CZ37197A3 - Pharmaceutical preparation - Google Patents

Description

Vynález se týká prostředků pro léčení endotoxemie, soi|visející I s endotoxiny. Zvláště se týká prostředků pro léčení takové obsahem sloučenin, které neutralizují a/nebo odstraňují endotoxiny z organismu a lze je použít i pro prevenci těchto stavů.

Dosavadní stav techniky

Endotoxický šok je stav, často smrtelný, provokovaný uvolňováním lipopolysacharidů (LPS) z vnější membrány většiny gramnegativních bakterií (například Escherichia coli; Salmonella typhimurium). Struktura bakteriálních LPS byla již dobře objasněna včetně zvláštní molekuly, označované jako lipid A, která je připojena k acylovým řetězcům prostřednictvím glukosaminové kostry molekul lipidu A (viz Raetz, Ann. Rev. Biochem. 59: 129 - 170 (1990).

Molekula lipidu A slouží jako membránová kotva pro lipopolysacharidové struktury („LPS“) a je to LPS, který podmiňuje vývoj endotoxického šoku. Je třeba zdůraznit, že molekuly LPS jsou charakterizovány strukturou typu lipidu A a polysacharidovou částí.

Tato poslední část se může v různých LPS v detailech molekuly lišit, ale zachovává si obecné strukturní motivy, charakteristické pro endotoxiny. Bylo by nesprávné uvádět, že molekula LPS je od bakterie k bakterii stejná (viz Raetz výše). V oboru je běžné označovat různé molekuly LPS jako „endotoxiny“ a tento termín bude dále používán souhrnně pro označení molekul LPS.

V US patentu 5,128,318, zde uváděném jako referenčním, bylo předpokládáno, že rekonstituované částice, obsahující jak

-2 apolipoproteín spojený s HDL, tak i lipid, schopný vazby na endotoxin

- —. t-. —. 1»*k » jCIIU II IQMIvavc, wy « Λ It / I V l I I Jř

Kv/f **/ * lakn účinné materiálv oro zmírnění endotoxicity, způsobené endotoxiny.

Ve starších------přihláškách -(US—07/928_;93G_T -12.8.4992;s PCT/US93/07453, 9.8.1993; US 08/288,568, 10.8.1994; US patent

5,344,822 se uvádí, že pro léčení toxicity, způsobené endotoxiny, může být použito různých jiných iáíek. Zvláště bylo zjištěno, že apolipoproteiny nejsou v rekonstituovaných částicích nutné, a že

-rekonstituovaná^částice může obsahovat peptid a lipid, přičemž peptid io není apolipoproteín.

Bylo rovněž zjištěno, že toxicita, způsobená endotoxiny, může být léčena postupným podáváním buď apolipoproteinu nebi peptidu, po kterém následuje lipid. Po postupném podání se částice uspořádají do formy rekonstituovaných částic a potom odstraňují endotoxin.

Bylo také zjištěno, že alespoň někteří jedinci mají přirozené ,______úrovně apolipoproteinu, které jsou vyšší než normální úrovně, takže účinné léčení endotoxemie může být provedeno podáváním rekonstituovaných částic, které neobsahují apolipoproteín nebo peptid, ale obsahují lipid podle přihlášky.

Navíc vynález, popisovaný v těchto přihláškách, zahrnoval použití rekonstituovaných .částic ,a .zde diskutovaných složek pro prevenci endotoxi neřn žp uso bene^-toxicity^ podá'Vání m“ úči n něhomnožství prostředku v případě potřeby prevence. Léčené subjekty zahrnují paeienty, trpící infekcemi nebo v rekonvalescenci po chirurgickém zákroku. Tito pacienti mají někdy velmi nízké hladiny HDL v plazmě, někdy pouze 20 % normální úrovně. V těchto případech je pro včasnou prevenci pomocí HDL nanejvýš žádoucí, aby byla tato nízká hladina vykompenzována.

Nyní bylo zcela překvapivě zjištěno, že fosfolipidy mohou být so použity samostatně nebo v kombinaci s dalšími látkami, jako jsou neutrální lipidy, choláty apod., jako účinné prostředky pro zmírnění

- 3 a/nebo prevenci endotoxemie. Zvláště výhodné je použití fosfatidylcholinů (dále označovány „PC“), buď samostatně, nebo v kombinaci s dalšími fosfolipidy, jako jsou sfingolipidy, v prostředcích, které v podstatě neobsahují peptidy a proteiny, jako apolipoproteiny nebo od nich odvozené peptidy. Pokud se prostředky používají ve formě intravenózních jednorázových dávek, neutrální lipidy, jako jsou mono-, di-, a triglyceridy je možno kombinovat s fosfolipidy, pokud celkové množství neutrálních lipidů je pod určitou úrovní. Pokud se neutrální lipidy podávají jinými formami, jako například intravenózně infuzí, jejich obsah není tak kritický, ale je třeba ho brát v úvahu.

Další výhodná provedení vynálezu zahrnují emulze, kde se spolu s fosfolipidem a neutrálním lipidem používá žlučová kyselina nebo sůl žlučové kyseliny.

Je zde ukázána účinnost žlučových kyselin a solí žlučových 15 kyselin, tedy cholátú, při léčení endotoxemie. Žlučové kyseliny je možno používat samostatně nebo v kombinaci s jedním nebo více fosfolipidy a/nebo neutrálními lipidy, jako je fosfatidylcholin a nebo triglycerid.

