DE69033038T2

DE69033038T2 - Zyklische Peptide mit aggregationshemmenden Eigenschaften

Info

Publication number: DE69033038T2
Application number: DE69033038T
Authority: DE
Inventors: Fadia El-Fehail Ali; James Martin Samanen
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1989-10-23
Filing date: 1990-10-22
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2010-10-23
Also published as: JP2922281B2; EP0425212A2; PT95661B; NZ235767A; ATE178613T1; EP0425212A3; JPH03161498A; AU6470590A; PT95661A; CA2027936A1; EP0425212B1; CA2027936C; ES2130118T3; KR910007964A; IE903775A1; CZ397991A3; ZA908426B; DE69033038D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Peptide, die die Blutplättchen- Aggregation hemmen, die Peptide enthaltende Arzneimittel und Verfahren zur Verwendung der Peptide. Insbesondere wird ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide in Kombination mit Fibrinolytika offenbart.

Technischer Hintergrund

Ein Thrombus ist das Ergebnis von Prozessen, die die Koagulationskaskade einleiten. Er besteht aus aggregierten Blutplättchen, die in einem polymeren Fibrin-Netzwerk eingebaut sind. Dieser Prozeß wird normalerweise infolge einer Gewebeverletzung eingeleitet und bewirkt eine Verlangsamung oder Verhinderung der Blutströmung in einem Gefäß. Eine Thrombus-Bildung kann auch durch ätiologische Faktoren eingeleitet werden, die mit einer Gewebeverletzung nicht direkt im Zusammenhang stehen, wie einem Atherosclerose-Plaque, einer Entzündung der Blutgefäße (Phlebitis) und Septikämie. In einigen Fällen kann die ungünstige Bildung eines Thrombus und die anschließende Verminderung der Blutströmung auch pathologische Folgen, wie Hirnschlag, Lungenembolie und Herzerkrankung, haben.
Bei der Thrombus-Bildung spielen Blutplättchen eine Hauptrolle. Bei der derzeitigen Therapie zur Thrombose-Bekämpfung werden Mittel eingesetzt, die das Arachidonat-Prostaglandin-System von Blutplättchen/Endothelzellen, wie Prostacyclin-Analoge, Cyclooxygenase-Inhibitoren, Thromboxansynthese- Inhibitoren und Thromboxanrezeptor-Antagonisten, und Antikoagulanzien, wie Heparin, modifizieren. Diese Mittel hemmen eine oder beide der zwei erkennbaren Phasen der Blutplättchen-Aggregation. Die Primärphase, die eine Reaktion auf chemische Stimuli, wie ADP (Adenosindiphosphat), Collagen, Epinephrin oder Thrombin, darstellt, bewirkt eine erste Blutplättchen- Aktivierung. Dieser schließt sich eine Sekundärphase an, die durch die Blutplättchen selbst initiiert wird und durch eine Thromboxan A&sub2; (TxA&sub2;)- Synthese und die Freisetzung von weiterem ADP aus den Blutplättchen- Speicherkörnchen charakterisiert ist, wodurch die Blutplättchen weiter aktiviert werden.
Das auch als Prostaglandin I&sub2; (PGI&sub2;) bezeichnete Prostacyclin und stabile PGI&sub2;-Analoge hemmen sowohl die Primär- als auch Sekundärphase der Blutplättchen-Aggregation. Die Verwendung solcher Analoge geht jedoch mit unerwünschten Veränderungen des Blutdrucks einher (vgl. Aiken et al., Prostaglandins, 19 (1980), 629-643).
Cyclooxygenase-Inhibitoren und Thromboxansynthese-Inhibitoren bewirken eine Blockierung der TxA&sub2;-Produktion. TxA&sub2;-Antagonisten blockieren die TxA&sub2;-Wirkungen durch Bindung des TxA&sub2;-Rezeptors. Diese Therapien wirken nur auf die zweite Phase der Blutplättchen-Aktivierung. Die Verwendung von Cyclooxygenase-Inhibitoren geht mit einer Geschwürbildung und einer nachteiligen Wirkung auf die Prostacyclin-Synthese einher.
Heparin verhindert die Fibrinogen-Aktivierung durch Thrombin und verhindert dadurch die Aktivierung des GPIIb-IIIa-Rezeptors durch Thrombin. Dies hemmt nur die Primärphase der Blutplättchen-Aggregation und hat eine geringe Wirkung auf die Blutplättchen-Aktivierung durch andere Mittel, wie Collagen, ADP und Epinephrin.
Cyclooxygenase-Inhibitoren, Prostaglandin-Analoge und Heparin hemmen allesamt indirekt die Blutplättchen-Aggregation durch Hemmung der Primär- oder Sekundärphase der Blutplättchen-/Fibrinogen-Aktivierung. Es besteht daher Bedarf an selektiven therapeutischen Produkten, die die Blutplättchen- Aggregation direkt blockieren, unabhängig davon, ob diese von der Primär- oder Sekundärphase der Blutplättchen-Aktivierung herrührt.
Man nimmt an, daß die Blutplättchen-Aggregation hauptsächlich durch den GPIIb-IIIa-Blutplättchen-Rezeptor-Komplex vermittelt wird. Der von Willebrand-Faktor, ein Plasmaprotein, und Fibrinogen können GPIIb-IIIa- Rezeptoren auf benachbarten Blutplättchen binden und vernetzen und dadurch eine Blutplättchen-Aggregation bewirken. Fibronectin, Vitronectin und Thrombospondin sind Proteine, bei denen sich auch gezeigt hat, daß sie an GPIIb-IIIa binden. Fibronectin ist im Plasma und als strukturelles Protein in der intrazellulären Matrix zu finden. Eine Bindung zwischen den strukturellen Proteinen und GPIIb-IIIa kann bewirken, daß Blutplättchen an geschädigten Gefäßwänden haften.
Die Bedeutung des GPIIb-IIIa-Rezeptors für die Blutplättchen-Aggregation ist mittels Verfahren gezeigt worden, bei denen der Rezeptor maskiert wird. Auf diese Weise haben Coller et al. (Blood, 66 (1985), 1456-1459) gezeigt, daß bei ADP- induzierten Hunden gegen diesen Komplex gerichtete Antikörper die Blutplättchen-Aggregation hemmen.
In den US-Patenten Nr. 517,686, Nr. 4,589,881, Nr. 4,661,111 und Nr. 4,614,517 sind Peptidfragmente von menschlichem Plasma-Fibronectin und synthetische Peptide offenbart, die die RGD-Sequenz enthalten und die die Zellanlagerung fördern sowie die Phagocytose erhöhen. Eine RGD-Sequenz enthaltende lineare und cyclische Peptide sind auch in WO 89/05150 (PCT US88/04403) beschrieben worden. Es ist berichtet worden, daß eine RGD-Sequenz enthaltende Peptide die Blutplättchen-Aggregation hemmen. Nievelstein et al. (Thromb. and Hemostasis, 58 (1987), 2133) haben berichtet, daß -RGDS-Peptide die durch Thrombin induzierte Aggregation von Blutplättchen und ihre Adhäsion an Fibronectin hemmen, wobei ihre Wechselwirkung durch den GPIIb-IIIa- Komplex erfolgen kann. Das US-Patent 4,683,291 offenbart Peptide, die einen Arg- und Lys-Rest und eine -RGD-Sequenz enthalten und die die Bindung von Fibronectin an Blutplättchen sowie die Blutplättchen-Aggregation hemmen. Ein Nachteil dieser Peptide ist ihre geringe Stabilität im Plasma und ihre geringe Wirksamkeit.
WO 89/05150 (PCT/US88/04403; La Jolla Cancer Research Foundation) offenbart bestimmte heterodetische (Disulfid- und Amid-) Peptide, die die Sequenz Arg-Gly-Asp enthalten und die Bindung von Vitronectin an normale Ratten-Nierenzellen hemmen.
EP-A 275748 (INSERM) offenbart bestimmte heterodetische (Disulfid-) Peptide der Formel Cyclo-(S,S)-Cys-X²-Gly-Asp-X³-Cys, die die Blutplättchen- Aggregation hemmen. Die am 25.07.90 eingereichte EP-A 410541 (Merck) offenbart bestimmte heterodetische Disulfid-Peptide und homodetische Peptide, die einen 7-Aminoheptylsäure-Rest enthalten und die Blutplättchen- Aggregation hemmen. Die am 25.07.90 eingereichte EP-A 410540 (Merck) offenbart bestimmte heterodetische (Disulfid-) Peptide und einen gamma- Aminobuttersäure- oder einen 7-Aminohexansäure-Rest enthaltende homodetische Peptide, die eine Arg-Gly-Asp-Sequenz enthalten. Die am 15.06.90 eingereichte WO 90/15620 (COR Therapeutics) offenbart homodetische und heterodetische (Disulfid-) Peptide, die die Sequenz K*-(Gly/Sar)-Asp enthalten, wobei K* ein Lysin-Rest oder ein modifizierter Lysin-Rest ist. Die am 08.09.89 eingereichte und am 22.03.90 veröffentlichte EP-A 406428 (Asahi) offenbart homodetische Peptide, die die Sequenz Arg-Gly-Asp enthalten und die Bindung menschlicher Epithelkrebszellen an Vitronectin und Fibronectin sowie die Blutplättchen-Aggregation hemmen. WO 91/15224 (SmithKline Beecham), Prioritätsdatum 30.03.90, offenbart bestimmte homodetische und heterodetische (Disulfid-) Peptide, die die Sequenz Arg-Gly-Asp enthalten und die Bindung des HIV-tat-Proteins an L8-Zellen (myoblastische Zellen), HUT-78-Zellen (T- Lymphocyten), MOLT-4-Zellen (T-Lymphocyten) und THP-1-Zellen (Myelomonocyten) hemmen. WO 92/00995 (Tanabe Seiyaku), Prioritätsdatum 09.07.90, offenbart homodetische und heterodetische (Disulfid-, Thioether-, Amid-) Peptide, die die Adhäsion von Leukocyten an Endothelzellen hemmen.
In der am 05.05.89 eingereichten EP-A 0 341 915 (SmithKline Beckman Corporation) sind andere lineare und cyclische Peptide beschrieben, wobei ihre Offenbarung durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird. Diese cyclischen Strukturen umfassen einen Disulfid-Ring, der durch zwei aliphatische Aminosäurereste gebildet wird, die eine Sulphydryl-Gruppe tragen.
Die vorliegende Erfindung stellt cyclische Verbindungen bereit, bei denen die cyclische Struktur ein homodetisches Peptid umfaßt, wobei der Ring durch eine Peptid-Bindung gebildet wird, oder ein heterodetisches Peptid, wobei der Ring durch ein Alkylen, Sulfid oder eine Disulfid-Brücke gebildet wird. Die vorliegende Erfindung offenbart ferner cyclische Verbindungen, bei denen die nachstehend in Formel (I) definierte Einheit B-Gly-Asp-Q mehr als einmal wiederholt ist. Die Entwicklung solcher ungewöhnlicher Ring-Strukturen führt überraschenderweise zu pharmakologisch aktiven Verbindungen. Weiter ist entdeckt worden, daß für eine Aggregations-hemmende Aktivität weder eine terminale Amino-Gruppe noch eine terminale Carbonyl-Gruppe erforderlich ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind darüberhinaus resistent gegen Plasma-Proteasen und hemmen selektiv die Bindung an den Fibrinogen- Rezeptor, gegenüber der an andere Integrin-Rezeptoren, wie Vitronectin oder Fibronectin. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht daher in ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Blutplättchen-Aggregation, ohne die Adhäsion von Blutplättchen an andere Integrin-Rezeptoren nennenswert zu hemmen.
Bei den neuesten Versuchen zur Behandlung verschlossener Arterien und tiefer Venenthrombosen werden fibrinolytische Mittel zur Lyse von Thromben oder Emboli eingesetzt, um die Blutströmung wiederherzustellen oder zu verbessern. Fibrinolytische Mittel, wie der Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA), Urokinase (UK), Prourokinase (pUK), Streptokinase (SK) und Mutanten und Derivate davon, sind proteolytische Enzyme, die bewirken, daß Fibrin an spezifischen Stellen hydrolysiert wird und das Fibrin-Netzwerk dadurch fragmentiert wird. Ihre Wirkung in vivo besteht in der proteolytischen Aktivierung von Plasminogen im Blut, wobei Plasmin gebildet wird, das die Lyse des Fibrin-Gerinnsels bewirkt. Die Lyse von Fibrin zu kleineren Peptiden bewirkt die Solubilisierung des Thrombus oder Embolus. Ein häufig vorkommendes Problem bei einer solchen Therapie besteht jedoch im erneuten Verschluß des Blutgefäßes aufgrund der Bildung eines sekundären Thrombus.
Die Therapie mit fibrinolytischen Mitteln wird am häufigsten zur Wiederherstellung der Blutströmung in einem thrombotischen Blutgefäß angewendet. Mit einer Fibrinolytika-Therapie lassen sich jedoch nicht die Faktoren bekämpfen, die für die Initiierung eines Thrombus verantwortlich sind. Aus diesem Grund werden oft Antikoagulanzien, wie Heparin, zur Verhinderung eines erneuten Verschlusses verwendet. Tatsächlich besteht bei Patienten, die einen hohen Stenose-Grad in einer Arterie aufweisen, nach einer Reperfusion ein extrem hohes Risiko einer erneuten Thrombose, selbst in Gegenwart hoher Heparin-Dosen (vgl. Gold et al., Circ., 73 (1986), 347-352). Außerdem ist die Verwendung von SK und tPA mit einer gesteigerten Blutplättchen-Aggregationsfähigkeit einhergegangen (vgl. Ohlstein et al., Thromb. Res., 4 (1987), 575-585). Eine Behandlung mit höheren tPA-Dosen kann mit einer systemischen Blutung einhergehen und wird zur Verhinderung eines erneuten Verschlusses nicht empfohlen. Daher besteht Bedarf an einem Verfahren zur Verhinderung einer erneuten Thrombose nach einer Therapie mit Fibrinolytika.
Die US-Patentanmeldung Serien-Nr. 917,122 offenbart TxA&sub2;-Antagonisten zur Verwendung bei einem Verfahren zur Verhinderung eines erneuten Verschlusses nach Reperfusion und zur Senkung der zur Fibrinolyse erforderlichen tPA-Dosis. Yasuda et al. (Clin. Res., 34 (1986), 2) haben gezeigt, daß bei Hunden nach Thrombolyse mit tPA ein erneuter Verschluß durch Fibrin-reiche Blutplättchen-Thromben durch einen monoclonalen Maus- Antikörper gegen GPIIb-IIIa verhindert werden kann. Die vorliegende Erfindung offenbart ein neuartiges Verfahren zur Verhinderung eines erneuten Verschlusses eines Blutgefäßes durch Verabreichung von Peptiden, die direkt die Blutplättchen-Aggregation hemmen.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel (I):
in der:
A' abwesend ist oder Asn, Gln, Ala oder Abu bedeutet;
A abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Arg, HArg, NArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Abu, Ala, Gly, His, Lys oder einem α-R'- substituierten Derivat davon, Dtc, Tpr oder Pro;
B eine D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus Arg, HArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Lys oder einem α-R'-substituierten Derivat davon;
Q abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Pro, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk)Pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle oder Na&sub1; oder einem α-R'-substituierten Derivat davon;
M abwesend ist oder Gly oder D- oder L-Glu, Phe, Pro, Lys, Ser oder, wenn n 1 ist, B-Gly-Glu-Q bedeutet;
W ein Halogenatom oder einen Alk-Rest bedeutet;
R' einen Alk-Rest oder PhCH&sub2; bedeutet;
Z&sub1; die folgenden Reste bedeutet
oder
Z&sub2; die folgenden Reste bedeutet
oder
wobei Z&sub1; und Z&sub2; über eine kovalente Bindung zwischen L¹ und L² verknüpft sind;
L¹ und L² -S- bedeuten;
X den Rest R&sub4;R&sub5;N bedeutet;
Y ein Wasserstoffatom, einen CONR&sub1;R&sub2;- oder einen CO&sub2;R&sub2;-Rest bedeutet;
R&sub1; und R&sub2; Wasserstoffatome, Alk- oder (CH&sub2;)pAr-Reste bedeuten;
R³ und R3' Wasserstoffatome, Alk-, (CH&sub2;)pAr-Reste oder zusammen die Gruppen -(CH&sub2;)&sub4;- oder -(CH&sub2;)&sub5;- bedeuten;
R&sub4; ein Wasserstoffatom oder einen Alk-Rest darstellt;
R&sub5; die Reste R&sub1;&sub1;, R&sub1;&sub1;CO, R&sub1;&sub1;OCO, R&sub1;&sub1;OCH(R11')CO, R&sub1;&sub1;NHCH(R11')CO, R&sub1;&sub1;SCH(R&sub1;&sub1;')CO, R&sub1;&sub1;SO&sub2; oder R&sub1;&sub1;SO bedeutet;
R&sub6; einen Alk-, OAlk-Rest, ein Halogenatom oder X bedeutet;
R&sub7; ein Wasserstoffatom, einen Alk-, OAlk-Rest, ein Halogenatom oder Y bedeutet;
R&sub8; und R8' Wasserstoffatome, Alk-, (CH&sub2;)pPh-, (CH&sub2;)pNph-Reste oder zusammen die Gruppen -(CH&sub2;)&sub4;- oder -(CH&sub2;)&sub5;- bedeuten;
R&sub9; ein Wasserstoffatom, einen Alk-Rest oder Y bedeutet;
R&sub1;&sub0; ein Wasserstoffatom oder einen Alk-Rest bedeutet;
R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub1;' Wasserstoffatome, C&sub1;&submin;&sub5;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl-, Ar-, Ar-C&sub1;&submin;&sub5;- alkyl- oder Ar-C&sub3;&submin;&sub7;-cycloalkyl-Reste darstellen;
Ar eine Phenyl-Gruppe oder eine mit einem oder zwei C&sub1;&submin;&sub5;-Alkyl-, Trifluormethyl-, Hydroxy-, C&sub1;&submin;&sub5;-Alkoxy-Resten oder Halogenatomen substituierte Phenyl-Gruppe ist;
Alk einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Rest bedeutet;
Het ein heterocyclischer Rest ist, ausgewählt aus Pyridin, Pyrrol, Pyrrolidin, Imidazol, Triazol, Thiophen, Furan und Thiazol, wobei L¹ sich in ortho-Stellung zu -CO- und L² sich in ortho-Stellung zu -NH- befindet;
n die Bedeutung 1 oder 2 hat; und
p die Bedeutung 0, 1, 2 oder 3 hat
und pharmazeutisch aktive Salze davon;
mit der Maßgabe, daß, wenn Z&sub1; -L¹-C(R&sub3;)(R3')-CH(X)-CO- ist, R&sub3; und R3' Wasserstoffatome oder Alk-Reste bedeuten oder zusammen die Gruppen -(CH&sub2;)&sub4;- oder -(CH&sub2;)&sub5;- darstellen, und wenn Z&sub2; -L²-C(R&sub8;)(R8')-CH(Y)-NH- ist, R&sub8; und R8' weder gleichzeitig Wasserstoffatome oder Alk-Reste sind noch zusammen die Gruppen -(CH&sub2;)&sub4;- oder -(CH&sub2;)- darstellen; und mit der Maßgabe, daß M nur dann abwesend ist, wenn Q abwesend ist und wenn Z&sub2; die folgende Bedeutung hat
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel (IA):
in der:
A' abwesend ist oder Asn, Gln, Ala oder Abu bedeutet;
A abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Arg, HArg, NArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Abu, Ala, Gly, His, Lys oder einem α-R'- substituierten Derivat davon, Dtc, Tpr oder Pro;
B MeArg bedeutet;
Q abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Pro, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk)Pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle oder Nal oder einem α-R'-substituierten Derivat davon;
M Gly oder D- oder L-Glu, Phe, Pro, Lys, Ser oder, wenn n 1 ist, B-Gly-Glu-Q bedeutet;
W ein Halogenatom oder einen Alk-Rest bedeutet;
R' einen Alk-Rest oder PhCH&sub2; bedeutet;
n die Bedeutung 1 oder 2 hat;
Alk ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Rest ist;
Z&sub1; und Z&sub2; zusammen eine kovalente Bindung zwischen dem Aminoterminalen Rest und dem Carboxy-terminalen Rest darstellen; und pharmazeutisch aktive Salze davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel zur Hemmung der Blutplättchen-Aggregation und Gerinnsel-Bildung, das eine Verbindung von Formel (I) oder (JA) oder eine Verbindung eines der Beispiele 1-9, 11; 12, 15, 16, 19 oder 21 (nachstehend als "ein erfindungsgemäßes Peptid" bezeichnet) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Hemmung der Blutplättchen-Aggregation bei einem Säuger, der dies benötigt, das die innerliche Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids umfaßt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verhinderung eines erneuten Arterien- oder Venenverschlusses bei einem Säuger nach Thrombolyse, das die innerliche Verabreichung einer wirksamen Menge eines fibrinolytischen Mittels und eines erfindungsgemäßen Peptids umfaßt. In Kombination mit bekannten Fibrinolytika, wie Streptokinase (SK), Urokinase (UK), Prourokinase (pUK) und dem Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) und Varianten oder Mutanten davon, eignen sich diese Verbindungen zur Verhinderung einer erneuten Thrombose.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel zur Herbeiführung einer Thrombolyse und Reperfusion und zur Verhinderung eines erneuten Arterien- oder Venenverschlusses bei einem Säuger, das ein Fibrinolytikum und ein erfindungsgemäßes Peptid in einem pharmazeutischen Träger umfaßt.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Verwendung in einem Verfahren zur Herbeiführung einer Thrombolyse-Therapie, der in einem Behälter ein Fibrinolytikum und ein erfindungsgemäßes Peptid umfaßt.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung offenbart cyclische Peptid-artige Verbindungen, die die Sequenz Gly-Asp umfassen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die Blutplättchen-Aggregation, wobei man annimmt, daß sie mit dem GPIIb-IIIa-Rezeptor und anderen Adhäsionsproteinen in Wechselwirkung treten.
In Verbindungen von Formel (I) bedeutet B zweckmäßigerweise Arg oder HArg oder ein α-R'-substituiertes Derivat von Arg oder HArg. Vorzugsweise ist B MeArg.
A ist vorzugsweise Dtc, Tpr oder Pro, wenn A' Asn, Gln, Ala oder Abu ist.
Y ist zweckmäßigerweise eine CONH&sub2;- oder CO&sub2;H-Gruppe.
Z&sub2; bedeutet zweckmäßigerweise
oder Pcs.
Z&sub1; bedeutet zweckmäßigerweise
oder Cys.
R&sub6; und R&sub7; sind zweckmäßigerweise Wasserstoffatome.
A' ist zweckmäßigerweise abwesend.
A bedeutet zweckmäßigerweise Sar oder ist abwesend.
In Verbindungen von Formel (IA) sind A und A' zweckmäßigerweise abwesend, n hat die Bedeutung 2 und Z&sub1; und Z&sub2; stellen zusammen eine kovalente Bindung dar.
Qist zweckmäßigerweise Ser, (Me)Ser, Thr, Tyr, Phe oder Nal, wenn n 2 ist. Q ist zweckmäßigerweise Phe.
Das in den Formeln der vorliegenden Beschreibung dargestellte X soll die Amino-Gruppe dieser Aminosäuren bedeuten. In gleicher Weise bedeutet Y die substituierte Carboxyl-Gruppe dieser Aminosäuren. Wenn Z&sub1; und Z&sub2; keine Aryl- Einheiten sind, können sie natürlich ein oder zwei chirale Zentren aufweisen, wobei die vorliegende Erfindung jede einzigartige nicht-razemische Verbindung umfaßt, die mit Hilfe herkömmlicher Verfahren synthetisiert und abgetrennt werden kann.
