseliny⁷ byly přidávány postupně od karbcxykonce až po dosažen požadované sekvence. Alfa aminoskupina byla chráněna pomocí

7-fluorenylmethoxykarbcnylové skupiny /FUGO/. Funkční skupiny postranních řetězci byly chráněny následujícím zplsobem: arginin a N^-rethylargtnin tosylem /Tos/ nebo 4-methcxyl2,3,6-trimethylfenylsulfonylem /mtr/; cenin Penzyl*therem/3zl/ cysens yruta g-O nragová be.nsylem /3zl/ robe t-but· ut--Gu/. FUOO ο·.ιη'·-ο oyla odstraněna působením

	oeridinu	v GUF. Peptid byl prodlužován	Τ', ν» á	ou	, -·· 0 _ Ί	^kvi -
vs	lsnt.1 uu	rokvšaliny chráněné FkOO skun	•ur:.,	'-3 ekt	i vaier.t
i;	At v GkF	a 2-3 ekvivalent! DOC v methy	lench	2 c	—idu.	Průoěh
?”·?	akce byl	ověřován pomocí nir.kydinovékc	L o tg +	u,	. Pckud	oylo
- Ά	·- ba . 1	o muku). Obecný pcrL	αΓ A/	-	oáz 1 - c	ící ·
1 .	Promytí	BUF	5 χ	1	mi n
0 — ·	Promytí	2 0/2 piperidinem v BUF	i X	i	...4 i.i — ..
♦	Sejmutí	chránící skupiny
	201 pipe	ri.dinem v BUF	1 x	7	fcT h *-
/	Promytí 0	'U?	1 0 x	1	•no ί n
5.	Ninhydri	novo7 test
5 -	.FUCO-AA	+ K03t v BUF, ponechat		O	min

v methylenchloridu r C- O

Prcrýt methylenchlo ri' ' - 4 . .-4 4 4- g*· cp 4 krovu , 4- i . Z ru-uu /nun

I O / - .... — + T -· ·- ..

^0 u 6, £ r- l- -.7 γ, Ί „ - ' ‘ ' - -¹· iT c; ¹ . .. ... .j ·. . , _c ......

-r

-1,,V.-, -3

.... ř .· A -..-.1.. -Τ', - r ~ --η skupina chránící N-nonec odstraněna a chráněn;/ peptid byl z pryskyřice odštěpen působením 1-2% TFA v methylenchloridu /3x15 min/. Methylenčhlor!dcvé extrakty s TFA byla spojeny a odpařením byl získán chráněný peptid.

Cyklizace bylo dosaženo tak, že chráněný peptid /0,2 mmol, 0,4 mM roztok v bezvodém DMF/ byl vystaven působení N-methylmcrfolinu /5 ekvivaletů/ a 1,2 ekvivalentů kyseliny 1-propanfosfcncvé po dobu 1 bod při 0^cC. Pak byl přidán další ekvivalent PPA a reakční směs byla míchána 18 hod při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odstraněno a odparek byl rozetřen s vodou, čímž byl získán požadovaný cyklický chráněný peptid. Skupiny chránící funkční skupiny postranních řetězců byly. sejmuty působením bezvodého hF v přítomnosti 1 3% ani sólu při 0°C po dobu 50 min. HF byl odstraněn ve vakuu, surový peptid byl rozpuštěn v 0,2 M kyselině octové, promyt 3 x etherem a lycfiližací byl získán požadovaný surový peptid.

Cyklo-/1,8/-árg-Gly-Asp-Fhe-Arg-Gly-Asp-Phe

Pryskyřice s chráněným cktapeptidem MOC-Αερ/C-t-5u// '••J _.y “,-l< --1.-. , -.0 / η. V- z --j -.J_ — připravena jak popsáno shora v množství 2 mmolů. ?c odstranění H-koncové FMCC skupiny 20.2 piperidinem v DMF byl peptid z pryskyřice odštěpen působením 1k TFA v methylenchloridu. Výtěžkem bylo 2,1 y, -·7η bílé pevné látky Ásp/C~t-3u/-Pne-3u/-Phe-Arg/Mtr/-Gly. Ke 300 mg, ,O.

Arg /M t r / -Gly - A s p ,· ' mmolu chráněného peptidů bylo při 0^vC přidáno 500 ml DMF, 110 yul, 1,0 mmol NMM a potom 152 p.1, 0,24 mmol PPA. Reakční směs byla 1 hod míchána při 0^vC, pak byl přidán další podíl PPA a míchání pokračovalo 18 hod. Rozpouštědlo bylo od strano 'pařez oy.

•en cyul:

···· · ·· ~

-g, /_m v _ z ^ / K.. - J ¹ 00,1 cyklického chráněného peptidů Ásp/C-t-Ju/-Fhe-Arg/Ktr/-Gly -Asp/C-t-3u/-Fhe . Fept.i 5 byl íi. 4

0'C 0 min vestaven nůsobení 20 ml bezvodého HP

-'V ³ t h-nⁿu zruštěn v 60

... 1 . . ../,· . C V

- -. ·. 4-. X X .

X -· ’ *1 /47

O--U. t*

- 63 cyklo-/1,8/-Arg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Ásp-Phe, který byl dále přečištěn gelovou filtrací na Sephadexu G-1 5 v 1/ kyselině octcvé/vodě. Odpovídající frakce byly spojeny a lyofilisovány. Pro další purifikaci byla použita metoda HPLC /5 p Altex Ultrasphere CBS, gradient, A:acet©nitril 3: voda-0,1% kyselina trifluoroctová, '0-40/ acetonitril za 10 min, UV detekce při 220 nm/. MS /FA3/ m/e 95¹ ,2 TLC Ρχ, 0,61 /n-3uOH:HCAc:

Hg0:EtCAc 1:1:1:1/, Ρχ, 0,63 /n-3uCH:HCAc:H_?C·: pyri din '5:5: '0:10/; HPLC k^# 7,73 /5 ρ Altex Ultrasphere CBS, gradient,

A: acetonitril 3: voca-0,1y kyselina trifluoroctová, 0-50/ acetonitril za 20 min, UV detekce při 220 nm/, k* 4,29

20/ s cetcni tril/v o da-0,¹ .1 kyselina ři 220 nm/; analýza aminokyselin:

•Ό 1 / /< 00/ / U.· ♦ v · / « --- / ¹ JI z ♦ /5 p Altex Ultra trifluercetcvá, UV detekce : Asp /2,00/, Gly /2,03/, Phe

-η ρPříprava cyklo-/'1 , /-KeArv ~?U y -Ar~-Gly -Asn-nPryskyřice a chráněným oktapeptidem F-.'CC-Aspy'C-t-bu/Phe-MeArg./Tos/-G2y-Asp,^/C-t-3u/-?he-Arg,^/Htr/-Gly-3A3P.TN byla o prav~;

·,··' ’ není N-koncové FKCC skupiny působením 20/ piperidinu v BMP byl peptid odštěpen z pryskyřice působením 1TFA v methylenchloridu. Výtěžek činil 1,2 on :hráněnéhc lineárního peptidů ve formě bílé pevné látky. K 535 ng, 0,4 mmolu chráněného peptidů v 1 1 BKF bylo přidáno 220 pl, 2,0 mmolu NMK a 304 pl, 0,43 mmolu PPA při 0^vC. Po 1 bod míchání při 0^vC byl přidán další podíl PPA a míchání pokračovalo 13 bod. Potom bylo odstraněno rozpouštědle a odparek byl rozetřen s vodou. Výtěžek činil 550 mg, 95^ cyklického chráněného peptidů cyklo -/I , °.,''-MeArg/Toc/-Gly-A?p/C-t -3u/~rhe-Arg/Ktr/-Gly-Asp /y-t -..;.y -/ne. r v nřítcmnssti ?

Pii. oyl vystaven p

m..

?_u bent d o nu 9 0 m: n· cde tra ve vakuu byl peptid rozpuštěn v 60 ml 0,2 K kyše nctcvA promyt i - - ·· ,< . ..

<<ϊ ... ·.· *·. v

Ůsp-Pbe. 2^1 .tg sarc x-.·-1, „_f,z -..·.

:.!,·· a lyefii i z tvář. Výtěžkem ; . é^r r» ,ί v r- ^Ί · /· ... ?. ·- '* -n ~ ^Λ ~ : byl o pe u?

^4 'v/ -* n · j - - ·

X··

- 64 jící frakce byly spojeny a lyofilizovány. Peptid byl dále puri· fikován pomocí HPLC /5 p. Altex Ultrasphere ODS, 5 pl 10 mm x 25 cm, gradient, A: acetonitril 3: voda-Q,1 % kyselina trifluor· octová, 10-50% acetonitril za 10 min, UV detekce při 220 nm/. Výtěžek činil 26 mg požadované čisté látky. MS /FA3/ m/e

965,4 TLC R_f 0,65 /n-3uOH:HCAc :H₉0:EtOAc 1:1:1:1/,

R_f 0,63 /n-3uOH:HOAc:H,O:pyridin 15:5:1 θ7ΐ 0/; HPLC k' 8,14 /5 p Altex Ultrasphere ODS, gradient, A: acetonitril 3': vcda0,1% kyselina trifluorcciová, 0-50% acetonitril za 20 min,

UV detekce při 220 nm/, k^z 9 /5 p Altex Ultrasphere CD3, 14% acetonitril/voda-0, ¹ ,0 kyselina trifluoroctové, UV detekce při 220 nm/. Analýza aminokyselin: Phe /1,75/, Arg /1,03/.

.esc

77/. Gly

Příklad 02

Příprava cyklo-/1,10/~Frc-Árg-01y-Asp~L-Phe-Pro-Arg~GlyAsp-L-Phe

Pryskyřice s navázaným chráněným dekapeptidem glu ; d / 0 -1 - 3’.: / - L -?h e -Pr o - .4rg /1; t ?- /' k y-nsn/c-u

W -L-Fhm-P

Arg/%ir/-Gly-3A3PTN byla véna oodle Příkladu množství 1 mmolu. Po odstranění U-koncové FMCC skupiny působením 20% piperidinu v DMF byl peptid z pryskyřice odštěpen pomocí 1,5% TFA v methylenchloridu. Výtěžkem bylo g/Mvrz ^{1 ΛΛ}· bílé oevné látku Asr/C-t-3u/-D-Phe-?rc»-Ar~ kv-i··»·’/Gly-Asp/O-t-3u/-D-Phe-Pro-Arg/Mtr/-Gly. 5 09 mg, 0,3 mm olu chráněného peptidu v 750 m.l DMF bylo smícháno s 165 /ul,

1,5 mmol NMM a 223 /.:1, 0,36 mmol PPA při 0^cC. Reakční směs l

byla míchána 1 hod při a sm*s byla míchána dalších 18 hod. Rozpouštědlo bylo odstrapak pyl přidán další podíl PPA carem ikon bul k 1 i e k é h o c h r á n ® n é h o

-! ,-1..