Vynález je detailněji popisován v následujícím textu.

Podstata vynálezu

Příklad 1

Faktory, které ovlivňují stimulaci faktoru TNF-α prostřednictvím LPS při zachování integrity interakce mezi proteiny plazmy a krevními elementy, je možno vhodně studovat in vitro v systému úplné lidské krve. Stejný systém byl použit k určení, která z lipoproteinových složek je důležitá při neutralizaci LPS.

Testovanými materiály byly rekonstituované proteiny s vysokou densitou (R-HDL), přirozené lipoproteiny plazmy (VLDL, LDS, HDL),

- 4 sérum s nedostatkem lipqproteinů (LPDS) a 20 % emulze !NTRA!_!P!DO bchat^ <*5ηίνο«πΗν fsměs triaivceridů a fosfolipidů).

I I i ι i \/ \ ii i k— f ** b J — - J \ - - - — “

Krev byla odebírána do heparinizované zkumavky, zředěna ^_róžtókěfň^Hank’s^Baiarrced--Salt-Solutian—(dále- -„H8SS“)- nebo__ _

- testovaným materiálem, rozpuštěným v HBSS. Výsieaný materiál byl přenesen do zkumavek Starstedt (250 μΙ/zkumavku). LPS bylo rozpuštěno v apyrogenním fyziologickém roztoku, obsahujícím 10 mM

HEPES, a přidáno (2,5 μ!) na konečnou koncentraci 10 ng/ml. Po _čtyřhodinové^inkubaci při 37 °C byly zkumavky ochlazeny na 4 °C a io centrifugovány při 10.000 g po dobu 5 minut. Supernatant byt sebrán a testován na TNF-α s použitím komerčního testu ELISA.

Následující tabulka 1 ukazuje srovnání prostředků, složených z ' testovaných materiálů. Obrázky 1A a 1B ukazují výsledky. Data jsou ukázána jako množství produkovaného TNF-α, vyneseného proti is koncentraci přidaného proteinu (oČFřT^TAjra-fusfafípřdcrfabr—ŤB-)r-By4opoužito logaritmického měřítka pro zobrazení širokého rozsahu použitých koncentrací, přičemž 10° odpovídá 1 mg/ml. Všechny inkubace úplné krve obsahovaly 10 ng/ml LPS E. coli 0111:B4, doplněný jedním z prostředků, jak ukazuje popis obrázků 1A a 1B.

Fakt, že se materiály liší v účinnosti při vyneseném obsahu proteinu (obr. 1 A), přičemž jsou velmi podobné když je vynesen obsah ^^fosfoíipidu~(obrrŤB)ntikazují'^na^tor že=fo5foíípidje--důléžitou-složkou^ Toto je potvrzeno zjištěním, že bezprotelnová emulze lipidu je účinnější než přirozený HDL, ale méně účinná než R-HDL. Zdá se, že protein není pro neutralizaci důležitý.

- 5 Tabulka 1: Složení přirozených lipoproteinú a rekonstituovaného HDL

Lipoprotein	TC	TG	PC	Protein
Třída	Hustota (g/ml)	% hmotnostní
VLDL	< 1,006	22	53	18	7
LDL	1,007 - 1,063	48	11	22	20,9
HDL	1,063 - 1,21	18	8	22	52
R-HDL	1,063 - 1,21	. -	-	79	21
LPDS	>1,21	0	0	2	98
Intralipid	-	1	93	6	0

Příklad 2

V dalším kroku byly testovány v úplné lidské krvi bezproteinové emulze lipidů, obsahující různá množství neutrálního lipidu. Bylo použito stejného testu na úplné lidské krvi in vitro, jak je uvedeno v příkladu 1.

Všechny popisované částice byly připraveny podle stejného protokolu, který zahrnoval míšení fosfolipidu, sfingomyelinu nebo fosfatidylcholinu, trioleinu a/nebo neesterifikovaného esteru cholesterolu, rozpuštěného v chloroformu, a navážení do lahvičky. Jako antioxidant byl přidán vitamin E (0,02 % hmotnost/objem). Potom byl připraven film suchého lipidu přeháněním suchého plynného dusíku nebo argonu přes vzorek. Potom byl do lahvičky přidán jeden objem apyrogenního fyziologického roztoku a lahvičkou bylo mícháno na mixéru, dokud nebyl všechen lipid suspendován. Roztok byl potom homogenizován ve vysokotlakém homogenizátoru. Vzorky, obsahující fosfatidylcholin (PC) s nebo bez trioleinu byly homogenizátorem cyklovány desetkrát při tlaku 136 MPa. Vzorky s obsahem esteru cholesterolu s jedním nebo více dalšími lipidy byly cyklovány 15 - 20 x

- 6 při tlaku 204 MPa. Homogenizované roztoky byly filtrovány stříkačkou s filtrem 0_:45 um a filtrát bvi až do použití (během 3 dnů) skladován při pokojové tepiotě. Získané výsledky ukazují obrázky 2A a 2B. V __těchto studiích je vynesena produkce LPS - dependentního TNF-a s proti koncentraci přidaného triglyceridů (obr. 2A) nebo fosfolipidu (obr. 2B). Prostředky, jak je uvedeno v popisu obrázku, obsahovaly (v procentech hmotnostních) 7 % triglyceridů („TG“), 45 % TG, 89 % TG, 94 % TG, R-HDL nebo fosfoiipid bez TG (ukázáno jen v obr. 2B). Prostředek s 89 % TG je s 10 % INTRALIPIDOem, zatímco 94 % TG se _{10 vz}tgh_ui_s i< 20 % INTRALIPIDu, Ve všech ostatních testech bylo použito vaječného fosfatidylcholinu (PC) a trioieinu.