Wenn Z&sub1; und Z&sub2; Phenyl-Gruppen sind, befindet sich an Position 1 eine Mercapto- oder Alkylen-Gruppe, an Position 2 befindet sich die Amino-/- Carboxyl-Gruppe und sie können an den Positionen 3, 4 oder 5 mit R&sub6; oder R&sub7; substituiert sein. Wenn Z&sub1; und Z&sub2; Naphthyl-Gruppen sind, kann sich die Mercapto- oder Alkylen-Gruppe an Position 1 oder 2 befinden, die Amino-/- Carboxyl-Gruppe befindet sich in ortho-Orientierung, und sie können an einer beliebigen Position des Naphthyl-Rings weiter substituiert sein.
Het stellt einen substituierten heterocyclischen Rest dar. Typische heterocyclische Reste sind Pyridin, Pyrrol, Pyrrolidin, Imidazol, Triazol, Thiophen, Furan und Thiazol. Innerhalb des Peptids bilden solche heterocyclischen Reste über zwei in ortho-Stellung befindliche Substituenten einen makrocyclischen Ring. Beispielsweise ist Z&sub1; eine heterocyclische Carbonsäure, die durch die Carboxyl-Gruppe an das Peptid gebunden ist und über eine durch L¹ definierte, in ortho-Stellung befindliche Brücke an Z&sub2;. Ebenso kann Z&sub2; ein heterocyclisches Amin sein, das durch den Amin-Rest an das Peptid gebunden ist und über eine als L² definierte, in ortho-Stellung befindliche Brücke an Z&sub1;.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Rest ist so gemeint, daß er eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl- und Isobutyl-Gruppe umfaßt. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Ar bedeutet eine Phenyl-Gruppe oder eine Phenyl-Gruppe, die mit ein oder zwei C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Resten, Trifluormethyl-Gruppen, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Resten, Hydroxy-Gruppen oder Halogenatomen substituiert ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verbindungen, bei denen alle -CONH- Peptidbindungen durch eine isostere Bindung ersetzt sind. Beispiele für Peptidisostere sind -NHCO-, -CH=CH-, -CH&sub2;CH&sub2;-, -COCH&sub2;-, -COO-, -CHOHCH&sub2;-, -CH&sub2;NR&sub4;-, -CSNH- und -CH&sub2;S-.
Spezifische erfindungsgemäße Verbindungen sind:
Cyclo(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Cys-NH&sub2; (SEQ ID Nr. 1);
Nα-Ac-Cyclo(S,S)-Cys-Arg-Gly-Asp-Man (SEQ ID Nr. 2);
Cyclo(S,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Man;
Cyclo(S,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Pcs-NH&sub2; (SEQ ID Nr. 3);
Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-Arg-Gly-Asp-Man (SEQ ID Nr. 4);
Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-MeArg-Gly-Asp-Man (SEQ ID Nr. 5);
Cyclo-(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Man;
Cyclo-(S,S)-Mba-D-MeArg-Gly-Asp-Man;
NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(2R,35) Pcs-NH&sub2; (SEQ ID Nr. 6);
NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(2R,3R) Pcs-NH&sub2; (SEQ ID Nr. 7);
NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH&sub2; (SEQ ID Nr. 10);
NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH&sub2; (SEQ ID Nr. 11);
Cyclo(1α,6γ)-Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-Glu-NHZ (SEQ ID Nr. 14);
Cyclo-(1,8)-MeArg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe (SEQ ID Nr. 16).
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind:
Cyclo-(S,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Man;
Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-MeArg-Gly-Asp-Man (SEQ ID Nr. 5);
NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pcs (SEQ ID Nr. 18); und
Cyclo(1,8)-MeArg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe (SEQ ID Nr. 16).
In der vorliegenden Beschreibung wird die auf dem Fachgebiet allgemein verwendete Nomenklatur zur Beschreibung der Peptide verwendet.
Entsprechend der herkömmlichen Darstellung befindet sich der Amino- Terminus auf der linken Seite und der Carboxy-Terminus auf der rechten Seite. Soweit nicht anders angegeben, wird angenommen, daß alle chiralen Aminosäuren (AA) die absolute L-Konfiguration aufweisen. Pen ist L- Penicillamin oder β,β-Dimethylcystein, APmp bedeutet 2-Amino-3,3- cyclopentamethylen-3-mercaptopropionsäure, Dtc ist 5,5-Dimethylthiazolidin- 4-carbonsäure, Trp bedeutet Thiazolidin-4-carbonsäure, Mpa ist 3-Mercaptopropionsäure, Pmp ist 3,3-Cyclopentamethylen-3-mercaptopropionsäure, Mdp ist 3-Mercapto-3-methylbutansäure, Pcs ist 3-Phenylcystein, das in der Position 3 razemisch ist, (3S)Pcs ist (2R,3S)-3-Phenylcystein, (3R)Pcs ist (2R,3R)-3- Phenylcystein, Man ist 2-Mercaptoanilin, Mba ist 2-Mercaptobenzoesäure, HArg ist Homoarginin, NArg ist Norarginin, (Me&sub2;)Arg ist N',N"-Dimethylarginin, (Et&sub2;)Arg ist N',N"-Diethylarginin, Nva ist Norvalin, Nle ist Norleucin, α-MeAsp ist Nα-Methylasparaginsäure, Nal ist beta-2-Naphthylalanin, Phg ist Phenylglycin, HPhe ist Homophenylalanin, Abu bedeutet 2-Aminobuttersäure, (Alk)Tyr ist O-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyltyrosin, (Alk)Ser ist O-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylserin, (Alk)Thr bedeutet O-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthreonin, (Alk)Cys ist S-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylcystein, (Alk) Pen bedeutet S-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylpenicillamin, (4'W)Phe bedeutet Phenylalanin, das an der Position 4 des Phenyl-Rings mit W substituiert ist, t-Bu ist das tertiäre Butyl- Radikal, Boc ist das t-Butyloxycarbonyl-Radikal, Fmoc bedeutet das Fluorenylmethoxycarbonyl-Radikal, Ph ist das Phenyl-Radikal, Cbz ist das Carbobenzyloxy-Radikal, BrZ ist das o-Brombenzyloxycarbonyl-Radikal, Clz ist das o-Chlorbenzyloxycarbonyl-Radikal, Bzl ist das Benzyl-Radikal, 4-MBzl ist das 4-Methylbenzyl-Radikal, Ac ist die Acetyl-Gruppe, Alk ist ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Rest, Ph ist die Phenyl-Gruppe, Nph ist eine 1- oder 2-Naphthyl-Gruppe, cHex ist die Cyclohexyl-Gruppe, DCC ist Dicyclohexylcarbodümid, DMAP ist Dimethylaminopyridin, DIEA ist Diisopropylethylamin, EDC ist N-Ethyl-N'- (dimethylaminopropyl)-carbodümid, HOBT ist 1-Hydroxybenzotriazol, THF ist Tetrahydrofuran, DMF ist Dimethylformamid, PPA ist das cyclische Anhydrid der 1-Propanphosphonsäure, DPPA ist Diphenylphosphorylazid, BOP ist Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat, HF ist Fluorwasserstoffsäure und TFA ist Trifluoressigsäure.
Mit dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriff "Kupplungsreagenzien" sind Reagenzien bezeichnet, die zur Bildung von Peptidbindungen verwendet werden können. Typische Kupplungsreagenzien sind Carbodümide, aktivierte Anhydride und Ester und Acylhalogenide. Reagenzien, wie EDC, DCC, DPPA, PPA, das BOP-Reagenz, HOBT, N- Hydroxysuccinimid und Oxalylchlorid, sind typische Reagenzien.
α-R'-substituierte Derivate der erfindungsgemäßen Aminosäuren, die als (α-R')AA bezeichnet werden können, bezeichnen Aminosäuren, die an der α- Amino-Gruppe mit R' monosubstituiert sind, wobei R' ein Alk- Rest oder eine Benzyl-Gruppe ist. R' ist vorzugsweise eine Methyl-Gruppe. Nα-Methylarginin und Nα-Methylglycin, bei denen es sich um (α-Me)Arg bzw. (α-Me)Gly handelt, sind in der vorliegenden Beschreibung entsprechend dem früher üblichen Bezeichnungssystem auch als MeArg und Sar (Sarcosin) bezeichnet. Alle anderen N-α-substituierten Aminosäuren tragen in ihrer Darstellung die Kennzeichnung α-. Aminosäuren, die an einer Mercaptan-, Guanidino- oder Hydroxyl-Gruppe alkyliert sein können, wie Tyr, Ser, Thr, Cys oder Pen, lassen sich durch das Fehlen dieser Kennzeichnung unterscheiden. (α-Me)Ser ist daher Nα-Methylserin, (Me)Ser ist O-Methylserin, (α-Me,Et)Ser ist Nα-Methyl- O-ethylserin und (α-Me,Et&sub2;)Arg ist Nα-Methyl-N',N"-diethylarginin.
Die Peptide werden vorzugsweise mittels des Festphasen-Verfahrens von Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85 (1964), 2149) hergestellt, obwohl auf dem Fachgebiet bekannte, in Lösung durchgeführte Verfahren erfolgreich eingesetzt werden können. Man kann eine Kombination von Syntheseverfahren, die an Festphasen und in Lösung durchgeführt werden, verwenden, wie bei einer konvergierenden Synthese, bei der Di-, Tri-, Tetra- oder Pentapeptid-Fragmente mittels einer Festphasen-Synthese hergestellt werden können und mittels eines in Lösung durchgeführten Verfahrens entweder verknüpft oder weiter modifiziert werden können. Zur Erzeugung der meisten erfindungsgemäßen Peptide wurden die Peptidsynthese-Verfahren eingesetzt, die von Ali et al. in J. Med. Chem., 29 (1986), 984, und J. Med. Chem., 30 (1987), 2291, allgemein dargelegt sind, wobei sie durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen werden.
Die reaktiven funktionellen Gruppen der Seitenketten jeder Aminosäure oder jeden Peptids werden in geeigneter Weise geschützt, wie auf dem Peptid- Fachgebiet bekannt. Beispielsweise kann die Boc-, Cbz- oder Fmoc-Gruppe zum Schutz einer Aminogruppe, insbesondere einer α-Amino-Gruppe, verwendet werden. Die Boc-Gruppe ist zum Schutz der α-Amino-Gruppe allgemein bevorzugt. Ein t-Bu, cHex oder ein Benzylester kann zum Schutz der in der Seitenkette befindlichen Carboxyl-Gruppe von Asp oder Glu verwendet werden. Eine Benzyl-Gruppe oder eine in geeigneter Weise substituierte Benzyl-Gruppe wird zum Schutz der Mercapto-Gruppe von Cystein oder anderer Thiol-Gruppen enthaltender Reste oder der Hydroxyl-Gruppe von Serin oder Threonin verwendet. Die Tosyl-Gruppe kann zum Schutz der Imidazolyl-Gruppe von His und eine Tosyl- oder Nitro-Gruppe kann zum Schutz des Stickstoffs der Guanidino-Gruppe von Arg verwendet werden. Für die Hydroxyl-Gruppe von Tyr, Ser oder Thr oder die &epsi;-Amino-Gruppe von Lysin kann eine in geeigneter Weise substituierte Carbobenzyloxy-Gruppe oder Benzyl-Gruppe verwendet werden. Die Phthalamido-Gruppe kann zum Schutz der &epsi;-Amino-Gruppe von Lysin verwendet werden. Eine geeignete Substitution der Carbobenzyloxy- oder Benzyl-Schutzgruppen ist eine ortho- und/oder para-Substitution mit einem Chloratom, einem Bromatom, einer Nitro-Gruppe oder einer Methylgruppe und sie wird zur Modifikation der Reaktivität der Schutzgruppe verwendet. Cystein und andere Schwefel-haltige Aminosäuren können durch Bildung eines Disulfids mit einem Thioalkyl- oder Thioaryl-Rest auch geschützt werden. Abgesehen von der Boc-Gruppe handelt es sich bei den Schutzgruppen am zweckmäßigsten um solche, die durch eine schonende Säure-Behandlung nicht entfernt werden. Diese Schutzgruppen werden mittels Verfahren, wie katalytischer Hydrierung, Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder Behandlung mit HF, entfernt, wie auf dem Fachgebiet bekannt.
Bei Verwendung von Festphasenverfahren wird das Peptid schrittweise aufgebaut, wobei am Carboxy-Terminus angefangen wird und auf den Amino- Terminus des Peptids hin gearbeitet wird. Eine Festphasensynthese wird durch kovalente Anlagerung des C-Terminus einer geschützten Aminosäure an ein geeignetes Harz, wie ein Benzhydrylamin-Harz (BHA), Methylbenzhydrylamin- Harz (MBHA), Chlormethyl-Harz (CMR), Hydroxymethyl-Harz (HMR) oder SASRIN-Harz, begonnen, wie in dem US-Patent Nr. 4,244,946 allgemein dargelegt. Ein BHA- oder MBHA-Trägerharz wird verwendet, wenn der Carboxy- Terminus des Peptidproduktes ein Carboxamid sein soll. Wenn der Carboxy- Terminus des Peptidproduktes eine Carboxyl-Gruppe sein soll, wird im allgemeinen ein CMR-Träger verwendet, obwohl dieser auch zur Herstellung eines Carboxamids oder Esters verwendet werden kann.
Sobald die erste geschützte Aminosäure (AA) mit dem gewünschten Harz verknüpft worden ist, wird die Amino-Gruppe mittels einer schonenden Säure- Behandlung von der Schutzgruppe befreit und die freie Carboxyl-Gruppe der zweiten geschützten AA wird mit dieser Amino-Gruppe verknüpft. Ohne Isolierung des Zwischenproduktes wird dieses Verfahren schrittweise solange durchgeführt, bis sich das gewünschte Peptid gebildet hat. Das fertige Peptid kann dann in beliebiger Reihenfolge deblockiert und/oder vom Trägerharz abgespalten werden.
Eine Alkali-Behandlung eines an einen CMR-Träger gebundenen Peptids in wäßrigem Alkohol spaltet das Peptid vom Harz ab und führt dazu, daß die Carboxy-terminale Aminosäure als Carbonsäure produziert wird. Eine Behandlung eines an einen CMR-Träger gebundenen Peptids mit Ammoniak oder Alkylaminen in einem alkoholischen Lösungsmittel stellt ein Carboxamid oder Alkylcarboxamid am Carboxy-Terminus bereit.
Wenn ein Ester gewünscht ist, kann das CMR-Harz zur Abspaltung des Peptids vom Harz mit einem geeigneten Alkohol, wie einem Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- oder Benzylalkohol, in Gegenwart von Triethylamin behandelt werden, wobei der Ester direkt produziert wird.
Mittels herkömmlicher Verfahren können Ester der erfindungsgemäßen Peptide auch aus dem Carbonsäure-Vorläufer hergestellt werden. Typischerweise wird die Carbonsäure mit einem Alkohol in Gegenwart eines Säure-Katalysators behandelt. In einer anderen Ausführungsform kann die Carbonsäure in ein aktiviertes Acyl-Zwischenprodukt, wie ein Säurehalogenid, umgewandelt und mit einem Alkohol, vorzugsweise in Gegenwart einer Base, behandelt werden.
Verfahren zur Herstellung C-terminaler Peptid-Ester ahne Veresterung der Seitenketten-Carboxyl-Gruppe von Asparaginsäure sind etwas komplizierter, sind jedoch dem Peptidsynthese-Fachmann wohlbekannt. Beispielsweise wird die Synthese mit einem Ester der C-terminalen Aminosäure oder eines Dipeptids begonnen und dieser wird über eine Flüssigphasen-Synthese mit einem Asparaginsäure-Rest verknüpft, dessen Seitenkette in geeigneter Weise geschützt worden ist. Danach wird die Carboxyl-Gruppe der Seitenkette selektiv von der Schützgrupppe befreit und mit einem Chlormethyl-Harz (CMR) verknüpft. Die Amino-Gruppe wird freigesetzt und es wird eine Festphasen- Peptidsynthese eingesetzt. Durch eine anschließende Abspaltung vom Harz unter Verwendung von HF wird die gewünschte Seitenketten-Carbonsäure erzeugt, während der Carboxy-Terminus des Peptids als Ester verbleibt. Wenn man die synthetische Sequenz mit dem Alkylamid einer in geeigneter Weise geschützten Aminosäure oder eines in geeigneter Weise geschützten Dipeptids beginnt, erhält man in ähnlicher Weise das entsprechende C-terminale Alkylamid des Peptids.
Zur Herstellung von Estern und substituierten Amiden in einem solchen Verfahren stellen Benzylester und Halogen- oder Alkyl-substituierte Benzylester geeignete Schutzgruppen für die 4-Carboxyl-Gruppe von Asparaginsäure dar. Wenn die Amino-Gruppe durch die Boc-Gruppe geschützt wird, kann die Benzylester-Schutzgruppe mittels Hydrierung selektiv entfernt werden und es kann eine Verknüpfung mit einem CMR-Träger erfolgen.
Wenn Z&sub2; keine Carbonsäure-Einheit besitzt oder Benzyl- oder substituierte Benzyl-Schutzgruppen (wie die Hydroxyl-, Thiol- oder Amino-Gruppe) an der Aminosäure (oder dem Dipeptid) hängen, die vor Anlagerung an das Harz mit Asparaginsäure verknüpft werden soll, eignet sich ein t-Butylester oder eine andere säurelabile Gruppe zum Schutz der Carboxyl-Gruppe der Asparaginsäure-Seitenkette. In diesem Fall wird die Amino-Gruppe von Asparaginsäure mittels einer basenlabilen Gruppe, wie der Fluorenylmethoxycarbonyl-Einheit (Fmoc), geschützt. Nach dem in Lösungsphase erfolgten Verknüpfen von Asparaginsäure mit einem Anilin, Amin oder einer Aminosäure (oder einem Dipeptid) wird mittels einer schonenden Säure-Hydrolyse eine selektive Schutzgruppen-Entfernung des t- Butylesters erreicht und die Seitenketten-Carboxyl-Gruppe wird mittels herkömmlicher Verfahren mit dem Harz verknüpft. Zur anschließenden Festphasen-Peptidsynthese wird danach die Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe mittels einer milden Base entfernt. Dieses Verfahren ist besonders effektiv, wenn der terminale Rest Z&sub2; ein substituiertes oder unsubstituiertes o- Mercaptoarylamin ist, das keine Carboxyl-Substituenten trägt.
Das bevorzugte Verfahren zur Abspaltung eines Peptids vom Trägerharz besteht in der Behandlung des am Harztäger gebundenen Peptids mit wasserfreier HF in Gegenwart eines geeigneten Kationen-Einfangmittels, wie Anisol oder Dimethoxybenzol. Durch dieses Verfahren werden alle Schutzgruppen gleichzeitig entfernt, mit Ausnahme eines einen Thioalkyl-Rest schützenden Schwefelatoms, und das Peptid wird vom Harz abgespalten. Solchermaßen vom CMR Harz hydrolysierte Peptide sind Carbonsäuren, während die vom BHA-Harz abgespaltenen Peptide als Carboxamide erhalten werden.
Die cyclischen Disulfid-Verbindungen von Formel (I) werden aus einem entsprechenden linearen Peptid der Formel (II)
hergestellt, in der A', A, B, Q M und n wie vorstehend für Struktur (I) definiert sind,
Z&sub1; die folgenden Reste bedeutet
oder
und Z&sub2; die folgenden Reste bedeutet
oder
wobei beliebige chemisch reaktive Zentren gegebenenfalls, wie vorstehend beschrieben, geschützt sind und die Schwefel-Einheit von Z&sub1; oder Z&sub2; mit T¹ oder T² substituiert ist. T¹ und T² sind verdrängbare Gruppen, wie ein Thioalkyl- Rest, ein Thioaryl-Rest, eine substituierte Benzyl-Gruppe oder ein Wasserstoffatom. Beispiele für geeignete verdrängbare Gruppen sind Wasserstoff, ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-Rest, insbesondere eine Ethylthio-Gruppe, Benzyl-Gruppe und 4-Methylbenzyl-Gruppe. Vorzugsweise handelt es sich bei den T¹- und T²-Einheiten jeweils um ein Wasserstoffatom oder eine der T¹- und T²-Einheiten ist ein Wasserstoffatom und die andere ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-Rest.
Die Bildung der Disulfidbindung kann mit Hilfe eines von zwei allgemeinen Verfahren erreicht werden. Wenn die Schwefel-haltigen Aminosäuren des linearen Peptids in unterschiedlicher Weise so geschützt werden, daß die Bildung eines Monomercaptans ermöglicht wird, kann eine Cyclisierung durch eine Basen-katalysierte nucleophile Verdrängung der Schutzgruppe der zweiten Schwefel-haltigen Aminosäure erreicht werden. Gruppen, die als verdrängbare Schutzgruppen besonders geeignet sind, sind Thioalkyl- oder Thioaryl-Reste. Ein Beispiel für dieses Verfahren ist der Schutz einer Schwefelhaltigen Aminosäure durch die Thioethyl-Gruppe und der Schutz der zweiten durch eine substituierte Benzyl-Gruppe. Durch die Schutzgruppen-Entfernung bei einem solchen Peptid mittels HF wird die Benzyl-Gruppe einer Aminosäure entfernt, während die zweite Aminosäure als Ethyldisulfid geschützt bleibt. Durch Rühren dieser Mercapto-/Disulfidverbindung in einer verdünnten Lösung bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8 wird die Verdrängung der Thioethyl-Gruppe und die Cyclisierung des linearen Peptids bewirkt.
Wenn das entsprechende lineare Peptid von Formel (II) vollständig von Schutzgruppen befreit und als Dimercaptan erzeugt ist, kann ein beliebiges Oxidationsmittel angewendet werden, von dem auf dem Fachgebiet bekannt ist, daß es ein Dimercaptan in ein Disulfid umwandeln kann. Beispiele für solche Mittel sind ein Alkalimetallcyanoferrat(III), insbesondere Kalium- oder Natriumhexacyanoferrat(III), Sauerstoffgas, Dijodmethan oder Jod. Eine Behandlung einer Verbindung von Formel (II) mit einem Oxidationsmittel bewirkt daher eine Cyclisierung der Verbindung. Die Umsetzung wird in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, wie wäßrigem Methanol oder Wasser, bei Temperaturen von etwa 0ºC bis etwa 40ºC und bei einer hohen Verdünnung durchgeführt. Der pH-Wert wird meistens bei etwa 7 bis etwa 8 gehalten. Die Cyclisierung kann am Peptid durchgeführt werden, während es noch am Trägerharz gebunden ist oder während andere funktionelle Gruppen noch geschützt sind, sie wird jedoch vorzugsweise am freien, von Schutzgruppen befreiten Peptid durchgeführt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (III)
bereit, in der A', A, B, Q M, Z&sub1;, Z&sub2; und n wie vorstehend für Formel (I) definiert sind, umfassend:
a) die oxidative Cyclisierung einer Verbindung der Formel (II)
wobei A', A, B, Q M, Z&sub1;, Z&sub2; und n wie vorstehend für Formel (I) definiert sind und T¹ und T² Wasserstoffatome bedeuten, oder
b) die nucleophile Cyclisierung einer Verbindung der Formel (II) durch Behandlung mit einer Base, wobei A', A, B, Q M, Z&sub1;, Z&sub2; und n wie vorstehend für Formel (I) definiert sind und eine der beiden T¹- und T²-Einheiten eine verdrängbare Gruppe darstellt und die andere ein Wasserstoffatom ist.
Eine andere Gruppe von Verbindungen der Formel (IA) sind homodetische Peptide, in denen Z&sub1; und Z&sub2; zusammen eine kovalente Bindung bedeuten. Diese Peptide werden aus den linearen Peptiden der Formel (IV)
H-[A'-A-(B-Gly-Asp-Q-)n-M]-OH
(IV)
