CZ346498A3 - Způsoby a meziprodukty pro výrobu [2-(2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-6-yl]amidu 4'-trifluormethylbifenyl-2-karboxylové kyseliny - Google Patents

Description

Způsoby a meziprodukty pro výrobu [2-(2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-6-yl]amidu 4'-trifluormethylbifenyl-2-karboxylové kyseliny

Oblast techniky

Vynález se týká [2-(2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl)1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-6-yl]amidu 4'-trifluormethylbifenyl-2-karboxylové kyseliny vzorce I znázorněného dále. Konkrétně se vynález týká způsobu a meziproduktů pro výrobu této sloučeniny vzorce I. Sloučenina vzorce I je inhibitorem proteinu C zprostředkovávajícího přenos mikrosomálních triglyceridů a/nebo sekrece apolipoproteinu B (Apo B). Díky tomu je tato sloučenina užitečná při prevenci a léčení atherosklerosy a jejích klinických následků, při snižování hladiny lipidů v séru a podobných chorob.

Dosavadní stav techniky

Protein zprostředkovávající přenos mikrosomálních triglyceridů (MTP) katalýzuje transport triglyceridů, cholesterylesteru a fosfolipidů. Předpokládá se, že je pravděpodobným činidlem podílejícím se na sestavování lipoproteinů obsahujících Apo B, což jsou biomolekuly přispívající ke tvorbě atherosklerotických lézí (viz Evropská patentová přihláška s publikačním číslem 0 643 057 Al a 0 584 446 A2 a Wetterau et al., Science, 258, 999 až 1001 (1992)). Sloučeniny inhibující MTP a/nebo jinak inhibující sekreci Apo B jsou v důsledku toho užitečné při léčení atherosklerosy. Takové sloučeniny jsou též užitečné při léčení jiných chorob nebo stavů, při nichž je možno inhibici MTP a/nebo sekrece Apo B snížit hladinu cholesterolu a triglyceridů v séru.

Takové choroby zahrnují hypercholesterolemii, hypertrigly• · • · • frfr • frfrfr* fr frfr · • frfr · • · frfr • · » fr • · · · • frfr frfrfr • 9 frfr ·· ceridemii, pankreatitis a obezitu a dále též hypercholesterolemii, hypertriglyceridemii a hyperlipidemii spojenou s pankreatitis, obezitou a diabetes.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob výroby sloučeniny

jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného

kde R představuje atom vodíku nebo R², a R² představuje allylskupinu nebo substituovanou methylskupinu, kde substituenty zahrnují 1 až 3 arylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku, přičemž tyto arylové skupiny jsou popřípadě substituovány jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z nitroskupiny a alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku;

a) nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce X • · · · · · · flfl · fl · ♦ flfl · · ··fl flflfl • · fl · · · fl

COJ

kde J představuje odstupující skupinu, jako atom halogenu, azidoskupinu, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aroyloxyskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, přednostně atom chloru nebo bromu; a

b) když R představuje R², nechá produkt ze stupně a) reagovat s kyselinou, jako trifluoroctovou kyselinou (TFA), p-toluensulfonovou kyselinou (PTSA), methansulfonovou kyselinou nebo trifluormethansulfonovou kyselinou a bromovodíkem v kyselině octové, přednostně s trifluoroctovou kyselinou.

Přívlastkem heterocyklický se označuje jakýkoliv jednoduchý kruh nebo kondenzovaný kruhový systém obsahující alespoň jeden kruhový heteroatom nezávisle zvolený ze souboru sestávajícího z atomů kyslíku, dusíku a síry. Do rozsahu této definice tedy mimo jiné spadá jakýkoliv polycyklický kondenzovaný kruhový systém obsahující jeden nebo více karbocyklických kondenzovaných nasycených, zčásti nenasycených nebo aromatických kruhů (obvykle benzenových kruhů), za předpokladu, že tento systém také obsahuje alespoň jeden kondenzovaný kruh, který obsahuje alepoň jeden z výše uvedených heteroatomů. Jakožto substituenty, mohou být takové heterocyklické zbytky připojeny ke zbytku molekuly prostřednictvím atomu karbocyklického kruhu (například benzenového kruhu) nebo heterocyklického kruhu.

·· ·· «· ·· 99 99

9 9 9 9 9 9 _Λ 9 9 99 9 9 · 9 » • 9 9 9 99 9 9 999999

9 9 9 9 9 9 9

9 9 99 99 99 9 9

Pod označením jeden nebo více kruhů se rozumí, že do rozsahu tohoto pojmu spadá jakýkoliv (jednoduchý nebo kondenzovaný) cyklický zbytek nebo zbytky. Tyto kruhy mohou být karbocyklické nebo heterocyklické, nasycené nebo zčásti nenasycené a aromatické nebo nearomatické.

Pod označením kondenzovaný polycyklický zbytek se rozumějí cyklické systémy, v nichž jsou všechny kruhy kondenzované.

Pod označením halogen se v tomto popisu rozumí fluor, chlor, brom a jod, pokud není uvedeno jinak.

Pod označením arylskupina (například arylskupina se 6 až 10 atomy uhlíku) se rozumí karbocyklická skupina nebo substituent. Aromatické skupiny obsahující jeden nebo více heteroatomů jsou zahrnuty do podsouboru charakterizovaného termínem heterocyklický, jak to bylo vysvětleno výše.

Pod označením acylskupina se rozumí alifatický nebo nebo cyklický uhlovodíkový zbytek připojený ke karbonylové skupině, prostřednictvím které je tento substituent připojen.

Pod označením alkylskupina a alkoxyskupina, pokud tato skupina obsahuje více než 2 atomy uhlíku, se rozumějí příslušné skupiny s řetězcem přímým nebo rozvětveným, ale naproti tomu pod označením jednotlivých konkrétních zbytků typu propylskupina nebo propoxyskupina se rozumějí pouze zbytky s přímým řetězcem, tedy příslušné normální skupiny, zatímco jejich isomery s rozvětveným řetězcem jsou označovány specifickými názvy, v tomto případě názvy isopropylskupina nebo isopropoxyskupina.

• fr fr ♦ • · ♦ frfr fr • frfrfr frfr frfr ♦ frfr • frfrfr* fr · • frfrfr · • fr frfr frfr frfr meziprodukty

Předmětem vynálezu jsou dále určité

kde Y představuje skupinu NH₂ nebo NO₂, a jejich tautomery. Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že se výše uvedené sloučeniny mohou vyskytovat v několika tauromerních formách. Všechny tyto tautomerní formy spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Dále jsou předmětem vynálezu také sloučeniny obecného vzorce II

kde R představuje skupinu R , přednostně skupinu vzorce ch₃oc₆h₄ch₂-.

Následuje podrobnější popis vynálezu. V dále uvedených reakčních schématech a popisu, který za nimi násle„ o duje, mají symboly R, R , J, K a Y, jakož i strukturní vzorce I až X výše uvedený význam.