Tyto výsledky ukazují, že bezproteinové prostředky, srovnávané ve vztahu k obsahu triglyceridů, jsou velmi odlišné. Tyto prostředky jsou si však velmi podobné, pokud jsou testovány vzhledem k obsahu _15 fosfolipidu (PC). To potvrzuje úlohu fosfolipidu, zejména pokud je účinný samotný fosfoiipid, ale v menší míře to nastává u emulzí,

------------- obsahujících až do 45 % TG.------------------------------ · ...................—

Příklad 3

Práce potom pokračovala na experimentech in vivo na myším modelu, který je považován za spolehlivý systém pro předpovídání u =—= —- “iicií; ----- -- - ——- _ _ —

V těchto experimentech byla myším podána jednorázová injekce dostatečných množství výše popsaných prostředků stejně jako dalších prostředků, (čistý fosfatidylcholin, 7 % TG, 25 % TG, 45 % TG, 71 % TG, 81 % TG, 89 % TG a 94 % TG) nebo kontroly s fyziologickým roztokem pro vytvoření dávky fosfolipidu (buď 200 mg/kg nebo 400 mg/kg) spolu s 25 mg/kg LPS E. coli 0111;B4. Kontrolní skupina dostala intravenozně fyziologický roztok ve stejném množství jako objem emulze. Přežívání po 72 hodinách je uvedeno v obr. 3. Ze 344 zvířat v kontrolních skupinách přežilo 155.

- 7 Samotný PC má mírný ochranný účinek, při míře spolehlivosti 95 % statisticky nevýznamný, zatímcoprostředky s obsahem TG 7 %, 45 % a 71 % výrazně zlepšovaly přežití. Prostředky s obsahem 80 % a 89 % TG byly účinné pouze částečně, zatímco 94 % TG přežití snižovalo.

Když byla dávka zvýšena až na 400 mg/kg PC, jak 89 %, tak i 94 % emulze TG významně snižovaly dobu přežití, pravděpodobně kvůli otravě TG, jak bude vysvětleno dále.

io Příklad 4

Práce, popisovaná v příkladech 1 - 3 ukázala, že fosfolipidy jsou aktivním prostředkem, působícím při inhibici endotoxemie. Fakt, že nepolární lipidy jiné než triglyceridy mohou tvořit emulze s fosfolipidy jinými než PC naznačuje, že mohou být vyzkoušeny také ostatní lipidy. is Jako příklady uvádíme sfingomyelin (další fosfolipid) a neesterifikovaný cholesterol (polární neutrální lipid) a jejich směsi. Mohou tak být také použity esterifikovaný cholesterol (nepolární ester), skválen (uhlovodík) a vitamin E (nepolární antioxidant). Pro jejich testování byla navržena řada experimentů s užitím úplné lidské krve (viz příklad 1) a testu přežívání myší (viz příklad 3).

Výše uvedeným způsobem byly připraveny emulze s použitím čistého fošfatidylcholinu, fosfatidylcholinu s 10 % hmotnostními neesterifikovaného cholesterolu, 10% hmotnostními sfingomyelinu . nebo celkově 10 % směsi obou. Emulze byly k úplné krvi přidávány v 25 koncentraci 100 mg/dl vzhledem k PC a 10 ng/ml LPS. Směs byla inkubována a bylo měřeno uvolňování TŇF-ou

Výsledky ukazuje obr. 4. Produkce TNF-a byla podstatně

- :

redukována již samotným PC. Uvolňování TNF-α potlačovaly rovněž emulze s obsahem neesterifikovaného cholesterolu, sfingomyelinu nebo směsi obou.

Příklad 6

Er.~. ; ;r.~ ----to.ifil/nnonáhn phnlaetarnln nU UlUUVaill vlivu hus i. ii'« .--ihn sfingomyelinu na emulze s obsahem neutrálního lipidu byl také použit _____tesu s-úpIn o u. krví— Em u lze J3y1y_opět_ při dá vány, v_ ko nceni traci___100 mg/di PC. v následující tabulce 2 jsou uvedeny různé prostředky (v % hmotnostních).

Tabulka 2

	Emulze	Složení
	~ a c q/ Tr> r o zo i O	ςς · Ας W W · -T w
PC +TG + C	54,4 : 45,3 : 0,3
PC+TG + SP	51,6 : 43,0 : 5,4
PC + TG + C + SP	51,4:42,9:0,3:5,4
PC + CE	54,5 : 45,5
........— .......-..... —
PC + CE+ C	54,4 : 45,3 : 0,3
PC + CE + SP	51,6:43,0:5,4
PC + CE+ C + SP	51,5:42,9:0,3:5,4

Výsledky jsou ukázány v obrázcích 5A a 5B. Emulze PC, připravené-vždy^s^neutrášním-lipidem, s^nebo=bez=dalšich^pólárnich₌ lipidu, meiy inhibicni účinek. Byla použita opět Koncentrace 10 ng/ml, která klinicky odpovídá koncentraci endotoxinu. Emulze, obsahující ester cholesterolu, mají menší účinnost než emulze s obsahem TG, zatímco emulze s obsahem neesterifikovaného is cholesterolu nepotlačují TNF-α stejně jako emulze, které ho neobsahují. Zdá se, že přídavek sfingomyelinu k emulzím zlepšil potlačení produkce TNF-a.