hergestellt, in der A', A, B, Q M und n wie vorstehend für Formel (IA) definiert sind. Diese linearen Peptide werden so hergestellt, daß die terminale Amino- Gruppe und die terminale Carboxyl-Gruppe des Peptides freigesetzt und cyclisiert werden, während die Carboxyl-Gruppe der Asp-Seitenkette geschützt bleibt. Eine Cyclisierung kann dann mit üblichen Reagenzien zur Bildung von Peptidbindungen, wie Carbodiimiden oder aktivierten Anhydriden, erreicht werden. Beispiele solcher Reagenzien sind Diphenylphosphorylazid, das BOP- Reagenz, das cyclische Anhydrid der 1-Propanphosphonsäure und DCC/HOBT. Es ist klar, daß die als H-[HN-AA-] bezeichnete terminale Amino-Gruppe von Peptid (IV) und die als [-AA-CO]-OH bezeichnete terminale Carboxyl-Gruppe an einen beliebigen Rest des Peptids (d. h. A', A, B, Gly, Asp, Q oder M) angelagert werden können, da die Bildung einer beliebigen Peptidbindung in den cyclischen Peptiden im letzten Schritt erreicht werden kann, wobei die gleiche Endverbindung hergestellt wird.
Wenn im Peptid Asp oder Glu vorhanden sind, besteht die Möglichkeit einer Cyclisierung entweder durch die Seitenketten-β-Carboxy-Gruppe (Asp) oder die γ-Carboxy-Gruppe (Glu) oder die terminale Carboxy-Gruppe der Aminosäure. Für Asp ist eine Cyclisierung durch die terminale Carboxy-Gruppe bevorzugt. Für Glu ist eine Cyclisierung durch die γ-Carboxy-Gruppe geeignet. Auf dem Fachgebiet sind allgemeine Verfahren zur Cyclisierung durch eine der beiden Carboxyl-Gruppen verfügbar, die in der vorliegenden Erfindung genauer erläutert sind.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IA) bereit, umfassend
i) die Cyclisierung einer Verbindung der Formel
H [A'-A-(B-Gly-Asp-Q)n-M]-OH
in der Z&sub1; und Z&sub2; zusammen eine kovalente Bindung bedeuten, H- und -OH die Amino- und Carboxyl-Reste von zwei beliebigen benachbarten Resten im cyclischen Peptid darstellen und A', A, B, Q M und n wie vorstehend definiert sind und beliebige, gegebenenfalls geschützte reaktive Gruppen aufweisen, mit einem Kupplungsreagenz, und
ii) Entfernung aller Schutzgruppen.
Eine Modifizierung der terminalen Amino-Gruppe des Peptids wird durch eine Alkylierung oder Acetylierung erreicht, wie allgemein auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Modifikationen können an der Aminosäure vor dem Einbau in das Peptid oder am Peptid nach dessen Synthese und Freisetzung der terminalen Aminogruppe durchgeführt werden, sollen jedoch vor Entfernung der Schutzgruppen vorgenommen werden.
Typischerweise wird eine Acetylierung an der freien Amino-Gruppe unter Verwendung des Acylhalogenids oder Anhydrids der entsprechenden Alkyl- oder Arylsäure in Gegenwart eines teriären Amins durchgeführt. Eine Monoalkylierung wird am zweckmäßigsten mittels einer reduktiven Alkylierung der Amino-Gruppe mit einem geeigneten aliphatischen Aldehyd oder Keton in Gegenwart eines schonenden Reduktionsmittels, wie Lithium- oder Natriumcyanoborhydrid, durchgeführt. Eine Dialkylierung kann mittels einer Behandlung der Amino-Gruppe mit einem Überschuß eines Alkylhalogenids in Gegenwart einer Base durchgeführt werden.
Eine Peptidsynthese in Lösung wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, die zur Bildung von Amid-Bindungen verwendet werden, erreicht. Typischerweise wird eine geschützte Boc-Aminosäure, die eine freie Carboxyl- Gruppe aufweist, unter Verwendung eines geeigneten Carbodiimid- Kupplungsmittels, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodümid (DCC), gegebenenfalls in Gegenwart von Katalysatoren, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und Dimethylaminopyridin (DMAP), mit einer geschützten Aminosäure verknüpft, die eine freie Amino-Gruppe aufweist. Andere Verfahren sind auch geeignet, wie die Bildung aktivierter Ester, Anhydride oder Säurehalogenide der freien Carboxyl-Gruppe einer geschützten Boc-Aminosäure und die anschließende Umsetzung mit dem freien Amin einer geschützten Aminosäure, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base. Beispielsweise wird eine geschützte Boc-Aminosäure oder ein geschützes Peptid in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran (THF), in Gegenwart einer Base, wie N-Methylmorpholin, DMAP oder ein Trialkylamin, mit Isobutylchlorformiat behandelt, wobei sich das "aktivierte Anhydrid" bildet, das anschließend mit dem freien Amin einer zweiten geschützten Aminosäure oder eines zweiten geschützten Peptids umgesetzt wird. Das mittels dieser Verfahren gebildete Peptid kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren am Amino- oder Carboxy-Terminus selektiv von Schutzgruppen befreit und unter Verwendung ähnlicher Verfahren mit anderen Peptiden oder Aminosäuren verknüpft werden.
Die erfindungsgemäßen α-R'-substituierten Aminosäure-Derivate, zu denen Derivate von Arg, HArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Ala, Gly, His, Abu, Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, Cys, (Alk)Cys, Pen, (Alk)Pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle und Nal gehören, werden mit Hilfe von Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Chemie üblich sind. Der R'-Substituent kann ein vorstehend definierter Alk-Rest oder eine Benzyl- Gruppe sein. Typische Verfahren zur Herstellung dieser Derivate sind in dem US-Patent Nr. 4,687,758; Cheung et al., Can. J. Chem., 55 (1977), 906; Freidinger et al., J. Org. Chem., 48 (1982), 77; und Shuman et al., Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Symposium (Herausgeber Rich, D., Gross, E.), (1981), 617, Pierce Chemical Co., Rockford, III, offenbart, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichungen durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird. Typischerweise wird eine Lösung der Cbz- oder Boc-Aminosäure in DMF/THF mit einem geeigneten Alkylhalogenid, wie Methyl- oder Ethyljodid, in Gegenwart einer Base, wie Natriumhydrid oder Kaliumhydrid, kondensiert. Zur Erleichterung der Umsetzung kann gegebenenfalls ein Kronenether, wie 18-Kronen-6 mit Kaliumhydrid, zugegeben werden. Wenn die Aminosäure eine funktionelle Gruppe, wie eine Hydroxyl-, Mercaptan-, Amino-, Guanidino-, Indolyl- oder Imidazolyl-Gruppe, trägt, werden im allgemeinen bei diesem Verfahren und den folgenden Verfahren diese Gruppen geschützt, wie vorstehend beschrieben. Daher wird Boc-Tyr(Bzl) mit Natriumhydrid und Methyljodid in einer THF/DMF-Lösung bei 0ºC behandelt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei Boc-(α-Me)Tyr(Bzl) erhalten wird.
In einer anderen Ausführungsform wird das freie Amin der Aminosäure mit einem geeigneten Aldehyd, wie Acetaldehyd oder Benzaldehyd, in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Natriumcyanoborhydrid, umgesetzt, um eine Monoalkylierung zu erreichen. Dieses Verfahren ist besonders zur Herstellung von α-Benzylaminosäuren geeignet. α-Benzylierte Aminosäuren lassen sich auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von α-Methylaminosäuren verwenden. Beispielsweise wird α-Methylarginin in drei Schritten hergestellt, indem 1) Arg(Tos) mit Benzaldehyd und Natriumcyanoborhydrid in einer Methanol-Lösung umgesetzt wird, wobei (α-Bzl)Arg(Tos) erhalten wird, 2) das benzylierte Produkt mit einer Formaldehyd/Ameisensäure-Lösung reduziert wird, wobei (α-Bzl, α-Met)Arg(.Tos) erhalten wird, und 3) die Benzyl-Gruppe mittels einer katalytischen Hydrierung (5% Pd/C in Eisessig/HCl) freigesetzt wird, wobei MeArg(Tos) erhalten wird.
α-R'-substituierte Derivate von Aminosäuren können auch mit Hilfe einer Reduktion von Oxazolidinonen hergestellt werden, die aus Fmoc- oder Cbz- Aminosäuren hergestellt worden sind. Typischerweise wird eine Fmoc- oder Cbz-Aminosäure mit einem geeigneten Aldehyd, wie Acetaldehyd oder Benzaldehyd, in Gegenwart von Toluolsulfonsäure in einer Toluol-Lösung erhitzt, wobei ein 2-substituiertes 5-Oxooxazolidin erzeugt wird. Mittels einer Reduktion dieses Oxazolidinons mit Triethylsilan und TFA in einer Chloroform- Lösung wird die α-substituierte Cbz- oder Fmoc-Aminosäure direkt erhalten. Dem Fachmann ist bekannt, daß bei Verwendung von Formaldehyd das Oxazolidinon an der Position 2 unsubstituiert ist und α-Methylaminosäuren produziert werden.
Säure-Additionssalze der Peptide werden standardmäßig in einem geeigneten Lösungsmittel aus der Stammverbindung und einem Überschuß an einer Säure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure oder Methansulfonsäure, hergestellt. Die Acetat-Salzform ist besonders geeignet. Bestimmte Verbindungen bilden innere Salze oder Zwitterionen, die akzeptabel sein können. Kationische Salze werden durch Behandlung der Stammverbindung mit einem Überschuß an einem alkalischen Reagenz, wie einem Hydroxid, Carbonat oder Alkoxid, das das entsprechende Kation enthält, oder mit einem geeigneten organischen Amin hergestellt. Kationen, wie Li&spplus;, Na&spplus;, K&spplus;, Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus; und NH&sub4;&spplus;, sind spezifische Beispiele für Kationen, die in den pharmazeutisch verträglichen Salzen vorkommen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Arzneimittel bereit, das ein erfindungsgemäßes Peptid und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Arzneimittel mit wie vorstehend beschrieben hergestellten Peptiden und anderen Peptiden oder Polypeptid-Derivaten von Fibronectin, Fibrinogen oder mit dem von Willebrand-Faktor können als Lösungen oder lyophilisierte Pulver zur parenteralen Verabreichung formuliert werden. Pulver können vor Verwendung durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder eines anderen pharmazeutisch verträglichen Trägers zubereitet werden. Eine flüssige Formulierung ist im allgemeinen eine gepufferte, isotonische, wäßrige Lösung. Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel sind eine normale isotonische Kochsalzlösung, eine 5%-ige Standard-Dextroselösung in Wasser oder eine gepufferte Natrium- oder Ammoniumacetat-Lösung. Eine solche Formulierung ist besonders zur parenteralen Verabreichung geeignet, kann jedoch auch zur oralen Verabreichung verwendet werden oder in einem Dosierungs-Inhalationsapparat oder -Zerstäuber zur Insufflation enthalten sein. Die Zugabe von Excipienten, wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose, Akaziengummi, Polyethylenglykol, Mannit, Natriumchlorid oder Natriumcitrat, kann wünschenswert sein.
In einer anderen Ausführungsform können diese Peptide eingekapselt, tablettiert oder in einer Emulsion oder einem Sirup zur oralen Verabreichung zubereitet werden. Zur Verbesserung oder Stabilisierung der Zusammensetzung oder zur Erleichterung der Herstellung der Zusammensetzung können pharmazeutisch verträgliche feste oder flüssige Träger zugegeben werden. Feste Träger umfassen Stärke, Lactose, Calciumsulfat-Dihydrat, Terra alba, Magnesiumstearat oder Stearinsäure, Talkum, Pectin, Akaziengummi, Agar oder Gelatine. Flüssige Träger umfassen Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Kochsalzlösung und Wasser. Der Träger kann auch ein Material mit verzögerter Wirkstoffabgabe, wie Glycerinmonostearat oder Glycerindistearat, allein oder in Kombination mit einem Wachs umfassen. Die Menge eines festen Trägers ist unterschiedlich, liegt jedoch vorzugsweise bei etwa 20 mg bis etwa 1 g pro Dosierungseinheit. Die Arzneimittel werden hergestellt, indem nach den herkömmlichen pharmazeutischen Verfahren gearbeitet wird, zu denen für Tablettenformen Mahlen, Mischen, Granulieren und im Bedarfsfall Zusammenpressen oder für Hartgelatine-Kapselformen Mahlen, Mischen und Einfüllen gehören. Bei Verwendung eines flüssigen Trägers liegt das Präparat in Form eines Sirups, Elixiers, einer Emulsion oder einer wäßrigen oder nichtwäßrigen Suspension vor. Ein solches Flüssigpräparat kann direkt p.o. verabreicht oder in eine Weichgelatine-Kapsel gefüllt werden.
Zur rektalen Verabreichung können die erfindungsgemäßen Peptide auch mit Excipienten, wie Kakaobutter, Glycerin, Gelatine oder Polyethylenglykolen, kombiniert und zu einem Zäpfchen verpresst werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Hemmung der Blutplättchen-Aggregation und Gerinnsel-Bildung bei einem Säuger, insbesondere dem Menschen, bereit, das die innerliche Verabreichung eines erfindungsgemäßen Peptids und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers umfaßt. Indikationen für eine solche Therapie umfassen akuten Herzinfarkt (AMI), tiefe Venenthrombose, Lungenembolie, Aneurysma dissecans, vorübergehende ischämische Attacken (TIA), Schlaganfall und andere mit einem Infarkt zusammenhängende Störungen sowie unstabile Angina. Auf eine solche Behandlung sprechen wahrscheinlich chronische oder akute Zustände einer gesteigerten Aggregationsneigung an, wie disseminierte intravasculäre Gerinnung (DIC), Septikämie, Schock nach einer Operation oder Infektion, postoperatives Trauma und Geburtstrauma, operativer Herz-Lungen-Bypass, inkompatible Bluttransfusion, Abruptio placentae, thrombotische thrombocytopenische Purpura (TTP), Schlangengift- und Immunerkrankungen. Außerdem können die erfindungsgemäßen Peptide bei einem Verfahren zur Prävention metastatischer Zustände verwendet werden.
Das Peptid wird dem Patienten entweder oral oder parenteral so verabreicht, daß die Konzentration des Medikamentes im Plasma zur Hemmung der Blutplättchen-Aggregation ausreicht. Das das Peptid enthaltende Arzneimittel wird in einer Dosis von etwa 0,2 mg/kg bis etwa 50 mg/kg in einer Weise verabreicht, die dem Zustand des Patienten entspricht. Zur kurzfristigen Therapie ist eine parenterale Verabreichung bevorzugt. Für hartnäckige Zustände einer gesteigerten Aggregationsneigung ist eine intravenöse Infusion des Peptids in 5%-iger Dextrose in Wasser oder normaler Kochsalzlösung am effektivsten, obwohl eine intramuskuläre Bolus-Injektion ausreichend sein kann.
Für chronische, jedoch nicht-kritische Zustände gesteigerter Blutplättchen-Aggregationsneigung ist die orale Verabreichung einer Kapsel oder Tablette oder eine intramuskuläre Bolus-Injektion geeignet. Das Peptid wird ein- bis viermal täglich in einer Dosis von etwa 0,4 mg/kg bis etwa 50 mg/kg verabreicht, wobei eine tägliche Gesamt-Dosis von etwa 0,4 mg/kg/Tag bis etwa 200 mg/kg/Tag erreicht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt darüberhinaus ein Verfahren zur Verhinderung eines erneuten Arterien- oder Venenverschlusses nach einer fibrinolytischen Therapie bereit, das die innerliche Verabreichung eines erfindungsgemäßen Peptids und eines fibrinolytischen Mittels umfaßt. Es hat sich herausgestellt, daß die Verabreichung eines Peptids zur fibrinolytischen Therapie entweder einen erneuten Verschluß ganz verhindert oder die Zeit bis zu einem erneuten Verschluß verlängert.
Der Begriff "fibrinolytisches Mittel" soll bei Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine beliebige Verbindung bedeuten, die direkt oder indirekt die Lyse eines Fibrin-Gerinnsels bewirkt, unabhängig davon, ob es sich um ein natürliches oder synthetisches Produkt handelt. Plasminogenaktivatoren sind eine wohlbekannte Gruppe fibrinolytischer Mittel. Geeignete Plasminogenaktivatoren umfassen beispielsweise Anistreplase, Urokinase (UK), Prourokinase (pUK), Streptokinas e (SK), Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) und Mutanten oder Varianten davon, die die Plasminogenaktivator-Aktivität beibehalten, wie Varianten, die chemisch modifiziert worden sind oder bei denen eine oder mehrere Aminosäuren angelagert, deletiert oder ersetzt worden sind oder bei denen eine oder mehrere funktionelle Domänen angelagert, deletiert oder verändert worden sind, wie mittels Kombination der aktiven Stelle eines Plasminogenaktivators mit der Fibrinbindungs-Domäne eines anderen Plasminogenaktivators oder Fibrin-bindenden Moleküls. Andere Beispiele für Varianten umfassen tPA-Moleküle, bei denen eine oder mehrere Glycosylierungsstellen verändert worden sind. Unter den Plasminogenaktivatoren sind tPA-Varianten bevorzugt, bei denen die Aminosäure-Primärsequenz in der Wachstumsfaktor-Domäne so verändert worden ist, daß die Serum-Halbwertszeit des Plasminogenaktivators erhöht wird. tPA-Wachstumsfaktor-Varianten sind beispielsweise von Robinson et al. in EP-A 0 297 589 und Browne et al. in EP-A U 240 334 und in GB 8815135.2 offenbart. Andere Varianten umfassen Hybridproteine, wie die in EP 0 028 489, EP 0 155 387 und EP 0 297 882 offenbarten, die allesamt durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen sind. Anistreplase stellt ein bevorzugtes Hybridprotein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung dar. Fibrinolytische Mittel können aus natürlichen Quellen isoliert werden, werden jedoch im allgemeinen mittels traditioneller gentechnischer Verfahren produziert.
Geeignete Formulierungen von tPA, SK, UK und pUK sind beispielsweise in EP-A 0 211 592 (US-Patent Serien-Nr. 890,432), der Deutschen Patentanmeldung Nr. 3032606, EP-A 0 092 182 und dem US-Patent Nr. 4,568,543 offenbart, die allesamt durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen sind. Typischerweise kann das fibrinolytische Mittel in einer wäßrigen, gepufferten, isotonischen Lösung formuliert werden, wie Natrium- oder Ammoniumacetat oder -Adipat, die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 5,5 gepuffert sind. Weitere Excipienten, wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose, Akaziengummi, Polyethylenglykol, Mannit und Natriumchlorid, können auch zugegeben werden. Eine solche Zusammensetzung kann lyophilisiert werden.
Das Arzneimittel kann mit dem Peptid und dem Fibrinolytikum im gleichen Behälter formuliert werden, eine Formulierung in verschiedenen Behältern ist jedoch bevorzugt. Bei Bereitstellung beider Mittel in Form einer Lösung können sie in einem Infusions-/Injektionssystem zur gleichzeitigen Verabreichung oder in einer Tandemanordnung enthalten sein.
Indikationen für eine solche Therapie umfassen Herzinfarkt, tiefe Venenthrombose, Lungenembolie, Schlaganfall und andere mit einem Infarkt zusammenhängende Störungen. Das Peptid wird kurz vor, gleichzeitig mit oder kurz nach der parenteralen Verabreichung von tPA oder eines anderen fibrinolytischen Mittels verabreicht. Es kann sich als wünschenswert erweisen, die Behandlung mit dem Peptid über eine längere Zeitspanne nach Wiederherstellung der Reperfusion fortzuführen, um einen erneuten Verschluß nach der Therapie weitestgehend zu verhindern. Die wirksame Dosis von tPA, SK, UK oder pUK kann bei 0,5 mg/kg bis 5 mg/kg liegen und die Dosis des Peptids kann etwa 0,1 mg/kg bis 25 mg/kg betragen.
Zur zweckmäßigen Verabreichung des Inhibitors und des fibrinolytischen Mittels zur gleichen Zeit oder zu unterschiedlichen Zeiten wird ein Kit hergestellt, der in einem einzelnen Behälter, wie einer Dose, einer Schachtel oder einem anderen Behälter, einzelne Flaschen, Beutel, Arzneifläschchen oder anderen Behälter umfaßt, wobei jede(r) eine wie vorstehend beschriebene wirksame Menge des Inhibitors zur parenteralen Verabreichung und eine wie vorstehend beschriebene wirksame Menge von tPA oder eines anderen fibrinolytischen Mittels zur parenteralen Verabreichung aufweist. Ein solcher Kit kann beispielsweise beide Arzneimittel, gegebenenfalls als lyophilisierte Pulver, in separaten Behältern oder im gleichen Behälter umfassen sowie Behälter für zur Zubereitung bestimmte Lösungsmittel. Eine Abänderung davon besteht darin, die zur Zubereitung bestimmte Lösung und das lyophilisierte Pulver in zwei Kammern eines einzigen Behälters unterzubringen und sie bei Verwendung zu mischen. Bei einer solchen Anordnung können das Fibrinolytikum und das Peptid separat verpackt werden, wie in zwei Behältern, oder sie können zusammen als Pulver lyophilisiert und in einem einzigen Behälter bereitgestellt werden.
Bei Bereitstellung beider Mittel in Form einer Lösung können sie in einem Infusions-/Injektionssystem zur gleichzeitigen Verabreichung oder in einer Tandern-Anordnung enthalten sein. Beispielsweise kann der Blutplättchen- Aggregations-Inhibitor in einer intravenös injizierbaren Form oder in einem Infusionsbeutel vorliegen, der über eine Schlauchleitung mit dem fibrinolytischen Mittel in einem zweiten Infusionsbeutel in Reihe verbunden ist. Unter Verwendung eines solchen Systems kann ein Patient eine erste Injektion vom Bolus-Typ oder eine erste Infusion des Peptid-Inhibitors erhalten, der eine Infusion des fibrinolytischen Mittels folgt.
Die pharmakologische Aktivität des Peptids wurde mit Hilfe der folgenden Tests beurteilt:

In vivo-Hemmung der Blutplättchen-Aggregation

Eine in vivo-Hemmung der Thrombus-Bildung wird gezeigt, indem nach dem in Aiken et al., Prostaglandins, 19 (1980), 629-643, beschriebenen Verfahren die systemischen und hämodynamischen Wirkungen einer Peptid- Infusion bei narkotisierten Hunden aufgezeichnet werden.

Hemmung der Blutplättchen-Agure ation

Von unbehandelten erwachsenen Hundemischlingen wurde Blut (zur Verhinderung der Koagulation mit Citrat versetzt) gesammelt. Durch 10- minütige Zentrifugation bei 150 · g bei Raumtemperatur wurde Blutplättchenreiches Plasma (PRP) präpariert. Durch 10-minütige Zentrifugation des PRP bei 800 · g wurden die Blutplättchen gewaschen. Das so erhaltene Zellpellet wurde zweimal in Tyrode-Puffer (pH 6,5) ohne Ca&spplus;&spplus; gewaschen und in einer Konzentration von 3 · 10&sup5; Zellen/ml in 1,8 mM Ca&spplus;&spplus; enthaltendem Tyrode- Puffer (pH 7,4) resuspendiert. Bei allen Blutplättchenaggregations-Tests wurden die Peptide 3 min vor dem Agonisten zugegeben. Die Agonisten- Endkonzentrationen betrugen 0,1 Einheit Thrombin/ml und 2 mM ADP (Sigma). Die Aggregation wurde in einem Chrono-Log-Lumi-Aggregometer kontrolliert. Die Lichtdurchlässigkeit 5 min nach Zugabe des Agonisten wurde zur Berechnung der prozentualen Aggregation nach der Formel:
% Aggregation = [(90-CR) + (90 - 10)] · 100
verwendet, wobei CR der Diagramm-Wert ist, 90 die Grundlinie bedeutet und 10 der PRP-Kontrollwert ist. IC&sub5;&sub0;-Werte wurden durch graphisches Auftragen von [% Aggregations-Hemmung] gegen [Peptid-Konzentration] bestimmt. Die Peptide wurden in einer Konzentration von 200 mM getestet und schrittweise um den Faktor 2 verdünnt, um eine geeignete Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen.
Zur Beurteilung der Peptid-Stabilität gegen Plasma-Proteasen wurden die Peptide 3 h (und nicht 3 min) vor Zugabe des Agonisten im PRP inkubiert. Die Verbindungen der Beispiele 1-21 zeigten für die ADP-stimulierte Aggregation von Hunde-Blutplättchen einen IC&sub5;&sub0;-Wert von etwa 0,1 uM bis 50 uM. Bevorzugte Verbindungen weisen einen IC&sub5;&sub0;-Wert von weniger als 10 uM auf.
Die folgenden Beispiele sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise beschränken, sondern werden nur zur Veranschaulichung der Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen aufgeführt. Für den Fachmann sind viele andere Ausführungsformen ohne weiteres ersichtlich und verfügbar.

BEISPIELE

In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben. Aminosäureanalysen erfolgten auf einer Dionex-autoion-100- Vorrichtung. Die Analyse des Peptidgehalts basiert auf einer Aminosäureanalyse. Massenspektren-Bestimmungen wurden auf einem VG- Zab-Massenspektrometer durchgeführt, wobei ein Beschuß mit schnellen Atomen erfolgte. Zur Dünnschichtchromatographie wurden Platten mit EM- Kieselgeldünnschichten (0,25 mm) verwendet. ODS bedeutet einen Octadecylsilyl-Kieselgel-Chromatographieträger. Die zur Darstellung der Elutionsmittel-Zusammensetzung verwendeten Abkürzungen sind wie folgt: n- BuOH - n-Butanol, HoAc - Essigsäure, H&sub2;O - Wasser, EtOAc - Ethylacetat, i-ProH - Isopropanol, P - Pyridin und CA - Chloressigsäure. HPLC-Analysen wurden auf einem Beckman 344-Gradienten-Chromatographiesystem mit einem CRIB- Aufzeichnungsintegrator entweder mit einem isokratischen oder einem kontinuierlichen Gradienten durchgeführt. Festphasen-Peptidsynthesen wurden unter Verwendung einer automatisierten Beckman 990- Synthesevorrichtung durchgeführt. Wo angegeben, basiert die Reinheit des Peptids auf einer Auswertung des HPLC-Chromatogramms. MeArg wurde mittels des von Ali et al. in dem US-Patent Nr. 4,687,758 (1987) offenbarten Verfahrens hergestellt.

Beispiel 1

Herstellung von Cyclo(S,S)-(2-Mercapto)benzoyl-arginyl-glycyl-aspartylcysteinamid [Cyclo-(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Cys-NH&sub2;] (SEO ID Nr.:1)

Allgemeines Verfahren zur Festphasen-Peptidsynthese an einem Benzhydrylamin-Harz
Peptidamide wurden mittels einer Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung eines Benzhydrylamin-Harzes als Träger synthetisiert. Geschützte Aminosäuren wurden schrittweise so lange angelagert, bis die gewünschte Sequenz erhalten wurde, wobei vom Carboxyl-Terminus begonnen wurde. Zum Schutz der alpha-Amino-Gruppe wurde die t-Butyloxycarbonyl (Boc)-Gruppe verwendet. Funktionelle Seitenketten-Gruppen wurden wie folgt geschützt: Arginin und Histidin mit der Tosyl (Tos)-Gruppe; Cystein und 3-Phenylcystein mit der p-Methylbenzyl (MBzl)- oder Ethylthio (SEt)-Gruppe; Serin und Threonin mit Benzylether (Bzl); Lysin mit der p-Chlorcarbobenzoxy (ClZ)- Gruppe; Glutaminsäure und Asparaginsäure mit Benzylester (OBzl) oder Cyclohexylester (O-dllex); Tyrosin mit der p-Bromcarbobenzoxy (BrZ)-Gruppe. Die Boc-Gruppe wurde durch Behandlung mit 50%-iger Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid entfernt. Das Amin-TFA-Salz wurde durch Behandlung mit 7%-igem Diisopropylethylamin (DIEA) in Methylenchlorid neutralisiert. Aminosäuren wurden mit dem länger werdenden Peptid unter Verwendung von 3 Äquivalenten einer Boc-Aminosäure und 3 Äquivalenten 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in DMF und 3 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Methylenchlorid verknüpft. Die Vollständigkeit der Verknüpfung wurde mittels eines Ninhydrin-Tests überprüft und im Bedarfsfall wurden die Verknüpfungen wiederholt. Die allgemeine Vorgehensweise ist nachstehend angegeben.
1. Waschen mit Methylenchlorid 1 · 1 min
2. Waschen mit 50%-iger TFA 1 · 1 min
3. Entfernung der Schutzgruppen mit 50%-iger TFA 1 · 20 min
4 Waschen mit Methylenchlorid 6 · 1 min
5. Neutralisierung mit 7%-igem DIEA 3 · 2 min
6. Waschen mit Methylenchlorid 4 · 1 min
7. Waschen mit Dimethylformamid 2 · 1 min
8. Boc-AA + HOBt in DMF nicht abtropfen lassen
9. DCC in Methylenchlorid 2 h
10. Waschen mit Dimethylformamid 2 · 1 min
11. Waschen mit Methylenchlorid 3 · 1 min
Zur Anlagerung des ersten (C-terminalen) Restes an das BHA-Harz wurde die Synthese bei Schritt S begonnen. Bei allen nachfolgenden Aminosäuren wurde die Synthese bei Schritt 1 begonnen.

a) 2-S-Ethylmercaptobenzoesäure

Zu mit Argon gespültem Hexan (50 ml) wurden Ethanthiol (3,7 ml, 50 mmol) und Sulfurylchlorid (4,0 ml, 50 mmol) zugegeben und die Lösung wurde 30 min gerührt. Toluol (100 ml) wurde zugegeben und unmittelbar danach wurde 2- Mercaptobenzoesäure (7,71 g, 50 mmol) zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt und das feste Produkt präzipitierte. Der Feststoff wurde filtriert, getrocknet und einer Chromatographie unterworfen (Kieselgel, Ethylacetat), wobei die Titelverbindung als brauner Feststoff (3,8 g, 36%) erhalten wurde.

b) Cyclo-(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Cys-NH&sub2; (SEO ID Nr.: 1)

Das geschützte Peptid-Harz-Zwischenprodukt Mba(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(O- Bzl)-Cys(4-MBzl)-MBHA wurde mittels des Festphasenverfahrens an einem 4- Methylbenzhydrylamin-Harz unter Verwendung einer automatischen Beckman-990-Synthesevorrichtung im Maßstab von 1,0 mmol synthetisiert. Alle Aminosäuren wurden an der Amino-Gruppe mit der t-Butyloxycarbonyl- Gruppe geschützt und unter Verwendung von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid/1- Hydroxybenzotriazol (DCC/HOBt) schrittweise miteinander so verknüpft, wie von All et al. in J. Med. Chem., 30 (1987), 2291, und J. Med. Chem., 29 (1986), 984, dargelegt. Nach Verknüpfung der letzten Aminosäure wurde das Peptid vom Harz unter Verwendung von wasserfreier HF (20 ml) in Gegenwart von Anisol (2,0 ml) 30 min bei 0ºC abgespalten, wobei die Seitenketten von den Schutzgruppen befreit wurden. Nach Eindampfen von HF im Vakuum wurde der Rückstand mit wasserfreiem Ether gewaschen, das Rohpeptid wurde mit 0,2 M Essigsäure extrahiert und der Extrakt wurde mit deionisiertem Wasser auf 2l verdünnt. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 8-9 eingestellt. Zur Entfernung des produzierten Ethylmercaptans wurde Stickstoff durch die Lösung hindurchgeperlt. Das Cyclisierungsverfahren erfolgte innerhalb von 24 h - 48 h. Die Umsetzungslösung wurde lyophilisiert, wobei ein Feststoff (320 mg) erhalten wurde. Mittels Chromatographie (Umkehrphasen-Säule bei mittlerem Druck, 10% Acetonitril/H&sub2;O - 0,1% TFA) wurde ein partiell gereinigtes Produkt bereitgestellt. Eine weitere Aufreinigung unter Verwendung einer Sephadex®-G-25- Filtration (0,2 M Essigsäure) führte zur Titel-Verbindung. MS (FAB) [M+H]&spplus; 583; TLC: Rf = 0,22 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,48 (B : W : I : C, 65 : 20 : 15 : 3); HPLC: k' = 2,2 (Vydac-218-TP-ODS-Säule, 12% Acetonitril/H&sub2;O - 0,1% TFA, UV- Nachweis bei 220 nm), k' = 3,6 (Vydac-218-TP-ODS-Säule, Gradient, A: Acetonitril, B : H&sub2;O - 0,19% TFA; 0-50% A während 10 min. UV-Nachweis bei 220 nm); Peptidgehalt: 45%; Aminosäureanalyse: Asp (0,94), Gly (1,00), Arg (0,42), Cys (0,53).

Beispiel 2

Herstellung von Nα-Acetyl-cyclo(S,S)-cysteinyl-arginyl-glycyl-aspartyl-(2- mercapto)phenylamid [Cyclo-(S,S)-Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Man] (SEQ ID Nr.:2)

a) 2-(4-Methylbenzyl)thioanilin (Man-4-MBzl)

Einer Lösung von 2-Thioanilin (5,0 ml, 42 mmol) in Ethanol (50 ml) wurde unter Argon Triethylamin (5,9 ml, 423 mmol) zugegeben. Danach wurde α- Brom-p-xylol (7,78 g, 42 mmol) in Ethanol (50 ml) tropfenweise zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde 1 h gerührt, im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, mit wasserfreiem Ether verdünnt und zur Entfernung von Triethylaminhydrobromid filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockene konzentriert, wobei ein gelbes Öl (5 g, 52%) erhalten wurde. Mittels Chromatographie (Kieselgel, 20% Ethylacetat/Hexan) wurde die Titel- Verbindung als gelbes Öl (4,26 g) erhalten.

b) Fmoc-Asp(O-tBu)-Man(4-MBzl)

Fmoc-Asp(O-tBu) (5,0 g, 122 mmol) wurde in THF (50 ml) gelöst, N- Methylmorpholin (1,3 ml, 118 mmol) wurde zugegeben und die Lösung wurde unter Argon 10 min in einem Ethanol-/Eisbad gekühlt. Isobutylchloroformiat (1,6 ml, 123 mmol) wurde zugegeben, das Umsetzungsgemisch wurde 5 min gerührt und anschließend erfolgte die Zugabe einer Lösung von Man(4-MBzl) (2,8 g, 122 mmol) in THF (50 ml). Das gekühlte Umsetzungsgemisch wurde 40 min und dann 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Das präzipitierte Amin-Salz wurde filtriert und das Filtrat wurde zu einem öligen Material eingedampft. Das Öl wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst und mit 1 M HCl (2 · 50 ml), einer gesättigten Salzlösung (1 · 50 ml), einer 10%-igen Natriumcarbonat-Lösung (1 · 50 ml) und einer gesättigten Salzlösung (1 · 50 ml) gewaschen. Danach wurde es getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem orangefarbenen Öl konzentriert. Eine Kristallisation aus Methanol ergab die gewünschte Verbindung in Form eines weißen Feststoffs (3,93 g, 26%). Schmp. 129ºC - 130ºC. H&sub2;O

c) Fmoc-Asn-Man(4-MBzl)

Ein Gemisch aus Fmoc-Asp(O-tBu)-Man(4-MBzl) (3,5 g) und 50% TFA in Methylenchlorid (50 ml) wurde 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und das Produkt wurde durch Zugabe von Ether präzipitiert. Der Feststoff wurde gesammelt und an der Luft getrocknet, wobei ein weißer Feststoff (2,23 g, 70%) erhalten wurde. Schmp. 155ºC - 156ºC.

d) Fmoc-Asp(O-Bzl-Harz)-Man(4-MBzl)

Einem gequollenen und gewaschenen Hydroxymethyl-Harz (1,0 g, 1 mmol, CH&sub2;Cl&sub2;) wurde eine Lösung von Fmoc-Asp-Man(4-MBzI) (1,42 g, 2,5 mmol) und DCC (10 ml, 0,3 M in CH&sub2;Cl&sub2;) in Dioxan (25 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18 h gerührt und schrittweise mit CH&sub2;Cl&sub2;, einem 1 : 1-Gemisch von CH&sub2;Cl&sub2; : EtOH und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Das nicht-umgesetzte Hydroxymethyl-Harz wurde unter Verwendung von Benzoylchlorid (0,5 ml) in CH&sub2;Cl&sub2; 30 min blockiert. Das Harz wurde, wie vorstehend angegeben, schrittweise gewaschen und getrocknet, wobei das an das Harz gebundene Peptid (2,16 g) erhalten wurde.

e) Nα-Acetyl-cyclo(S,S)-Cys-Ara-Gly-Asp-Man (SEO ID Nr.: 2)

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 (b) wurde das geschützte Peptid-Harz-Zwischenprodukt Nα-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-Bzl-Harz)- Man(4-MBzl) aus Asp(O-Bzl-Harz)-Man(4-MBzl) hergestellt, indem Boc-Gly, Boc- Arg(Tos) und Boc-Cys(SEt) schrittweise damit verknüpft wurden. Nach Verknüpfen der letzten Aminosäure wurde die terminale Boc-Gruppe mit TFA entfernt und das Peptid wurde unter Verwendung eines Gemisches aus Essigsäureanhydrid (10 Äquivalente) und Diisopropylethylamin (10 Äquivalente) in Dimethylformamid acetyliert. Das Peptid wurde vom Harz gespalten, cyclisiert und isoliert, wie in Beispiel 1 (b) angegeben, wobei das Rohpeptid (310 mg) bereitgestellt wurde. Mittels Chromatographie (ODS- Umkehrphasen-Säule bei mittlerem Druck, 10% Acetonitril : H&sub2;O - 0,1% TFA) wurde das Titel-Peptid (24 mg) bereitgestellt. MS (FAB) [M+H]&spplus; 597,2; TLC: Rf = 0,57 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,23 (n-BuOH : H&sub2;O : i-ProH : CA 65 : 20: 15 : 3); HPLC: k' = 4,9 (Vydac-218-Tp-ODS-Säule, 10% Acetonitril/H&sub2;O - 0,1%TFA, UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 4,5 (Vydac-218-Tp-ODS-Säule, Gradient, A : Acetonitril, B : H&sub2;O - 0,1%TFA, 0% - 50% A während 15 min. UV-Nachweis bei 220 nm); Peptidgehalt: 44,6%; Aminosäureanalyse: Asp (1,00), Gly (1,03), Arg (0,94), Cys (0,5).

