CZ338699A3 - Substituované benzamidy - Google Patents

Description

1 ·· ···· · · ·* • · · · ♦ ♦ · • · t ♦ * ♦ • · · · · · ♦ · • · · · · * ·»*» · · «· ♦* • · ·· • · ♦ • » · • · · · · · • ♦ • · · * ^.MnoivSrrečKA scJvcwát '*! :V' ; ί,.^,ΗΛ .li. . i ? yltb- 99

Substituované benzamidy

Oblast techniky

Vynález se týká substituovaných benzamidů obecného vzorce I :

a jejich použiti 0 cr^N^oŘ3 v oblasti léčiv.

Dosavadní stav techniky

Autoimunní onemocněni vznikají na základě reaktivity imunního systému vůči tělesným strukturám. Přitom dojde ke zrušení jinak obvyklé tolerance vůči tělesným tkáním. V pa-togenezi různých autoimunních onemocnění hrají vedle protilátek rozhodující roli obzvláště T-lymfocyty a monocyty/ makrofágy. Aktivované monocyty/makrofágy secernuji velké množství různých mediátorů podporujících zánětlivé procesy, které j sou přímo nebo nepřímo odpovědné za zničení tkání postižených autoimunním onemocněním. Aktivace monocytů/ makrofágů se děje buďto v interakci s T-lymfocyty nebo přes bakteriální produkty jako lipopolysacharid (LPS). Aktiviza-ce monocytů/makrofágů a granulocytů indukovaná různými bakteriálními produkty je navíc charakteristická pro obecné zánětlivé reakce. 2 «··· e · ·· e· ·· ·< Význam rovnováhy mezi cytokiny podporuj ícími záněty (příkladně inteleukin IL-12) cytokiny tlumícími záněty (příkladně interleukin IL-10) pro vývoj a průběh zánětů případně autoimunních onemocnění je na základě početných šetření pokusy na zvířatech a prvních klinických vyšetřování jasně dokumentovaný. Na rozličných zvířecích modelech pro onemocnění, jako Rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus a zánětlivá onemocnění kůže a sliznic se prokazuje patofyziologický význam IL-12 (Immunol. Today 16/8: 383-387, 1985; J. Immunol. 155: 4661-4668, 1995; J. Exp.

Med. 182: 1281-1290 , 1995; J. Exp. Med. 187/4: 537-546 , 1998). Aplikací IL-12 je možné dané onemocnění vyvolat případně po neutralizaci endogenní IL-12 dochází k oslabenému průběhu nemoci až do vyléčení zvířete. U zánětlivých onemocnění střev se nachází jak u nemocných zvířat tak i u pacientů s Morbus Crohn v zanícených úsecích střev výrazně zvýšená reaktivita T-buněk. Ta je charakterizována zesílenou expresí IL-12 a IFN-gama v lezích. Oproti tomu je imunosuprimující cytokin IL-10 v lezích výrazně snížen (Immunity 3: 171-174, 1995; J. Exp. Med. 182: 1281-1290, 1995; Eur. J. Immunol. 26: 1156-1163; Eur. J. Immunol. 28: 379-389, 1998). Význam imunosuprimují-čího cytokinu IL-10 pro vývoj zánětlivých onemocnění střev se ukazuje také v tom, že myš "knockautováná" IL-10 vyvíjí spontánní Colitis (Immunity 3: 171-174, 1995). Aktivace T-buněk produkujících IFN-gama v Lamina propria střeva spočívá v podstatě na lokální tvorbě IL-12. Na zvířecím modelu alergeny indukované Colitis mohlo být ukázáno, že trvalou těžkou Colitis je možné podrobit terapii protilátkami vůči IL-12. Neutralizace IL-12 protilátkami vede ke klinické a histopatologické normalizaci nálezu v průběhu několika má- 3 I · « · · 4 • · • · t • · lo dní. V T-buňkách z Lamina propria myší ošetřených anti-IL-12 již nebylo možné prokázat tvorbu IFN-gama (J.Exp.Med. 182: 1281-1290).