- 9 Příklad 6

Emulze, obsahující ester cholesterolu, byly testovány na modelu in vivo, použitém v příkladu 3, s letální dávkou endotoxinu. Byly připraveny emulze s obsahem PC a TG nebo PC a esteru cholesterolu (CE), které byly podávány v jednotlivé dávce 200 mg/kg PC spolu s 25 mg/kg E. coli 0111:B4 LPS (smrtelná dávka) ocasní cévou. Kontrolní skupiny dostaly intravenózně stejný objem fyziologického roztoku. V obrázku 6 jsou porovnány výsledky pro emulze, obsahující CE a TG. Každá emulze byla testována minimálně ve dvou experimentech s ío použitím 16 a více zvířat.

Jak je ukázáno, emulze s obsahem 7 % nebo 45 % CE (% hmotnostní) významně zlepšovaly přežití. Tyto výsledky spolu s výsledky podle příkladu 5 ukazují, že CE může být nahrazeno TG za vytvoření emulzí, které neutralizují endotoxin.

Příklad 7

Bezproteinové emulze fosfolipidů s triglyceridem účinně blokují produkci TNF-α v úplné krvi, stimulovanou LPS. Teoreticky mohou být také tyto emulze účinné in vivo, jestliže je možno je bezpečně podávat

2o v dávkách, které vytvoří ochranné koncentrace fosfolipidů v plazmě. Naše předchozí experimenty s R-HDL ukazují, že minimální dávka fosfolipidů je přibližně 200 mg/kg. S použitím této dávky a objemu plazmy, která tvoří 4,5 % tělesné hmotnosti, lze vypočítat koncentraci triglyceridu, očekávanou v plazmě, po podání řady emulzí se stoupajícím obsahem triglyceridu. Výsledek ukazuje obr. 7 jako hladkou čáru, která se zakřivuje vzhůru se stoupajícím hmotnostním % TG. Koncentrace TG v plazmě u zdravých dospělých zřídka překročí 1000 mg/dl dokonce i po tučném jídle. U pacientů s.koncentrací TG v plazmě nad 2000 mg/dl ja hlášena pankreatitida’ (Farmer, a další,

Amer. J. Med. 54: 161 - 164 (1973); Krauss, a další, Amer. J. Med. 62; 144 - 149 (1977); Glueck, a další, J. Lab. Clin. Med. 123: 59 - 61).

- 10 Koncentrace TG nad 4000 mg/dl je extrémně vzácná a svědčí o vážném stavu. Poslední dvě hladiny jsou na obrázku označeny vodorovnými čárami. Podání buď 10 % nebo 20 % INTRALlPID®u v dávce, která poskytne 200 mg/kg fosfolipidu, má zvýšit koncentrace s TG v plazmě (viz dva prázdné kroužky) s jistotou nad bezpečné meze.

Naopak podání emulzí, které obsahují 7 %, 45 %, 71 % nebo 78 % (plné čtverce zleva doprava) zvýší koncentraci TG v plazmě na 136,

477, 1300 nebo 2000 mg/di. Emulze s obsahem TG až do přibližně 50 % by neměly být z hlediska TG toxické.

¹⁰

Příkíad 8

Ve stejném typu experimentů, který se uvádí v předcházejících příkladech, byla testována účinnost kombinací fosfolipidu a žlučové kyseliny, tj. cholátu sodného.

is Způsob, kterým byly připravovány prostředky, podávané testovacím zvířatům, však byl odlišný.

V tomto příkladu a v následujících příkladech byly prostředky připravovány s použitím vysokotlakého homogenizátoru Microfluidizer. Tento přístroj umožňuje zvětšení měřítka.

2o Kapalný triolein nebo kapalný sojový triglycerid byly naváženy _2 do vhodného -množství vody nebo v ody, ob s a buj ící 9' mMí 18' mM- nebo 36 mM cholát sodný. Na papír by! navážen pevný granulovaný fosfatidylcholin a potom pomalu za míchání přidáván k roztoku. Pro dispergování lipidu je vždy potřebná doba 3 až 5 minut. Po dispergaci byly materiály nality do homogenizátoru. Zařízení používá pro pohon čerpadla hydraulického tlaku a dva paprsky vzorku jsou směřovány proti sobě. Tlak může dosáhnout až 170 MPa. Po srážce jsou paprsky protlačovány tryskou ve tvaru kříže a tím se roztok homogenizuje.

Vzorky byly recirkulovány homogenizátorem, přičemž jeden

3o průchod je definován jako čas, který potřebuje čerpadlo k protlačení

- 11 celého vzorku přístrojem. Pro dosažení homogenního vzorku byl vzorek cirkulován dvacetkrát. Byla přidána dextróza do konečné koncentrace 5 %.