Beispiel 3

Herstellung von Cyclo(S,S)-(2-Mercapto)benzoyl-(Nα-methyl)arginyl-glycylaspartyl-(2-mercapto)phenylamid [Cyclo-(S,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Man]

Das geschützte Peptid-Harz-Zwischenprodukt Mba(SEt) -MeArg(Tos)-Gly- Asp(O-Bzl-Harz)-Man(4-MBz1) wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 angegeben, im Maßstab von 1,0 mmol hergestellt, abgespalten und cyclisiert. Nach Beendigung der Cyclisierung ließ man die wäßrige Phase über eine Säule von Arnberlite®-XAD-2 (1 : 1 Acetonitril : H&sub2;O - 0,1% TFA) laufen und dann wurde sie konzentriert und lyophilisiert, wobei ein Rohpeptid (100 mg) bereitgestellt wurde. Mittels Chromatographie (ODS-Umkehrphasen-Säule bei mittlerem Druck, 30% Acetonitril/H&sub2;O - 0,1% TFA) wurde die Titel-Verbindung (14 mg) erhalten. MS(FAB) m/e [M+H]&spplus; 602,3; TLC: Rf = 0,63 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1); HPLC: k' = 3,2 (Vydac-218-TP-ODS-Säule, 20% Acetonitril/H&sub2;O - 0,1% TFA, Nachweis bei 220 nm), k' = 2,3 (Vydac-218-TP-ODS-Säule, Gradient, A : Acetonitril, B : H&sub2;O - 0,1%TFA, 20% - 50% A während 10 min. Nachweis bei 220 nm); Peptidgehalt: 79%; Aminosäureanalyse: Asp (1,00), Gly (1,21).

Beispiel 4

Herstellung von Cyclo-(S,S)-(2-Mercapto)benzyl-(Nα-methyl)arginyl-glycylaspartyl-(2-mercapto)phenylamid [Cyclo-(S,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Man]

a) Boc-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer kalten Lösung von Boc-Asp(O-cHex) (31,5 g, 100 mmol) in THF (500 ml) und N-Methylmorpholin (13,1 g, 120 mmol) wurde Isobutylchloroformiat (15,6 ml, 1,2 mmol) tropfenweise zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und eine Lösung von Man(4-MBz1) (22,0 g, 96 mmol) in THF (500 ml) wurde zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Umsetzungsgemisch filtriert und das Filtrat wurde zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (500 ml) gelöst und nacheinander mit 5%-iger wäßriger Citronensäure (3 · 150 ml), Wasser (1 · 400 ml), einer 10%-igen wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung (1 · 400 ml), Wasser (1 · 400 ml) und einer gesättigten Salzlösung (1 · 300 ml) gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet (wasserfreies K&sub2;CO&sub3;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel- Verbindung (53 g) erhalten wurde.

b) Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Boc-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl) (52 g) wurde mit 50% TFA/Methylenchlorid (400 ml) 45 min bei Raumtemperatur behandelt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und zur Entfernung von TFA-Spuren mehrmals mit Methylenchlorid behandelt. Nach Zugabe von Ether präzipitierte das Produkt in Form seines TFA-Salzes. Der Feststoff wurde gesammelt und an der Luft getrocknet, wobei ein weißer Feststoff (46,7 g, 88%) erhalten wurde.

c) Boc-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer kalten Lösung von Asp(O-Hex)-Man(4-MBzl) (46,7 g, 86,4 mmol) in DMF (100 ml) wurde Diisopropylethylamin (15 ml, 86,1 mmol) zugegeben. N- Hydroxybenzotriazol (14,0 g, 104 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-Gly (16,6 g, 94,8 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde in der Kälte wenige Minuten gerührt und N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodümid (18,2 g, 94,9 mmol) wurde zugegeben. Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde auf ein kleines Volumen konzentriert und in 1,5 l wäßrige 10%-ige K&sub2;CO&sub3;-Lösung gegossen. Das präzipitierte Produkt wurde mittels Filtration gesammelt und mit Wasser so lange gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war, wobei die Titel-Verbindung (50,6 g) bereitgestellt wurde.

d) Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 4 (c) (11,7 g, 20 mmol) wurde, wie in Beispiel 4(b) beschrieben, mit 50% TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (80 ml) behandelt, wobei die Titel- Verbindung in einer Menge von 12,4 g erhalten wurde.

e) Boc-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 4(d) (12,4 g, 20 mmol) in DMF (20 ml) wurde DIEA (3,6 ml, 20 mmol) zugegeben. HOBt (3,4 g, 20 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-N-MeArg(Tos) (10,1 g, 22 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde mehrere Minuten gerührt und EDC (4,4 g, 22 mmol) wurde portionsweise zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde auf ein kleines Volumen konzentriert und in eine 10%-ige wäßrige K&sub2;CO&sub3;-Lösung gegossen. Der erhaltene Feststoff wurde mittels Filtration gesammelt und mit Wasser so lange gewaschen, bis ein neutraler pH- Wert erreicht war, wobei die Titel-Verbindung (20,4 g) bereitgestellt wurde.

f) MeArg (Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 4(e) (17,7 g, 19,5 mmol) wurde, wie in Beispiel 4(b) beschrieben, mit 50% TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (80 ml) behandelt, wobei das TFA-Salz der Titel-Verbindung bereitgestellt wurde.

g) Mba(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHexl-Man(4-MBzl)

Einer kalten Lösung der Verbindung von Beispiel 4(f) (20 mmol) in DMF (20 ml) wurde DIEA (3,5 ml, 22 mmol) tropfenweise zugegeben. Mba(SEt) (4,6 g, 22 mmol) und EDC (4,2 g, 22 mmol) wurden nacheinander zugegeben und anschließend erfolgte die Zugabe von 4-N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP) (2,9 g, 24 mmol). Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und das Rühren wurde weitere 24 h fortgesetzt. Weitere Portionen von Mba(SEt) (4,6 g, 22 mmol), DMAP (2,9 g, 24 mmol) und EDC (4,2 g, 22 mmol) wurden zugegeben und das Rühren wurde weitere 24 h fortgesetzt, um die Umsetzung zum Abschluß zu bringen. Das Umsetzungsgemisch wurde konzentriert, der Rückstand wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und die Lösung wurde nacheinander mit Wasser, 5%-iger wäßriger Citronensäure, Wasser und einer gesättigten Salzlösung gewaschen. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und zu einem Feststoff (19,1 g) konzentriert. Mittels Chromatographie (Kieselgel, 10% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;) wurde die Titel- Verbindung (9,0 g) bereitgestellt.

h) Cyclo-(S,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Man

Das geschützte lineare Peptid von Beispiel 4(g) (8,5 g, 8,5 mmol) wurde mit wasserfreier HF (90 ml) und Anisol (8,5 ml) 1 h bei 0ºC behandelt. HF wurde bei 0ºC unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Ether gewaschen, wobei ein brauner Feststoff (5,0 g) erhalten wurde. Der Feststoff wurde in Wasser (16 ml) gelöst und der pH-Wert wurde unter Verwendung von Ammoniumhydroxid auf 8,0 eingestellt. Zur Entfernung des erzeugten Ethylmercaptans wurde Stickstoff durch die Lösung hindurchgeperlt. Nach 7 Tagen ließ man die wäßrige Lösung über eine Amberlite®-XAD-2-Säule (50% Methanol/H&sub2;O) laufen, wobei nach Lyophilisierung 3,0 g Material erhalten wurden. Eine weitere Aufreinigung mittels Flash-Chromatographie (ODS- Umkehrphasen-Säule bei mittlerem Druck, 21% Acetonitril/H&sub2;O - 0,1% TFA) ergab 2,3 g eines partiell aufgereinigten Materials. Durch eine Endreinigung unter Verwendung einer Sephadex -G-15-Gelfiltration (0,2 M Essigsäure) wurde die Titel-Verbindung (1,0 g) bereitgestellt.

Beispiel 5

Herstellung von Cyclo(S,S)-(2-Mercapto)benzoyl-(Nα-methyl)arginyl-glycylaspartyl-(3-phenyl)cysteinamid [Cyclo-(S,S)-Mba-MeAru-Gly-Asp-Pcs-NH&sub2;] (SEO ID Nr.: 3)

Diastereomeres 3-Phenylcystein wird nach dem von Nagai et al. in Peptide Chemistry (Herausgeber M. Ueki), Proceedings of the 26th Symposium on Peptide Chemistry, Tokyo, (24. - 26. Oktober 1988), Seiten 247-252, Protein Research Foundation, Minoh-shi, Osaka, beschriebenen Verfahren hergestellt. Unter Verwendung von Standardverfahren wird dieses Material in S-(4- Methoxyphenyl)-N-(t-butoxycarbonyl)-3-phenylcystein umgewandelt. Das geschützte Peptid-Harz-Zwischenprodukt Mba(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-Bzl)- Pcs(4-MBzl)-MBHA wird mit Hilfe des Festphasen-Verfahrens an 4- Methylbenzhydrylamin-Harz synthetisiert. Alle Aminosäuren werden an der Amino-Gruppe durch die t-Butyloxycarbonyl-Gruppe geschützt und unter Verwendung von N,N-Dicyclohexylcarbodümid/l-Hydroxybenzotriazol (DCC/HOBt) schrittweise gekuppelt, wie in Beispiel 1 dargelegt. Nach Verknüpfung der letzten Aminosäure wird das Peptid unter Verwendung von wasserfreier HF (20 ml) in Gegenwart von Anisol (2,0 ml) 30 min bei 0ºC vom Harz abgespalten, wobei die Schutzgruppen der Seitenketten entfernt werden. Nach Eindampfen von HF im Vakuum wird der Rückstand mit wasserfreiem Ether gewaschen, das Rohpeptid wird mit 0,2 M Essigsäure extrahiert und der Extrakt wird mit deionisiertem Wasser auf 2l verdünnt. Der pH-Wert der wäßrigen Phase wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 7-8 eingestellt und Stickstoff wird durch die Lösung hindurchgeperlt. Nach 24 h - 48 h wird die Umsetzungslösung lyophilisiert, wobei ein Rohprodukt erhalten wird. Mittels Chromatographie (Umkehrphasen-Säule bei mittlerem Druck, Acetonitril/H&sub2;O - 0,1% TFA) wird das Titel-Produkt bereitgestellt.

Beispiel 6

Herstellung von Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-Arg-Gly-Asp-Man (SEO ID Nr.: 4)

a) Boc-Asp(O-cHexl-Man(4-MBzl)

Einer kalten Lösung von Boc-Asp(O-cHex) (31,5 g, 100 mmol) und N- Methylmorpholin (13,1 g, 120 mmol) in THF (500 ml) wurde Isobutylchlorformiat (15,6 ml, 1,2 mmol) tropfenweise zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und danach wurde eine Lösung von Man(4-MBzl) (22,0 g, 96 mmol) in THF (500 ml) zugegeben. Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung (mittels TLC kontrolliert) wurde das Amin-Salz abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (500 ml) gelöst und nacheinander mit 5%iger wäßriger Citronensäure (3 · 150 ml), Wasser (1 · 400 ml), einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung (1 · 300 ml), Wasser (1 · 400 ml) und einer gesättigten Salzlösung (1 · 30 ml) gewaschen. Die organische Lösung wurde getrocknet (wasserfreies K&sub2;CO&sub3;), filtriert und konzentriert, wobei das Titel-Produkt (53 g) erhalten wurde.

b) Aso(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Boc-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl) (1) (52 g) wurde mit einer 50%-igen TFA- Lösung in Methylenchlorid (400 ml) 45 min bei Raumtemperatur behandelt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, der Rückstand wurde zur Entfernung von TFA- Spuren mehrmals einer azeotropen Destillation aus Methylenchlorid unterworfen und das Produkt wurde durch Zugabe von Ether präzipitiert. Der Feststoff wurde gesammelt und an der Luft getrocknet, wobei ein weißer Feststoff (46,7 g, 88%) erhalten wurde.

c) Boc-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer kalten Lösung der Verbindung von Beispiel 6b (46,7 g, 86,4 mmol) in DMF (100 ml) wurde DIEA (15 ml, 86,1 mmol) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (14,0 g, 104 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-Gly (16,6 g, 94,8 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten in der Kälte gerührt und danach wurde EDC (18,2 g, 94,9 mmol) portionsweise zugegeben. Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde auf ein kleines Volumen konzentriert und in 1,5 l wäßrige 10%-ige K&sub2;CO&sub3;-Lösung gegossen. Das präzipitierte Produkt wurde mittels Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen, wobei die Titel- Verbindung (50,6 g) erhalten wurde.

d) Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 6c (2,92 g, 5 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6b mit 50% TFA (80 ml) behandelt, wobei die Titel-Verbindung (2,93 g, 98%) erhalten wurde.

e) Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 6d (1,4 g, 2,3 mmol) in DMF (4 ml) wurde DIEA (410 ul, 2,3 mmol) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (380 mg, 2,76 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-Arg(Tos) (1,2 g, 1,32 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und dann wurde EDC (493 mg, 1,32 mmol) zugegeben. Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies K&sub2;CO&sub3;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (1,91 g) erhalten wurde.

f) Arg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 6e (1,9 g, 2,1 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6b mit 50% TFA (10 ml) behandelt, wobei die Titel- Verbindung (1,59 g) erhalten wurde.

g) Boc-Sar-Ara(Tos)-Gly-Asp(O-cHexl-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 6f (0,8 g, 2,3 mmol) in DMF (2 ml) wurde DIEA (153 ul) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (143 mg, 2,76 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-Sar (183 mg, 2,53 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und danach wurde EDC (186 mg, 2,53 mmol) portionsweise zugegeben. Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Dann wurde es zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies K&sub2;CO&sub3;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (0,78 g) erhalten wurde.

h) Sar-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-dHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 6g (780 mg, 0,8 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6b mit 50% TFA (5 ml) behandelt, wobei die Titel- Verbindung (500 mg) erhalten wurde.

i) Mba(SEt)-Sar-Arg(Tos)-Gly-Asn(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 6h (0,85 g, 0,5 mmol) in DMF (2 ml) wurde DIEA (89 ul) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (248 mg, 1,8 mmol) wurde zugegeben und anschließend Mba(SEt) (394 mg, 0,55 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und danach wurde EDC (353 mg, 0,55 mmol) portionsweise zugegeben. Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Danach wurde es zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x), 5%-iger Citronensäure (2 x), Wasser (3 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (0,45 g) erhalten wurde.

j) Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-Arg-Gly-Asp-Man (SFO ID Nr.: 4)

Das geschützte lineare Peptid von Beispiel 6i (423 mg) wurde mit wasserfreier HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) 1 h bei 0ºC behandelt. Die HF wurde bei 00C unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Ether zerrieben. Der Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, wobei das cyclisierte Rohpeptid (235 mg) erhalten wurde. Es wurde mittels Gelfiltration (Sephadex -G-15, 1% Essigsäure/Wasser) aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei die halbaufgereinigte Titel- Verbindung (65 mg) erhalten wurde. Ein Aliquot des halbaufgereinigten Peptids (18 mg) wurde mittels präparativer HPLC (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, 10 mm · 25 cm, 20% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm) aufgereinigt, wobei die aufgereinigte Titel-Verbindung (6,0 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 659,1 [M+H]&spplus;; HPLC: k' = 6,6 (5 u-Altex- Ultrasphere®-ODS, 4,5 mm · 25 cm, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 10% - 50% Acetonitril in 20 mm, UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 6,9 (Altex-Ultrasphere®-ODS, 20% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (1,00), Gly (1,03), Arg (1,11).

Beispiel 7

Herstellung von Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-MeArg-Gly-Asp-Man (SEO ID Nr.: 5)

a) Boc-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 6d (0,6 g, 1,0 mmol) in DMF (42 ml) wurde DIEA (130 ul, 2,2 mmol) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (165 mg, 1,2 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-MeArg(Tos) (0,5 g, 1,1 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und danach wurde EDC (210 mg, 1,2 mmol) zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Es wurde zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x), 5%-iger Citronensäure (2 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (780 mg, 86%) erhalten wurde.

b) MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 7a (789 mg, 0,86 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6b mit 50% TFA (4 ml) behandelt, wobei die Titel- Verbindung erhalten wurde.

c) Boc-Sar-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 7b (0,8 g, 0,86 mmol) in DMF (2 ml) wurde DIEA (153 ul) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (143 mg, 1,03 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-Sar (183 mg, 0,95 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und EDC (186 mg, 0,95 mmol) wurde zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde 18 h gerührt. Das Umsetzungsgemisch wurde zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x), 1 N HCl (1 x), Wasser (3 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (0,65 g) erhalten wurde.

d) Sar-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 7c (650 mg, 0,8 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6b mit 50% TFA (5 ml) behandelt, wobei die Titel- Verbindung (S 10 mg) erhalten wurde.

e) Mba(SEt)-Sar-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 6d (0,5 g, 0,5 mmol) in DMF (2 ml) wurde DIEA (120 ml, 0,6 mmol) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (150 mg, 0,55 mmol) wurde zugegeben und anschließend Mba(SEt) (394 mg, 0,55 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und danach wurde EDC (2 60 mg, 0,55 mmol) portionsweise zugegeben. Man ließ sich das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde es 18 h gerührt und zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x), 5%-iger Citronensäure (2 x), Wasser (3 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel- Verbindung (0,46 g) erhalten wurde.

f) Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-MeArg-Gly-Asn-Man (SE ID Nr.: 5)

Das geschützte lineare Peptid von Beispiel 7d (450 mg) wurde mit wasserfreier HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) 1 h bei 0ºC behandelt. HF wurde bei 0ºC unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Ether zerrieben. Der Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, wobei das cyclisierte Rohpeptid (268 mg) erhalten wurde. Es wurde mittels Gelfiltration (Sephadex®- G-15, 1% Essigsäure/Wasser) aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei das halbaufgereinigte Peptid erhalten wurde. Ein Aliquot des halbaufgereinigten Peptids (65 mg) wurde mittels HPLC (5 u- Altex-Ultrasphere®-ODS, 10 mm · 25 cm, 20% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm) weiter aufgereinigt, wobei die Titel- Verbindung (6,0 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 673,2 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,68 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,74 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 11,8 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - O,1% Trifluoressigsäure, 10% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 8,6 (Altex Ultrasphere®-ODS, 20% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (1,04), Gly (1,00).

Beispiel 8

Herstellung von Cyclo-(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Man

a) Mba(SEt)-Arg(Tosl-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 6f (0,80 g, 0,88 mmol) in DMF (2 ml) wurde DIEA (153 ul) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. Mba(SEt) (380 mg, 0,97 mmol) wurde zugegeben, das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und EDC (340 rng, 0,97 mmol) und anschließend 4-Dimethylaminopyridin (215 mg) wurden zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde es 18 h gerührt und zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x), 5%-iger Citronensäure (2 x), Wasser (3 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (0,41 g) erhalten wurde.

b) Cyclo-(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Man

Das geschützte lineare Peptid von Beispiel 8b (223 mg) wurde mit wasserfreier HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) 1 h bei 0ºC behandelt. HF wurde bei 0ºC unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Ether zerrieben. Der Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, wobei das cyclisierte Rohpeptid (92 mg) erhalten wurde. Ein Aliquot (20 mg) wurde mittels HPLC (5 u- Altex-Ultrasphere -ODS, 10 mm · 25 cm, 18% Acetonitril/Wasser - O,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm) aufgereinigt, wobei die aufgreinigte Titel- Verbindung (5,0 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 588 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,68 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1) und 0,70 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 6 (5 u.-Altex-Ultrasphere -ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 10% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 3,6 (5 u-Altex-Ultrasphere -ODS, 20% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (0,81), Gly (1,28), Arg (1,00).

Beispiel 9

Herstellung von Cyclo-(S,S)-Mba-D-MeArg-Gly-Asn-Man

a) Boc-D-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 7d (0,6 g, 1,0 mmol) in DMF (42 ml) wurde DIEA (130 ul, 2,2 mmol) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. HOBt (202 mg, 1,5 mmol) wurde zugegeben und anschließend Boc-D-MeArg(Tos) (0,663 g, 1,5 mmol). Das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und danach wurde EDC (288 mg, 1,5 mmol) zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde es 18 h gerührt und zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x); 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x), 5%iger Citronensäure (2 x), Wasser (3 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (500 mg) erhalten wurde.

b) D-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Die Verbindung von Beispiel 9a (500 mg, 0,5 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6b mit 50% TFA (5 ml) behandelt, wobei die Titel- Verbindung (658 mg) erhalten wurde.

c) Mba(SEt)-D-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)

Einer eiskalten Lösung der Verbindung von Beispiel 9b (658 mg, 0,71 mmol) in DMF (4 ml) wurde DIEA (120 ml, 0,85 mmol) zugegeben, um den pH-Wert auf einen neutralen Wert zu bringen. Mba(SEt) (306 mg, 1,42 mmol) wurde zugegeben, das Umsetzungsgemisch wurde wenige Minuten gerührt und EDC (274 mg, 1,42 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (174 mg, 1,42 mmol) wurden zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde es 18 h gerührt und zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser (1 x), 10% K&sub2;CO&sub3; (2 x), Wasser (1 x), 5%-iger Citronensäure (2 x), Wasser (3 x) und einer Salzlösung (1 x) gewaschen. Der Ethylacetat-Extrakt wurde getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (0,37 g) erhalten wurde.

d) Cyclo-(S,S)-Mba-D-MeArg-Gly-Asp-Man

Das geschützte lineare Peptid von Beispiel 9c (370 mg) wurde mit wasserfreier HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) 1 h bei 0ºC behandelt. HF wurde bei 0ºC unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Ether zerrieben. Der Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, wobei das cyclisierte Rohpeptid (246 mg) erhalten wurde. Es wurde mittels Gelfiltration (Sephadex®- G-15, 1% Essigsäure/Wasser) gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei die gereinigte Titel-Verbindung (13 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 602 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,74 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,68 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 6,7 (5 u-Altex- Ultrasphere®-ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 10% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 6,1 (5 u-Altex- Ultrasphere®-ODS, 21% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV- Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (1,00), Gly (1,21).