• klo-/1 ,1 0/-Pro-Arg/Mtr/-.G^j·

Asp/C-t -3u/-D-Phe -Pro -Arg/lčtr/ oeotbdu tylo oři dáno 3 9 :

..v-y,

IU v

- G1 v - A s p / C -1 - 3u / - L - ?k e . K niku PF a 3 ml anisolu a , . X Λ X ,

-y

vsnuu oy_ :

prsmyt I⁷ x surového produktu cyklo-/!,10/-Pro-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Pro-ArgGly -Asp-D-Phe . 1 26 mg surového peptidu bylo purifikováno gelovou filtrací na Sephadexu G—15 v 1% kyselině octové/vodě. Odpovídající frakce byly spojeny a lyofilizcvány. Podíl 58 mg částečně purifíkovaného peptidu byl přečištěn pomocí HPLC /5 p Altex Ultrasphere ODS, 26% acetonítril/voda-0,1 % kyselina trifluoroctové, UV detekce při 220 mn/. Výtěžek požadované čisté sloučeniny činil 24 mg. MS /Fká/ m/e 1145,5 [j'UH]⁺; TL^ ,9? /n-muca:.-u-ae .1.1.1/ p Z -Q _/r- _ -,-. -J.fc · t_P

U . rvtr-M fH r 1 c . c; . 1 9 < 1 9 / · Ρ *ⁱ 9 ^{k x} * 'A·.··· ~ j

Altex Ultrasphere o~ gradient, A: acetonitril 3: voda-0,1% kyselina trifluorccfc. κ 9 · - .-· λ 4* > »“· t 4“ >-* ·’ Ί ,-, o 1 Γ¹ ·τ· 4 -r_:. T ’ ’ * <3 z* 4· * V r* & r> *’ 7’ 7' 9 * .. y .V. ·-* k-z - ± -- fc· J. -fc — Z-O* h.· iii -i - * j -z· v '·— ·- fc' -k bz L. u.· ;. Λ. fc. fc- fc/ i / <

* 0 o / ρ gg t θχ Ul tra sche^e CD3, 25 % n oe t oni t^i 1 /'voda — 3, 1 /kyselina trifluoroctová, UV č aminokyselin: Asp /2,00/, Gly n4

M' 99.

/9 UCJ / r>Y»_Cl /'9 7'/ /9 9/ / fc- , w <0 / J _ V , C. « : : / y - - ♦ h- / fc. J fc,· (L / * ~Glp-Pro-Arg/Vtr/-Gly-3ASRTN byla připravena říkladu 20 v množství 1 mmolu. Po odstranění N-konec«τ'Ζ·^ pn my ηΛ 3 Q 3 p /j? 9 Q9' y 4 y’ ý- 4 p*j 7^Ty ]? r/y 7_ pgi m4· 4 *4 n z pryskyřice pomocí 2/u TFA v mothylerohloriou. m bylo 1,2 g, 100% bílé pevné látky Asp/C-t-3u/-D-Pro-Arg/Mtr-Gly. K 703 mg, 0,8 mmolu chráněného pep 9 Ί 7',’7 qvTc př-i ~ í ;oile P

Pro-Gly + 4 411 / u _n-.ν. j > U..U.

r.

/V' <i

V' , č / -> O ’O duo /1.0, 4,0 mmolu NMM a 608 fc·' v ·

Reakční směs byla míchána 1 hod vři uk oyl přidán další podíl PPA a směs byla míchána dal

V 45 7? g . -r ''ir:'! ζ 4~ U' S¹ 1 n 4.., r~ ZS ,4 r. -L _v, r·. r »·' z-, -> ? 4- ,

u. výtěžkem uyic 286 ng,

.. zw 4.....

λ ...η r.ů«’.-n^,cbn LJU

- n r·

.... .. .... 4· 4 Λ r- Ί •ť... .. ,íi a η

.. .. v ··. iii L

.,.-,-1 A 4 ván gelovou filtrací na Sephadexu G-15, 1% kyselina octová/voda Odpovídající frakce byly spojeny a lyofiližovány. Výtěžek čisté požadované sloučeniny byl 14⁷ mg. VS /FA3/ z/e 530,3 [v+Hp TLC R_f 0,44 /n-3u0H:H0Ac:H₂0:St0Ac 1:1:1:1/, R_f 0,45 /n-3uCH: HOÁcuH^O:pyridin 15:5:10:10/; HPLC k' 6,8? /5 p Altex Ultrasphere CPS, gradient, A: acetonitrii 3: voda-0,1% kyselina trifluoroctová, 0-50X acetonitril za 20 mir

UV detekce při a · p π·ΐ 1 ( _λ ;vs

Analýza aminokyselin: Asp /1,00/, Gly /2,00/, Pro /2,00/, /

Příklad 'rav?

'•v - - <· -^;· ^ν·- „ .

/0 -t -/u/~L~?ro -p-ro -Γ-lv-Ar~/ktr/-42 v-S V bv’’ a

FMOC skupiny působením 20/

HK ch-á, ’ umelu, u. peri dinu v . _p i ν-. ,-Ι ; o -l''-v*' ⁷ -3 O· Ή Ί^- ή ,-η λ v žx 0> -·· ?Γ3. v 3 na.

N-koncové h- r-‘ ur;

. , - ·.. .j . v.y . .

/ n C Ί & r 4 látky. K 320 mg, 0.37 umelu chráněného peptidu v 1 1 EMF bylo přidáno 220 pl, 2,0 umelu NMu a 304 ^1, 0,48 mmolu PPA. byla míchána 1 kcd př

PPA a směs byla míchána 18 hod něno a zbytek byl rozetřen s vodou. Výtěžek činil 97 mg, 31/ r'.Uri í i'¹/ kb o x—. A i- λ n.o --η ή e i j pvz' - -/i r _m v — A τί? /*·’+ —n

Asp/C-t-3u/-D-Pro. 168 mg chráněného peptidu bylo smícháno s 2 o ~ ____________ _ _ ___ __________________ _____________ ·' ~U -o <3

Reakční

-/ Ί 3? ‘7*· *,

Λ v f*

-''', o ΙΛ h» v

AA 4 /9 73 3 fo Π -Ρ n

V-vn *1 -··» f~ A r· 4 -v·, <

b/i te_i. 4 /•s * * y»n >* r»p *- p-r u ... i v. .

₇ :z D3 vény ennnn?. cicn nin, rczpzčt/k. v 60 ml 0,0 V myseliny octové, promyt 3 x -theru a lyofilizován; bylo získáno 156 mg cyklo-/1,6 -G Vsn-rj-pr*r'_e rC^'3 ; v ~ fUp^O V ék‘^ phpvt^ nnnifíkcvnn --levou nlkuu r. - 3' ~ < _; u ·ο/Λ ·.

. . 4 , — .

r. '·· · 9 /-// -IC :\3 ,

- 67 5MA*to ,42 /n-3uCH:H0Ac:H₂0:pyridin 15:5:10:10/; HPLC k /5 p Altex Ultrasphere ODS, gradient, A: acetonitril 3: voda-0,13 kyselina trifluoroctová, 0-503 acetonitril za 20 min, UV detekce při 220 nm/; analýza aminokyselin : Asp /1,06 Gly /2,00/, Pro /1,31/, Arg /1,29/.

' 0 ' !	,44
3: za	20
Asp	/ i

Příklad 25

Příprava cyklo-/·: ,C/-01y-Arg-Oly-Asp-3er-?ro .j s navázaným chráněným hexapeptidem. F?700-Asp

Prysky /? -t-3u/-3er/3zl/-?ro-Gly -Arg/V+r/-G_j na podle Příkladu 20 v množství 1 mmolu. Po odstranění N-koncové PMOC skupiny působením 203 píperidinu v DMF byl peptid z pryskyřice odštěpen pcmccí 13 TPA v methylenchloridu.

•-SA3PIN byla nřinraveVýtažkem byle

Λ;

•63 mg,

Hiráněného Unárního peptidu ve pevr.é látky. H 703 mg, 0,3 mmol chráněného peptidu v C J. XOH bylo· přidáno -30 p.l, -1,0 mmol a 6 03 /ul , 0, ^Ί5 mm

PPA při 0“C. Reakční směs zyla mí chána 1 hod při Ο'Ό, pak syl přidán další díl PPA a směs oyla míchána 18 hod. Rozpouštědlo byla odstraněno a zbytek by?- rozetřen s vodou. Výtěžkem, oyla 128 mg, 383 cyml'ckého chráněného peptidu. Ke 300 mg peptidu bylo přidáno 2 0 ml bezvodého HF a 2 ml ani sólu a směs byla ponechána 5θ min při 0°C. Po odstranění HP ve vakuu byl peptdd, zbavený chránících skupin, rozpuštěn v 60 ml. 0,2 M kyseliny octové, promyt 2 x 20 ml etheru a lyofilizaván. Výtěžkem bylo 256 mg surového cyklc-/1,6/-Pro-Gly-Arg-Gly-Asp-DPro. Podíl 172 mg surového peptidu byl purifikován gelevou filtrací na Sephadexu G-15, 1 kyselina octová/voda. Odpovídající frakce byly spojeny a lycfilizcvány. 50 mg částečně vyčištěného neptldu byle dále ourifikeváno HPLC /5 p Altex 31 ·;:·&.··p-here OLG, 4,.1 acetoni trii/voda-C, 1 ,;· kyselina trifluerlátky činil 33 mg. 33 /n-3uOH:HOAo:H^O:PtOAc /ΡΛ3/ m/e )

- U ' 7 / V'.

? o ' <· - > *

A ’· J

cžadovsné	či sté
h]+; tlc	Pf 0,42
/n -3uCH	84 c : ;T„Q
ex Ultra?	i i ·'
g . V\r c:. p’’ 4 w -77 - ‘------ ·	4- Vl4 -‘'‘'i

mh-mauk /0,94/, Gly /2,00/, Pro /1,03/, Arg /1,03/, Ser /0,9/.

Příklad 26

Příprava cyklo-/1 ,6/-Prc·-Arg-Gly-Asp-Gly-E-Pro

Chráněný hexanentid navázaná ru

-Asp , 0-t-3u/-Gly-F~?rc-Prc-Arg/Tos/-Gly-SASRln byl připraven rc^le Příkladu 20 v množství 1 mmolu. Po odstranění N-kencevé FMOC skupiny působením 20/ pipeřidinu v F?6F byl peptid z pryskyřice odštěpen pomocí 21 TFA v methylenchloridu. Výtěžek chráněného lineárního peptidu byl 663 mg, 32,u bílé pevné látky.