Při pokojové teplotě byly smíseny endotoxin, vyčištěný z E. coli 5 0111:B4 (40 mg/kg) a emulze, která je diskutována dále (200 mg fosfatidylcholinu/kg) byly smíseny a ihned podány intravenózní injekcí ocasní cévou myším C57BL6/J (hmotnost mezi 19 a 30 g). Myši, kterým byl podáván samotný cholát, dostávaly objem cholátu sodného stejný jako objem emulze přípravku cholát/EML při stejné koncentraci io cholátu. Kontrolní myši dostávaly stajný objem 5 % dextrózy, aby byla zachována osmolalita plazmy.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3, která následuje. Emulze fosfatidylcholinu / 7 % triglyceridu, popsaná v předcházejících příkladech. Pokud byl použit cholát sodný, byl přidáván v uvedených i5 koncentracích k surovým materiálům před jejich emulgací.

Tabulka 3: Ochrana myší od letální dávky endotoxinu

Čas	Kontrola	7 % TG	7 % TG + CA	18 mM CA
	9 mM	18 mM	36 mM	bez PC nebo TG	+ PC
h	Počet přeživších (N)
0	28	28	8	16	8	- 8	8
24	9	12	4	15	8	8	8
48	. 5..	10	2	15	8	8	8
72	2	5	1	15	8	8	8
96	1	0	1	15	8	7	8

Dále udáváme hmotnostní procenta v emulzích. Při použitém 9 mM cholátu jsou hmotnostní procenta vzhledem k emulzi: 7 % cholátu,

6,1 % triglyceridu a 86,9 % fosfatidylcholinu. Při použitém 18 mM

- 12 cholátu jsou hmotnostní procenta vzhledem k emulzi: 13,1 % cholátu, ^ΛΖ — : -i - - — 04 O O/ f μ λ I i Drí noii^ífcim ΓϊίΚΛ

Q,Z 70 UiyiyueilUU a UI,4Í. /a ivuiauujiviivuiiu. . .. _rwM^.»wU:

cholátu jsou hmotnostní procenta vzhledem k emulzi: 23,2 % cholátu, -5-% 4rlglyce.ridu.a-74,8-.%-fosfat!dylcholinu___________________________________

Je třeba zdůraznit, že v těchto experimentech podávané množství LPS (40 mg/kg) je mnohem vyšší než množství používané pro studium letality v předcházejících experimentech. Účeiem těchto vyšších dávek je překrýt jakýkoliv ochranný vliv, který by bylo možno připsat—fosfatidylcholinu a—nebo—trigLycerldu—Závěr,—který_by_jriěL vyplynout z těchto experimentů je ten, že existuje ochranný účinek, který lze přičíst soii žlučové kyseiiny, cholátu sodnému.

Nejsou zde uvedeny studie, prováděné s použitím jiných solí žlučové kyseliny a solí žlučové kyseliny s obsahem taurinu. Další příklady žlučových kyselin jsou allodeoxycholová kyselina,

Ts rithocfiioldvá kyselina“ RyOdeoxycholová kyselina; hyocholovákyseiina, α, β a ω - muricholové kyseliny, murodeoxycholová kyselina, ursodeoxycholová kyselina, ursocholová kyselina a všechny jejich soli jako jsou soli sodné nebo konjugáty s taurinem nebo glycinem (viz Hoffmann, výše).

-Příklad 9 — „ - · ... - .. _

Dále bylo studováno přežívání při použití myší jako pokusných zvířat.

V této studii byla pokusná zvířata rozdělena do čtyř skupin. 25 První skupina dostala roztok 5 % dextrózy a byla použita jako kontrolní. Druhá skupina dostala emulzi 93 % hmotnostních fosfatidylcholinu a 7 % hmotnostních triglyceridů, připravených jak je uvedeno výše. Emulze obsahovala 5 % dextrózu a sojové fosfolipidy v množství přibližně 50 mg/ml lipidu. Ve třetí a čtvrté skupině byla zvířatům podána podobná emulze jako druhé skupině, doplněná buď

- 13 18 mM cholátem sodným nebo 18 mM deoxycholátem sodným. V tomto experimentu bylo použito stejného protokolu jako v příkladu 8.

Přežívání bylo měřeno 72 hodin po podání a je uvedeno v následující tabulce:

Tabulka 4: Účinek přídavku žlučové kyseliny k 7 % emulzi triglyceridu na 72 hodinové přežívání myší.

Skupina	N	Přežití	Hodnota p ve skupině
	%	1	2	3
1	5 % dextróza	28	4	-	-	-
2	7 % TG	64	8	NS	-	-
3	cholát sodný + 7% TG	16	94	0,00001	0,00001	-
4	deoxycholát sodný + 7 %TG	8	75	0,0001	0,00001	NS

Při porovnání přežití byla statistická významnost mezi skupinami io testována generalizovanou Wilcoxovou metodou s použitím počítačového programu. Porovnání se skupinou 1 kontroly jsou uvedena v řádku „1“, porovnání se skupinou 2, ošetřenou 7 % emulzí jsou uvedena v řádku „2“ a porovnání se skupinou 3, léčenou emulzí s cholátem sodným jsou uvedena v řádce „3“.

Ί5 dak procento přežití, tak i statistická analýza jasně ukazují neočekávanou převahu prostředků s obsahem žlučové kyseliny.

Příklad 10

Ve druhé sérii experimentů bylo jako modelu použito králíka. V 20 tomto modelu se určovalo uvolňování TNF-α (tumor necrosis factor).