• · • ·

IV (R=R²) • flflfl • fl flfl flfl 99 flfl » flflfl flfl·· • · flfl ··· · · · · • · flfl flfl ·· flflflfl·· flfl flflflfl · · flflflfl flfl flfl flfl ··

Schéma

III (R=H>

>*· to· • ·· · • ·· · •toto to·· • to • to ·· to >*·· • to toto • ·· • · · · « • ·· ·· • · · · ·· to*

Schéma 3

IV (R=R²)

Pd/C

I fl flflflfl flfl flfl flfl flfl flfl fl flflfl flflflfl • · ····· flflflfl • fl flfl flfl * · flflfl flflfl flfl flflflfl · · flflflfl flfl flfl ·· flfl

Jak je znázorněno ve schématu 1, sloučenina vzorce IX se připraví reakcí 1,2,4-triazolu se sloučeninou obecného vzorce R²K, kde K představuje halogen definovaný výše, za přítomnosti báze. Sloučeninou vzorce R²K je přednostně 4-methoxybenzylchlorid. Tato reakce se provádí při teplotách blízkých teplotě místnosti v polárním rozpouštědle, jako Ν,Ν-dialkylkarboxamidu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, například dimethylacetamidu (DMAC) a dimethylformamidu (DMF); ketonu, například acetonu a methylethylketonu; alkanolu s 1 až 6 atomy uhlíku, například ethanolu, methanolu a isopropylalkoholu; nebo ve směsi výše uvedených rozpouštědel. Jako báze užitečné při tomto způsobu podle vynálezu je možno uvést hydroxidy, uhličitany a hydrogenuhličitany alkalických kovů. V přednostním provedení tohoto způsobu je rozpouštědlem dimethylformamid a bází hydroxid sodný.

Sloučenina vzorce VIII se připraví tak, že se sloučenina vzorce IX zahřívá s formaldehydem v horké vodě.

Reakce se provádí při teplotě zpětného toku za použití vnějšího zdroje tepla při asi 100 až asi 135°C. Formaldehyd, kterého se používá v nadbytku, může být ve formě 37% vodného roztoku (také známého jako formalin) nebo ve formě lineárního polymeru (paraformaldehyd) nebo trimeru (trioxan). Formaldehyd vzniklá rozkladem paraformaldehydu v horké vodě nebo reakcí trioxanu ve vodném roztoku obsahujícím silnou kyselinu. Přednostním zdrojem formaldehydu je formalin.

Sloučenina obecného vzorce VII se připraví tak, že se sloučenina vzorce VIII podrobí Mitsuhobuho reakci s ftalimidem za přítomnosti trifenylfosfinu a dialkylazodikarboxylátu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí nebo dipiperidinylazodikarboxylátu. Přednostním azodikarboxylátem je diisopropylkarboxylát. Tuto reakci je možno provádět při teplotě od asi 0 do asi 65°C v aprotickém rozpouštědle, jako

99

9 9 9 • 9 9

9 9 9

9 9

tetrahydrofuranu (THF), isopropyletheru a dioxanu. V přednostním provedení se tato reakce provádí při asi 15°C v tetrahydrofuranu.

Sloučenina vzorce VII se převede na sloučeninu vzorce VI tak, že se suspenduje v aprotickém suspenzním médiu, jako alkanolu s 1 až 6 atomy uhlíku, například methanolu, ethanolu nebo isopropylalkoholu, a nechá reagovat s hydrazinem. Hydrazinu se přednostně používá ve formě hydrátu a přednostním suspenzním médiem je methanoi. Reakci je možno provádět při teplotě blízké teplotě místnosti až asi 65 °C, přednostně při teplotě místnosti.

Sloučenina vzorce IV (R = R²) se připraví reakcí sloučeniny vzorce VI se sloučeninou vzorce V o₂n (v) kde Y je zvolen ze souboru sestávajícího z halogenu a popřípadě substituované alkylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku nebo arylsulfonyloxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v arylové části, za přítomnosti báze a aprotického rozpouštědla.

Y představuje přednostně skupinu CH₃SO₃ (methansulfonyloxy). Reakce se přednostně provádí pod inertní atmosférou, jako pod atmosférou dusíku nebo argonu, při teplotě od asi teploty okolí do teploty zpětného toku použitého rozpouštědla. Jako báze, jichž je možno použít, lze uvést organická báze, jako trialkylaminy s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, pyridin a N-methylmorfolin. Jako aprotická rozpouštědla přicházejí v úvahu tetrahydrofuran, dichlormethan a dimethylformamid. Přednostně se reakce to··· • to ·· • · » » · · · · • · · • ·· • · · * ·» ·· • · * ·* · »·· ··· • · • to ·· provádí v tetrahydrofuranu, pod atmosférou dusíku při teplotě zpětného toku rozpouštědla. Přednostní bází je triethylamin. Sloučeninu obecného vzorce V, kde Y představuje methansulfonyloxyskupinu, je možno připravovat tak, že se suspenze sloučeniny obecného vzorce V, kde Y představuje hydroxyskupinu, v halogenalkanu s 1 až 6 atomy uhlíku, při nízké teplotě pod inertní atmosférou nechá reagovat s methansulfonylchloridem za přítomnosti báze. Jako báze, které jsou užitečné pro tento účel, je možno uvést báze uvedené výše. Inertní atmosféru mohou tvořit výše jmenované plyny. Reakční teplota je od asi -40 do asi 0°C. Přednostně se reakce provádí pod dusíkem při asi -30°C za přítomnosti triethylaminu.

Postupem znázorněným ve schématu 3 se sloučenina o

obecného vzorce IV (R = R ) převede na sloučeninu obecného vzorce IV (R = H) reakcí s kyselinou, jako trifluoroctovou kyselinou (TFA), p-toluensulfonovou kyselinou, methansulfonovou kyselinou nebo trifluormethansulfonovou kyselinou a bromovodíkem v kyselině octové, přednostně s kyselinou trifluoroctovou. Reakci je možno provádět při teplotě od asi teploty místnosti do asi 60°C, přednostně při teplotě místnosti. Trifluoroctové kyseliny je možno použít v neředěné formě nebo ve formě roztoku v dichlormethanu.

Sloučenina obecného vzorce IV, kde R představuje vodík, se převede na sloučeninu obecného vzorce III, kde R představuje vodík, reakcí s vodíkem za tlaku asi 100 až asi 300 kPa za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru a organického rozpouštědla. Jako hydrogenační katalyzátory je možno uvést palladium, platinu a Raneyův nikl. Tyto kovy je možno použít ve formě solí, například hydroxidu palladnatého, nebo na nosičích, například na uhlíku. Hydrogenace se provádí při teplotě od asi teploty místnosti do asi 50°C, přednostně při teplotě místnosti. Jako katalyzátoru se dává ···· přednost 10% palladiu na uhlíku a jako rozpouštědlu methanolu.