První použití rekombinantního IL-10 na lidech potvrdilo vlastnosti tlumení zánětů. Po podání IL-10 zdravým proban-dům je tvorba záněty podporujícího cytokinu TFN-αΖ/α a IL-1 ex vivo pomocí monocytů aktivovaných LPS o 65 až 95 % redukována (J. Immunol. 154: 5492-5499, 1995). Použití IL-10 u pacientů se steroidně refrakterním Mobus Crohn vede ke zlepšení klinických symptomů (Gastroenterology, 113: 383-389). Před nedávném bylo referováno také o subkutánním použití IL-10 u tří pacientů s Psoriasis. Došlo ke zlepšení symptomů nemoci. Dále byla snížena tvorba IL-12 a TNF a rovněž exprese povrchových molekul na monocyty (J. Clin. Invest. 101: 783-794). Použití protilátek na IL-12 u člověka stoj í v současné době před námi.

Souhrnně lze konstatovat, že nedostatek IL-10, případně přebytek IL-12 podmiňuje patofyziologii velkého množství zá-nětlivých onemocnění. Úsilí o normalizaci rovnováhy ILO-10/IL-12 mají proto značný terapeutický potenciál. Základní úkol vynálezu spočívá tedy ve vývoj i nových imunomodulátorů, které nevedou k obecné imunosupresi a přitom ovlivňují normalizaci rovnováhy ILO-10/IL-12.

Podstata vynálezu

Nyní bylo objeveno, že požadavky kladené na vyvíjené látky mohou být splněny určitými substituovanými benzamidy. Předmětem vynálezu jsou podle toho substituované benz- 4 • · ···· · · • · · · · • · · · • · · · · * · · · · •·«· ·» ·· • · · · · * • · · # * · • · · · · · ··· · · · · ··· • t « • · · « · · amidy obecného vzorce I :

kde znamená R·*· skupinu vzorce COOR^, kde R^ znamená alkylový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 uhlíkovými atomy, nebo skupinu vzorce CONR^R^, kde R^ a R^ jsou stejné nebo rozdílné a znamenají alkylovou skupinu s 1 až 6 uhlíkovými atomy s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo spolu s dusíkovým atomem představuj í pyrrolidinový, piperidinový, hexamethyleniminový nebo morfolinový kruh, R^ chlor, fluor, CF^, alkylový zbytek s 1 až 3 uhlíkovými atomy nebo vodík a R^ hydroxylovou skupinu, alkylový nebo alkoxylový zbytek s 1 až 6 uhlíkovými atomy (s přímým nebo rozvětveným řetězcem a případně substituovaný skupinou OH-, alko-xy-, ester- nebo amidovou skupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy s otevřeným řetězcem nebo cyklickou) nebo zbytek CH2-NR^R^, kde R^ a R^ jsou definovány jako výše.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být jak v racemické tak i v enanciomerní formě nebo ve formě solí s farmaceuticky akceptovatelnými kyselinami. 5 • · • · · · • · « · • · • ♦ • · · • · Výhodné jsou substituované benzamidy, ve kterých zbytek R^ představuje skupinu vzorce COOR^, kde R^ je alkylový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 uhlíkovými atomy, nebo skupinu vzorce CONR^R^, kde R~* a R^ spolu s du-sikovým atomem představují morfolinový kruh, R je vodík o a R představuje hydroxylovou skupinu nebo zbytek vzorce Cl^NR^R^, kde R^ a R^ spolu s dusíkovým atomem představuj i morfolinový kruh.

Obzvláště výhodné jsou 2-(morfolin-4-karbonyl)-N-(l-morfolin-č-ylmethyl-2,6-dioxo-piperidin-3-yl)-benzamid a methylester kyseliny N-(l-hydroxy-2,6-dioxo-piperidin-3-yl)-ftalamidové.

Sloučeniny obecného vzorce I je možné získat tak, že se karboxylová kyselina vzorce Ha nebo lib

nejprve převedou známým způsobem na ester (R^ = COOR^1) nebo na amid (R^ = CONR^R^). Přitom se při použití výchozí látky karboxylové kyseliny lib již získají sloučeniny podle vynálezu. Do těchto sloučenin odvozených odpovídajícím způsobem od karboxylové kyseliny II a je rovněž možné známým 6 6 • · · · · · • · · · • · ·· ·· » · · · ι * · · • · · · · · • · ·· · · způsobem, příkladně Mannichovou reakcí s paraformaldehydem a sekundárním aminem vzorce HNR^R^ zavést zbytek R^, který je různý od hydroxylové skupiny.