K 646 mg, 0,8 mmol chráněného peptidu v 1,4 1 F/F bylo přidáno 44 0 pl, 4,0

A —,_r _u VMM a 6 0 i ^1, 0,96 mmcl PPA nr

Ά-; λ O.-i

Reakcnt srn cyi jmíchána 1 hrd při 0'G, pak byl přidán další podíl F?A a ?m?3 byla míchána '3 hod. Rozpouštědle· .bylo odstraněno a zbytek byl rozetřen s vodou. Výtěžkem byle 40Cmg, ? i/v £VÍ-i~* Cxl-íriC ol·. r. ~ p -7to neptrdu zylAt:,-/',6/-?vc-Arg/lcs/·

Oly-Asp/O-t -Fu/-Gly-F-Prc . h 4 *n /> 4 u ó -»n <s y 6l rp 7 q p ] - ITT? 7 na 50 min při 0^c0. Po vený chránících skupin, rez vé, promyt 3 x 2 0· ml etheru

Λ -_Γ ^Ί,~ - θ γ, f< γ: Q -Κ ,ρ ρ 4 ml ani selu a směs bvl

-4- - 4 >

oy... r mnechá stranění HF ve vakuu oyl peptid, zbaén v 60 ml 0,2 H kyseliny ccicr lyofilizcván. Produktem byl surový cyklo-/i , 6/-Prc-Arg-Gly-Asp-Gly-F-Pro. Podíl 75 mg surového· peptidu byl purifikován pomocí HPLC /7 p Altex Ultraspheře OFS, 7/ gcetonitril/vcc.a-0,1 Z kyselina trifluoroctcvá, UV detekce při 220 nm/. Výtěžkem bylo 35 mg požadované čisté sloučeniny. MS /FA3/ m/e 530,5 ^+hJ⁺; TLG R^. 0,35 /n-3uCH: KGAc:H₉0:FtCAc 1:1/.:1/, P^ 0,6 /n-3uOH:HCAc:H?C:pyridin 15:5:10:10/: HPLC k' 6,7 /5 p Altex Ultrasphere CFG. gradient, A : acetonitril 3: vcda-O/u kyselina tri fluor oct o r á , --50,4 acetonitril za 0C min. UV detekce při 2 Ultrasphere CFG, nm/, k /,o /y p •^tonitri 1/voda-0,1 / kyselina triíUuorr-o rA-i rn/: analýza asm noky

Příklad 27

Příprava cyklo-/],6/-Pro-Arg-Gly-Asp-Gly-D-Phe

Chráněný hexapeptid navázaný na pryskyřici FMOC-Asp/O-t3u/-Gly-D-Phe-Pro-Arg/Mtr/-Gly-3Á3RTN byl připraven podle Příkladu 20 v množství 1 nmolu. Pc odstranění N-kcneové FMCC skupiny pomocí 20/ piperidinu v DMF byl peptid z pryskyřice odštěnen násobením 2,0 TFA v methylenchloridu. Výtěžek bílé pevné látky Asp/0-t-3u/-Gl,y-D-Phe-Pro-Arg/Tes/-Gly činil 936 mg, 100/. K 733 mg, 0,8 mmolů chráněného peptidu v 1 //O g n.‘ . ^;r 3

PDA. Reakční směs byla míchána 1 hod další nodíl PPA a směs ··· c f v· ...

> rn η Τ'

-· .v.-n. !2> v*

OS /τ·_Γ. ,. /_ Π řUHl F c ~·

- V-7-. /, ' _ onu se^u 3 o ve vaku¹.; b.vl nromvt 3 x 20 ml etheru s lycfiliocván. Výtěžek surověno peptidu byl purifikován polovou filtrací na Sephadexu G-15 v 1/ kyselin? octové/vcdě. Odpovídájící frakce byly spojeny a lyofiiizovány. Výtěžek Částečně vyčištěného peptidu byl 178 ra 6⁷ mg tohoto neptiou bylo purifiková:

nemocí HPLC μ Alt*

U1 .trasuhere u'u3, ; 5/ aceto >ni tri 1/voda-C.11 kyselina nriuorcetcvá, UV detekce při 220 nm/. Výtěžek byl 53 mg požadované čisté sloučeniny. M5 /FA3/ m/e UT η n ř Ί /U -UitOtj . * .·». u ρ.. τ<·» ο» « 1 . 1 . 1 .1 / u x „2 -pnu sun n FZ /r-PnpVJ · / i i _ZTT-| 4 :jo ; .·, . v . Τ7,ί·«7 / v. * ς .ς . 1 ·, 1 λ / . /- ¢- r- V & η /ς ,- n *a_v i i i 77.7 ~1- _o >-.o

-•7----^---o · nu - ---- ι , ..χ~- κ / η μ v _ v. ao^-ue , s : 3c: x: voc2 zelová, ’ - 50/ acetcnitril oa 20 nm/, ?/ 5, '8 /5 μ Altex Ultrasphere -mu voda-0,1/ kyselina tri fluoroctová, UV detekce oři 220 na/.

ý. <·.· - · λ -r 4 -r~. r· b

......) » -'-rv detekce sř „p -g ] g r> r«.

^: 7 ~ ,x ilz·' ' V”' - <7 !- 7 4,-,. C -7 , ’ -7 7/ /7 7 .,_r 5 3

-- ......--- · - · . /)--! / 1

Příklad 28

Příprava cyklo-/! , 5/-D-Ala-Arg-Gly-A,'sp-Ser

Chráněný hsxapeptid navázaný na pryskyřici FMCC-Asp/3zl/Ser/3zl/-D-Ala-Arg/Tos/-Gly-3ASRIN byl připraven podle Příkladu 20 v množství 1 mmolu. Po odstranění N-koncové FMCC skupiny pomocí 20/ pipéridinu v DMF byl peptid z pryskyřice odštěpen působením bi TFA v methylenchloridu. Výtěžkem bylo 400 mg,

64% bílo pevné látky Asp/3zl/-3er/3zl/-D-Ala-Árg/Tes/-Gly.

K 168 mg, 0.2 mmolu chráněného peptidů v 0,5 1 DMF bylo přidáno a 152 pl_} 0,24 mmol PPA při 0°C. Reakční hod při 0'C, pak byl přidán další podíl.

hcd. Rozpouštědlo bylo odstraněno

p.2, 1,0 mmol NMM směs byla míchána ¹ a směs byla mekána 1 a zbytek byl rozetřen s vodou. Výtěžkem bylo 164 mg, 67/ cyklického chráněného peptidů cyklo-/: ,//-D-Alst-Arg/Tcs/· Asp/3zl/-3er/Del/. K chráněnému peptidů bylo přidáno 1 0 ·: bezvodého HF a 1 ml anisclu a reakční směs byla ponechán; min p*i 0 C. Fo odstranění HF ve vakuu byl peptid, zbaven;! in rozpuštěn v 20 ml 0,2 etheru.. 3ylc získáno 73 mg surového chránících sku m-emyt 2

- v‘ ......X -· ·· c oduktu purifikovén HPLC /5 p Áltex Ultrasphere CD3, 1,5% acetonitril/ voda-0,1% kyselina trifluoroctové, UV detekce při 220 nm.

Vvtěžek požadované čisté sloučeniny byl 28 ^/O‘

U! < · i,^- · / X' .1 ..

m/e

487,1 [_' ^L’’3 4 TLC Hz. 0,0 /n-3uCH:HCAc:H₂0:FtCAc 1:1:1:1/, ,43 /n-3uCH:HCAc:HpC:pyridin 15:5:10:0/; HPLC k' 0,6

R, p, Altex Ultrasphere 033, gradient, A: acetonitril 3: voda0,1/ kyselina trifluoroctové, 3-50/ acetonitril za 20 min, /c / >

UV detekce při

z. z. v nni / , ň.

,4 /5 ρ Áltex Ultrasphere 'V

1,5/ acozonitril/voda - 0,1/ kyselina trifluoroctové, UV detekce pni 2 nm, analýza aninokyselin:

.-1..

-J / > -) ~ / ' ·· > Z! , :_a

Příklad 29

Příprava cyklo-/1,5/-Ala-Arg-Gly-Asp-L-Ser

Chráněný hexapeptid vázaný na pryskyřici FMCC-Asp/O-t3u/-L-3er/3zl/-Ala-Arg/mtr/-Gly-SA3RIN byl připraven podle Příkladu 20 v množství 1 mmolu. Po odstranění N-kcnccvé FMCC skupiny pomocí 203 piperidinu v IMF byl peptid odštěpen z pryskyřice působením 23 TFA v methylenchloridu. Výtěžkem bylo 860 mg, 1003 bílé pevné látky Asp/0-t-3u/-l-3?r/3zl/-Ala.7 τ-> .cl* r*. r

Ar ‘íc >

;h:

o;

pl

IMF bylo přidáno 220 pl, 2,Cmnoly ΊΜΜ a 304 FFA při O''C. Reakční směs byla míchána ‘ hod při vC, pak byl přidán další podíl PPA a směs byla míchána dalších 13 hod. Rozpon š tědl o byle odstrar.-nc a zbytek byl rozedřen s vedou. Výtěžek cyklického chráněného peptidu cykle-/* ,5/Al3-Árg/mtr/-Gly-Asp/C-t -3u/-l-3er/3zl/ činil F ng. OH.

K cfiránonému peptidu cylo přidáno 20 ml bezvodého HF a 2 ml ani sólu a směs bvla ponechána 5b min při C~C. Po odstranění HF ve vakuu byl peptid, zbavený chránících skupin, rozpučíš:

%«,V' sromvt 1 x tlenu a filizován. Výtěžek surového eyklc-/1.5/~lla-Arg~Gly-AspF-3er činil 208 mg. 70 mg surového peptidu byle purifikováno gelovou filtrací na Sephadexu G-15 v 13 kyselině octové/ veděr Cdpovídající frakce byly spojeny a lyofi lizovány. Výtě: kem bylo 71 mg požadované čisté sloučeniny. 33 /FA3Z m/e 487,2 [m+hJ⁺; TLC .% 0,49 /n-3uCH:HCAc:H_?C:FtCAc 1:1:1 :>/,

R^. 0,38 /n-3uCH:FCAČ:H₂G: pyri din 1 5 :5 1 0:1 0/; HPLC k' 5,5 /5^ Altex Ultrasphere CIS, gradient, A: acetonitril 3: v.oda-0,1>o kyselina trifluoroctové, 0 - 50žj acetonitril za 20 min, UV detekce při 220 nm/, '

7,6 /5 ρ Altex Ultrasphere 113, 1 , 53 ucetoríiril/voda-0,1/„· kyselina trifluerocícvá, UV detekce při 220 nm/. Analýza aminokyselin: Asp /0.98/,

Gly /1 ,

/.Λ /

/. Ala /·, 16/.