Beispiel 11

Herstellung von NαAc-cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(2R,3S)Pcs-NH&sub2; (SE ID Nr.: 6)

Das geschützte Pentapeptid-Harz Boc-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)- (2R,3S)-Phenylcystein(4-MBzl)-MeBHA wurde nach Beispiel 1 im Maßstab von 0,5 mmol hergestellt. Nach Entfernung der N-terminalen Boc-Gruppe mit 50% TFA in Methylenchlorid und Neutralisierung des erhaltenen TFA-Salzes mit 7% DIEA in Methylenchlorid wurde das an das Harz gebundene Peptid mit Essigsäureanhydrid (0,47 ml) und DIEA (0,86 ml) in Methylenchlorid (20 ml) 40 min acetyliert.
Mittels einer 50-minütigen Behandlung mit wasserfreier flüssiger HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) bei 0ºC wurde das Peptid vom Harz gespalten, wobei die Seitenketten-Schutzgruppen entfernt wurden. Nach Entfernung von HF unter Vakuum wurde das Harz mit Ethylether gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Harz wurde dann mit 1% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) und anschließend 10% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit deionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 7,65 eingestellt. Eine Cyclisierung erfolgte durch Hindurchperlen eines Inertgases, wie Argon, in dem die freie Sulfhydryl-Gruppe, die durch die Abspaltung der MBzI-Gruppe erzeugt wurde, die eines der Schwefelatome schützt, die SEt-Gruppe verdrängt, die das andere Schwefelatom schützt. Das Cyclisierungs-Verfahren dauerte 48 h bis 72 h. Die Lösung wurde einer Chromatographie unterworfen (ODS-Kieselgel, Stufengradient: a) Wasser, b) 12% Acetonitril - 0,1% TFA - Wasser). Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde aus 1% Essigsäure/Wasser lyophilisiert, wobei das gereinigte Titel-Peptid (80 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 682,2 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,56 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,61 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 13,1 (5 u-Altex- Ultrasphere®-ODS, Gradient, A:Acetonitril, B: Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 0% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 5,7 (5 u-Altex- Ultrasphere®-ODS, 15% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV- Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (0,97), Gly (1,00), Cys (0,38), β- Phenyl-Cys (0,63).

Beispiel 12

Herstellung von NαAc-cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(2R,3R)Pcs-NH&sub2; (SE ID Nr.: 7

Das geschützte Pentapeptid-Harz Boc-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)- (2R,3R)-3-Phenylcystein(4-MBzl)-MeßHA wurde nach Beispiel 1 im Maßstab von 0,5 mmol hergestellt. Nach Entfernung der N-terminalen Boc-Gruppe mit 50% TFA in Methylenchlorid und Neutralisierung des erhaltenen TFA-Salzes mit 7% DIEA in Methylenchlorid wurde das an das Harz gebundene Peptid mit Essigsäureanhydrid (0,47 ml) und DIEA (0,86 ml) in Methylenchlorid (20 ml) 40 min acetyliert.
Mittels einer 50-minütigen Behandlung mit wasserfreier HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) bei OoC wurde das Peptid vom Harz gespalten, wobei die Seitenketten-Schutzgruppen entfernt wurden. Nach Entfernung von HF unter Vakuum wurde das Harz mit Ethylether gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Harz wurde dann mit 1% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) und anschließend 10% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit deionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,65 eingestellt und durch Hindurchperlen von Argon durch die Lösung erfolgte eine Cyclisierung (Argon vertreibt Ethanthiol, das durch die freie Sulfhydryl-Gruppe von Pcs, die die Cystein-Sulfhydryl-Gruppe schützende SEt-Gruppe nucleophil verdrängt, freigesetzt wird). Nach 72 h wurde die Lösung einer Chromatographie unterworfen (ODS-Kieselgel, Stufengradient: a) Wasser, b) 11% Acetonitril/Wasser - 0,1% TFA). Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde aus 1% Essigsäure/Wasser lyophilisiert, wobei das Titel-Peptid (92 mg) erhalten wurde.
MS (FAB) m/e 682 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,70 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), 0,67 (n- BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 8,35 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 0% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 4,45 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, 12% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm);
Aminosäureanalyse: Asp (1,00), Gly (0,96), Cys (0,38), β-Phenyl-Cys (0,56).

Beispiel 15

Herstellung von NaAc-cyclo-(S,S)-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-MeArg-Gly-Asp-Ser- Cys-NH&sub2; (SEO ID Nr.: 10)

Das geschützte Dekapeptid-Harz Boc-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)- Ser(Bzl)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Ser(Bzl)-Cys(4MBzl)-MeBHA wurde nach Beispiel 1 im Maßstab von 1,0 mmol hergestellt. Nach Entfernung der Nterminalen Boc-Gruppe mit 50% TFA in Methylenchlorid und Neutralisierung des erhaltenen TFA-Salzes mit 7% DIEA in Methylenchlorid wurde das an das Harz gebundene Peptid mit Essigsäureanhydrid (0,94 ml) und DIEA (1,72 ml) in DMF (30 ml) 40 min acetyliert.
Mittels einer 50-minütigen Behandlung mit wasserfreier flüssiger HF (30 ml) in Gegenwart von Anisol (3 ml) bei 0ºC wurde das Peptid vom Harz gespalten, wobei die Seitenketten-Schutzgruppen entfernt wurden. Nach Entfernung von HF unter Vakuum wurde das Harz mit Ethylether gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Harz wurde dann mit 1% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) und anschließend 10% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit deionisiertem Wasser auf 1,5 l verdünnt. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,9 eingestellt und Argon wurde 72 h durch das Umsetzungsgemisch hindurchgeperlt. Die Lösung wurde lyophilisiert, wobei ein Rohpeptid (409 mg) erhalten wurde. Ein Aliquot (209 mg) wurde mittels Gelfiltration (Sephadex®-G- 15, 1% Essigsäure/Wasser) aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei die gereinigte Titel-Verbindung (20 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 1108,3 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,23 (n- BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,45 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 5,6 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 0% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 0,6 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, 10% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (2,11), Gly (2,06), Cys (1,84), Ser (2,00), Arg (0,84).

Beispiel 16

Herstellung von NαAc-cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly-Asp-Ser- Cys-NH&sub2; (SEO ID Nr.: 11)

Das geschützte Dekapeptid-Harz Boc-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex) - Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-cHex)-Ser(Bzl)-Cys(4MBzl)-MeBHA wurde nach Beispiel 1 im Maßstab von 1,0 mmol hergestellt. Nach Entfernung der Nterminalen Boc-Gruppe mit 50% TFA in Methylenchlorid und Neutralisierung des erhaltenen TFA-Salzes mit 7% DIEA in Methylenchlorid wurde das an das Harz gebundene Peptid mit Essigsäureanhydrid (0,94 ml) und DIEA (1,72 ml) in DMF (30 ml) 40 min acetyliert.
Mittels einer 50-minütigen Behandlung mit wasserfreier flüssiger HF (10 ml) in Gegenwart von Anisol (1 ml) bei 0ºC wurde das Peptid vom Harz gespalten, wobei die Seitenketten-Schutzgruppen entfernt wurden. Nach Entfernung von HF unter Vakuum wurde das Harz mit Ethylether gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Harz wurde dann mit 1% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) und anschließend 10% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit deionisiertem Wasser auf 1,5 l verdünnt. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,6 eingestellt und Argon wurde 72 h durch das Umsetzungsgemisch hindurchgeperlt. Die Lösung wurde wurde einer Chromatographie unterworfen (ODS-Kieselgel, Stufengradient: a) Wasser, b) 5% Acetonitril - 0,1% TFA - Wasser). Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde aus 1% Essigsäure/Wasser lyophilisiert, wobei ein halbaufgereinigtes Peptid (800 mg) erhalten wurde. Ein Aliquot (200 mg) wurde mittels Gelfiltration (Sephadex®-G-15, 1% Essigsäure/Wasser) aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei die aufgereinigte Titel-Verbindung (90 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 1108,4 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,29 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,32 (n- BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 6,6 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 5% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nrn), k' = 6,6 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, 4% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm);
Aminosäureanalyse: Asp (2,00), Gly (2,21), Cys (1,45), Ser (1,70), Arg (1,12).

Beispiel 19

Herstellung von Cyclo-(1α,6γ)-Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-Glu-NH&sub2; (SEO ID Nr.: 14)

Das geschützte Hexapeptid-Harz Boc-Gly-MeArg(Tos)-Gly-Asp(Bzl)-Ser(Bzl)- Glu(t-But)-BHA wurde nach Beispiel 1 im Maßstab von 1,0 mmol hergestellt. Die N-terminale Boc-Gruppe von Glycin und der t-Butylester auf der Glutaminsäure-Seitenkette wurden mit 50% TFA in Methylenchlorid entfernt. Das erhaltene TFA-Salz wurde mit 7% DIEA in Methylenchlorid neutralisiert und das an das Harz gebundene Peptid wurde unter Verwendung des BOP-Reagenzes (3 mmol) und DIEA (6 mmol) in DMF zwischen der alpha-Amin-Gruppe von Glycin und der gamma-Carboxy-Gruppe von Glutaminsäure cyclisiert.
Mittels einer 50-minütigen Behandlung mit wasserfreier flüssiger HF (30 ml) in Gegenwart von Anisol (3 ml) bei 0ºC wurde das Peptid vom Harz gespalten, wobei die Seitenketten-Schutzgruppen entfernt wurden. Nach Entfernung von HF unter Vakuum wurde das Harz mit Ethylether gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Harz wurde dann mit 1% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) und anschließend 10% Essigsäure/Wasser (2 · 30 ml) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden lyophilisiert, wobei ein Rohpeptid (680 mg, 100%) erhalten wurde.
Das Rohpeptid wurde mittels Flash-Chromatographie (ODS-Umkehrphasen- Kieselgel-Säule, 1,5% Acetonitril/Wasser - 0,1% TFA) aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde aus 1% Essigsäure/Wasser lyophilisiert, wobei ein partiell aufgereinigtes Peptid (356,8 mg) erhalten wurde. Ein Aliquot des partiell aufgereinigten Peptids (66 mg) wurde mittels HPLC (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, 2% Acetonitril/Wasser - O,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm) weiter aufgereinigt, wobei die aufgereinigte Titel-Verbindung (31 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 615 [M+H]&spplus;; TLC: Rf = 0,36, TLC: Rf = 0,38 (n- BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,42 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 7,43 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 0% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 4,43 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, 3% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (1,00), Gly (1,88), Ser (0,85), Glu (1,05).

Beispiel 20

Allgemeines Verfahren zur Festphasen-Peptidsynthese homodetischer Peptide - FMOC-SASRIN-Verfahren

Cyclische homodetische Peptide wurden mittels einer Festphasen- Peptidesynthese unter Verwendung eines SASRIN-Harzes (Bachem) als Träger synthetisiert. Geschützte Aminosäuren wurden schrittweise so lange angelagert, bis die gwünschte Sequenz erhalten wurde, wobei vom Carboxy- Terminus angefangen wurde. Zum Schutz der alpha-Amino-Gruppe wurde die 9- Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-Gruppe verwendet. Funktionelle Seitenketten-Gruppen wurden wie folgt geschützt: Arginin und Na- Methylarginin mit der Tosyl (Tos)- oder 4-Methoxyl-2,3,6- trimethylphenylsulfonyl (Mtr)-Gruppe; Serin mit Benzylether (Bzl); Glutaminsäure und Asparaginsäure mit Benzylester (Bzl) oder t-Butylester (t- Bu). Die FMOC-Gruppe wurde durch eine Behandlung mit 20% Piperidin in DMF entfernt. Aminosäuren wurden an das länger werdende Peptid unter Verwendung von 2-3 Äquivalenten der FMOC-geschützten Aminosäure, 2-3 Äquivalenten HOBt in DMF und 2-3 Äquivalenten DCC in Methylenchlorid gekuppelt. Die Beendigung der Verknüpfung wurde mittels des Ninhydrin-Tests überprüft und Verknüpfungen wurden im Bedarfsfall wiederholt. Die allgemeine Vorgehensweise ist nachstehend angegeben.
1. Waschen mit DMF 5 · 1 min
2. Waschen mit 20%-igem Piperidin in DMF 1 · 1 min
3. Schutzgruppen-Entfernung mit 20%-igem Piperdin in DMF 1 · 7 min
4. Waschen mit DMF 10 · 1 min
5. Test auf Schutzgruppenentfernung mittels Ninhydrin
6. FMOC-AA + HOBt in DMF, nicht abtropfen lassen 2 min
7. DCC in Methylenchlorid 2 h
8. Waschen mit DMF 5 · 1 min
9. Waschen mit Methylenchlorid 3 · 1 min
10. Test auf vollständige Verknüpfung mittels Ninhydrin
11. Weitermachen ab Schritt 1, wenn ein negatives Ergebnis beim Ninhydrin-Test erhalten wurde, oder erneutes Verknüpfen ab Schritt 6, wenn ein positives Ergebnis beim Ninhydrin-Test erhalten wurde.
Nach Fertigstellung des gewünschten geschützten Peptids wird die FMOC- Schutzgruppe des N-Terminus entfernt und das geschützte Ppetid wird unter Verwendung von 1%-iger - 2%-iger Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid (3 · 15 min) vom Harz abgespalten. Die Methylenchlorid-/TFA-Extrakte werden kombiniert und konzentriert, wobei das geschützte Peptid erhalten wird.
Um eine Cyclisierung zu erreichen, wird das geschützte Peptid (0,2 mmol, 0,4 mM Lösung in trockenem DMF) mit N-Methylmorpholin (S Äquivalenten) und dem cyclischen Anhydrid von 1-Propanphosphonsäure (PPA) (1,2 Äquivalenten) 1 h bei OoC behandelt. Ein weiteres Äquivalent von PPA wird zugegeben und man läßt das Umsetzungsgemisch 18 h bei Raumtemperatur rühren. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird mit Wasser zerrieben, wobei das gewünschte cyclische geschützte Peptid erhalten wird. Die geschützten funktionellen Seitenketten-Gruppen werden mittels einer 50- minütigen Behandlung mit wasserfreier HF in Gegenwart von Anisol (10%) bei 0ºC von den Schutzgruppen befreit. HF wird unter Vakuum entfernt, das Rohpeptid wird in Essigsäure (0,2 M) gelöst, mit Ether gewaschen (3 x) und lyophilisiert, wobei das gewünschte Rohpeptid erhalten wird.

Beispiel 21

Herstellung von Cyclo-(1,8)-MeArg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe (SEO ID Nr.: 16)

Das geschützte Octapeptid-Harz FMOC-Asp(O-t-Bu)-Phe-MeArg(Tos)-Gly- Asp(O-t-Bu)-Phe-Arg(Mtr)-Gly-SASRIN wurde nach Beispiel 20 im Maßstab von 1 mmol hergestellt. Nach der Entfernung der N-terminalen FMOC-Gruppe mit 20% Piperidin in DMF wurde das an das Harz gebundene Peptid mit 1% TFA in Methylenchlorid vom Harz abgespalten, wobei das geschützte lineare Peptid (1,22 g, 84%) als weißer Feststoff erhalten wurde. Das geschützte Peptid (585 mg, 0,4 mmol) in DMF (1 l) wurde mit NMM (220 ul, 2,0 mmol) und PPA (304 ul, 0,48 mmol) bei OoC behandelt. Nach 1-stündigem Rühren bei 0ºC wurde eine weitere Portion PPA zugegeben und das Rühren wurde 18 h fortgesetzt. Durch Entfernung des Lösungsmittels und Zerreiben des Rückstandes mit Wasser wurde das cyclisierte geschützte Peptid Cyclo-(1,8)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(O-t- Bu)-Phe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(O-t-Bu)-Phe (550 mg, 95%) bereitgestellt. Das Peptid wurde mit wasserfreier HF (30 ml) in Gegenwart von Anisol (3 ml) 50 min bei 0ºC behandelt. Nach Entfernung von HF unter Vakuum wurde das Peptid in 60 ml 0,2 M Essigsäure gelöst, mit Ether gewaschen (3 · 20 ml) und lyophilisiert, wobei das Rohpeptid Cyclo-(1,8)-MeArg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe (406 mg) erhalten wurde. Das Rohpeptid (200 mg) wurde mittels Gelfiltration (Sephadex®-G-15, 1% Essigsäure/Wasser) aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das Peptid wurde mittels HPLC (5 u-Altex- Ultrasphere®-ODS, 5 ul, 10 mm · 25 cm, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 10% - 50% Acetonitril in 10 min. UV-Nachweis bei 220 nm) weiter aufgereinigt, wobei die aufgereinigte Titel-Verbindung (26 mg) erhalten wurde. MS (FAB) m/e 965,4 [M+H]+; TLC: Rf = 0,65 (n- BuOH : HOAc : H&sub2;O : EtOAc 1 : 1 : 1 : 1), Rf = 0,63 (n-BuOH : HOAc : H&sub2;O : Pyridin 15 : 5 : 10 : 10); HPLC: k' = 8,14 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS, Gradient, A : Acetonitril, B : Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, 0% - 50% Acetonitril in 20 min. UV-Nachweis bei 220 nm), k' = 9 (5 u-Altex-Ultrasphere®-ODS-Säule, 14% Acetonitril/Wasser - 0,1% Trifluoressigsäure, UV-Nachweis bei 220 nm); Aminosäureanalyse: Asp (1,97), Gly (2,00), Phe (1,95), Arg (1,03).

Beispiel 31

Herstellung von (2R,3S)-3-Phenylcystein

a) (4S)-3-(((4'S,5'R)-5'-Phenyl-2'-thioxo-4'-oxazolidinyl)carbonyl)-4-(phenylmeth)-2-oxazolidinon (1)

Einer Suspension von frisch hergestelltem Zinn(11)-triflat (vorher dreimal mit wasserfreiem Ether unter Argon gewaschen) (7,2 g, 17,6 mmol) und N- Ethylpiperidin in trockener THF (60 ml) mit einer Temperatur von -78ºC wurde 3-(Isothiocyanoacetyl)-2-oxazolidinon (4,4 g, 15,8 mmol) in THF (20 ml) zugegeben. Die blaßgelbe Lösung wurde 2 h bei -78ºC gerührt, dann ließ man die Lösung 5 min auf -40ºC erwärmen und nach einem erneuten Kühlen bei -78ºC wurde Benzaldehyd (2.02 g, 19,1 mmol) unverdünnt zugegeben. Nach 2,5- stündigem Rühren des Umsetzungsgemisches bei -78ºC wurde es durch die Zugabe von 40 ml wäßrigem Phosphatpuffer, pH-Wert 7, abgeschreckt. Der erhaltene Brei wurde durch Celite® filtriert. Das Filtrat wurde mit 200 ml wäßriger 1 N Natriumhydrogensulfat-Lösung verdünnt und mit Cl&sub2;CH&sub2; extrahiert (3x). Die kombinierten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Flüchtige Bestandteile wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 200 ml wäßriger Natriumhydrogensulfat-Lösung gelöst. Der Rückstand wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, Methylenchlorid) gereinigt, wobei die Titel-Verbindung 1 (5,3 g, 87%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 2,980 (dd, J = 13,6, 8,5 Hz, 1H, CHHPh), 3,236 (dd, J = 13,6, 3,5 Hz, 1H, CHHPh), 4,350 - 4,382 (m, 2H, H-5), 4,729 - 4,823 (m, 1H, H-4), 4,986 (dd, J = 5,2, 1,9 Hz, 1H, C(S)NHCH), 6,467 (d, J = 5,2 Hz, 1H, C(S)OCH), 7,206 - 7,449 (m, 10H).

b) Methyl-(4S,5R)-5-phenyl-2-thioxooxazolidin-4-carboxylat (2)

Einer aus dem Aldol-Produkt 1 (6,96 g, 18,2 mmol) in wasserfreiem Methanol (42 ml) und Cl&sub2;CH&sub2; (42 ml) bestehenden Lösung von 0ºC wurde über eine Kanüle eine Suspension zugegeben, die durch die Zugabe von Methylmagnesiumbromid (6,7 ml, 20,02 mmol, 1,1 Äquivalente, 3 M in Diethylether) zu wasserfreiem Methanol (25 ml) gebildet worden war. Nach 3- minütigem Rühren des Umsetzungsgemisches wurde es durch die Zugabe von 50 ml einer wäßrigen 1 N Natriumhydrogensulfat-Lösung abgeschreckt. Flüchtige Bestandteile wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 200 ml wäßriger Natriumhydrogensulfat-Lösung gelöst und mit Cl&sub2;CH&sub2; extrahiert (3x). Die kombinierten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, 5 : 5 : 1 Methylenchlorid/Ether/Methanol) gereinigt, wobei die Titel-Verbindung 2 (4,18 g, 96%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 3,875 (s, 3H), 4,534 (d, J = 6,1 Hz, 1H, H-4), 5,967 (d, J = 6,1 Hz, 1H, H-5), 7,414 (s, 5H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 53,4, 64,6, 85,6, 125,6, 129,1, 129,5, 136,7, 168,5, 188,8.

c) Methyl-(4S,SR)-3-(tert-butyloxycarbonyl)-5-phenyl-2-oxazolidin-4-carboxylat (3)