Dalším předmětem vynálezu je použití substituovaných benzamidů vzorce I v léčivech, obzvláště jako imunomodu-látory. Substance podle vynálezu zřetelně inhibují tvorbu cytokinu IL-12 podporujícího zánětlivé procesy pomocí humánních monocytů aktivovaných LPS. Na druhé straně zvyšují substance této skupiny tvorbu cytokinu IL-10 tlumícího záněty pomocí pomocí humánních monocytů aktivovaných LPS. Toto odlišuje nové substance od známých imunomodulátorů jako ste-roidy a inhibitory fosfordiesterázy, které suprimují syntézu jak IL-12 tak i IL-10. Na základě svého charakteristického imunomodulátorního účinku (tlumení IL-12, zvyšování IL-10) jsou substance podle vynálezu vhodné pro ošetřování a/nebo profylaxi zánětů, obzvláště zánětů kůže a sliznic, cév a rovněž pro ošetřování a/nebo proxylaxi autoimunnich onemocnění . K těmto onemocněním patří mezi jiným záněty kůže (příkladně atopická Dermatitis, Psoriasis, ekzémy), záněty cest dýchacích (příkladně Bronchitis, Pneumonie, Asthma bronchia-le, ARDS (Adult Respirátory Distress Syndrome), Sarkoidose, Silikose/Fibrose), záněty gastrointestinálního traktu (příkladně gastroduodenální Ulcera, Morbus Crohn, ulcerativní Co-litis), dále onemocnění jako Hepatitis, Pankreatitis, Appen-dicitis, Peritonitis, Nephritis, Aphthosis, Konjunktivitis, Keratitis, Uveitis, Rhinitis.

Autoimunní onemocnění zahrnují příkladně onemocnění ar-thritického okruhu (příkladně reumatoidní Arhritis, asociovaná onemocnění HLA-B27), dále Multiple Sklerose, Diabetes 7 ···» • φ • · φ · • · · ···· ··· • · ···· # · # • ··· · ···· ··· ·· • · ♦ · · * · «· · · · * » Φ · · · ♦ · · mladistvých nebo Lupus erythematodes.

Dalšími indikacemi jsou Sepsis, bakteriální Meningitis, Kachexie, odmítavé reakce transplantátů, reakce Graft versus Host a reperfusní syndrom a atheroskleroza. Léčiva podle vynálezu obsahují vedle nejméně jedné sloučeniny obecného vzorce I nosné materiály, plniva, rozpouštědla, zřeďovadla, barviva a/nebo pojivá. Volba pomocných látek a použité množství závisí na tom, zda se má léčivo podávat orálně, intravenozně, intraperitoneálně, intra-dermálně, intramuskulárně, intranasálně, bukálně nebo lokálně. Pro orální aplikace jsou vhodné přípravky ve formě tablet, žvýkacích tablet, dražé, kapslí, granulátu, kapek, šfav nebo sirupů, pro parentální, topické a inhalační aplikace roztoky, suspenze, lehce rekonstituovatelné suché přípravky a rovněž spreje. Příklady vhodných perkutánních aplikačních forem sloučenin podle vynálezu jsou depotní dávky v rozpuštěné formě, na nosné folii nebo náplasti, případně za přídavku prostředků podporujících penetraci kůží. Z orálně nebo perkutánně použitelných použitelných forem přípravků se mohou sloučeniny podle vynálezu uvolňovat se zpožděním.