Příklad 30

Příprava cyklo-/’ ,3/-N°^í-[2^_(2-(2-amido-fenyl)ethyl)-benzoyl]MeArg-Gly-Asp-amidu a/' hydrochlorid kyseliny 2-jj? -( 2-aminof eny lmethyl] benzoové

Suspenze 5,6,11, 12-tetrahydrcdibenzCb,fjazccin-o-onu /8,5 g, 32 mmolu/ v 5-2 ml 6 N HCl byl a zahřívána pod zpětným chladičem 16 hod. Reakční směs byla za horka zfiltrována, aby še odstranil r.ezreagcvaný výchozí materiál , pak byla směs ochlazena a znovu zfiltrována. Výtěžkem bylo ‘0,5 g,

88/ hvdrcchloridu kyseliny 2-^2-(z-aminofenyl) ethylj benzoové.

b/ kyselina 2-(2-^2- (fenylnethcxykarbcnylamino)fenyl)ethylj benzoová

Suspenze hydrochloridu kyseliny 2-£2-(2-aminofenyjethyljbenzoové /33° mg, 1 mmol/^z ve 2 rol 1 N roztoku hydroxidu sodného ve vodě byla za inzivníhc míchání doplněna '70 mg, · mmolem benzylchloroformátu a 1 ml ’N roztoku hydroxidu sodného ve ·> · <·. —1 X 7 —. .- \ ,·\ -/ —’ »* X. —, 1· · - Í—. —· -á --,1 «·' v-i <-» * .7 1— - ,-9 — - - z-, ra _r.. ra. ·. ' ~ ra ra i » · κ · :.x. >, V ;.raÁra, ΐχ-c-— kj~ ... iv kyselinou chlorovodíkovou a zfiltrována. Pevný produkt byl promyt vodou a hexanem, rozpuštěn v methylenchloridu, organická fáze byla pak promyta vodou, usušena se síranem hořečnatým, pevná látka 53% 2- 2- 2 ky s e% i ny.

zfiltrován a concentrovár. ve vakuu. Výsledná byla rozetřena s etherem. Výtěžkem bylo 0,2 g, fenylmethcxy-ksrbcnylami.no -fenyl ethyl benzoové t -butyl -2-[_2- (2 - (fenylmethcxykarbcnylamino)fenyl) ethyljK roz fenyl)-’tip cfh O’7 '’u L / - - 1 ' - : ' -----1 v byl p:.. Čilo, 7zí' toku kyseliny 2- [2-[2- (fenylmetkcxykarbenylam; no) ijoenzoové /5,2 <'· 3,014 mol/ ve 120 ml methylenγ ] 7; ⁴ A A ^ri * °· C 371 A‘7 n / 1 3 3.] y *7 k\-' 3 2 1 n^cs 3 τ V ‘3 n ^3 b’ - 3' ' ^T A 7 '/ 7 ' — * ⁰ 7 ^Ί 7; A 3 ^Γ; tí · 3 C γ ry ; * i k nři'~ávár no dobu n^ncYka dní, dokud reakce nesl.

X »- ..... /·:; '...“Ira. · - -v. ; rray-ra £ . γ p· ’g Γ r '7 ⁴ g,3T Ά . A A 3 A V 7 sodného a pak vodou. Organická fáze byla vysušena síranem hořečnatým a koncentrována ve vakuu. Výsledný olej byl purifikován chromatografií na silikagelu v systému hexan: ethylacetát 95: 5. Výtěžkem bylo 1,8 g, 31% t-butyl-2-[2-(2-(fenylme thoxy karbony lamino ) fenyl) -ethyl]' -benz o á tu.

d/ t-butyl-2-[2-(2-amincfer.yl)ethylJbenzeát

-[a-fíe^-lMthoxykarionylamino^fer.ylethyijbenzoátu v 140 ml ethanolu bylo pří-Λ v.V + mo

Tf-σ

-, Z Λ >ána s vodíkem dokud ;^nce nesuc mtrovana a koncentrovaná chromatografií na Θ *t h P 1 · V V ΐ 'L Ž X ~ ± 1« - 7 Ί Π ρ X- -i ·· v. .J - C- _· e vakuu. Zbytek byl purifíkován v systému petrolether: ethyl7, _ X +..-I , .· : „~v.. „j

-f r~_e o^cr

1-2-L-(2-aMnof_enyI)_e/ ‘-i>u-.yi-2-L2-(2-Ví*-n:cc-A_Sp/c-s₂i/-_iainc)í-«-n₅-i)_fitkyiJ.

bcn^c aí

V «7 '4 rt rt •xv. 1 TUV' rt 'rt -y 1 rt r-..'· r.-^- ⁷ ~ v '-v Ί rt n M - A - rt .v ..... -------- .. -- — —' -'j — pm .. m;.....3 £ íj¹ * Ρ -ύ,τ~;~ι! -i o·ý-y 1 nVrt <> >·*<·>.r* Π, ό Τ'ί ·; r>.-rt . P rt p V p 'rt -f ρκ· rt, q ΉτΊ '.'-i r, 4 V -4 -.--,-,-:4- -r_r. ’,-s / -,- rtOZ '•'.-“I vg-rig <3 £ 4· rt Ir rt OC

w.ut o Uz a* .. bl.v u L· .i: J_ w . i-·-·-. '·> » *- ‘Λ; ··* i' - -·'-*·*··< - ·'- .----- — «,? naci tA':.7;-t-(2--,-.l-cf_?ryletí-vyjb,_;-_iCÁ.,, - _? σ-τ-τ-, . o 3-” rv ~ k- rt tn o ’· P k n rt

-j ) ·, V- Z V 1*1

Z'-O n L,Ir , ;m kno.. x, b_ητ o kj^y .4. c

Po skončení reakce, jejíž průběh byl sledován pomocí TLC, byla reakční směs zahuštěna do sucha. Odparek byl. rozpuštěn v ethylacetátu /40 ml/ a postupně prornýván 3 x 15 ml vody, x 15 ml 10/ vodného roztoku Na^CC^, 3 x 15 ml vody rt * rt ’' ^v .A J rt ’’ : t.ok'- -··^Ί 9 _trc._vg_TA

C-rganicKý roztek byl vysušen i 4- X v< 4v. _{Λ Λ} ._r ·... ,. rt _r, rt n rt ... , ,/ OjiG -· .i.;

-k* / _t -3,:71.-2-.‘.„--g -rtíg

Po odstranění rozpouštědla ve vakuu byla získána bílá pevná látka t-butyl-|22-(.2-Asp/0-3zl/-aininofenylethyl)Jbenzoát jako bílá pevná látka. K roztoku odparku v bezvodém DMF /8 ml/ bylo přidáno 135 mg, 0,88 mmol H03t, 262 mg, 0,88 mmol FMOC-Gly a 153 pl, 0,88 mmol DIEA, pak bylo přidáno 170 mg, 0,88 mmol EDC a směs byla míchána přes noc. Reakční směs byla zahuštěna a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu. Ethylacetátový extrakt byl postupně promyt 3 x 15 ml vody, 2x15 ml 10/ vodného roztoku RaHCO^, 3x15 ml vody a 1 x 15 ml nasyceného roztoku soli. Organický roztok byl vysušen bezvodým xa_oS0,, 2 4 zfiltrován a koncentrován

Výtěžek požadované sloučeniny, r e k r y s t a 1 c· v a n é FMOC se z iP-FKOC-Gly etheru-hexanu činil 1 30 mg. Skupina řejmě ztratila během zpracování.

zj t-butyl-2-^2-(2-(3oc-MeÁrg/Ίos/-Gly-Asp/0-3zl/-amino)í eny 1) ethy 1) benzoát

K studené j. o ztoku MO mg, 0,25 mmol sloučeniny z Příkladu 30 f a 133 mg, 0,3 mmol 3oc-MeArg/Tos/ ve 2 ml DMF bylo přidáno 87 /ul, 0,5 mmol DIEA a 50 mg, 0,3 mmol HO'3t.

Reakční směs bvla za studená ma nexolix minut oa bylo po částech přidáno 50 mg, 0,3 mmol EDC. Reakční směs byl míchána 18 hod při teplotě místnosti a potom zahuštěna. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu a roztok byl postupně pro15 rl vody, 2- x 15 ml 10/ vodným roztokem NaHCOryt. 3 '3’ x 15 ml vody a 1 x 15 ml nasyceného roztoku soli. Organ: roztok byl vysušen bezvodým Na23O^, zfiltrován a zahuštěn, Výtěžek požadované sloučeniny byl 120 mg.

h/ 2-[2-(2-(heArg/Tos/-Gly-Asp/0-3zl/-amino)fenylethyljbenzoová kyselina po ri:

op?

Sloučenina z Příkladu. 30 g 2 hod vystavena působení 5OM u. Rozpouštědlo bylo odstraní kován-'-' edp ;řen ze zbytku, aoy byla při teplotě místnosti roztoku 1FA v methvlenchlono a methylenchlorid byl bvlv odstraněny stcoy IRA.

nt.o u DC byla xana dc .novu na sl enma.

i/ cyklo-/1 ,3/-N%t.2-(2-(2 -amido-fenyl) ethyl)benzoylJiéeArgGly -Asp-amid

K chráněnému lineárnímu peptidu z Příkladu 30 h byle přidáno 5 ekvivalentů NME a 1 ,2 ekvivalentu PPA při 0°C. Reakční směs byla míchána 1 hod při 0°C, pak byl přidán další podíl PPA a směs byla míchána dalších 18 hod. Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek byl rozetřen s vodou. Tak byl získán cyklický chráněný peptid cyklo/1 ,3/-3^-^2-(2- rridcfenylethyl)benzoylj-AeArg/Tos/-Gly-Asp/0-3zl/ amid. Cyklický peptid byl 50 min vystaven působení bezvodého. HP v přítomnosti anisolu při 0°C. Po odstraň:rí HF ve víku:; byl peptid, zbaven- chráníc ich skupin, rez aut “n v kyselině octové, promyt etherem a lyofilizován; takto ryla získána požadovaná sloučenina.

Příklad 31

Příprava (2··.', 33)-3-fenylcy:

.a/ (43) -3 - (( G ^ř3,5 *R) -5 nyl) -4-(fenylmethyl)-2-oxazolidincn(1 )

Při -78°C bylo k suspenzi 7,2 g, 17,6.mmol čerstvě připraveného triflátu cínatého, předem promytého třikrát bezvodým ethere.m pod argonem, a N-ethylpiperidinu v bezvodém TH? /5 0 ml přidáno 4,4 y, 15,8 mmol 3- isothiokyanoacetyl -2-oxazolidinon v 2 v ii. 1 _L í ± í* · Světle žlutý roztok byl .míchán 2 hod při -78°C, pak byl na 5 min ohřát aa -40°C, znovu ochlazen na

-78°C a pak bylo přidáno 2,02 y, 19,1 mmol benzaldehydu in c substanci». Reakční směs byla míchána 2,p hod při -73 C a pak byl:

iáno 40 il vodného fosfátového pufru c· pH 7. 3u:

naze lelite. Filtrát by orán 200 rl 1 N vodného roztok!.^- hydroyensíraru sodného a 3 x extrahován ClyCb^· Spojené organické fáze b'-^rly vysušeny nad bezvodý::; síranem sodnám a zahuštěny, těkavé látky byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v 200 ml vodného roztoku hydro c

5by~ek byl z hoven ehlcr

Z LOVocovcu

- 76 chromatografií na silikagelu v methylenchloridu. Výtěžek požadované sloučeniny 1 byl 5,3 g, 37b. NMR /CDCl^/. S 2,930 /dd, J = 13,6, 8,5 Hz, 1 H, CHHPh/, 3,236 /dd, J = 13,6, 3,5 Hz, 1H, CHHPh/, 4,350-4,382 /?_, 2 Η, H-5/, 4,729-4,823 /m,