- 14 Králíci byli rozděleni do tří skupin a dostali.5 % roztok dextrózy,

0Λ / 7 %\ íoL· ia rJictit ilnv/ónn \/óca

C7I(IUÍ4LÍ I UQI Ulipiuu « ii iy ijr wvi iww _t t j**«* j ** *· <«*·««·. - —« · ~ nebo emulzi 93 % Ί 7 % s obsahem 18 mM kyseliny cholové.

_Koncentrace_dextrózy_byia„u_všech_emulzí_nastayena_na__5_%, jako v přikladu 3. Králíci dostali uvaděči dávku emulze a o 2 hodiny později jim bylo podáno 100 pg LPS E. coli 0111 : B4. Po uváděcí dávce byly prostředky podávány intravenozne prubeznou ínfuzi rychlosti 50 mg lipidu na kg tělesné hmotnosti za hodinu, intravenózní podávání pokračovalo 3 hodiny po podání LPS.

Ίο Králíkům byla odebírána krev před začátkem experimentu, 30 minut po podání uváděcí látky a v hodinových intervalech v průběhu 5 hodin po podání.

V následující tabulce jsou uvedeny špičkové hodnoty TNF-a. Těch bylo dosaženo 2 hodiny po podání endotoxinu.

Byla určována statistická významnost za použití známého

Studentova testu . Jak je v tabulce ukázáno, po podání 18 mM kyseliny cholové došlo k podstatnému snížení hladiny TNF-a.

Tabulka 5 Účinek emulze na produkci TNF-α u králíka

	Emulze	TNF-a	Významnost
		ng/mi	N	P
Kontrola 5 % dextróza	134±70	9
Emulze” 7 %'TG	68±5	5	<0,05
Emulze 7 % TG + 18 mM kys.cholové	39±20	4	<0,01

Předcházející příklady detailněji popisují vynález, který v jednom hledisku zahrnuje zmírnění nebo prevenci endotoxemie u

- 15 pacienta podáváním účinné dávky fosfolipidu, s kterým se endotoxin spojuje. Fosfolipid spojený s endotoxinem je potom z těla odstraněn standardními biologickými způsoby, které se neliší od normálních v oboru známých způsobů odstraňování lipoproteinových částic. Spojení endotoxinu s fosfolipidem endotoxin inaktivuje.

Příklady také ukazují, že pro dosažení stejného účinku jako u fosfolipidů, tj. léčení a prevence endotoxemie, je možno také podávat některou látku z rodiny kyselin cholových nebo solí kyselin cholových, jako je kyselina žlučová nebo sůl kyseliny žlučové. Pro léčení endotoxemie tědy mohou být použity prostředky, neobsahující peptidy a proteiny, ve kterých je přítomna žlučová kyselina, sůl žlučové kyseliny nebo obě látky. Kyseliny cholové se popisují např. u: Hofmann, Hepatology 4(5): 4S-14S (1984), která se zde uvádí jako reference. Pozornost je třeba věnovat zvláště obrázkům 1 a 2 na str.

is 5S, které ukazují struktury, charakteristické pro kyseliny cholové.

Léčeným subjektem je zejména člověk, ale vynález je možno také použít ve veterinárním lékařství.

Termín „zmírnění“ se zde používá pro léčení, které snižuje zátěž endotoxemií, způsobenou některým z produkovaných endotoxinú, například gramnegativních bakterií (S. typhimurium, E. coli atd.). Prevenci je možno provádět podáváním prostředku v okamžiku, kdy jedinec je nebo pravděpodobně bude v situaci, kdy může dojít k expozici endotoxinuem. To se klasicky vyskytuje v průběhu chirurgického zákroku. Jedinec, který se má podrobit chirurgickému výkonu, tedy může dostat aktivní složku jako přípravu na výkon.

Účinné množství kombinace fosfolipidu a žlučové kyseliny, nutné pro léčení pacienta, může být různé. Obecně se dává přednost dávce od 200 až do přibližně 800 mg fosfolipidu na kg tělesné

3o hmotnosti, avšak množství může být nižší nebo vyšší v závislosti na vážnosti endotoxemie nebo stupni rizika ve vztahu k prevenci. Pro

- 16 kyseliny cholové a jejich soli, jako jsou žlučové kyseliny a jejich soli, —· — ů.í. **!UI!ii««X Ί Π «**» *·4λ kt I i^>r> A ΓΎΊΛΐ Γϊ Lr Π oc puuíjva uavr\a wm ριιυικ,ιι^ iw xw ..._a tělesné hmotnosti, lépe 15 mg až přibližně 275 mg na kg tělesné .hmotností.-_____________________ ___________________________.

Je žádoucí podávat žlučovou kyselinu nebo „soli žlučové kyseliny a fosfolipidy v prostředcích, které také obsahují neutrální lipidy, ale není to nezbytné, protože emulze bez neutrálních lipidů se pravděpodobně budou vyskytovat také. Požadavek na kombinované

-podávánLfosfolipidů^vypLývá-ze_sku.tačno_s.ti^_že_se_neuírálnLllf3idy_a_ io fosfolipidy spojují do částic, které se podobají lipoproteinúm, ale lisí se od nich tím, že neobsahují žádné proteinové nebo peptidové složky, které jsou samozřejmě v lipoproteinech vždy přítomny.