·· ·* ·· ·· • e · · · · ···» • » ····· ···· • · «· ·· · · »»···♦ ·· ···· · · «··· ·· ·· «· ··

Sloučenina obecného vzorce III, kde R představuje atom vodíku, se převádí na sloučeninu vzorce I reakcí se zdrojem 4'-trifluormethylbifenyl-2-karbonylové skupiny zvoleným ze souboru zahrnujícího halogenidy, azidy a směsné anhydridy, za přítomnosti rozpouštědla a báze. Reakce se provádí při teplotě od asi teploty místnosti do asi 50 °C, přednostně při teplotě místnosti. Jako rozpouštědla užitečná při tomto postupu je možno uvést aprotická rozpouštědla uvedená výše, halogenalkany a směsi těchto rozpouštědel. Přednostním rozpouštědlem je směs tetrahydrofuranu a methylenchloridu, která se vytvoří když se k suspenzi sloučeniny obecného vzorce III (R = H) v tetrahydrofuranu přidá roztok karbonylové sloučeniny v methylenchloridu.

Postupem znázorněným ve schématu 3 je sloučeninu vzorce I možno alternativně připravit tak, že se sloučenina obecného vzorce III, kde R představuje skupinu R², nechá reagovat se zdrojem 4'-trifluormethylbifenyl-2-karbonylové skupiny definovaným výše, za vzniku sloučeniny vzorce II, která se nechá reagovat s kyselinou, jako trifluoroctovou kyselinou (TFA), p-toluensulfonovou kyselinou, methansulfonovou kyselinou nebo trifluormethansulfonovou kyselinou a bromovodíkem v kyselině octové, přednostně s kyselinou trifluoroctovou, jak je to popsáno výše. R² představuje skupinu p-CH₃OC₆H₄CH₂- a zdrojem 4'-trifluormethylbifenyl-2-karbonylové skupiny je 4'-trifluormethylbifenyl-2-karbonylchlorid.

Sloučenina vzorce I a její tautomery tvoří adični soli s kyselinami a pod označením farmaceuticky vhodné soli se rozumí například takové soli, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, hydrogensulfáty, fosfáty, ···· ·· ·· • · 9 • · ··· • € · « • · · « ·· »· ·· ·· • · · · • · · · • ··· fr·· • · <· ·· hydrogenfosfáty, dihydrogenfosfáty, acetáty, sukcináty, citráty, methansulfonáty, p-toluensulfonáty, atd. Uvedený výčet solí nepředstavuje pro rozsah vynálezu žádné omezení. Sloučenina vzorce I a její tautomery také tvoří polyadiční soli.

Adiční soli sloučeniny vzorce I a jejích tautomerů s kyselinami se snadno připravují reakcí této sloučeniny ve formě báze s vhodnou kyselinou. Jedná-li se o sůl s jednosytnou kyselinou (například hydrochlorid, hydrobromid, p-toluensulfonát nebo acetát), hydrogensůl dvojsytné kyseliny (například hydrogensulfát nebo sukcinát) nebo dihydrogensůl trojsytné kyseliny (například dihydrogenfosfát nebo citrát), používá se alespoň jednoho molárního ekvivalentu a obvykle molárního nadbytku příslušné kyseliny. Když jsou však požadovány takové soli, jako jsou sulfáty, hemisukcináty, hydrogenfosfáty nebo fosfáty, obvykle se používá příslušného přesného chemického ekvivalentu kyseliny. Volná báze se obvykle spojuje s kyselinou v pomocném rozpouštědle, v němž se požadovaná sůl sráží. Izolaci soli lze provést i jiným způsobem, například zkoncentrováním roztoku a/nebo přídavkem nerozpouštědla.

Sloučeninu vzorce I, její tautomery a jejich farmaceuticky vhodné soli (tyto sloučeniny jsou dále označovány jako účinné sloučeniny) lze podávat orálně, a proto se jich obvykle používá v kombinaci s farmaceuticky vhodnými nosiči nebo ředidly vhodnými pro zpracování na orální dávkovači formy. Vhodné, z farmaceutického hlediska přijatelné, nosiče zahrnují inertní pevná plniva nebo ředidla a sterilní vodné nebo organické roztoky. Účinná sloučenina bude v takových farmaceutických prostředcích přítomna v množství postačujícím pro zajištění požadovaného dávkového množství ležícího v rozmezí uvedeném dále. Pro orální podávání lze tedy sloučeniny podle vynálezu kombinovat s vhodnými pevnými • · • · nebo kapalnými nosiči nebo ředidly a zpracovávat na kapsle, tablety, prášky, sirupy, roztoky, suspenze apod. Farmaceutické prostředky mohou popřípadě obsahovat také přídavné složky, jako jsou ochucovadla, sladidla, excipienty apod. Farmaceutické prostředky, které zahrnují účinnou sloučeninu a farmaceuticky vhodný nosič, jsou vhodné pro léčbu takových stavů, jako je atherosklerosa, pankreatitis, obezita, hypercholesterolemie, hypertriglyceridemie, hyperlipidemie a diabetes.

Účinné sloučeniny inhibují nebo snižují sekreci apo B, pravděpodobně inhibicí MTP, přestože se na této inhibici možná podílí i jiný mechanismus. Tyto sloučeniny jsou užitečné při jakýchkoliv chorobách nebo stavech, při nichž je zvýšena hladina apo B, sérového cholesterolu a/nebo triglyceridů. Předmětem vynálezu je proto dále také způsob léčení chorob zvolených ze souboru zahrnujícího atherosklerosu, pankreatitis, obezitu, hypercholesterolemii, hypertriglyceridemii, hyperlipidemii a diabetes, jehož podstata spočívá v tom, že se savci, zejména člověku, který takové léčení potřebuje, podá amid vzorce I definovaného výše v množství postačujícím pro snížení sekrece apolipoproteinu B. Zvláštní podskupina výše jmenovaných stavů zahrnuje atherosklerosu, obezitu, pankreatitis a diabetes a nej zajímavější chorobou je z tohoto hlediska atherosklerosa.

Pod pojmem léčení se v souvislosti s účinnými sloučeninami rozumí také preventivní, jakož i aleviační ošetření.

Tablety, pilule, tobolky apod. mohou také obsahovat pojivá, jako je tragant, klovatina, kukuřičný škrob nebo želatina, excipienty, jako je fosforečnan vápenatý, rozvolňovadla, jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob a kyselina alginová, mazadla, jako je stearan hořečnatý a sladidla, • ··· • ··· ····

- r- · · ····· ···· — 15 — ···♦···· ··· ··· jako je sacharosa, laktosa nebo sacharin. Pokud je dávkovači jednotkovou formou tobolka, může prostředek obsahovat kromě látek výše uvedeného typu také kapalný nosič, jako mastný olej .

Další látky mohou být přítomny v podobě povlaků nebo za účelem modifikace fyzikální podoby dávkovači jednotky. Tak například tablety mohou být potaženy šelakem, cukrem nebo oběma těmito látkami. Sirupy a elixíry mohou kromě účinné přísady obsahovat sacharosu, jako sladidlo, methyl- a propylparaben, jako konzervační činidlo, a dále též mohou obsahovat barvivo a ochucovací látku, jako je třešňové nebo pomerančové aroma.