Η, H-4/, 4,936 /dd, J = 5,2, 1,9 Hz, 1 H, C 3 NHCH/,

6,467 /d, J = 5,2 Hz, 1 H, C 3 CCH/, 7,2 06-7,449 /m, 10 H/.

b/ methy 1/43,5P/-5 - °nyl-2-thio’^rQ.oxazolidin-4-karbox.ylát /2/

K rezteku 6,96 g, 13,2 mm®lu aldolevého produktu 1 ve 42 ml bezvedéh® methanelu a 42 ml C1₂CH₂ byla při 0⁹C p»mocí kanyly přidána suspenze, vytvořená přidáním 6,7 ml, 20,02 mmolu, 1,1 ekvivalentu 3M bromidu methylheřečnatéhe v diethyletheru k 25 ml bezvodého methanelu. Reakční směs byla míchána 3 min a pak byl® přidán® 50 ml 1 N hydregensíranu sodného ve vodě. Těkavé látky byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v 200 ml vodného rozteku hydregensíranu sodného a 3. x extrahován C1₂CH₂. Spojené organické fáze byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny. Zbytek byl purifikeván rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu v methylenchloridu: etheru methanolu 5:5:1·„Výtěžek požadované sloučeniny činil 4,18 g, 96b. ¹H UIvlR /CDCiy. δ 3,875 /s, 3H/, 4,534 /d, J =

6,1 Hz, 1 Η, H-4/, 5,967 /d, J = 6,1 Hz, 1 Η, H-5/, 7,414 /s, 5 H/; ¹³C NMR /CDCl-j/. £ 53,4, 64,6, 35,6, 1 25,6, 129,1,

129,5, 136,7, 163,5, 133,3.

c/ methyl/43, 5R?3-/tert -but.yloxy karbony l) -5 -fenyl-2-oxazoličin-4-karboxylát /3/

K roztoku 4,18 g, 17,6 mmolu thiooxazolidinu 2 v 80 ml Cl₂CrI₂ bylo za stálého míchání při teplotě místnosti přidáno 4,25 g, 19.36 mmol t-butyl-pyrokarbonátu a 110 mg, 0,05 ekviv.· dimethylaminopyridinu rozpuštěných v 8 ml C1₂CH₂. Reakční směs byla míchána 30 min, pak byla ochlazena na 0°C a bylo přidáno 44 ml 30b vodný H₂O₂ a 44 ml 38b kyseliny mravenčí. Výsledná dvoufázová směs byla míchána 30 min a potom nalita do 500 ml 1 M vodného roztoku uhličitanu draselného. Vodný roztok byl extrahován 3 x ClgCHg. Spojené organická fáze byly promyty 1 M vodným roztokem uhličitanu draselného, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny. 3ylo získáno 5,6 g, 100 a napěněného oleje, který byl přečištěn rychlou sloupcovou chromatografií v systému 30/ ethylacetát/hexan. Výtěžkem bylo 5,4 g, 95/ požadovaného 3oc chráněného oxazolidinonu 3,. ^]H NMR /CDC1₃/. 5 1,504 /s, 9 H/. 3,385 /s, 3 H/, 4,642 /d, J=4,3 Hz, 1 Η, H-4/, 5,389 /d, J = 4,3 Hz, 1 Π, H-5/', 7,401 7,46° /m, 5H/; ¹³C NMR /CDCl-j/. £ 23,2, 53,3., 63,8, 76,0, 84,9, 125,2, 129,3, 122,6, 137,3, 150,3, 169,1.

d/ methvl/23,3R/2-f/tertrbutyloxykarbony1/ amino} -3-hydroxy3-fenylpropionat /4/

K roztoku 5,6 u, 17,6 mmol methylesteru 3. ^v 300ml dioxanu bylo při í praveného eplotě místnosti přidáno 44 ml, 88 mmol cérstv 2 N vodného roztoku hydroxidu litného. Vzniklá při3U3penze byla míchána přes noc při teplotě mí látky byly odstraněny ve vakuu. Zbytek byl 1 N vodného roztoku hvdrogensÍránu sodného stnosti. Těkavé rozpuštěn v 300 ml n 3 extrahován

CljCH^. Spojené organické ným, zahuštěny, zbytek byl a ochlazen na 0°C. Pak byl áze byly vysušeny znovu rczpustěn v přidáván etherový nad síranem sod300 ml etheru roztok diazomethanu ^: míchán š do vzniku stálého 15 min při 0°C a 30 nažloutlého zabarvení. Roztok b.yl min při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odstraněno a výsledný napěněny olej byl purifikován rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití stupňového gradientu: 30á ethvlacetát-hexan, 5 0a ethylacetát -hexan/ Výtěžkem bylo nejdříve 4,01 g, 813 požadovaného 3oc chráněného aminoalkoholu 4 a potom 460 mg, 12/ de-3oc oxazolidinu. Aminoalkohol 4 bvl získán jako bílá krystalická látka. Teplota tání 1 01-1 02°C /ether-hexan/; (ptj - -15,1° /c = 0, 93, CHC1₃/; ¹H NMR /CDCiy. <? 1,333 /s, 9H/, 2,704 /bs, 1 H, OH/, 3,761 /s, 3 4/, 4,501 /bd, J = 6,6 Hz, 1 H, HO-/, 5,237 /dd, J = 3,5, 3,4 Hz, 1 H/, 5,273-5,351 /m, 1 H/,

13,

344 0 /br/, 2~^j80, 174'?, 170/,1595, 1165 cm

Jjk⁺HJ : Analýza pro a, > > -'6 ; ;í, 6 , .

' H (' '·! · o '1/^h21 5 ,02

7,237-7,362 /m, 5H/; ^1JG NMR /C/ClM.S 28,1, 52,4, 5 \5, 73,3,

30,0, 126,0, 127,9, 123,2, 139,9, Í55,5, 171,5; Ih /Hdr/ ¹ ; M m/z 295 , 7,12. N ;lezeno:

e/ methyl/2S,3R/-2-(/tert-butyloxykarbonyl/amino)-3-methansulfonyl-3-fenylpropionát /6/

K roztoku 0,94 g, 3,18 mmol alkoholu 4 a 0,73 g, 7,18 mmol NET^ v 1 0 ml C^Cl·^ bylo při 0°C přidáno 418 mg, 3,65 mmol methansulfon,ylchloridu. Reakční směs byla míchána 45 min při 0°C. Potom byla přidána studená zředěná HC1, směs byla zředěna ClgCH^ a organická vrstva byla promýta vodným roztokem NaHCOp nasyceným solným roztokem a vysušena nad . Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový mesylát £ byl získán jako napěněná bílá tento produkt použit bez d cf 1 ,41 7 /s, 9H/, 2,910 /s, 4,853 /DD, J = 9,6, 6,6 Hz

Hz, 1 Η, H-H/, 5,893 /d, /m, 5H/; IR ZK.3R/ 34 00, pesrná. látka. V dalším postupu byl alšího přečištění, bi NMR /CDC1-,/.

H, Cr^OHs/, 3,705 /s, 3 Η, ΟΗ_βΟ-/ , 1 H, H-C₂/, 5,173 /bd, J = 9,6 = 6,6 Hz, 1 H, JI-C₃/, 7,389-7,400 0, 2950, 1745, 1715, 1520, 1360, '/ methyl/2R,33/3-/acetylthio/2-(/tert-outyloxykarbonvl/aminoj-3-fenylpropionát /7/

S°il D3U a kyseliny thioloctová byla při pra véna přidáním

1,2 g, 15,8 mmol kyseliny thioloctová k roztoku 1,68 g, 11,07 mmol D3U v 5 ml DMF. Tento roztok byl přidán k roztoku 1,13 g, 3 ,'1 6 mmol mesylatu 6. v 10 ml DMF. Reakční směs byla míchána 30 hod při teplotě místnosti. Pak byla přidána voda a ClgCI^ a směs byla 4 x promyta vodou. Organická vrstva byla promyta solankou a vysušena nad Na_?30^. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový olej byl purifikován rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu v systému 8,0 ethylacetát/toluen. Výtěžek požadovaného acetylovaného thiolu 7 ve formě bezbarvé kapaliny činil 0, 37 g, 87%. [<x3²% ~ +143,6° c = 2,50,

CIIC1₃/; Ή NMR /CDCl₃/.d 1,427₍/s, 93/, 2,330 /s, 3H, Cly /dd, J = 9,6, 4 H-N/, 5,138 /:,

CÚS/, 3,685 /s, 3 H, CH₃C-/, 4,903 /dd, J = 9,6, 4,7 Hz,

Hz, 1

H-C₂/, 5,'yJ /bd, J

Hz, 1 H, H-C₃/, 7,289-7,400 /m, 53/,· ¹³C NMR /CDCly £ 28,1, 30,2, 49,9, 52,2, 57,3, 80,2, 128,2, 128,4, 128,6, 136,6

155,1, 17·

193,3 /-303-/; IR /čistý/ 338

- 79 1750, 16 90, 1520, 1340, II70 cm“¹; 103 m/z 354 [m+Hj; Analýza pro γΗ₂βΟ^Ν3'-vypočteno: C, 57,79; H, 6,51· Nalezeno: C, 57,64; H, 6,59· g/ me thyl/2R, 33/-2-(7't ert-bňtyloxy karbon,y 1/amino)-3merkapto-3-fenylpropionat /9/

Acetylovaný thiol 7. /290 mg, mmol/ byl rozpuštěn v methanolu /4 ml/ a pak bylo přidáno 4,1 ml 0,2 N vodného roztoku NaOH. Reakční směs byla míchána 20 min při teplotě místnosti a průběh reakce byl sledován pomocí TLC. Roztok byl potom opatrně neutralizován zředěnou HC1. Těkavé látky byly odstraněny ve vakuu a zbytek byl extrahován 3 x Cl 2^2« Organická vrstva byla promyta solankou a vysušena nad NagSC,,. Surový produkt byl purifikcván rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu v systému 10% ethylacetát/hexan. Požadovaný thiol 2 byl získán jako bílá pevná látka; výtěžek byl 242 mg, )5žž>. Teplota tání 76-77°C /ether-hexan/;

= +.92,3 /c = 0,96, CKCly; ¹H NMR /CDCl^/. & 1,392 /s, 9 H/, 2,207 /d, J = 7,3 Hz, 3H/, 4,800 /dd, J 8,7, 6,3 Hz, 1 H, CH-N/, 5,059 /bd, J = 3,7 Hz, 1 H, NH/, 7,3707,282 /m, 5H/; ¹³C NléR /CDC1₃/. (f 23,0, 52,1, 5 9,5, 80,1, 127,5, 127,6, 123,8, 138,8, 155,9, 171,5; IR /K3r/ 3335,

2990, 1740, 16 5 , 1530, 1165 cm“¹; M3 m/z 312 ----- ⁺

M+H , 6,75;

nalezeno : C, 5θ,03; H, 6,88.