Einer gut gerührten Lösung des Thiooxazolidinons 2 (4,18 g, 17,6 mmol) in Cl&sub2;CH&sub2; (80 ml) wurden bei Raumtemperatur in Cl&sub2;CH&sub2; (8 ml) gelöstes Di-tbutylpyrocarbonat (4,25 g, 19,36 mmol) und Dimethylaminopyridin (110 mg, 0,05 Äquivalente) zugegeben. Nachdem das Umsetzungsgemisch 30 min gerührt worden war, wurde es auf 0ºC gekühlt und 30%-iges wäßriges H&sub2;O&sub2; (44 ml) und 88%-ige Ameisensäure (44 ml) wurden zugegeben. Das erhaltene Zweiphasen- Gemisch wurde 30 min gerührt und danach in eine wäßrige 1 M Kaliumcarbonat-Lösung (500 ml) gegossen. Die wäßrige Lösung wurde mit Cl&sub2;CH&sub2; extrahiert (3x). Die kombinierten organischen Phasen wurden mit einer wäßrigen 1 M Kaliumcarbonat-Lösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, wobei ein schaumiges Öl (5,6 g, 100%) erhalten wurde. Das Öl wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (30% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, wobei das gewünschte Boc-geschützte Oxazolidinon 3 (5,4 g, 95%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,504 (s, 9H), 3,385 (s, 3H), 4,642 (d, J = 4,3 Hz, 1H, H-4), 5,389 (d, J = 4,3 Hz, 1H, H-5), 7,401 - 7,462 (m, 5 H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 28,2, 53,3, 63,8, 76,0, 84,9, 125,2, 129,3, 129,6, 137,3, 150,8, 169,1.

d) Methyl-(2S,3R)-2-((tert-butyloxycarbonyl)amino)-3-hydroxy-3-phenylpropionat (4)

Einer Lösung des Methylesters 3 (5,6 g, 17,6 mmol) in Dioxan (300 ml), die Raumtemperatur hatte, wurde eine frisch hergestellte wäßrige 2 N Lithiumhydroxid-Lösung (44 ml, 88 mmol) zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde die Nacht über bei Raumtemperatur gerührt. Flüchtige Bestandteile wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in einer 1 N wäßrigen Natriumhydrogensulfat-Lösung (300 ml) gelöst und mit Cl&sub2;CH&sub2; extrahiert (3 x). Die kombinierten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, der Rückstand wurde danach erneut in Ether (300 ml) gelöst und nach Kühlen auf 0ºC wurde eine Lösung von Ether-Diazomethan so lange zugegeben, bis eine blaßgelbe Farbe bestehen blieb. Die Lösung wurde 15 min bei OoC und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der schaumige Öl-Rückstand wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, Stufengradient: 30% Ethylacetat/Hexan, 50% Ethylacetat/Hexan) aufgereinigt, wobei der gewünschte Boc-geschützte Aminoalkohol 4 (4,01 g, 81%) und anschließend das De-Boc-Oxazolidinon (460 mg, 12%) erhalten wurden. Der Aminoalkohol 4 wurde in Form eines weißen Feststoffs erhalten, der kristallisierte. Schmp. 101ºC - 102ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = - 15,1º (c = 0,93, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,333 (s, 9 H), 2,704 (bs, 1H, OH), 3,761 (s, 3H), 4,501 (bd, J = 6,6 Hz, 1H, HO-), 5,237 (dd, J = 3,5, 3,4 Hz, 1H), 5,273 - 5,351 (m, 1H), 7,287 - 7,362 (m, 5H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 28,1, 52,4, 59,5, 73,8, 80,0, 126,0, 127,9, 128,2, 139,9, 155,5, 171,5. IR (KBr) 3440 (br), 2980, 1745, 1705, 1525, 1165 cm&supmin;¹; MS m/z 296 [M+H]&spplus;; Analyt. Berechnung für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub1;O&sub5;N: C, 61,02; H, 7,12. Festgestellt: C, 59,96; H, 6,94.

e) Methyl-(2S,3R)-2-((tert-butyloxycarbonyl)amino)-3-methansulfonyl-3- phenylpropionat (6)

Einer Lösung von Alkohol 4 (0,94 g, 3,18 mmol) und NEt&sub3; (0,73 g, 7,18 mmol) in Cl&sub2;CH&sub2; (10 ml) wurde bei 0ºC Methansulfonylchlorid (418 mg, 3,65 mmol) zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch 45 min bei 0ºC rühren. Danach wurde es mit kalter verdünnter HCl abgeschreckt und mit Cl&sub2;CH&sub2; verdünnt, die organische Schicht wurde mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung und anschließend einer Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Roh-Mesylat 6 wurde als schaumiger weißer Feststoff erhalten, der im nächsten Schritt ohne weitere Aufreinigung verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,417 (s, 9H), 2,910 (s, 3H, CH&sub3;-OMs), 3,705 (s, 3H, CH&sub3;O-), 4,853 (dd, J = 9,6, 6,6 Hz, 1H, H-C&sub2;), 5,173 (bd, J = 9,6 Hz, 1H, H-N), 5,893 (d, J = 6,6 Hz, 1H, H-C&sub3;), 7,389 - 7,400 (m, 5H); IR (KBr) 3400, 2980, 2950, 1745, 1715, 1520, 1360, 1180 cm&supmin;¹.

f) Methyl-(2R,3S)-3-(acetylthio)-2-((tert-butyloxycarbonyl)amino)-3-phenylpropionat (7)

Einer Lösung von Mesylat 6 (1,18 g, 3,16 mmol) in DMF (10 ml) wurde eine vorher gebildete Lösung des DBU-Salzes von Thioessigsäure (gebildet durch Zugabe von Thioessigsäure (1,2 g, 15,8 mmol) zu einer Lösung von DBU (1,68 g, 11,07 mmol) in DMF (5 ml)) zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch 30 h bei Raumtemperatur rühren. Danach wurde es mit Wasser abgeschreckt, mit Cl&sub2;CH&sub2; verdünnt und mit Wasser gewaschen (4 x). Die organische Schicht wurde mit einer Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Rohöl wurde mittels Flash- Säulenchromatographie aufgereinigt (Kieselgel, 8% Ethylacetat/Toluol), wobei das gewünschte aceetylierte Thiol 7 (0,97 g, 87%) als farblose Flüssigkeit erhalten wurde. [α]²&sup0;D = + 143,6º (c = 2,50, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,427 (s, 9 H), 2,330 (s, 3H, CH&sub3;-COS), 3,685 (s, 3H, CH&sub3;O-), 4,903 (dd, J = 9,6, 4,7 Hz, 1H, H-C&sub2;), 5,073 (bd, J = 9,6 Hz, 1H, H-N), 5,138 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-C&sub3;), 7,289 - 7,400 (m, 5H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 28,1, 30,2, 49,9, 52,2, 57,3, 80,2, 128,2, 128,4, 128,6, 136,6, 155,1, 170,1, 193,3 (-COS-). IR (unverdünnt) 3380, 2990, 2960, 1750, 1690, 1520, 1340, 1170 cm&supmin;¹; MS m/z 354 [M+H]&spplus;; Analyt. Berechnung für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub3;O&sub5;NS: C, 57,79; H, 6,51. Festgestellt: C, 57,64; H, 6,59.

g) Methyl-(2R,3S)-2-((tert-butyloxycarbonyl)amino)-3-mercapto-3-phenylpropionat (9)

Das acetylierte Thiol 7 (290 mg, 0,82 mmol) wurde in Methanol (4 ml) gelöst und NaOH (4,1 ml, 0,2 N wäßrige Lösung) wurde zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt (mittels TLC kontrolliert). Die Lösung wurde dann vorsichtig mit verdünnter HCl neutralisiert. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Cl&sub2;CH&sub2; extrahiert (3 x). Die organische Schicht wurde mit einer Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Rohprodukt wurde mittels Flash- Säulenchromatographie (Kieselgel, 10% Ethylacetat/Hexan) aufgereinigt, wobei das gewünschte Thiol 9j (242 mg, 95%) als weißer Feststoff erhalten wurde. Schmp. 76ºC - 77ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = + 92,3º (c = 0,96, CHCl&sub3;); ¹H- NMR (CDCl&sub3;). δ 1,392 (s, 9H), 2,207 (d, J = 7,3 Hz, SH), 3,698 (s, 3H), 4,471 (dd, J = 6,7, 6,3 Hz, 1H, CH-S), 4,800 (dd, J = 8,7, 6,3 Hz, 1H, CH-N), 5,059 (bd, J = 8,7 Hz, 1H, NH), 7,370 - 7,282 (m, 5H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 28,0, 52,1, 59,5, 80,1, 127,5, 127,6, 128,8, 138,8, 155,9, 171,5; IR (KBr) 3335, 2990, 1740, 1685, 1530, 1165 cm&supmin;¹. MS m/z 312 [M+H]&spplus;; Analyt. Berechnung für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub1;O&sub4;NS: C, 57,88; H, 6,75. Festgestellt: C, 58,08; H, 6,88.

h) (2R,3S)-2-((tert-Butyloxycarbonyl)aminol-3-((4-methylbenzyl)-thio)-3- phenylpropionsäure (10)

Das acetylierte Thiol 7 (520 mg, 1,47 mmol) wurde in Methanol (8 ml) gelöst und NaOH (1,62 ml, 1 M wäßrige Lösung) und anschließend Bromxylol (300 mg, 1,62 mmol) wurden zugegeben. Nach 20 min wurde der pH-Wert überprüft und weitere 1, 1 Äquivalente der Base wurden zugegeben. Man ließ die Umsetzung 3 h bei Raumtemperatur rühren (Kontrolle mittels TLC). Die Lösung wurde vorsichtig mit verdünnter HCl neutralisiert. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Cl&sub2;CH&sub2; extrahiert (3 x). Die organische Schicht wurde mit einer Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, 2% Essigsäure/20% Ethylacetat/Hexan) aufgereinigt, wobei die gewünschte Säure 10 (480 mg, 79%) als weißer Feststoff erhalten wurde.
Schmp. 131ºC - 132ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = + 211,7º (c = 0,99, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). s 1,403 (s, 9H), 2,316 (s, 3H), 3,515 (d, J = 13 Hz, 1H), 4,194 (d, J = 13 Hz, 1 H), 4,790 (bs, 1H), 4,931-5,050 (m, 1H), 5,050- 5,352 (bs, 1H), 7,082 (s, 4H), 7,287 - 7,307 (m, 5H); IR (KBr) 3380, 3000, 1700, 1515, 1170 cm&supmin;¹. MS m/z 402 [M+H]&spplus;;
Analyt. Berechnung für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub7;O&sub4;NS: C, 65,81; H, 6,78. Festgestellt: C, 65,91; H, 7,00.

Beispiel 3 Z

Herstellung von (2R,3R)-3-Phenylcystein:

a) (4R)-3-((2'R,3'S)-2'-brom-3'-hydroxy-3' phenylyropanoyl)-4-(phenylmethyl)-2-oxazolidinon (12)

Einer Suspension von 3-(Bromacetyl)-2-oxazolidinon 11 (4,74 g, 15,9 mmol) in Diethylether (30 ml) mit einer Temperatur von -78ºC wurden Triethylamin (2,25 g, 22,2 mmol) und frisch destilliertes Di-n-butylboryltriflat zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt und die Lösung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene braune Zweiphasen-Gemisch wurde allmählich auf -78ºC gekühlt und Benzaldehyd (1,27 g, 11,9 mmol) wurde unverdünnt zugegeben. Nachdem das Umsetzungsgemisch 30 min bei -78ºC und 2,5 h bei OºC gerührt worden war, wurde es mit Ether verdünnt, mit einer 1 N wäßrigen Natriumhydrogensulfat-Lösung (2 x) und Wasser gewaschen und konzentriert. Der Rückstand wurde in Ether (30 ml) gelöst und auf OºC gekühlt. Der Rückstand wurde tropfenweise einem Gemisch von Methanol und 30%-igem wäßrigem Wasserstoffperoxid (1 : 1, 30 ml) zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde 1 h bei OºC gerührt, danach vorsichtig in eine gesättigte wäßrige Natriumhydrogencarbonat-Lösung gegossen und mit Ether extrahiert (2 x). Die kombinierten organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen (2 x), über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde, der mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, 2% Ethylacetat/- Methylenchlorid) aufgereinigt wurde, wobei das Bromhydrin 12 (3,62 g, 75%) erhalten wurde.

b) (4R)-3-((2'S,3'S)-2'-azido-3'-hydroxy-3'-pyhenylpropanoyl)-4-(phenylmethyl)-2-oxazolidinon (13)

Einer Lösung von Aldol-Addukt 12 (3,1 g, 7,67 mmol) und Natriumazid (0,99 g, 15,3 mmol) in DMSO (26 ml) wurde 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene dunkle Lösung wurde mit Hexan/Methylenchlorid, das im Verhältnis 2 : 1 vorlag, verdünnt, mit Wasser gewaschen (4 x), über Natriumsulfat getrocknet und zu einem blaßen Öl konzentriert, das kristallisierte. Eine Aufreinigung mittels einer Rekristallisation aus Ether/Hexan ergab das Azid 13 (2,2 g, 80%) in Form eines weißen Feststoffs, der kristallisierte. Schmp. 115ºC - 116ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = -6,6º (c = 2,2, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 2,745 (dd, J = 13,6, 9,6 Hz, 1H, CHH-Ph), 2,949 (d, J = 6,6 Hz, 1H, -OH), 3,310 (dd, J = 13,6, 3,4 Hz, 1H, CHHPh), 4,199 - 4,274 (m, 2H, H-5), 4,714 - 4,752 (m, 1H, H-4), 5,075 (dd, J = 8,5, 6,6 Hz, 1H, CH-OH), 5,383 (d, J = 8,5 Hz, 1H, CHN&sub3;), 7,197 - 7,532 (m, 10H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 37,3, 55,5, 63,1, 66,5, 74,8, 126,7, 127,3, 128,7, 128,8, 128,9, 129,3, 134,8, 139,5, 153,3, 169,6. IR (KBr) 3420, 3025, 2100, 2760, 1700, 1400, 1225 cm&supmin;¹. MS m/z 349 [M+H-H&sub2;O]&spplus;; Analyt. Berechnung für C&sub1;&sub9;H&sub1;&sub8;O&sub4;N&sub4;: C, 62,29; H, 4,95; N, 15,29. Festgestellt: C, 62,03; H, 5,06, N, 15,23.

c) Methyl-(25,3S)-2-azido-3-hydroxy-3-phenylpropionat (14)

Einer Lösung von Azid 13. (1,52 g, 4,15 mmol) in wasserfreiem Methanol (8 ml) und Cl&sub2;CH&sub2; (8 ml) mit einer Temperatur von 0ºC wurde über eine Kanüle eine Suspension zugegeben, die durch die Zugabe von Methylmagnesiumbromid (5,2 ml, 4,5 mmol, 0,88 M in Diethylether) zu wasserfreiem Methanol (5 ml) gebildet worden war. Nach 3-minütigem Rühren des Umsetzungsgemisches wurde es durch Zugabe von 20 ml einer 1 N wäßrigen Natriumhydrogensulfat- Lösung abgeschreckt und mit Methylenchlorid extrahiert (3 x). Die kombinierten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash- Säulenchromatographie (Kieselgel, Methylenchlorid) aufgereinigt, wobei die Titelverbindung 14 (807 mg, 88%) als weißer Feststoff bereitgestellt wurde, der kristallisierte. Schmp. 40ºC - 41ºC (Ether - Hexan); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 3,084 (bs, 1 H, -OH), 3,774 (s, 3H), 4,108 (d, J = 7 Hz, 1H, CH-N&sub3;), 5,003 (bd, J = 6,4 Hz, 1H, HC- OH), 7,372 (s, 5H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 52,6, 74,5, 126,6, 128,6, 128,7, 136,1, 169,3. IR (KBr) 3500 (b), 3020, 2960, 2120, 1740, 1460, 1440 cm&supmin;¹. MS m/z 238 [M+NH&sub4;]; Analyt. Berechnung für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;O&sub3;N&sub3;: C, 54,30; H, 5,01; N, 19,00. Festgestellt: C, 54,31; H, 5,08, N, 18,78.

d) Methyl-(25,3S)-2-((tert-but-butyloxycarbonyl)amino)-3-hydroxy-3-phenylpronionat (15)

Im Handel erhältliches Palladium auf Holzkohle (80 mg) in Ethylacetat (4 ml) wurde 15 min unter einer Wasserstoff-Atmosphäre kräftig gerührt. Dieser Suspension wurde ein Gemisch aus dem Azidoalkohol 14 (800 mg, 3,6 mmol) und Di-t-butyldicarbonat (943 mg, 4,32 mmol) in Ethylacetat (4 ml) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde unter Wasserstoffgas 2 h bei Raumtemperatur gerührt (Kontrolle mittels TLC) und durch ein Celite®-Filter filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der weiße Feststoff wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, 30% Ethylacetat/Hexan) aufgereinigt, wobei der gewünschte Boc-geschützte Aminoalkohol 15 (1,04 g, 98%) als weißer kristallisierender Feststoff erhalten wurde. Schmp. 101ºC - 102ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = +83,3º (c = 1,05, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,433 (s, 9H), 3,701 (s, 3H), 3,929 (bd, J = 5,3 Hz, 1H, HO-), 4,710 - 4,760 (m, 1H), 5,168 - 5,188 (m, 1H), 5,190 - 5,310 (m, 1H), 7,248 - 7,380 (m, 5 H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 28,2, 52,2, 59,7, 74,9, 80,5, 126,0, 127,9, 128,2, 139,3, 156,1, 170,1. IR (KBr) 3450, 3390, 3000, 1760, 1710, 1530, 1280, 1260 cm&supmin;¹. MS m/z 296 [M+H]&spplus;;
Analyt. Berechnung für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub1;O&sub5;N: C, 61,02; H, 7,12. Festgestellt C, 60,96; H, 6,96.

e) Methyl-(25,3S)-2-((tert-butyloxycarbonyl)amino)-3-methansulfonyl-3-phenylpropionat (16)

Einer Lösung von Alkohol 15 (1, 94 g, 6, 81 mmol) und Triethylamin (1,25 g, 12,4 mmol) in Cl&sub2;CH&sub2; (15 ml) wurde bei OºC Methansulfonylchlorid (0,96 g, 8,4 mmol) zugegeben. Man ließ das Umsetzungsgemisch 20 min bei OoC rühren. Es wurde mit kalter verdünnter HCl abgeschreckt, mit Cl&sub2;CH&sub2; verdünnt und die organische Schicht wurde mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung und anschließend mit einer Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Roh-Mesylat 16 wurde als schaumiger weißer Feststoff erhalten, der ohne weitere Aufreinigung im nächsten Schritt verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,394 (s, 9H), 2,916 (s, 3 H), 3,718 (s, 3H), 4,878 (dd, J = 8,7, 5,0 Hz, 1H, H-2), 5,231 (bd, J = 8,7 Hz, 1H, H-N), 5,917 (d, J = 5,0 Hz, 1H, H-3), 7,379 - 7,425 (m, 5H).

f) Methyl-(2R,3R)-3-(acetylthio)-2-((tert-butyloxycarbonyl)amino)-3 phenylpropionat (17)

Einer Lösung von Mesylat 16 (2,72 g, 7,29 mmol) in DMF (7 ml) wurde das Kaliumsalz von Thioessigsäure (3 g, 29,9 mmol) auf einmal zugegeben. Die Lösung wurde sehr dickflüssig und weiteres DMF (5 ml) wurde zugegeben. Die Lösung wurde 20 h unter Argon bei Raumtemperatur gehalten. Sie wurde mit Wasser abgeschreckt, mit Cl&sub2;CH&sub2; verdünnt und mit Wasser gewaschen (4 x). Die organische Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt enthielt ein 6 : 1-Gemisch des gewünschten Produkts 17 und des Oxazolidinons 1 (wie mittels ¹H-NMR des Rohproduktes gezeigt). Dieses Gemisch wurde mittels Flash-Chromatographie (Kieselgel, Gradient, 5% bis 50% Ethylacetat/Hexan) aufgereinigt, wobei das gewünschte acetylierte Thiol 17 (1,65 g, 69%) als brauner Feststoff und anschließend Oxazolidinon S (193 mg, 12%) erhalten wurde. Das acetylierte Thiol wurde umkristallisiert, wobei ein weißer Feststoff erzeugt wurde. Schmp. 87ºC - 88ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = -97,20 (1,0, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,431 (s, 9H), 2,355 (s, 3H), 3,616 (s, 3H), 4,766 (dd, J = 6,6, 6,3 Hz, 1H, H-2), 5,029 (bd, J = 6,6 Hz, 1H, H-3), 5,2,64 (bd, J = 6,3 Hz, 1H, H-N), 7,311 (s, 5H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 28,3, 30,2, 50,5, 52,2, 58,5, 80,3, 128,1, 128,3, 128,6, 137,8, 154,9, 170,6, 193,5. IR (KBr) 3380, 2990, 2960, 1745, 1690, 1520, 1240, 1170 cm&supmin;¹. MS m/z 354 [M+H]&spplus;; Analyt. Berechnung für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub3;O&sub5;NS: C, 57,77; H, 6,56; N, 3,97. Festgestellt: C, 58,05; H, 6,92; N, 3,73.

g) Methyl-(2R,3R)-2-((tert-butYloxycarbonyl)amino)-3-((4-methylbenzyl)- thiol-3-phenylnronionsäure (18)

Das acetylierte Thiol 17 (500 mg, 1,4 mmol) wurde in Methanol (2 ml) gelöst und NaOH (1,6 ml, 1 M wäßrige Lösung) und anschließend Bromxylol (300 mg, 1,62 mmol) wurden zugegeben. Nach 20 Minuten war der größte Teil des Ausgangsmaterials verschwunden (mittels TLC kontrolliert). Die Lösung wurde vorsichtig mit verdünnter HCl neutralisiert. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Cl&sub2;CH&sub2; extrahiert (3 x). Die organische Schicht wurde mit einer Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, S% bis 20% Ethylacetat/Hexan) aufgereinigt, wobei der gewünschte Ester 18 (480 mg, 79%) als weißer Feststoff erhalten wurde, der kristallisierte. Schmp. 97ºC - 98ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = -171,8º (c = 1,05, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,384 (s, 9H), 2,326 (s, 3H), 3,393 (d, J = 13 Hz, 1H), 3,551 (d, J = 13 Hz, 1 H), 3,572 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,126 (d, J = 5,4 Hz, H-3), 4,630 (dd, J = 8,8, 5,8 Hz, 1 H, H-2), 5,220 (bd, J = 8,8 Hz, 1H, H-N), 7,028 - 7,107 (m, 4H), 7,291 - 7,362 (m, 5H); ¹³C- NMR (CDCl&sub3;). δ 21,0, 28,3, 35,5, 51,6, 52,1, 57,5, 80,1, 127,8, 128,5, 128,7, 128,9, 129,2, 134,3, 136,9, 138,4, 154,7, 170,8; MS m/z 316 [M+H]&spplus;; Analyt. Berechnung für C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub9;O&sub4;NS · 1/4 H&sub2;O: C, 65,76; H, 7,08; N, 3,33. Festgestellt: C, 65,59; H, 7,03; N, 3,36.

h) (2R,3R)-2-((Tert-butyloxvcarbonyl)amino)-3-((4-methylbenzyl)thio)-3- phenyluropionsäure (19)

Der Methylester 18 (380 mg, 0,91 mmol) und wasserfreies Lithiumchlorid (376 mg, 8,89 mmol) wurden in trockenem DMF (10 ml) gelöst. Das Umsetzungsgemisch wurde 4 Tage bei 90ºC erhitzt. Das Umsetzungsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, mit verdünnter HCl abgeschreckt und mehrmals mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit einer Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Kieselgel, Stufengradient: 20% Ethylacetat/Hexan, 25% Ethylacetat/5% Essigsäure/Hexan) aufgereinigt, wobei das Ausgangsmaterial 18 (75 mg, 20%) wiedergewonnen wurde und anschließend die gewünschte Carbonsäure als weißer Feststoff erhalten wurde, der umkristallisiert wurde (341 mg, 77%). Schmp. 107ºC - 108ºC (Ether - Hexan); [α]²&sup0;D = -143,7º (c = 1,66, CHCl&sub3;); ¹H-NMR (CDCl&sub3;). δ 1,379 (s, 9H), 2,300 (s, 3H), 3,460 (d, J = 13,3 Hz, 1H), 3,588 (d, J = 13,3 Hz, 1H), 4,242 (d, J = 5,5 Hz, H-3), 4,646 (dd, J = 8,7, 5,5 Hz, 1H, H-2), 5,273 (bd, J = 8,7 Hz, 1H, H-N), 7,055 (s, 4H), 7,259 - 7,340 (m, 5H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;). δ 21,1, 28,2, 35,5, 50,8, 58,1, 80,5, 127,9, 128,6, 128,9, 129,2, 133,9, 136,9, 138,1, 155,3, 174,5; MS m/z 401 [M+H]&spplus;; Analyt.
Berechnung für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub7;O&sub4;NS: C, 65,81; H, 6,78; N, 3,48. Festgestellt: C, 65,83; H, 6,92; N, 3,57.