Účinné sloučeniny podle vynálezu je také možno podávat parenterálně. Pro parenterální podávání se hodí prostředky, které lze získat smísením sloučenin podle vynálezu se sterilními vodnými nebo organickými médii za vzniku injekčních roztoků nebo suspenzí. Roztoky nebo suspenze těchto účinných sloučenin je možno připravovat ve vodě, k níž je přidána vhodná povrchově aktivní látka, jako hydroxypropylcelulosa. Disperze lze také připravovat v sezamovém nebo arašídovém oleji, ethanolu, vodě nebo polyolu (například glycerolu, propylenglykolu a kapalném polyethylenglykolu) nebo jejich vhodných směsích, rostlinném oleji, N-methylglukaminu, polyvinylpyrrolidonu a směsích těchto látek v olejích. Použít lze i vodných roztoků vodorozpustných farmaceuticky vhodných solí sloučenin podle vynálezu. Za běžných podmínek skladování a použití budou takové prostředky obsahovat konzervační činidlo zabraňující růstu mikroorganismů. Injekční roztoky vyrobené výše uvedeným způsobem je možno podávat intravenosně, intraperitoneálně, subkutánně nebo intramuskulárně.

Farmaceutické formy vhodné pro injekční použití zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperse a sterilní prášky pro časově odloženou přípravu sterilních injekčních roztoků nebo dispersí. Ve všech případech musí být získaná forma sterilní a dostatečně tekutá, aby ji bylo možno aplikovat injekční stříkačkou. Musí být stálá za podmínek výroby a skladování a musí být chráněna proti kontaminačnímu působení mikroorganismů, jako jsou bakterie a plísně.

Dávkování sloučeniny vzorce I se bude obecně měnit v závislosti na faktorech, které jsou dobře známy odborníkům v tomto oboru, jako je prudkost léčené choroby a způsob podávání. Obvykle se budou sloučeniny vzorce I podávat teplokrevným živočichům (jako je člověk) tak, aby se dosáhlo účinné dávky. Obvykle se bude denní dávka podávat najednou nebo v několika dílčích dávkách, přičemž celková vhodná denní dávka bude ležet v rozmezí od asi 0,1 do asi 15, přednostně od asi 1 do asi 5 mg/kg tělesné hmotnosti. Obdržená celková denní dávka bude tedy ležet v rozmezí od 1 do 1000 mg, přednostně od 5 do 350 mg.

Sloučeninu podle vynálezu je možno podávat v kombinaci s jinými farmaceutickými činidly, včetně jiných činidel snižujících hladinu lipidů. Taková činidla zahrnují inhibitory biosyntézy cholesterolu, zejména inhibitory HMG CoA reduktasy a inhibitory skvalen synthetasy, sekvestranty žlučové kyseliny, fibráty, inhibitory absorpce cholesterolu a niacin.

Zkoušené sloučeniny jsou považovány za účinné, pokud se jejich účinnost prokáže kterýmkoliv z dále uvedených testů.

Účinnost sloučenin podle vynálezu je možno zjišťovat měřením inhibice sekrece apo B v buňkách HepG2.

fl · • ·

Buňky HepG2 se pěstují v Dulbeccem modifikovaném Eagleově médiu s přídavkem 10 % fetálního hovězího séra (růstové médium; Gibco) v 96 jamkových kultivačních miskách ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého tak dlouho, dokud se nedosáhne přibližně 70% konfluence. Zkoušená sloučenina se rozpustí v dimethylsulfoxidu na koncentraci 10 až 20mM a vzniklý roztok se dále zředí růstovým médiem na ΙμΜ koncentraci. Vzniklý zásobní roztok se sériově ředí v poměru 1 : 1 růstovým médiem a do jednotlivých jamek 96-jamkových kultivačních misek obsahujících buňky HepG2 se přidá vždy 100 μΐ získaného ředěného roztoku. Po 24 hodinách se odebere růstové médium a specifickým testem ELISA se měří koncentrace apo B a pro kontrolu také apo AI. Inhibitory se identifikují jako sloučeniny, které snižují sekreci apo B do média, aniž by ovlivňovaly sekreci apo AI.

Zkouška ELISA na apo B se provádí takto: Monoklonální protilátka proti humánnímu apo B (Chemicon) se zředí na koncentraci 5 μρ/ιηΐ fosfátem pufrovaným roztokem chloridu sodného a azidu sodného (PBS+0,02 % azidu sodného) a 100 μΐ vzniklého přípravku se přidá do každé jamky 96jamkové misky (NUNC Maxisorb). Po inkubaci přes noc při teplotě místnosti se odstraní roztok protilátky a jamky se 3x promyjí kombinací PBS/azid. Nespecifická místa na plastu se blokují inkubací jamek po dobu 1 až 3 hodin s roztokem o koncentraci 10 g/litr hovězího sérového albuminu (BSA) v médiu PBS/azid. Do každé jamky se přidá 100 μΐ růstového média odebraného od buněk HepG2 nebo apo B standardů o různém zředění (0,004% Tween 20/1% BSA v PBS/azid), načež následuje 18-hodinová inkubace. Z jamek se odtáhne kapalná fáze a jamky se třikrát promyjí (0,1% Tween 20 v PBS), načež se k nim přidá vždy 100 μΐ sekundární protilátky ve zředění 1 : 1 000, kterou je kozí antihumánní apo B (Chemicon). Po tříhodinové inkubaci při teplotě místnosti se roztok odtáhne ·· ·» ·· ·· • · · · · · • · · ·

a jamky se znovu třikrát promyjí výše uvedeným způsobem. Potom se do každé jamky přidá 100 μΐ králičího protikozího IgG konjugovaného s alkalickou fosfatasou (Sigma) zředěného v poměru 1 : 1600 v PBS/1% BSA/2mM chlorid horečnatý a jamky se inkubují 1 hodinu při teplotě místnosti. Kapalná fáze se znovu odsaje, jamky se čtyřikrát promyjí výše uvedeným způsobem a do každé jamky se přidá 100 μί roztoku p-nitrofenylfosfátu (pNPP, Sigma) o koncentraci 1 mg/ml ve 25mM hydrogenuhličitanu sodném/2mM chloridu hořečnatém o pH 9,5. Po 20 až 30minutové inkubaci se reakce ukončí přídavkem 50 μΐ 0,2M roztoku hydroxidu sodného. Měří se absorbance v každé jamce při 405 nm a od naměřené hodnoty se vždy odečte hodnota pozadí při 650 nm. Koncentrace apo B se vypočítá ze standardní křivky sestrojené z výsledků paralelních měření prováděných za použití purifikovaných LDL standardů. Koncentrace apo AI se měří analogickým postupem, pouze s tím rozdílem, že se místo protilátek pro apo B použije protilátek pro apo AI (Chemicon) a inkubace antigenu se provádí při 37°C místo při teplotě místnosti.

Účinnost lze také potvrdit zkouškou, při níž se přímo zjišfuje, zda zkoušená sloučenina inhibuje aktivitu MTP.