Množství účinné látky podávané pacientům se mění v závislosti na hmotnosti pacienta, způsobu aplikace, indikaci a stupni závažnosti onemocnění. Obvykle se aplikuje 1 mg/kg až 150 mg/kg nejméně jedné sloučeniny podle vynálezu vzorce I. 8 • · · » • · • · • · · • · t • « • · f · Příklady provedení vynálezu

Tabulka 1 Příklad č. Struktura substance vzorce I, kde Název 1 srovnávací příklad RÍ=COOH r2_h r3=ch3-nr5r^, přičemž R5 a R6 spolu s atomem dusíku značí morfolinový kruh N-(1-morfolin-4-yl-methyl-2,6-dioxo-piperidin-3-yl)-fta-lamidová kyselina 2 srovnávací příklad Rl=H R?=H S 6 R —CH^-NR^R^, přičemž R3 a RĎ spolu s atomem dusíku značí morfolinový kruh N-(1-morfolin-4-yl-methyl-2,6-dioxo-piperidin-3-yl)-benz-amid 3 podle vynálezu R1=CO-NR5R6. přičemž R*5 a R^spolu s atomem dusíku značí morfolinový kruh R?=H < r3=ch;,-nr5r°) přičemž R5 a R6 spolu s atomem dusíku značí morfolinový kruh N-(1-morfolin-4-kar-bonyl)-N-(1-morfolin-4-yl-methyl-2,6-di-oxo-piperidin-3-yl)-benzamid 4 podle vynálezu RÍ=COCHo R?=H 3 r3=oh Methylester kyseliny N-(l-hydroxy-2,6-dioxo-piperidin-3 -yl)-ftalamidové 5 podle vynálezu r1=co-nr5r6. přičemž R3 a R°spolu s atomem dusíku značí morfolinový kruh R,=H R3=CH2-NR:5R°, přičemž R^ a R® spolu s atomem dusíku značí piperidinový kruh 2-(morfolin-4-karbo-nyl)-N-(1-piperidin-4-yl-methyl-2,6-di-oxo-piperidin-3-yl)-benzamid

Tabulka 1 (dokončení) Příklad č. Struktura substance vzorce I, kde Název 6 podle vynálezu rJ=C0CHo R?=H 5 , R -CH^-NR^R^, přičemž R5 a R° spolu s atomem dusíku značí piperidinový kruh Ethylester kyseliny N-(2,6-dioxo-l-pipe-ridin-l-yl-methyl-piperidin-4-yl) ftalamidové

Substance v Tabulce 1 byly charakterizovány pomocí *-H-NMR spektroskopie (přístroj : DPX 300 Avance firmy