Beispiel 33

Zusammensetzung einer parenteralen Dosierungseinheit

Ein Präparat, das 20 mg einer Verbindung von Beispiel 1 oder 2 als steriles Trockenpulver enthält, wird wie folgt hergestellt: 20 mg der Verbindung werden in 15 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen in eine 25 ml-Ampulle für mehrere Dosen filtriert und lyophilisiert. Das Pulver wird durch Zugabe von 20 ml 5%-iger Dextrose in Wasser (D5W) zur intravenösen oder intramuskulären Injektion zubereitet. Die Dosierung wird dabei durch das Injektionsvolumen bestimmt. Eine anschließende Verdünnung kann durch Zugabe eines abgemessenen Volumens dieser Dosierungseinheit zu einem anderen Volumen von D5W zur Injektion erfolgen oder eine abgemessene Dosis kann einer anderen Vorrichtung zur Arzneimittelabgabe, wie einer Flasche oder einem Beutel zur IV-Tropfinfusion oder einem anderen Injektions-Infusionssystem, zugegeben werden.

Beispiel 34

Zusammensetzung einer oralen Dosierungseinheit

Eine Kapsel zur oralen Verabreichung wird durch Mischen und Mahlen von 50 mg der Verbindung von Beispiel 3 mit 75 mg Lactose und 5 mg Magnesiumstearat hergestellt. Das erhaltene Pulver wird gesiebt und in eine Hartgelatine-Kapsel eingefüllt.

Beispiel 35

Zusammensetzung einer oralen Dosierungseinheit

Eine Tablette zur oralen Verabreichung wird hergestellt, indem 20 mg Saccharose, 150 mg Calciumsulfat-Dihydrat und 50 mg der Verbindung von Beispiel 3 mit einer 10%-igen Gelatine-Lösung gemischt und granuliert werden. Die feuchten Körnchen werden gesiebt, getrocknet, mit 10 mg Stärke, 5 mg Talkum und 3 mg Stearinsäure gemischt und zu einer Tablette verpresst.
Die vorstehende Beschreibung offenbart vollständig, wie die vorliegende Erfindung durchzuführen und anzuwenden ist. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die in der vorliegenden Beschreibung genau beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern umfaßt alle Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges der folgenden Patentansprüche.

SEQUENZVERZEICHNIS

SEQ ID Nr.: 1
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLANGE: 4 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 bedeutet N-alpha-2-Mercaptobenzoyl-Arg;
Xaa an Position 4 bedeutet Cysteinamid;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 4 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN:
Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 2
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 4 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 bedeutet N-alpha-Acetyl-Cys;
Xaa an Position 4 ist das 2-Mercaptophenylamid von Asp;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 1 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN:
Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 3
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 4 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 bedeutet N-alpha-Methyl, N-alpha-2-mercaptobenzoyl-Arg;
Xaa an Position 4 bedeutet beta-Phenylcysteinamid;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 4 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQID Nr.: 4
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 4 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 bedeutet N-alpha-2-Mercaptobenzoyl-MeGly;
Xaa an Position 4 bedeutet das 2-Mercaptophenylamid von Asp;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 4 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 5
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 4 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 bedeutet N-alpha-2-Mercaptobenzoyl-MeGly;
Xaa an Position 2 bedeutet N-alpha-Methyl-Arg;
Xaa an Position 4 bedeutet das 2-Mercaptophenylamid von Asp;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 4 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 6
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 5 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 bedeutet N-alpha-Acetyl-Cys;
Xaa an Position 2 bedeutet N-alpha-Methyl-Arg;
Xaa an Position 5 ist (3S)-beta-Phenylcysteinamid;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 5 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 7
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 5 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 ist N-alpha-Acetyl-Cys;
Xaa an Position 2 ist N-alpha-Methyl-Arg;
Xaa an Position 5 ist (3R)-beta-Phenylcysteinamid;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 5 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 10
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 10 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 ist N-alpha-Acetyl-Cys;
Xaa an Position 6 ist N-alpha-Methyl-Arg;
Xaa an Position 10 ist Cysteinamid;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 10 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 11
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 10 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 ist N-alpha-Acetyl-Cys;
Xaa an Position 2 ist N-alpha-Methyl-Arg;
Xaa an Position 10 ist Cysteinamid;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 10 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 14
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 6 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 2 ist N-alpha-Methyl-Arg;
Xaa an Position 6 ist Glutaminsäureamid;
die alpha-Amino-Gruppe von Gly an Position 1 bildet mit der gamma-Carboxyl- Gruppe von Xaa an Position 6 eine Peptidbindung.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQID Nr.: 16
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: 8 Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 ist alpha-Methyl-Arg;
die alpha-Amino-Gruppe von Xaa an Position 1 bildet mit der Carboxyl-Gruppe von Phe an Position 8 eine Peptidbindung.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist
SEQ ID Nr.: 18
SEQUENZTYP: Peptid
SEQUENZLÄNGE: S Aminosäuren
TOPOLOGIE: circulär
MERKMALE:
Xaa an Position 1 ist N-alpha-Acetyl-Cys;
Xaa an Position 2 ist N-alpha-Methyl-Arg;
Xaa an Position 5 ist beta-Phenylcystein;
das Schwefelatom von Xaa an Position 1 und das Schwefelatom von Xaa an Position 5 bilden eine Disulfidbrücke.
EIGENSCHAFTEN: Fibrinogenrezeptor-Antagonist

Claims

1. Verbindung der Formel:

in der:

A' abwesend ist oder Asn, Gln, Ala oder Abu bedeutet;

A abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Arg, HArg, NArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Abu, Ala, Gly, His, Lys oder einem α-R'-substituierten Derivat davon, Dtc, Tpr oder Pro;

B eine D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus Arg, HArg, (Mez) Arg, (Et&sub2;) Arg, Lys oder einem α-R' -substituierten Derivat davon,

Q abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Pro, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Ihr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk) Pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle oder Nal oder einem α-R'-substituierten Derivat davon;

M abwesend ist oder Gly oder D- oder L- Glu, Phe, Pro, Lys, Ser oder, wenn n 1 ist, B-Gly-Glu-Q bedeutet;

W ein Halogenatom oder einen Alk-Rest bedeutet;

R' einen Alk-Rest oder PhCH&sub2; bedeutet;

Z&sub1; die folgenden Reste bedeutet

oder

Z&sub2; die folgenden Reste bedeutet

oder

wobei Z&sub1; und Z&sub2; über eine kovalente Bindung zwischen L¹ und

L verknüpft sind;

L¹ und L² -S- bedeuten;

X den Rest R&sub4;R&sub5;N bedeutet;

Y ein Wasserstoffatom, einen CONR&sub1;R&sub2;- oder einen CO&sub2;R&sub2;-Rest bedeutet;

R&sub1; und R&sub2; Wasserstoffatome, Alk- oder (CH&sub2;)pAr-Reste bedeuten;

R&sub3; und R&sub3;, Wasserstoffatome, Alk-, (CH&sub2;)pAr-Reste oder zusammengenommen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub4;- oder - (CH&sub2;)&sub5;- bedeuten;

R&sub4; ein Wasserstoffatom oder einen Alk-Rest darstellt;

R&sub5; die Reste R&sub1;&sub1;, R&sub1;&sub1;CO, R&sub1;&sub1;OCO, R&sub1;&sub1;OCH (R11') CO, R&sub1;&sub1;NHCH(R11')CO, R&sub1;&sub1;SCH(R11'), R&sub1;&sub1;SO&sub2; oder R&sub1;&sub1;SO bedeutet; R&sub6; einen Alk-, OAlk-Rest, ein Halogenatom oder X bedeutet;

R&sub7; ein Wasserstoffatom, einen Alk-, OAlk-Rest, ein Halogenatom oder Y bedeutet;

R&sub8; und R&sub8;' Wasserstoffatome, Alk-, (CH&sub2;)PPh-, (CH&sub2;)PNph-Reste oder zusammengenommen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub9;- oder - (CH)&sub5;- bedeuten;

R&sub9; ein Wasserstoffatom, einen Alk-Rest oder Y bedeutet;

R&sub1;&sub0; ein Wasserstoffatom oder einen Alk-Rest bedeutet;

R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub1;, Wasserstoffatome, C&sub1;&submin;&sub5;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl-, Ar-, Ar-C&sub1;&submin;&sub5;-alkyl-, Ar-C&sub3;&submin;&sub7;-cycloalkylreste darstellen;

Ar eine Phenylgruppe oder eine mit einem oder zwei C&sub1;&submin;&sub5;-Alkyl-, Trifluormethyl-, Hydroxy-, C&sub1;&submin;&sub5;-Alkoxyresten oder Halogenatomen substituiert ist,

Alk einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest bedeutet;

Het ein heterocyclischer Rest ist, ausgewählt aus Pyridin, Pyrrol, Pyrrolidin, Imidazol, Triazol, Thiophen, Furan und Thiazol, wobei L¹ sich in ortho-Stellung zu -CO- und L² sich in ortho-Stellung zu -NH- befindet;

n die Bedeutung 1 oder 2 hat; und

p die Bedeutung 0, 1, 2 oder 3 hat

und pharmazeutisch aktive Salze davon;

mit der Maßgabe, daß, wenn Z&sub1; -L¹-C (R&sub3;) (R3')-CH (X) -CO- ist, R&sub3; und R3' Wasserstoffatome oder Alk-Reste bedeuten oder zusammen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub9;- oder - (CH&sub2;)&sub5;- darstellen, und wenn Z&sub2; -L²-C (R&sub6;) (R8')-CH (Y) -NH- ist, R&sub8; und R8' weder beide Wasserstoffatome oder Alkreste sind noch zusammen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub9;- oder - (CH&sub2;)&sub5;- bilden; und

mit der Maßgabe, daß M nur dann abwesend ist, wenn Q abwesend ist und wenn Z die folgende Bedeutung hat

2. Verbindung nach Anspruch 1, in der Z&sub1; die folgende Bedeutung hat:

oder

3. Verbindung nach Anspruch 1, in der Z&sub2; die folgende Bedeutung hat:

oder

4. Verbindung nach Anspruch 1, in der Z&sub1; die folgende Bedeutung hat

oder Cys

und Z&sub2; die folgende Bedeutung hat

oder Pcs.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der Z&sub1; die folgende Bedeutung hat

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in der Z&sub2; die folgende Bedeutung hat

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in der B Arg, HArg oder ein α-R'-substituiertes Derivat von Arg oder HArg ist.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in der A' und A abwesend sind.

9. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in der B MeArg ist.

10. Verbindung, nämlich:

Cyclo(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Cys-NH&sub2; (SEQ ID No. 1);

Nα-Ac-Cyclo(S,S)-Cys-Arg-Gly-Asp-Man (SEQ ID No. 2);

Cyclo(S,S) -Mba-MeArg-Gly-Asp-Man;

Cyclo(S,S)-Mba-MeArg-Gly-Asp-Pcs-NH&sub2; (SEQ ID No. 3);

Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-Arg-Gly-Asp-Man (SEQ ID No. 4);

Cyclo-(S,S)-Mba-Sar-MeArg-Gly-Asp-Man (SEQ ID No. 5);

Cyclo-(S,S)-Mba-Arg-Gly-Asp-Man;

Cyclo-(S,S)-Mba-D-MeArg-Gly-Asp-Man;

NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(2R, 3S)Pcs-NH&sub2; (SEQ ID No. 6),

NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(2R, 3R Pcs-NH&sub2; (SEQ ID No. 7);

NαAc-Cyclo-(S,S) Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-MeArg-Gly-Asp-Ser- Cys-NH&sub2; (SEQ ID No. 10);

NαAc-Cyclo-(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Arg-Gly-Asp-Ser- Cys-NH&sub2; (SEQ ID No. 11).

11. Arzneimitel, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 oder 20 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

12. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 oder 20 zur Verwendung in einem Medikament.

13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 oder 20 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines akuten Myocardinfarkts.

14. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 oder 20 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schlaganfall oder vorübergehenden ischemischen Attacken.

15. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 oder 20 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von instabiler Angina.

16. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 oder 20 und eines fibrinolytischen Mittels für die Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung einer Thrombolyse und Hemmung einer arteriellen oder venösen Restenose in einem Säuger.

17. Verbindung der Formel:

in der:

A' abwesend ist oder Asn, Gln, Ala oder Abu bedeutet;

A abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Arg, HArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Abu, Ala, Gly, His, Lys oder einem α-R'-substituierten Derivat davon, Dtc, Tpr oder Pro;

B eine D- oder L-Aminosäure ist, ausgewählt aus Arg, HArg, NArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Lys oder einem α-R'-substituierten Derivat davon,

Q abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Pro, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk) Pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle oder Nal oder einem α-R'-substituierten Derivat davon;

M abwesend ist oder Gly oder D- oder L-Glu, Phe, Pro, Lys, Ser oder, wenn n 1 ist, B-Gly-Glu-Q bedeutet;

W ein Halogenatom oder einen Alk-Rest bedeutet;

R' einen Alk-Rest oder PhCH&sub2; bedeutet;

Z&sub1; die folgenden Reste bedeutet

oder

Z&sub2; die folgenden Reste bedeutet

oder

wobei Z&sub1; und Z&sub2; über eine kovalente Bindung zwischen L¹ und L³ verknüpft sind;

L¹ und L² -S- bedeuten;

T¹ und T² jeweils ein Wasserstoffatom oder einen ersetzbaren Rest bedeutet;

X den Rest R&sub4;R&sub5;N bedeutet;

R&sub1; und R&sub2; Wasserstoffatome, Alk- oder (CH&sub2;)pAr-Reste bedeuten;

R&sub3; und R&sub3;, Wasserstoffatome, Alk-, (CH&sub2;)PAr-Reste -oder zusammengenommen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub4;- oder - (CH&sub2;)&sub5;- bedeuten;

R&sub4; ein Wasserstoffatom oder einen Alk-Rest darstellt;

R&sub5; die Reste R&sub1;&sub1;, R&sub1;&sub1;CO, R&sub1;&sub1;OCO, R&sub1;&sub1;OCH (R11')CO, R&sub1;&sub1;NHCH(R11') CO, R&sub1;&sub1;SCH(R11')CO, R&sub1;&sub1;SO&sub2; oder R&sub1;&sub1;SO bedeutet;

R&sub6; einen A1k-, OAlk-Rest, ein Halogenatom oder X bedeutet;

R&sub8; und R&sub8;, Wasserstoffatome, Alk-, (CH&sub2;) pPh-, (CH&sub2;) pNph- Reste oder zusammengenommen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub4;- oder -(CH&sub2;)&sub5;- bedeuten;

R&sub9; ein Wasserstoffatom, einen Alk-Rest oder Y bedeutet;

R&sub1;&sub0; ein Wasserstoffatom oder einen Alk-Rest bedeutet;

R&sub1;&sub1; und R1' Wasserstoffatome, C&sub1;&submin;&sub5;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl-, Ar-, Ar-C&sub1;&submin;&sub5;-alkyl-, Ar-C&sub3;&submin;&sub7;-cycloalkylreste darstellen; Ar eine Phenylgruppe oder eine mit einem oder zwei C&sub1;&submin;&sub5;-Al- kyl-, Trifluormethyl-, Hydroxy-, C&sub1;&submin;&sub5;-Alkoxyresten oder Halogenatomen substituiert ist,

Alk einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest bedeutet;

n die Bedeutung 1 oder 2 hat; und

p die Bedeutung 0, 1, 2 oder 3 hat;

mit der Maßgabe, daß, wenn Z&sub1; -L¹-C(R&sub3;)(R2') -CH(X)-CO- ist, R&sub3; und R&sub3;. Wasserstoffatome oder Alk-Reste bedeuten oder zusammen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub4;- oder - (CH&sub2;)&sub5;- darstellen, und wenn Z&sub2; -L²-C(R&sub8;)(R&sub8;)(R8') -CH(Y)-NH- ist, R&sub8; und R8' weder beide Wasserstoffatome oder Alkreste sind noch zusammen die Gruppen - (CH&sub2;)&sub9;- oder - (CH&sub2;)&sub5;- bilden; und

18. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) wie vorstehend in Anspruch 1 definiert, umfassend

a) die oxidative Cyclisierung einer Verbindung der Formel

in der:

A', A, B, Q, M, Z&sub1;, Z&sub2; und n wie in Anspruch 1 definiert sind; und

T¹ und T² Wasserstoffatome sind, oder

b) nucleophile Cyclisierung einer Verbindung der Formel (II) durch Behandlung mit einer Base, wobei A', A, B, Q, M, Z&sub1;, Z&sub2; und n wie vorstehend definiert sind, und einer der Reste T¹ und T² eine ersetzbare Gruppe ist und der andere ein Wasserstoffatom.

19. Verbindung der Formel

in der

A' abwesend ist oder Asn, Gln, Ala oder Abu bedeutet;

A abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Arg, HArg, NArg, (Me&sub2;)Arg, (Et&sub2;)Arg, Abu, Ala, Gly, His, Lys oder einem α-R'-substituiertem Derivat davon, Dtc, Tpr oder Pro;

B ein MeArg ist;

Q abwesend ist oder eine D- oder L-Aminosäure bedeutet, ausgewählt aus Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Pro, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk)Pen, Ala, Val, Nva, Met, Leu, Ile, Nle oder Nal oder einem α-R'-substituierten Derivat davon;

M Gly oder D- oder L- Glu, Phe, Pro, Lys, Ser oder, wenn n 1 ist, B-Gly-Glu-Q bedeutet;

W ein Halogenatom oder einen Alk-Rest bedeutet;

R' einen Alk-Rest oder PhCH&sub2; bedeutet;

n die Bedeutung 1 oder 2 hat, und

Alk einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest bedeutet;

Z&sub1; und Z&sub2; zusammengenommen eine kovalente Bindung zwischen dem aminoterminalen Ende und dem carboxyterminalen Ende bilden;

und pharmazeutisch aktive Salze davon.

20. Verbindung nach Anspruch 19, nämlich

Cyclo(1α,6γ)-Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-Glu-NH&sub2; (SEQ ID No. 14);

Cyclo-(1,8)-MeArg-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly-Asp-Phe (SEQ ID No. 16).

21. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

in der:

A', A, B, Q, M und n wie in Anspruch 19 definiert sind;

Z&sub1; und Z&sub2; zusammengengommen eine kovalente Bindung zwischen dem aminoterminalen Ende und dem carboxyterminalen Ende bilden, umfassend

i) Cyclisierung einer Verbindung der Formel:

H-[A'-A-(B-Gly-Asp-Q-)n-M]-OH

in der H- und -OH die Amino- und Carboxylreste beliebiger zweier nebeneinanderliegender Reste im cyclischen Peptid bedeuten und A', A, B, Q, m und n wie in Anspruch 19 definiert sind, mit einem Kupplungsreagenz, wobei reaktive Gruppen gegebenenfalls geschützt sind, und

ii) Entfernung der Schutzgruppen.