Inhibici aktivity MTP zkoušenou sloučeninou je možno kvantifikovat na základě sledování inhibice přenosu radioizotopem značeného triglyceridu z donorních vesikul do akceptorních vesikul za přítomnosti rozpustného lidského MTP. Způsob přípravy MTP je založen na metodě, kterou popsali Wetterau a Zilversmit v Biochem. Biophys. Acta (1986) 875: 610. V krátkosti lze tento postup popsat takto: Kousky lidských jater zmrazené při teplotě -80°C se nechají roztát na ledu, rozmělní se a několikrát propláchnou ledově chladným 0,25M roztokem sacharosy. Všechny následující stupně se provádějí na ledu. Za použití Potter-Elvehiemovy • · • · 9 9

9

·· 99 • 9 9 · • 9 9 9

9 999 • 9 ·· 99 teflonové třecí misky se vyrobí 50% homogenát v 0,25M roztoku sacharosy. Tento homogenát se zředí v poměru 1 : 1 0,25M roztokem sacharosy a zředěná směs se 20 minut odstřeďuje při 10 000 x g při teplotě 4°C. Získaná peleta se resuspenduje v roztoku sacharosy a znovu 20 minut odstřeďuje při 10 000 x g. Supernatanty se spojí a mikrosomy se peletizují 75minutovou centrifugací při 105 000 x g. Supernatant se zahodí a mikrosomální peleta se suspenduje v minimálním objemu 0,25M sacharosy, suspenze se zředí na koncentraci 3 ml/g (vztaženo na výchozí hmotnost jater) 0,15M pufrem Tris-HCl o pH 8,0. Získaná suspenze se rozdělí do 12 frakcí a centrifuguje se 75 minut při 105 000 x g. Supernatanty se zahodí a mikrosomální pelety se skladují ve zmrazeném stavu při -80°C až do použití.

Pro přípravu MTP před vlastním prováděním zkoušky se roztátá peleta suspenduje ve 12 ml chladného 50mM Tris-HCl, 50mM chloridu draselného, 5mM chloridu hořečnatého o pH 7,4 a k suspenzi se za míchání pomalu přidá 1,2 ml 0,54% roztoku deoxycholátu (pH 7,4), aby mikrosomální membrány popraskaly. Po 30minutové inkubaci na ledu za mírného míchání se suspenze 75 minut odstřeďuje při 105 000 x g. Supernatant obsahující rozpustný protein MTP se 2 až 3 dny dialýzuje se 4 výměnami zkouškového pufru (150mM TrisHCl, 40mM chlorid sodný, lmM EDTA, 0,02% azid sodný, pH 7,4). MTP z lidských jater se skladuje při 4°C a těsně před použitím se zředí v poměru 1 : 5 zkouškovým pufrem. Přípravky MTP nevykazují žádnou významnou ztrátu přenosové aktivity při skladování až do 30 dnů.

Liposomy se připraví pod atmosférou dusíku při teplotě místnosti z disperse 400μΜ vaječného fosfatidylcholinu (PC), 75μΜ kardiolipinu z hovězího srdce a 0,82μΜ [¹⁴C]-trioleinu (110 Ci/mol) ve zkouškovém pufru ultrazvukovým zpracováním v lázni. Přidají se vhodná množství • · · lipidů v chloroformu a přípravek se vysuší pod proudem dusíku a potom hydratuje zkouškovým pufrem. Akceptorní liposomy se připraví pod atmosférou dusíku z disperse l,2mM PC, 2,3μΜ trioleinu a 30pM [³H]-PC (50 Ci/mol) ve zkouškovém pufru ultrazvukovým zpracováním v lázni. Donorní a akceptorní liposomy se 2 hodiny odstřeďují při 160 000 x g při teplotě 7°C. Vrchních 80 % supernatantu s obsahem malých unilamelárních liposomů se opatrně oddělí a uloží při 4°C až do doby použití na přenosové zkoušky.

Aktivita MTP se měří za použití přenosové zkoušky, která se zahájí smícháním donorních a akceptorních vesikul s rozpustným MTP a zkoušenou sloučeninou. Ke 100 μΐ buď 5% BSA (kontrolní pokus), nebo 5% BSA s obsahem zkoušené sloučeniny se přidá 500 μΐ zkouškového pufru, 100 μΐ donorních liposomů, 200 μΐ akceptorních liposomů a 100 μΐ zředěného proteinu MTP. Po 45minutové inkubaci při 37°C se přenos triglyceridu zastaví přídavkem 500 μΐ suspenze DEAE celulosy ve zkouškovém pufru o koncentraci 500 g/1. Směs se 4 minuty míchá a potom se donorní liposomy vázané k DEAE celulose nechají selektivně sedimentovat v průběhu nízkorychlostní centrifugace. Spočítají se impulsy ^JH a v alikvotu supernatantu obsahujícího akceptorní liposomy a zjištěných hodnot se použije pro výpočet procentického množství získaných akceptorních liposomů a přenosu triglyceridu (procenta) za použití kinetiky prvního řádu. Inhibice přenosu triglyceridu zkoušenou sloučeninou se projeví poklesem radioaktivity ¹⁴C ve srovnání s kontrolními vzorky získanými bez použití zkoušené sloučeniny.

Účinnost zkoušených sloučenin jako inhibitorů MTP je také možno měřit in vivo za použití následující zkoušky.

Myším samcům (o hmotnosti 20 až 30 g, různé kmeny) se orální sondou podá v množství 0,25 ml/25 g tělesné hmot• frfrfr • a · ♦ · · ♦ · fr frfrfr frfrfrfr * · ···· · ·· · • frfr frfr · fr ··· ··· • · · · · · · fr frfr frfr · · · * nosti zkoušená sloučenina suspendovaná ve vodném 0,5% roztoku methylcelulosy. Roztoky sloučenin se dávkují bud' opakovaně v průběhu několika dnů nebo, alternativně, jednou v době 90 minut před usmrcením myší a shromážděním krve za účelem přípravy séra. Sérum se zkouší na koncentraci triglyceridu za použití obchodně dostupné soupravy pro enzymatické stanovení (Triglyceride G; Wako Fine Chemicals). Inhibitory MTP se identifikují na základě schopnosti snižovat hladinu triglyceridů v séru ve srovnání s kontrolním pokusem, při němž se myším podává pouze vehikulum.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Pro izolaci sloučenin podle tohoto vynálezu se použije obvyklých purifikačních a separačních metod a/nebo postupů známých odborníkům v tomto oboru. Jako příklady takových postupů je možno uvést všechny typy chromatografie (vysokotlaká kapalinová chromatografie, chromatografie na sloupci obvyklého adsorbentu, jako silikagelu, a chromatografie na tenké vrstvě), překrystalování a postupy diferenciální extrakce (tj. kapalina-kapalina).

Příklady provedení vynálezu

Preparativní postup 1

1-(4-Methoxybenzyl)-1,2,4-triazol

1,2,4-Triazol (7,5 g, 0,109 mol) se rozpustí v dimethylformamidu (50 ml). Ke vzniklému roztoku se za míchání pod atmosférou dusíku v ledové lázni při 10°C v jedné dávce přidají částečně rozdrobněné pelety hydroxidu sodného (17,5 g, 0,438 mol), což vyvolá exotermickou reakci a teplo-

- 22 - :, fc · ·· · · ta směsi se zvýší na asi 25’C. Ke směsi se poté během 5 minut při 25°C přikape roztok 4-methoxybenzylchloridu (15 ml, 0,111 mol) v dimethylformamidu. Reakční směs se 4 hodiny míchá při teplotě místnosti a přidá se k ní ethylacetát a voda. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se promyjí čtyřikrát vodou a jednou vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a přefiltrují. Z filtrátu se za sníženého tlaku odpaří rozpouštědlo. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě oleje (výtěžek 69 %, 14,15 g).