Zvláště požadovanými formami léčení jsou ty, kde fosfolipidem je fosfatidylcholin, jako např. fosfatidylcholin vaječného žloutku,

Tš ^fosfaficiytčITOliřrže^oji-n&bo-sflTrgeii^iclTTJakoržlučOvá-kyselina-nebOsůl žlučové kyseliny je výhodná kyselina cholová a/nebo její soli, jako je cholát sodný, deoxycholát sodný a chenodeoxycholát sodný. Co se týče neutrálních lipidů, je výhodné používat ester cholesterolu nebo triglycerid, ale mohou být také použity jiné neutrální lipidy, jako je skvalen nebo jiné uhlovodíkové oleje, di- a monoglyceridy a antioxidanty, jako je vitamin E.

( _ . 3* -f I r- —l ITL- »» si X l t X Λ l lA. jr JX rt t ř ·”ϊ Lr » I

X4,C’puU4,iri U4i i γ vi i i u! en Γμυυαναιιιρι uou curu, ' JZI IVGI i ix.25 výhodná je jednorázová injekce nebo jiné intravenozní formy. Pokud se použije forma jednorázové injekce, a prostředek obsahuje triglycerid, musí se věnovat určitá pozornost dávkování. Je totiž poměrně dobře známo, že triglyceridy jsou toxické, když se podávají v příliš velké dávce. Odborník s obvyklou zkušeností v oboru však může snadno sestavit prostředek tak, aby bylo riziko otravy triglyceridem sníženo nebo odstraněno. Obecně, pokud se používá formy jednorázové injekce, by prostředky neměly obsahovat více než 80 hmotnostních procent triglyceridu nebo jiného neutrálního lipidu, s

- 17 výhodou ne více než 70 % hmotnostních. Nejvýhodněji by prostředky k podávání jednorázovou injekcí neměly obsahovat více než 50 % hmotnostních neutrálního lipidu.

Když se však použije jiné intravenózní formy, než je 5 jednorázová injekce, riziko otravy je sníženo. I pro intravenózní nebo i ostatní formy podávání jsou nicméně výše uvedené rozsahy výhodné, i když ne nezbytné. Pro žlučové kyseliny a soli žlučových kyselin se dávky s výhodou pohybují od přibližně 25 mg/kg tělesné hmotnosti až do přibližně 500 mg/kg tělesné hmotnosti, přičemž zvláště výhodné io jsou dávky od přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti do přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti. Pro fosfolipidy jsou výhodné dávky od přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti až do přibližně 1000 mg/kg tělesné hmotnosti. Uvedené dávky jsou obecně použitelné, avšak budou se lišit v závislosti na pacientovi a způsobu podávání.

Jak je uvedeno výše, prostředky bez proteinů a peptidů vyžadují přítomnost alespoň jednoho fosfolipidu nebo žlučové kyseliny/soli žlučové kyseliny. V případě fosfolipidu je výhodné, aby byl přítomen alespoň jeden neutrální lipid, jako je triglycerid, diglycerid nebo monoglycerid. Prostředky mohou obsahovat další materiály, jako jsou steroly (např. cholesterol, β-sitosterol), esterifikované nebo neesterifikované lipidy (např. ester cholesterolu nebo neesterifikovaný cholesterol), uhlovodíkové oleje, jako je skvalen, ántioxidanty jako je vitamin E, avšak tyto látky nejsou nezbytné. V takovém prostředku může být samozřejmě použito více než jednoho fosfolipidu a/nebo více . 25 než jednoho neutrálního lipidu. Pokud se používá kombinací neutrálního lipidu a fosfolipidu, neutrální lipid by měl být přítomen v koncentraci οά přibližně 3 % až do přibližně 50 % hmotnostních vzhledem k celkovému množství lipidu v prostředku. ,

V případě žlučových kyselin/solí žlučových kyselin je možno je

3o použít odděleně nebo v kombinaci s fosfolipidem, neutrálním lipidem nebo oběma. S· ohledem na tyto další materiály (např. fosfolipidy a

- 18 neutrální lipidy) jsou výhodné výše uvedené látky. Je možno popř.

použil aaisi siuuueiiiny 4. vyae uveucnyCn.

Součástí vynálezu jsou také prostředky, použitelné pro léčení end ot óxem i é( Jedním ž proveden í“ výn á I ezu v této^- § kup iň ě^j e“ prostředek, obsahující alespoň jednu látku ze skupiny žlučová kyselina /sůl žlučové kyseliny, fosfolipid a neutrální lipid, přičemž prostředek jako celek obsahuje množství látky, které umožní zmírnit endotoxemii. Tento prostředek s výhodou obsahuje (v % hmotnostníGh)-od-přibliině-5-% do-přib!ižně-30⁰/o^žlučové-kyseiiny/solL žlučové kyseliny, od přibližně 3 % do přibližně 50 % neutrálního lipidu a od přibližně 10 % do přibližně 95 % fosfolipidů. Zvláště výhodné jsou prostředky, obsahující od přibližně 10 - 15 % hmotnostních žlučové kyseliny /soli žlučové kyseliny, od přibližně 5 % do přibližně 10 % hmotnostních neutrálního lipidu a zbytek tvoří fosfolipid.

ís Je třeba zdůraznit, že tato hmotnostní procenta se vztahují na prostředky, skládající se ze tří složek. Když je třísložkový systém . ...______.... . .... . .............___________________- _ _______ _____ __________ . ______ ύ·λ __ _ _ kombinován např. s nosičem, pomocnou látkou a případnými výše uvedenými látkami, procento vztažené na celý prostředek tím poklesne. Dále je třeba zdůraznit, že tyto farmaceutické prostředky jsou vždy bez proteinů a peptidů.