Analýza pro C₁^H₂₁0^N3 - vypočteno: C, 57,88;

a/ kyselina /2R, 33/-2-(/tert-butyloxyk&bon,yl/amino)-3-^/4methylbenzyl/thio^-3-ienylpropionová /1 0/

520 mg, 1 ,47 mmol ace ty loveného thiolu 7. bylo rozpuštěno v 3 ml methanolu. Pak bylo přidáno 1,62 ml, 1 M vodného roztoku NaOH a dále 300 mg, 1,62 mmol bromxylenu. Po 20 min bylo zkontrolováno pH a pak byl přidán. 1,1 ekvivalent zásady. Reakční smos byla míc.ána 3 hod při teplotě místnosti a průběh reakce byl kontrolován pomocí TLC. Roztok byl opatrně neutralizován zředěnou HC1. Ték-.vé látky byly odstraněny ve vakuu a zbytek byl 3 x e>trahovén Cl.₅Crt₀. Organická vrstva

L— t— byla promyta solankou a vysušena nad Na^SO^. Surový produkt byl purifikován rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu v systému 2,6 kyselina octová/20% ethylacetát/hexan. Výtěžek požadované kyseliny 10 , získané jako bílá pevná látka, činil 430 mg, 79/. Teplota tání 131-132°C /ether/hexan/;

[<xý _D = +211,7° /_c = 0,99, CHCl^/j ¹H NMR /GDCl^/. $ 1,403 /s, 9 H/, 2,316 /s, 3 H/, 3,515 /d, J = 13 Hz, 1 H/, 4,194 /d, J = 13 Hz, 1 H/, 4,790 /bs, 1 H/, 4,931-5,050 /m, 1 H/, 5,050-5,352 /bs, 1 H/, 7,082 /s, 4 H/, 7,287-7,307 /m, 5 H/;

IR ZK3r/ 3380, 3000, 1700, 1515, 1170 cm¹. MS m/z 402 [m+h]⁺; Analýza pro ^22^27^4^ “ vypočteno: C, 65,81; R, 6,78.

- nalezeno :

ód , 91 ;

7,00.

Příklad 32

Příprava /2R,3R/-3-fenylcysteinu a/ /4R/-3-(/2 ^zR,3 *3/-2'-bromo-3*-hydroxy-3‘-fenylpropanoyl)4-/fenylmethyl/-2-oxazolidinon /12/ h suspenzi 4,74 g, 15,9 mmol 3-/bromoacetyl/-2-oxazolidinonu 11 ve 30 ml diethyletheru bylo při teplotě -73°C přidáno?,25 g, 22,2 mmol triethylaminu a čerstvě destilovaný di-n-butylooryltriflat. Chlazení bylo přerušeno a roztok byl míchán 2 hod při teplotě místnosti. Výsledná dvoufázová hnědá směs byla postupně ochlazena na -78°C a pak bvlo přidáno 1,27 g, 11,9 mmol čistého benzaldehydu. Reakční směs byla míchána 30 min při -73°C a 2,5 hoc při 0°C, pak byla zředěna etherem, promyta 2 x 1 N vodným roztokem hvdrogensíranu sodného, potom vodou a zahuštěna.

Zbytek bvl rozpuštěn v 30 ral etheru a ochlazen na 0°C. Tento roztok byl po kapkách přidán ke směsi metnanolu a 3/ vodného roztoku peroxidu vodíku /1:1, 3- ml/. Reakční směs byla míchána 1 hod pi 0°C , pak bvla opatrně nalita do nasyceného vod-’ ného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahována 2 x etherem. Spojené organická fáze byly promvty 2 x nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušeny nad síranem sodným a zním ň tony na bílou pevnou látku. Tento _,rodukt byl puri: icován rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu v systému 2% ethylacetát/methvlenchlorid. Výtěžek bromohydrinu 12 byl 3,62 g, 75/· b/ /4R/-3- (/2'3,3 *3/-2 '-azido-3'-hydroxy-3'-fenylpropanoyl)4-/fenvlmethyl/-2-oxazolidinon(1 3]

Roztok 3,1g, 7,67 mmol aldolového aduktu 12 a 0,92 g, 15,3 mmol azidu sodného v 26 ml DM3C byl míchán 5 hod při pokojové teplotě. Výsledný tmavý roztok byl zředěn 2:1 směsí hexan/methylenchlorid, promyt 4 x vodou, vysušen nad síranem sodným a zahuštěn na světí·' olej, který krystalizoval. Rekrystalizací z etheru/hexanu bylo získáno 2,2 g, 80/ bílého krystalického azidu 13 · Teplota tání 115-116°C /ether/hexan/;

D ⁼ ~^D’° /o = 2,2, CHCI-,/; ^bH NMR /CDC1·,/. cf

2,745 /dd, J = 13,6,- 9,6 Hz, 1 H, CHH-Ph/, 2,949 /a, J = 6,6

Hz, 1 H, -OH/, 3,310

J = 13,6, 3,4 Hz, 1 H, CHHPh/,

4,199-4,274 /m, 2H, H-5/ 4,714-4,752 /m, 1H, 1 /cd, J = 8,5, 6,6 Hz, IH, CH-OH/, 5,383 /d, J 1 H, CHN₃/, 7,197-7,532 /m, 10 H/. ¹³C NMR /CDC1₃/. $ 37,3, 55,5, 63,1, 66,5, 74,8, 126,7, 127,3, 128,7, 128,8, 128,9, 129,3, 134,3, 139,5, 153,3, 169,6. IR /K3r/ 3420, 3025,

00, 2760, 1700,1400,1225 cm^-1. MS m/z 349 [μ+Η-Η₂<?] ⁺ .

Analýza pro C^H^O^N^ - vypočteno: C, 62,29; H, 4,95; 14,15,29.

nalezeno : C, 62,03; H, 5,06; 14,15,23

-4/,

5,

3,5 c/ methyl/2S,3S/-2-azido-3-hydroxy-3-fenylpropionat /14/

K roztoku 1,52 g, 4,15 mmol azidu 13 v 3 ml oezvodého methanolu a 8 ml Cl^CHj byle při 0°C kanylou přidána suspenze, vytvořená přidáním 5,2 ml, 4,5 mmol, 0,28 M methvlmagnesiumbromidu v diethyletheru k 5 ml bezvodého methanolu, Reakční směs byla míchána 3 min, pak bylo přidáno 20 ml 1 N vodného roztoku hydrogensíranu sodného a směs byla 3 x extrahována methylenchloridem. Spojené organické fáze byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny. Hbytek byl purifikovén rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu v methylenchloridu. Ryla získána bílá Krystalická látka - požadovaná sloučenina 1 4; výtěžek činil 307 vg, 28Teplota tání 4 0-41 /ether-hexan/; NMR /CDCl^/. cf 3,084 /bs, 1 H, -CH/, 3,774 /s, 3 H/, 4,108 /d, J = 7 hZ, 1 H, CH-N^/, 5,003 /bd, J = 6,4 Hz, 1 H, HC-OH/, 7,372 /s, 5 H/; ^{1 3}C NMR /CDCl^/.^ 52,6, 74,5,

126,6, 128,6, 128,7, 136,1, 169,3; IR /K3r/ 3500 /b/, 3020, 2960, 2120, 1740, 1460, 1440 cm^-1; MS m/z 238 £m+NHJ 1 Analýza pro - vypočteno: C, 54,30; H, 5,01; N, 19,00 nalezeno: C, 54,31; H, 5,08; N, 18,78 d/ methyl/2S,3S/-2-(/tert-butyloxykarbony1/amino)-3-hydroxy3-fenylpropionát /15/ mg komerčně dostupného palladia na aktivním uhlí ve 4 ml ethylacetátu bylo intenzivně mícháno 15 min ve vodíkové atmosféře. K této suspenzi byla přidána směs 800 mg, 3,6 mmol azidoalkoholu 14 a 943 mg, 4,32 mmol di-tgbutyldikarbonátu ve 4 ml ethylacetátu. Výsledná směs byla míchána pod vodíkem 2 hod. při teplotě místnosti a průběh reakce byl sledován pomocí TLC. Směs byla zfiltrována přes Celíte, filtrát byl zahuštěn ve vakuu a vzniklá pevná bílá látka byla purifikována rychlou sloupcovou chromatografií na silikagelu v 30b ethylacetátu/hexanu. Výtěžek bílého krystalického Boc chráněného aminoalkoholu 15 byl 1,04 g, 98b. Teplota tání 101-102°C /ether-hexan/; £cXj²°_D = +83,3° /c = 1,05, CHC1₃/; ¹H NMR /CDCiy. ř 1,433 /s, 9 H/, 3,701 /s, 3 H/, 3,929 /bd, J =

5,3 ,lz, .1. H,. HO-/, . 4,71 0-4,760 /m, 1 H/, 5.,168-5.,183. /m, 1 H/,.

5,190-5,310 /m, 1 H/, 7,243-7,380 /ra, 5 H/;

C NMR /CDCiy.

ó 28,2, 52,2, 59,7, 74,9, 30,5, 126,0, 127,9, 123,2, 139,3, 156,1, 170,1; IR /K3r/ 3450, 3390, 3000, 1760, 1710, 1530, 1230, 1260 cm¹; MS m/z 206 [m+h]⁺.

Analýza pro C^H₂^0^N - vypočteno: C, 61,02; H, 7,12 nalezeno : C, 60.96; Η, 6,96.

e/ methyl/23,3S/-2- (/tert-butyloxykarbonyl/amino)-3-methansulfonvl-3-fenylpropionát /16/

K roztoku 1, 14 g, , 81 mmol alkoholu 15 a 1,25 g, 12,4 mmcl triethylaminu v 15 ml C1₂CH₂ bylo přidáno

0,96 g, 8,4 mmol methansulfonylchloridu. Reakční směs byla míchána 20 min při 0°C. Potom byla přidána studená zředěná HC1, směs byla zředěna ClgCHg, organická vrstva byla promyta vodným roztokem NaHCOp pak solankou a vysušena na Na^SO^. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Surový mesylát 1 6, získaný v podobě bílé napěněné pěné látky, byl použit bez dalšího čištění v následujícím kroku. ¹HNMR /CDCl^/.(í 1,394 /s, 9 H/, 2,916 /s, 3' H/, 3,718 /s, 3 H/, 4,378 /dd, J= 8,7, 5,0 Hz,

Η, H-2/, 5,231 /bd, J = 8,7 Hz, 1 Η, H - N/, 5,917 /d, J =

5,0 Hz, 1 Η, H-3/, 7,379-7,425 /m, 5 H/.

f/ methyl/2R,3R/-3-/acetylthio/2- ζ/tert-butyloxykarbonyl/amino) 3-fenylpropionat /17/

K roztoku 2,72 g, 7,29 mmol mesylatu 16 v 17 ml DMF bylo přidáno 3 g, 29,9 mmol draselné soli kyseliny thioloctové. Roztok velmi zhoustl, proto bylo přidáno 5 nl DMF.