¹H NMR (CDC1₃): δ 8,00 (s, 1), 7,93 (s, 1), 7,19 (d, 2),

6,88 (d, 2), 5,23 (s, 2), 3,78 (s, 3), hmotnostní spektrum: m/z: 109 (M+l)

Preparativní postup 2

5-(Hydroxymethyl)-1-(4-methoxybenzyl)-1,2,4-triazol

Sloučenina z preparativního postupu 1 (7,6 g, 40 mmol) se rozpustí v 37% vodném roztoku formaldehydu (25 ml). Vzniklý roztok se 4 dny v olejové lázni o teplotě 130°C zahřívá ke zpětnému toku. Průběh hydroxymethylační reakce se monitoruje chromatografií na tenké vrstvě silikagelu za použití směsi ethylacetátu a chloroformu v poměru 3:1, jako elučního činidla. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a nalije do vody. Vodná směs se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se promyjí IM hydroxidem sodným, vodou a vodným roztokem chloridu sodného. Výsledný roztok se vysuší síranem hořečnatým a odpaří. Získaný surový produkt se trituruje s hexany s obsahem malého množství 2-propanolu. Získá se 4,9 g (56 %) sloučeniny uvedené v nadpisu o teplotě tání 95 až 100°C.

^XH NMR (CDC1₃): δ 7,72 (s, 1), 7,21 (d, 2), 6,85 (d, 2),

5,70 (bs, 1, OH), 5,32 (s, 2), 4,69 (s, 2), 3,78 (s, 3) ¹³C NMR (CDC1₃): δ 159,6, 149,8, 145,6, 129,2, 127,0, 114,3, ····

4 4··· 4 4

444 4 4» 44 44 44

55,3, 54,9, 52,0, IR (KBr): 1610, 1585, 1512 cm^-1, hmotnostní spektrum: m/z 220 (M+1)

Analýza pro ^cn^Hi3^N3°2^: vypočteno: C 60,26, H 5,98, N 19,17, nalezeno: C 60,30, H 6,16, N 19,66

Struktura se potvrdí rentgenovou analýzou jednoho krystalu.

Preparativní postup 3

5-(Ftalimidomethyl)-1-(4-methoxybenzyl)-1,2,4-triazol

Produkt z příkladu 2 (8,5 g, 38,8 mmol), trifenylfosfin (11,2 g, 42,7 mmol) a ftalimid (6,3 g, 42,7 mmol) se při teplotě místnosti rozpustí v tetrahydrofuranu (125 ml).

Ke vzniklému kalnému roztoku se během 40 minut přikape roztok diisopropylazodikarboxylátu (8,4 ml, 42,7 mmol) v tetrahydrofuranu (40 ml), přičemž se teplota chlazením v lázni z ledové vody udržuje okolo 15°C. Během přídavku se vysráží produkt ve formě bílé pevné látky. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti a poté zředí hexany (125 ml). Po 30minutovém míchání se shromáždí bílý pevný produkt, který se promyje hexany a vysuší za vakua. Získá se 12,2 g produktu (výtěžek 91 %) o teplotě tání 167 až 172°C.

¹H NMR (CDC1₃): δ 7,85 (s, 1), 7,81 (m, 2), 7,69 (m, 2), 7,09 (d, 2), 7,66 (d, 2), 5,43 (s, 2), 4,89 (s, 2), 3,72 (s, 3) ¹³C NMR (CDC1₃): δ 150,9, 145,6, 134,2, 131,8, 128,3, 127,0,

123,6, 114,3, 112,9, 112,1, 55,2, 52,0, 32,8, IR (KBr) 1772, 1720, 1689, 1612, 1586, 1519 cm^-1, hmotnostní spektrum: m/z 349 (M + 1)

Analýza pro C₁₉H₁₆N₄O₃: vypočteno: C 65,50, H 4,63, N 16,08, nalezeno: C 65,35, H 4,80, N 16,18 • 99 9

99 99 99

9 9 9 9 9

9 9999 9 99 9

99 99 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 99 99 99

Preparativní postup 4

5-(Aminomethyl)-1-(4-methoxybenzyl)-1,2,4-triazol

Produkt z preparativního postupu 3 (5 g, 14,4 mmol) se suspenduje v methanolu (50 ml) a ke vzniklé suspenzi se za míchání přidá hydrát hydrazinu (1,6 ml, 32 mmol). Po několiká minutách vznikne čirý roztok. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti, dokud se nevysráží ftaloylhydrazid. Poté se reakční směs zředí methylenchloridem (50 ml). Suspenze hydrazidu se 45 minut míchá, přefiltruje a pevná látka se promyje methylenchloridem. Filtrát se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí v methylenchloridu a 1M hydroxidu sodném. Vodná vrstva se zalkalizuje na pH 12. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje methylenchloridem. Organické vrstvy se spojí, promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a za sníženého tlaku se odpaří rozpouštědlo. Izoluje se titulní produkt ve formě bezbarvého oleje (3 g, výtěžek 97 %).

¹H NMR (CDC1₃): δ 7,79 (s, 1), 7,12 (d, 2), 6,81 (d, 2),

5,27 (s, 2), 3,88 (s, 2), 3,74 (s, 3), 1,59 (bs, 2, NH₂) ¹³C NMR (CDC1₃): δ 150,3, 14ř,6, 130,4, 129,0, 128,8, 127,3,

114,3, 55,3, 51,7, 37,7

Preparativní postup 5

2-[2-(4-Methoxybenzyl)-2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl]-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin

1) 2-(2-Hydroxyethyl)-5-nitrobenzylalkohol (6,38 g,

32,4 mmol) a triethylamin (11,3 ml, 81 mmol) se pod atmosférou dusíku suspendují v methalenchloridu (100 ml). Vzniklá suspenze se za míchání ochladí na -30°C a během 15 minut se k ní přikape roztok methansulfonylchloridu (5,5 ml, 71,2 mmol) v methylenchloridu (32 ml). Po 30 minutách se chladicí ««·· ·* ·· *♦

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 999 · · · 9

9 99 9 9 9 9 999 ·99

9 9 9 9 9 9 ·

999 9 99 99 9· 99 lázeň odstaví a ke směsi se přidá ÍM kyselina chlorovodíková (130 ml). Reakční směs se 10 minut míchá a oddělí se vrstvy. Organická vrstva se promyje vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a přefiltruje. Filtrát se odpaří za sníženého tlaku na žlutou pevnou látku (10,7 g,

94% výtěžek), které se použije bez dalšího přečištění.