V případě prostředků, které neobsahují žlučovou kyselinu nebo sÚ!^-ž!učové⁼kyseíiny“ takové prostředky•-be2_^!-pfoteinů⁼“'a-^s'peptidu-s^t výhodou obsahují alespoň přibližně 3 % hmotnostní neutrálního lipidu, až do přibližně 50 % hmotnostních neutrálního lipidu, přičemž zbytek tvoří alespoň jeden fosfolipid. Neutrální lipid je s výhodou triglycerid, ale může jím být jakýkoliv z dalších neutrálních lipidů, které se uvádějí výše. Fosfolipidem také může s výhodou být fosfatidylchoiin.

Další aspekty vynálezu budou odborníkovi v oboru jasné a není třeba je zde dále rozvádět.

Uvedené příklady a specifikace je nutno pokládat za ilustrativní a v žádném případě nemají předkládaný vynález omezovat; další

- 19 provedení v rámci podstaty vynálezu jsou pak odborníkům v oboru samozřejmé.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A a 1B ukazuje výsledky, pro testování různých prostředků na modelu, přičemž byla určována neutralizace endotoxinu pomocí uvolňování TNF v úplné lidské krvi.

Obr. 1A ukazuje úlohu proteinu a obr. 1B úlohu fosfolipidu. Testovanými sloučeninami jsou přirozené lipoproteiny a (VLDL,

LDL, HDL), rekonstituovaný HDL ( R-HDL) a prostředky

INTRALIPID®, stejně jako emulze s obsahem fosfolipidu a proteinu.

Obr. 2A a 2B srovnávají úlohu triglyceridu (neutrálního lipidu) a fosfatidylcholinu, fosfolipidu, na stejném modelu.

Obr. 3 ukazuje toxicitu způsobenou podáním různých prostředků PC a PC/TG na myším modelu s použitím modelu s 55 % letalitou, přičemž se podává LPS E. coli.

Obr. 4 ukazuje data, která je možno porovnat s testem s úplnou lidskou krví výše, ale s použitím fosfolipidu s neesterifikovaným cholesterolem, sfingomyelinem nebo směsí obou na místě triglyceridů.

Obr. 5A a 5B ukazují výsledky, porovnatelné s výsledky na obrázcích 1A a 1B s tím rozdílem, že v nových obrázcích je fosfolipid, neestirifikovaný cholesterol a/nebo sfingomyelin smíchán s

2s ’ triglyceridy nebo esterifikovaným cholesterolem jako neutrálním tukem.

Obr. 6 porovnává výsledky získané s použitím esteru cholesterolu a emulzí s obsahem triglyceridu na myším modelu in vivo.

- 20 Obr. 7 ukazuje prostředky podle vynálezu teoretická množství trinivreridů uvolněná do krve do Dodání různých TG, s · <9 - y ^- ~ “ -- - · vyznačenou úrovní toxicity.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY j j

   L ( b 0 f. 0

   1. Farmaceutický prostředek bez proteinů a peptíďl, _ vyznačující se tím, že obsahuje kyselinu cholovou nebo sůl kyseliny cholové, fosfolipid a neutrální lipid.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznalo čující se tím, že kyselinou cholovou nebo solí kyseliny cholové je žlučová kyselina nebo sůl kyseliny žlučové.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, is vyznačující se tím, že že sůl kyseliny žlučové je zvolena ze skupiny cholát sodný, deoxycholát sodný a chenodeoxycholát sodný.
4. 4. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, je cholát sodný.

   podle nároku 2, ž e solí žlučové kyseliny
5. 5. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že fosfolipidem je

   25 fosfatidylcholin.

   -22
6. 6. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 4, vyznačuj i C i a a ! i.·'* /*J Í.a

   C? I VUl V I l|V IM Wl i i jw sfingolipid.
7. 7. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že neutrálním lipidem je triglycerid.
8. 8. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že neutrálním lipidem je ester cholesterolu.
9. 9. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že obsahuje až do 70 % hmotnostních neutrálního lipidu. ·
10. 10. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že obsahuje až do 50 % hmotnostních neutrálního lipidu.
11. 11. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že obsahuje od přibližně 5 % do přibližně 10 % hmotnostních neutrálního lipidu.
12. 12. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr fosfolipidu k neutrálnímu lipidu je přibližně 93 : 7.

    - 23
13. 13. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje od přibližně 5 % hmotnostních do přibližně 30 % hmotnostních kyseliny cholové nebo soli kyseliny cholové.
14. 14. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že obsahuje od přibližně 10 % hmotnostních do přibližně 15 % hmotnostních kyseliny cholové nebo soli kyseliny cholové.
15. 15. Farmaceutický prostředek bez proteinů a peptidů, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr kyseliny cholové nebo soli kyseliny cholové, fosfolipidu a neutrálního lipidu je přibližně 13 : 81 : 6.
16. 16. Farmaceutický prostředek podle nároku 15. vyznačující se tím, že fosfolipidem je fosfatidyicholin, neutrálním lipidem je triglycerid a kyselinou cholovou nebo solí kyseliny cholové je cholát sodný.
17. 17. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 16 pro použití v lékařství.
18. 18. Použití farmaceutického prostředku podle některého z nároků 1 až 16 při výrobě prostředku pro prevenci a léčení člověka nebo zvířete, trpící endotoxemií.