Roztok byl ponechán pod argonem 20 hod při teplotě místnosti.

Pak byla přidána voda, a směs byla 4 x promyta vodou.

Organická vrstva byla usušena nad NagSO^. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Surový produkt obsahoval směs 6:1 požadovaného produktu 17 a oxazolidinonu ty, jak je doloženo bd NMR surového produktu. Tato směs byla purifixována rychlou sloupcovou chromatografii na silikagelu v gradientu 5% až 50% ethvlacetát/hexan. Takto byl získán požadovaný acetvlovar ný’’thiol 17 /výťěžek: 1 ,65^- g', '6^%;· žluťohnědá pevná látka/ a potom oxazolidinon.ty /výtěžek: 193 mg, 12%/« Acetylovány thiol byl rekrystalizován za vzniku, bílé pevné látky.

Teplota tání 87-33°C /ether-hexan/; = -97 2° /1 0

CHC1₃/; ¹H NMR /CDC1₃/. 1 ,431 /s, 9 H/, 2,355 /s, 3 H/,

3,616 /s, 3 H/, 4,766 /dd, J = 6,6, 6,3 Hz, 1 Η, H-2/, 5,029 /bd , J = 6,6 Hz, 1 Η, H-3/, 5,264 /bd, J = 6,3 Hz, 1 Η, H-N/, 7,311 /s, 5 H/; ¹³C NMR /CDCl-j/. f 28,3, 30,2, 50,5, 52,2,

53,5, 30,3, 128,1, 128,3, 128,6, 137,3, 154,9, 170,6, 193,5.

IR /X3r/ 3380, 2990, 2960, 1745, 16-90, 1520, 1240, 1170 ca¹.

M3 m/z 354 [m+hJ⁺; Analýza pro C^H^ÍxNS:

vypočteno: C, 57,77; 2, 6,56; N, 3,97.

nalezeno: C, 53,05; H, 6,92; N, 3,73.

g/ methyl/2R, 3R/-2-(/tert-butylox.ykarbonyl/ amino)-3-(/4methylbenzyl)thio -3-fenylpropionóvá kyselina /18/

500 mg, 1,4 mmol acetylovaného thiolu 17 bylo rozpuštěno v 2 ml methanolu, pak bylo přidáno 1,6 ml, 1M vodného roztoku NaOH a nakonec 300 mg, 1,62 mmol hromoxylenu. Po 20 min většina výchozího materiálu zmizelo, jak bylo zjištěno pomocí TLC. Roztok byl opatrně neutralizován zředěnou HC1. Těkavé látky byly odstraněny ve vakuu a zbytek byl extrahován ClgCHp 3 x. Organická vrstva byla promyta solankou a vysušena nad k^SO^. Surový produkt byl přečištěn rychlou chromatografií na silikagelu v systému p7o až 20>o eth.ylacetát/hexan. Požadovaný ester 18 byl získán jako bílá krystalická látka. Výtěžek byl 430 mg, 79/. Teplota tání 97-98°C /ether-hexan/; L<]²% ⁼ -171,8° /c = 1,05, CHC1₃/; ^]H NMR /CDC1·}/. S 1,384 /s, 9 H/, 2,326 /s, 3 H/ 3,3 93 /d, J = 13 Hz, 1 H/, 3,551 /d, J = 13 Hz, 1 H/,

3,572 /s, 3 H, OCH₃/, 4,126 /d, J = 5,4 Hz, H-3/, 4,630 /dd,

J = 8,8, 5,3 Hz, 1 Η, H-2/, 5,220 /bd,' J = 3,8 Hz, 1 H, H-N/, 7,028-7,107 /m, 4 H/, 7,2 91-7,362 /rn, 5 ¹³C NMR /CDCiy.

$ 21,0, 28,3, 35,5, 51,6, 52,1, 57,5, 80,1, 127,8, 128,5, 123,7, 128,9, 129,2, 134,3, 136,9, 133,4, 154,7, 170,8; m/z 316 [m+h] ; Analýza pro ΟροΗροΟ,Νο . 1/4 H?O - vypočteno:

29 4

C, 65,76; H, 7,08; N, 3,33; nalezeno: C', 65,5 9; N, 3,36.

7,03;

h/ /2R,3R/-2-^/tert-butyloxykarbonyl/amino^-3-^/4-methvlbenzyl/thio)-3-f en.ylpropionová kyselina /19/

380 mg, 0,91 mmol methylesteru 18 a 376 mg, 8,89 mmol bezvodého chloridu lithného bylo rozpuštěno v 10 ml DMP. Reakční směs byla 4 dny zahřívána na 90°C. Po ochlazení na teplotu místnosti byla k směsi přidána zředěná HC1. Potom byla směs několikrát extrahována ethylacetétem, organická vrstva byla promyta solankou a vysušena nad Na23C·^. Surový produkt byl purifikován rychlou sloupcovou chromatografií na silikarelu za použití stupňového gradientu: 20v ethvlacetát/hexan, 25/ eti vlacetát/5kyselina octová/he^van. Nejprve

- 35 se objevil výchozí materiál 13 /75 mg, 203/ a potom požadovaná karboxylová kyselina jako bílá pevná látka; po rekrystalizaci byl výtěžek 341 mg, 773. Teplota tání 107-108°C /etherhexan/; [tx3²°_D= -143,7° /c = 1,66, CHCl-^/; NMR /CDCl^/.

1,379 /s, 9 H/, 2,300 /s, 3 Η/, 3,460 /d, J = 13,3 Hz, 1 H/, 3,588 /d, J = 13,3 Hz, 1 H/, 4,242 /d, J = 5,5 Hz, H-3/, 4,646 /dd, J = 3,7, 5,5 Hz, 1 Η, H-2/, 5,273 /bd, J = 8,7 Hz, 1 H, H-N/, 7,055 /s, 4 H/, 7,259-7,34 0 /m, 5 H/; ¹³C NMR /CDCl-^/.

21,1, 23,2, 35,5, 50,8, 58,1, 30,5, 127,9, 128,6, 128,9,

29,2, 133,9, 136,9, 133,1, 155,3, 1 74,5; MS m/z 401 [lá+H]⁺. Analýza pro ^C22^27^4^^{S: C}’ θ5,31; H, 6,73; N, 3,48 - vypočten©.

‘Nalezeno: 65,83;

TJ

6,92; N, 3,57.

Příklad 33

Složení farmaceutického prostředku pro parenterální dávkování

Preparát obsahující 20 mg sloučeniny z Příkladu 1 nebo 2 v poďobe sterilního suchého prášku byl připraven následujícím způsobem: 20 mg sloučenin;/ bylo rozpuštěno v 15 ml destilované vody. Roztok byl za sterilních podmínek zfiltrován do 25 ml vícedávkcvé ampule a lyofilizován. Prášek byl rozpuštěn v 20 ml 5/ dextrosy ve vodě /DpVtf/ pro intravenózní nebo intramuskulární injekce. Dávkování je tak určeno injikovaným objemem. Další ředění může být provedeno přidáním odměřeného o ojemu tohoto roztoku preparátu k dalšímu, o o jemu. D5W pro injekce, nebo může být odměřená dávka přidána k jinému mechanismu pro podávání účinné látky, jako je láhev nebo sáček pro nitrožilní kapací infúzi či jiný systém pro injekci a infúzi.

Příklad 34

Složení farmaceutického prostředku pro orální dávkování

Kapsle pro orální podání byla připravena smícháním a umletím 50 mg sloučeniny z Příkladu 3 s 75 mg laktos.y a 5 mg magnesiumstearatu. Prosátý prášek byl pak nasypán do tvrdé želatincvé kaosle.

Příklad 35

Složení farmaceutického prostředku pro orální dávkování

Tableta pro orální podání byla připravena smícháním a granulací 29 mg sacharosy, 150 mg dihydrátu síranu vápenatého a 50 mg sloučeniny z Příkladu 3 spolu s 103 roztokem želatiny. Mokré granule byly prosáty, usušeny, smíchány s 10 mg škrobu, mg talku a 3 mg kyseliny stearové; z táto směsi byla vylisována tableta.

Tento popis plně vysvětluje přípravu a použití sloučenin, které jsou předmětem vynálezu. Vynález však není omezen zde popsaným přesným způsobem provedení, ale zahrnuje všechny modifikace v rozmezí následujících nároků.

JUDr. Zdeňka KOREJZOVÁ advokátka

Λ??-/

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Cyklické protiagregační peptidy obecného vzorce I:

   Zz₁ -A'-A\

   3-Gly-Asp-2 _n-M-Z₂ k' je bu3 nepřítomen, nebo představuje Asn, Gin, Ala nebo Abu; A je buč nepřítomen, nebo představuje D- bebo L-aminokyselinu, a to Arg, HArg, (He^Arg, (Et ₂) Ar g, Abu, Ala, Gly, His, Lys, nebo její <X.-R'substituovaný derivát , dále pak Dtc,

   Tpr nebo Pro;

   znamená D- nebo L-aminokyselinu, a to Arg, HArg, HArg, (%e₂)Arg, (Et₂)Arg, Lys,nebo její <X-R* substituované deriváty;

   je buč nepřítomen, nebo představuje D- nebe L-avňnouy.selinu, a to Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4*V»')Phe, HPhe, Phg, Pro, Trp, His, Ser, Alk Ser, Thr, (Alk)Cys, (Alk^Pen, Ala, Val, Nva, Het,

   Leu, Ile, Nle nebo Nal, nebo její <X-R' substituovaný derivát;

   Η j e buč a to Glu, 3-Gly-Glu nepřítomný, nebo znamená D- nebo L-aminoky s^e-kis»-? Phe, Pro, Lys, Ser anebo, je-li n rovno 1 , I_

   Oiyd ! ΑΛ3Γ0θν ÍA73iyNÁAOHd

   W ’ je buč halogen nebo Alk;

   av$n

   R' je buč Alk nebo PhCH₂;

   znamená z

   o kde Z. a Z₉ jsou spojeny uovai £ 12 lentní vazbou mezi L a L nebe Zi a Z^ dohromady představují kovalentní vazbu mezi aminokoncovým zbytkem a karboxykoncovým zbytkem;
2. 2

   L a If znamenají -3- nebo -(CH?)