^H NMR (CDC1₃): δ 8,17 (m, 2), 7,66 (d, 1(, 5,39 (s, 2),

4,50 (t, 2), 3,28 (t, 2), 3,10 (s, 3), 3,00 (s, 3)

2) Produkt z preparativního postupu 4 (1,1 g, 5 mmol) a triethylamin (1,8 ml, 12,7 mmol) se pod atmosférou dusíku rozpustí v tetrahydrofuranu (15 ml). Vzniklý roztok se po kapkách smísí s roztokem produktu ze stupně 1) (1,75 g, 5 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml). Výsledný roztok se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti a přes noc zahřívá ke zpětnému toku. Reakční směs se ochladí a přidá se k ní methylenchíorid a ÍM hydroxid sodný. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje dalším méthylenchloridem. Spojené organické vrstvy se promyjí vodou a vodným roztokem chloridu sodného a vysuší síranem hořečnatým. Surový produkt se izoluje z methylenchloridu a přečistí chromatografií na silikagelu za použití 30% ethylacetátu v chloroformu, jako elučního činidla. Získá se 1,2 g (výtěžek 63 %) sloučeniny uvedené v nadpisu ve formě žlutého oleje, který pomalu ztuhnne.

¹H NMR (CDC1₃): δ 7,98 (m, 2), 7,88 (s, 1), 7,10 (m, 3),

6,76 (d, 2), 5,40 (s, 2), 3,81 (s, 2), 3,73 (s, 3), 3,63 (s, 2), 2,95 (t, 2), 2,80 (t, 2), ¹³C NMR (CDC1₃): δ 159,4,

151,4, 150,4, 145,6, 141,5, 135,6, 129,0, 127,4, 123,7,

123,7, 120,8, 114,1, 112,1, 55,5, 55,2, 53,1, 52,1, 50,1,

29,0 IR (KBr): 1610, 1584, 1517 cm^-1, hmotnostní spektrum: m/z 380 (M+l) ♦ flt· «

• » ♦ • * flfl

Preparativní postup 6

2-(2H-[1,2,4]Triazol-3-ylmethyl)-6-nitro-l,2,3, 4-tetrahydroisochinolin

Titulní produkt z příkladu 5 (8,8 g, 23,2 mmol) se rozpustí v trifluoroctové kyselině (88 ml). Vzniklý roztok se přes noc míchá při teplotě místnosti a výsledná směs se odpaří za sníženého tlaku. Olejovitý zbytek se rozpustí v methylenchloridu. Methylenchloridový roztok se extrahuje dvakrát 1M roztokem kyseliny chlorovodíkové. Kyselinové extrakty se spojí a promyjí jednou methylenchloridem. Kyselinový extrakt se převrství čerstvým methylenchloridem a jeho pH se 10% vodným hydrogenuhličitanem sodným nastaví na 10. Vyloučený produkt se shromáždí a promyje vodou a methylenchloridem. Získá se 3,99 g (výtěžek 66 %) produktu o teplotě tání 163 až 166’C.

^H NMR (DMSO-dg): 5 8,20 (s, 1), 7,97 (d, 1), 7,92 (dd, 1), 3,82 (s, 2), 3,73 (s, 2), 2,92 (t, 2), 2,76 (t, 2), ¹³C NMR (DMSO-dg): δ 147,8, 146,2, 143,2, 136,5, 128,2, 123,8,

120,8, 55,1, 53,4, 49,6, 28,9, hmotnostní spektrum: m/z 260 (M + 1)

Analýza pro C₁₂ ^Hi3^N5°2·⁰·15CH₂C1₂: vypočteno: C 53,65, H 4,93, N 25,98, nalezeno: C 53,65, H 4,93, N 25,75

Příklad 1

6-Amino-2-(2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin

Titulní produkt z preparativního postupu 6 (4,46 g, 17,4 mmol) se rozpustí v methanolu (220 ml). Vzniklý roztok se hydrogenuje 4 hodiny za přítomnosti 10% palladia na uhlíku (2,23 g) za tlaku 345 kPa. Katalyzátor se odstraní filtrací přes Celit^^R^ a z filtrátu se za sníženého tlaku • frfrfr· frfr frfr frfr frfr • fr · frfrfr frfrfr· • · frfr frfrfr fr frfr fr • · frfr frfr frfr frfrfr frfrfr • fr frfrfr· fr « • frfr · frfr frfr frfr frfr odstraní methanol. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (3,56 g, výtěžek 91 %) o teplotě tání 191 až 193°C.

NMR (DMSO-dg): δ 6,65 (d, 1), 6,32 (dd, 1), 6,28 (d, 1), 4,79 (S, 2), 3,71 (s, 2), 3,41 (s, 2), 3,34 (s, 2) ¹³C NMR (DMSO-dg): δ 155,9, 147,0, 134,5, 127,1, 122,4,

113,8, 112,7, 55,4, 53,9, 50,9, 29,2, IR (KBr): 1633, 1612, 1584, 1513 cm^-1, hmotnostní spektrum: m/z 230 (M+1)

Analýza pro ^ci2^H15^N5^: vypočteno: C 62,86, H 6,59, N 30,55, nalezeno: C 62,49, H 6,39, N 30,45

Příklad 2 [2-(2H-[1,2,4]Triazol-3-ylmethyl)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-6-yl]amid 4'-trifluormethylbifenyl-2-karboxylové kyseliny (sloučenina vzorce I)

A) Produkt z příkladu 1 (3,3 g, 14,5 mmol) se suspenduje v methylenchloridu (100 ml) a tetrahydrofuranu (40 ml) s triethylaminem (2,23 ml, 15,9 mmol). Vzniklá suspenze se míchá při teplotě místnosti, přičemž se k ní přikapává roztok 4'-trifluormethylbifenyl-2-karbonylchloridu (4,13 g, 14,5 mmol) v methylenchloridu (40 ml). Reakční směs se míchá přes noc a přidá se k ní uhličitan sodný (17 g, 0,2 mol) ve vodě (440 ml). Vzniklá směs se 15 minut míchá a oddělí se vrstvy. Vodná vrstva se podruhé extrahuje methylenchloridem. Spojené organické vrstvy se promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě pěny. Tato sloučenina je identická s výše uvedenou sloučeninou.

^ΧΗ NMR (CDC1₃): δ 13,88 (bs, 1), 10,21 (s, 1), 7,74 (d, 2), 7,67 - 7,48 (m, 6), 7,31 (s, 1), 7,20 (dd, 1), 6,91 (d, 1), 3,73 (s, 2), 3,56 (s, 2), 2,73 (m, 4), IR (KBr) 1651, 1618, 1603, 1541, 1510 cm^-1, hmotnostní spektrum: m/z 478 (M⁺) ··«· • ♦ · ♦ • · · · • 9 9 • · · • ·

B) Titulní produkt z příkladu 4 (0,49 g, 8,2 mmol) se rozpustí v trifluoroctové kyselině (5 ml). Vzniklý roztok se přes noc míchá při teplotě místnosti, načež se z něj za sníženého tlaku odstraní těkavé látky. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a k ethylacetátovému roztoku se přidá 10% vodný uhličitan sodný. Vrstvy se oddělí a organická vrstva se promyje vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a za sníženého tlaku se z ní odstraní rozpouštědlo. Získá se titulní produkt, který je identický s titulním produktem získaným postupem A).

Příklad 3

6-Amino-2-(2-(4-methoxybenzyl)-2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin

2-[2-(4-Methoxybenzyl)-2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl]-6-nitro-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin (0,5 g, 1,3 mmol) v methanolu (25 ml) se 3 hodiny hydrogenuje za přítomnosti 10% palladia na uhlíku (0,25 g) za tlaku 345 kPa. Reakční směs se přefiltruje a z filtrátu se za sníženého tlaku odpaří rozpouštědlo. Ke zbytku se přidá ethylacetát a voda a pH vzniklé směsi se tuhým uhličitanem sodným nastaví na 10. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje dalším ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým, přefiltrují a filtrát se odpaříza sníženého tlaku. Získá se produkt ve formě oleje (0,4 g, výtěžek 87 %). ¹H NMR (CDC1₃): δ 7,86 (s, 1), 7,18 (d, 2), 6,79 (m, 3),

6,48 (m, 2), 5,42 (s, 2), 3,76 (s, 3), 3,73 (s, 2), 3,50 )s, 2), 2,80 (m, 2), 2,69 (m, 2), IR (KBr) 1613, 1587, 1513 cm^-1, hmotnostní spektrum: m/z (348 (M⁺ - 1) • 444 «4 44 ·4

4 444 4444 — OQ —. 4 4 4 4 «44 β 4 4 4

4 «44444444444

4444 4 4

4444 44 44 44 44

Příklad 4 [2-(2-(4-methoxybenzyl)-2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethyl)-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-6-yl]amid 4'-trifluormethylbifenyl-2-karboxylové kyseliny

Titulní produkt z příkladu 3 (0,38 g, 1,1 mmol) a triethylamin (0,17 ml, 1,2 mmol) se rozpustí v methylenchloridu (14 ml). Vzniklý roztok se míchá při teplotě místnosti, přičemž se k němu přikapává roztok 4'-trifluormethylbifenyl-2-karbonylchloridu (0,31 g, 1,1 mmol) v methylenchloridu (40 ml). Po 4 hodinách ke k reakční směsi přidá 10% vodný roztok uhličitanu sodného. Vzniklá směs se 30 minut míchá. Methylenchloridová vrstva se promyje vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě tuhé pěny (0,63 g, výtěžek 97 %).

¹H NMR (CDC1₃): δ 7,79 (s, 1), 7,72 (d, 1), 7,64 (d, 2),

7,58 - 7,34 (m, 6), 7,12 (d, 2), 7,01 (s, 1), 6,90 - 6,72 (m, 4), 5,38 (s, 2), 3,73 (s, 3), 3,65 (s, 2), 3,50 (s, 2),

2,79 (t, 2), 2,68 (t, 2), IR (KBr) 1668, 1615, 1599, 1567,

1536, 1514 cm“¹, hmotnostní spektrum: m/z 598 (M⁺ + 1) pv'jif6 4-98 toto·· toto toto toto toto • toto· to · · to • · ·*·· to ·· to « «to ·· «to ····«· • totototo · · • to· ·· ·· «to

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby [2-(2H-[1,2,4jtriazol-3-ylmethyl)1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-6-yl]amidu 4’-trifluormethylbifenyl-2-karboxylové kyseliny vzorce I

   N (i) vyznačující se tím, že se sloučenina

   N (III) kde R představuje atom vodíku nebo R², a R² představuje allylskupinu nebo substituovanou methylskupinu, kde substituenty zahrnují 1 až 3 arylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku, přičemž tyto arylové skupiny jsou popřípadě substituovány jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z nitroskupiny a alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku;

   a) nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce X • frfrfr· fr· ·« ·· • fr fr frfrfr frfrfr • · · · ··· · frfr • fr frfrfrfr · frfrfr · frfr frfr frfr

   COJ kde J představuje odstupující skupinu, jako atom halogenu, azidoskupinu, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aroyloxyskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, přednostně atom chloru nebo bromu; a

   b) když R představuje R², nechá se produkt ze stupně a) reagovat s kyselinou.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že kyselina je zvolena ze souboru sestávajícího z trifluoroctové kyseliny, p-toluensulfonové kyseliny, methansulfonové kyseliny a trifluormethansulfonové kyselinou a bromovodíku v kyselině octové.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že kyselinou je kyselinou je kyselina trifluoroctová.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že se sloučenina obecného vzorce III, kde

   R má výše uvedený význam, připraví tak, že na sloučeninu vzorce IV (IV) • flflfl ·· ·· ·· ·· · · > · · · · · • · · · ··· · · · · • * <· ·· ·· «·· ·♦· ·· ···· · · ··· · ·· ·· ·» ·· (a) se působí vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru za vzniku sloučeniny vzorce III, kde R představuje R², nebo (b) (1) se působí kyselinou a (2) na produkt ze stupně (1) se působí vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru, za vzniku sloučeniny obecného vzorce III, kde R představuje atom vodíku.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t i m , že se sloučenina obecného vzorce IV připraví reakcí sloučeniny obecného vzorce VI

   R² (VI) kde R představuje R², se sloučeninou obecného vzorce V kde Y má výše uvedený význam, za přítomnosti báze.
6. 6. Způsob výroby sloučeniny vzorce I, vyznačující se tím, že se (a) připraví sloučenina obecného vzorce IV, kde R představuje R², reakcí sloučeniny obecného vzorce VI, kde R o představuje R , se sloučeninou obecného vzorce V • · · · kde Y má výše uvedený význam, za přítomnosti báze;

   (b) na sloučeninu obecného vzorce IV (R = R²) (1) (i) se působí kyselinou trifluoroctovou za vzniku sloučeniny obecného vzorce IV (R = H);

   (ii) na sloučeninu obecného vzorce IV (R = H) se působí vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru, za vzniku sloučeniny obecného vzorce III (R = H; a (iii) na sloučeninu obecného vzorce III (R = H) se působí sloučeninou vzorce X; nebo (2) (i ) se působí vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru za vzniku sloučeniny obecného vzorce III (R = R²);

   (ii) na sloučeninu obecného vzorce III (R = R²) se působí sloučeninou vzorce X za vzniku sloučeniny obecného vzorce II (R = R²) a (iii) na sloučeninu obecného vzorce II (R = R²) se působí kyselinou trifluoroctovou.
7. 7. Způsob podle nároku 4, vyznačující tím, že hydrogenační katalyzátor je zvolen ze • · · ·

   I 0 · 1 » 0 0 4

   000 004

   0 4 • · 0 0 ··♦· • · fr · · · · » · · 4 fr · · 4 • 0 ··

   - 34 souboru sestávajícího z palladia na uhlíku, hydroxidu palladnatého, Raneyova niklu a oxidu platičitého.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t í m , že hydrogenačním katalyzátorem je palladium na uhlíku.

   kde Y představuje aminoskupinu nebo nitroskupinu, a její tautomery.
9. 10. Sloučenina podle nároku 9, kde Y představuje aminoskupinu, a její tautomery.
10. 11. Sloučenina podle nároku 9, kde Y představuje nitroskupinu, a její tautomery.

    2 2 kde R představuje R a R·⁶ má výše uvedený význam.

    • · · · • ·
11. 13. Sloučenina podle nároku 12, kde R³ představuje skupinu vzorce CH₃OCgH₄CH₂-.