   X je R4R5N nebo H;

   Y je H, (00.^^2 nebo CO2R2} \ *

   R^ a Rp jsou H, Alk nebo (CH₂)pAr;

   R-) a R^ jsou .Ί, Alk, (CH'2) Ar onebo dohromady znamenají ΐ” ^ne^°

   R, je K nebo Alk;

   R^ Ó® ^11’ ^R1 1 CO * OCO, R^ θΟΗ (R-j *| ') CO >

   R_{1 1}NHCH(R₁₁ z) CO, R₁₁SCH(R_{1 r})CO, R_n30₂ nebo R^SO;

   R je Alk, OAlk, halogen nebo X;

   R? je H, Alk, OAlk, halogen nebo Y;

   Rg a R_gz jsou H, Alk, ('CHj) Ph, ^CH₂) Nph, anebo dohromady představují -(CH₂) nebo -(CH₂)--;

   R^ je H, Alk nebo Y;

   *10 je H nebo Alk;

   R₁₁ a Rj ₁ - jsou H, Cj__alk,yl, Cg_γcykloalkyl, Ar,

   Ar-μ _galkyl, Ar-Cg ^cykloalkyl;

   Ar je fenyl nebo fenyl substituovaný jednou nebo dvěma μ ^alkylovými, trifluorometh.vlovými , hydroxy-, μ g-alkoxy nebo halogenovými skupinami;

   n je 1 nebo 2;

   q je 0 nebo 1 ;

   p je 0, 1, 2 nebo 3 a farmaceuticky aktivní soli yýše zmíněných látek;

   podmínkou je, aby když n rovná se 1 a μ je X-Cys, X-Pen nebo X-APmp, Z₂ není Cys-Y, Pen-Y nebo APmp-Y.

   2. Sloučenina podle nároku vuie síru.

   , . 1 2 v má jak L tak L před sta3. Sloučenina podle nároku 2, v níž Z, je o -

   4. Sloučenina podle nároku 2, v níž μ

   -ΠΧ'

   - 90 5. Sloučenina podle nároku 1, v níž Z^a Z^ dohromady představují kovalentní vazbu.

   6. Sloučenina podle nároku 1 - 5, v níž 3 je Arg, HArg nebo o<-R^z substituovaný derivát Arg neb© HArg.

   7. Sloučenina podle nár©ku 1 - 6, v níž A' a A nejsou přítomné.

   8. Sloučenina podle nároku 4, v níž 3 je MeArg.

   9. Sloučenina podle nároku 1, kterou je: cyklo (3, S ) -Mba -Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂ ;

   k^-Ac-cyklo(3,3)-Cys-Arg-Gly-Asp-Man;

   cykle(3,3)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Man;

   cyklo (3,3 )-Mba»-Me Arg-Gly-Asp-PcS-NH₂;

   cyklo-(3,3) -Mba-Sur-Arg-Gly-Asp-Man;

   cyklo - (s, 3) -Kba-3ar-MeArg-Gly-Asp-Kan;

   cyklo-(0,3)-Mba-Arg-Gly-Asp-Man;

   cyklo -('S, S) -Mba -D-MeArg-Gly-Asp-Man;

   cykl©-(3,3)-Mba-MeArg-Gly-Asp-N-Me-Man;

   N^wAc -cykle -(3,3) -Sv s -MeArg -Gly -As p-{ 2 R, 33^ Pc s -NH₂:

   N^Ac-cyklo- (3,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(2R,3R^Pcs-NH₂;

   N^Ac-cyklo - (3,S)-Cys-Arg-Gly-Asp-3er-Arg-Gly-Asp-3er-Cys-NH₂ N^Ac-cyklo- (3,3 )-Cys-Arg-Gl.y-Asp-3er-Arg-Gly-Asp-3er-Pen-NH₂ N^A c-cykl©-(3,3)-Cy s-Arg-Gly-As p-3e r-Me Arg-Gly-A s p-3e r-CysNH₂;

   Ν°ίΑc-cyklo-(S,3)-Cy s-MeArg-Gly-A s p-3 er-Arg-Gly-Asp-SerC,ys-NH₂;

   N°ŠAc -cykle-(3,3 ) -Cy s -Arg -Gly -Asp-Ser -Ly s -Gly -Glu -3er-Cy s -NH₂ cyklo-0 °S 6 Ϊ)-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Glu-NH₂;

   cyklo - (i°í, 6 -Gly -Me Arg -Gly -Asp-Ser-Glu-NH₂;

   cyklo-(1,8)-Arg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe nebo cyklo-¢1,3)-MeArg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe.

   10. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podl nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   f

   - 91 1 1 . Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podle nároku 9 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   12. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 - 9 pro použití v léčivu.

   13. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků

   - 9 pr© výrobu léčiva k léčení akutního infarktu myokardu.

   14. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků

   - 9 pre výrobu léčiva k léčení mrtvice nebo přechodných ischemických záchvat!.

   15· Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 - 9 pro výrobu léčiva k léčení nestabilní angíny.

   16. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 - 9 a fibrinelytické látky pro výrobu léčiva působícího trembolýzu a bránícímu opakovanému ucpání tepny nebo žíly savce.

   7Sloučenina obecného vzorce II:

   -T 3-T‘ ₁ -á' -A - (.3 -Gly -A s p -Q J_n -lvi -Z ₂

   II kde :

   A' je bud nepřítomen neb® Asn, Gin, Ala nebo Abu;

   A je bud nepřítomen nebo D- či L-aminekyselina, a to Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Ht₂)Arg, Abu, Ala, Gly, His, Lys·,. neb© její <X-R^Z substituovaný derivát, dále pak Dtc, Tpr nebo Pro;

   je D- nebe L-aminokyselina, ; to Arg, HArg, HArg, (Kíe₉) Arg, (Ft-₂)Arg, Lys, nebo její <X.-R^Z substituovaný derivát;

   je bud nepřítomen nebo D

   Alk Tyr, Phe , (4 } Phe, nebe L-aminok.vselina,

   Phe, Phg, Pro, Irp, Hi te Tyr, , Ser, «<» (Alk)ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, fAlkjPen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle či Nal, nebe její <X~r' substituovaný derivát;

   M bu3 není přítemen, nebo je D- neb© L-Glu, Phe, Pre,

   Lys, Ser nebo, je-li n rovné 1, 3-Gly-Glu-Q;

   W je halogen nebo Alk;

   R^z je Alk nebe PhCí·^» představuje . kde Z. a 7 jscu spoj^nv

   12“ kcvalentní vizbcu mezi L a L'^-;

   fL

   T

   X

   Y

   R

   R a

   a

   R4 ^H5 ^R7 ^R3 ^{A R}8 jseu -3-;

   je vodík nebo odstranitelná skupina;

   je R^R^N nebo H;

   je H, CONRjR₂ nebo CC^Rgí jsou H, Alk neb© (CH₂)pAr;

   jsou H, Alk, (CHg^pAr, neb® dehremačy představují -(Cí^^- neb© -(CH₂)₅-í je H nebe Alk;

   je R_n , R_nCO, R_nOCO, R_{] 1} OCH(R_{1 1} )30, R_] ,NHCH(R_n ^0, R_{1 1}SCH(R_{1 1} ^30, Η_η3Ο₂ nebo R^SO;

   je Alk, CAlk, halogen nebo X;

   je H, Alk, OAlk, halogen nebo Y;

   jsou H, Alk, (CH₀) Ph, (CH₉) Jph, neb© dohromady představují -^)4- nebo -\CH₂^-;

   R-, je H, Alk neb© Y;

   R^ 0 je H nebo Alk;

   ₁ a 1 ' jsou H, C^alkvl, C^^cyklealkyl, Ar, Ar-G^ _^alkvl, Ar-CZ Cvklealkyl;

   Ar je fenyl nebo fenyl substituovaný jednou ci dvěma

   Cj -alkylovými, trifluoromethylovými, hydroxy,

   -alkoxy neb© halsgenovými skupinami;

   n je 1 nebo 2;

   q je 0 nebo 1 a p je 0, 1, 2 nebe 3, za předpokladu, Se je-li n rovn© 1 a Z^ X-Cys, X-Pen nebo X-APmp, pak Z₂ není Cys-Y, ?en-Y nebo APmp-Y.

   18. Postup přípravy sloučeniny obecného vzorce III:
3. 3-3

   Z₁A^z-A-(3-Gly-Asp-D_<}_n-M-Z₂

   III kde A', A, B, Q, M, Z| , Z₂ a n mají stejný význam, jaký je uveden u nároku 1 a L a L^oba představují 3; t© zahrnuje a/ ©xidativní cyklizací sloučeniny ©becného vzorce II:

   S-T

   S-T‘

   Z₁ -A'-A-(3-Gly-Asp-Q)_n-M-Z

   II

   A', A, 3, Q, M a n mají stejný význam, jaký je uveden nároku 1;

   2

   Z. a Z_o jseu spojeny kovalentní vazbou mezi L a L , jak ¹ *· 1? je uveden© u nároku 1, a L a L“ obě představují 3;

   U a jsou H, neb® b/ nukleofilní cvklizaci sloučeniny obecného -vzorce II <ma j i

   2 váný výše a T a T představují jeden odstranitelnou skupinu působením zásady, kde A, A, 3, Q, Μ, Z^ , Z_o a nevyznám definovaný výše i a druhý H.

   19. Postup přípravy sloučeniny ©becného vzeree V:

   / _

   Z₁-A'-A-(3-Gly-Asp-Q)_n- M-Z₂

   A', A, 3, Q, Man mají stejný význam, jaký je uveden u nároku 1 ;

   2

   Z, a Z_o jsou spojeny přes kovalentní vazbu mezi L a L , ⁴ 12 f \ jak je uveden© u nároku 1, a L a L každý představuje (CH?) ;

   Λ neb© Z} a Z₂ dehremady představují kovalentní vazbu mezi aminokencovým zbytkem a karbexvkoncevým zbytkem: t© zahrnuje i/ cyklizací sloučeniny obecného vzeree:

   H-[z₂-Z₁ -A'- A-(3-Gly-Asp-Q-)_n-]vJ-0H pomocí kondenzačního činidla, kde: I? a jsou (CH_?1 ; neb©

   H- [a '-A- (3-Gly-Asp-Q-) -MlJ -OH kde Zy a Z₂ dohromady představují kovalentní vazbu;

   H- a -OH zde představují amin· a karboxylový zbytek kterýchkoliv dvou sousedních zbytků v cyklickém peptidu a A*, A,

   3, Q, M a n mají stejný význam, jaký je uveden u nároku 1 a reaktivní skupiny jsou vhedně chráněny a ii/ edstranění všech chránících skupin.

   20. Sleučenina obecného vzorce I uvedeného u nároku 1, co do obsahu zde popsaná s odkazem na příklady.

   . Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu uvedenou v nároku 20 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   22. Sloučenina uvedená v náreku 20 pro použití v léčivu

   23. Použití sloučeniny uvedené v náreku 20 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení akutního infarktu myokardu a /nebe/ mrtvice neb® přechodných ischemických záchvatů a /nebo/ nestabilní anginy.

   24· Použití sloučeniny uvedené v nároku 20 a fibrinolytické látky pr® výrobu farmaceutického prostředku působícího trombolýzu a bránícímu ©pakovanému ucpání tepny nebo žíly savce.

   25. Sleučenina obecného vzorce II uvedeného v nároku 17 jejíž podstata je zde popsaná a doložena příklady.

   26. Postup pre přípravu sloučeniny obecného vzorce III uvedeného v nároku 18, tak jak je zde popsaný a dolezený příklady.

   27· Postup pro přípravu sleučeniny obecného vzorce V uvedený v nároku 19 , tak jak je zde popsaný a doložený přX- advckátka