Bruker, 300 MHz, rozpouštědlo DMSO-dg , údaje o chemickém posunu v ppm). Pří k 1 a d 1 1,97 - 2,16 (m, 2H, CH2); 2,52 - 2,86 (m, 2H, CH2) ; 3,20 - 3,75 (m, 8H, CH2); 4,50 - 4,65 (m, 2H, NCH2N); 4,64 - 4,82 (m, 1H, CH); 7,49 - 7,66 (m, 3H, aromat.); 7,79 - 7,85 (d, 1H, aromat.); 8,60 - 8,72 (d, 1H, CONH). Pří k 1 a d 2 1,94 - 2,20 (m, 2H, CH2); 2,68 - 2,95 (m, 2H, CH2) ; 3,28 -3,70 (m, 8H, CH2); 4,52 - 4,65 (m, 2H, NCH2N); 4,83 - 4,96 (m, 1H, CH); 7,42 - 7,58 (m, 3H, aromat.); 7,85 - 7,92 (m, 2H, aromat.); 8,85 - 8,89 (d, 1H, CONH). Pří k 1 a d 3 1,92 - 2,24 (m, 2H, CH2); 2,69 - 3,02 (m, 2H, CH2) ; 10 • · · · • · · « • « • · • · · · · · • · · · · ··· · ···· *· • · * * Μ · · · · 3,12 (s, 2Η, CH2); 3,35 - 3,77 (m, 12H, CH2); 4,52 - 4,68 (ra, 2H, NCH2N); 4,74 - 4,98 (m, 1H, CH); 7,28 - 7,32 (d, 1H, aromat.); 7,45 - 7,59 (m, 2H, aromat.); 7,74 - 7,80 (d, 1H, aromat.); 8,78 - 8,88 (d, 1H, CONH). Příklad 4 2,01 - 2,18 (m, 2H, CH2); 2,58 - 2,88 (m, 2H, CH2); 3,79 (s, 3H, COOCH3); 4,70 - 4,80 (m, 1H, CH); 7,54 - 7,72 (m, 3H, aromat.); 7,77 - 7,81 (d, 1H, aromat.); 8,77 - 8,82 (d, 1H, CONH); 10,21 (s, 1H, NOH). Příklad 5 1,38 - 1,46 (m, 6H, CH2); 1,96 - 2,16 (m, 2H, CH2); 2,20 - 2,32 (m, 4H, CH2); 2,60 - 2,92 (m, 2H, CH2); 3,26 - 3,75 (m, 8H, CH2); 4,57 - 4,70 (m, 2H, NCH2N); 4,72 - 4,88 (m, 1H, CH); 7,28 - 7,30 (d, 1H, aromat.); 7,43 - 7,57 (m, 2H, aromat.); 7,70 - 7,74 (m, 1H, aromat.); 8,75 - 8,78 (d, 1H, CONH). Příklad 6 1,18 - 1,26 (t, 3H, CH3); 1,36 - 1,48 (m, 6H, CH2); 1,95 - 2,16 (m, 2H, CH2); 2,22 - 2,34 (m, 4H, CH2); 2,60 - 2,90 (m, 2H, CH2); 4,08 - 4,18 (q, 2H, OCH2); 4,55 - 4,68 (m, 2H, NCH2N); 4,70 - 4,80 (m, 1H, CH); 7,54 - 7,72 (m, 3H, aromat.); 7,78 - 7,83 (d, 1H, aromat.); 8,78 - 8,82 (d, 1H, CONH). • · * · · • ♦ · · · • · ♦ · • · · ♦ • · · · · · · * · · ♦ 11 • ♦ · · Šetření imunomodulatorické účinnosti

Humánní monocyty se izoluj i z periferních krevních mo-nonukleárních buněk (PBMC), které se zíksaji Ficoll- centri-fugací na základě hustotního gradientu z heparinisované úplné krve. K tomu se inkubují PBMC monoklonální protilátkou, která je orientována proti povrchové molekule CD14 specifické pro monocyty a je napojena na supermagnetickém Microbead (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach). K pozitivní selekci označenýých monocytů ze směsi buněk PBMC se veškerá buněčná suspenze nanese na sloupec s feromagnetickou nosnou matricí a umístí se do magnetického pole. Přitom jsou buňky, které byly obohaceny Microbead, vázány na nosnou matrici, neoznačené buňky procházejí sloupcem a odstraní se. Po vyjmutí matrice z magnetického pole se buňky obsahující protilátky eluuji promytím pufrem z již demagentizovaného sloupce. Čistota takto získané CD14-pozitivní populace monocytů činí asi 95 až 98 %. Tyto monocyty se inkubuji v hustotě 10^ buněk/ml media kultury (RPMI, suplementováno 10 % fetálním hovězím šerem) se zkoušenými látkami rozpuštěnými v DMSO po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C a 5 % CC>2. Následně se přidá 20 pg/ml LPS z E. coli. Po 24 hodinách se vyjmou zbytky kultury neobsahuj ící buňky a testuj i se na obsah cytokinů IL-12 a IL-10.

Koncentrace IL-12 a IL-10 ve zbytcích buněčných kultur byly stanoveny pomocí Sandwich-ELISA za použití dvojích anti-IL-12 případně anti-IL-10 monoklonálních protilátek (Biosource Europe, Fleurus, Belgie). Byla zahrnuta referenční standardní křivka s humánním IL-12 případně IL-10. Detekční limit pro IL-12 ELISA čini 10 pg/ml, detekční limit IL-10 ELISA 15 pg/ml.

Tabulka 2

Substance Koncentra- Produkce IL-12 ν Produkce IL-12 v ce % kontroly (=100%) % kontroly (=100%) Dle pří- 10 pg/ml 76 109 kladu 1 2 pg/ml 78 84 0,4 μg/ml 90 87 Dle pří- 6,0 gg/ml 105 69 kladu 2 2,0 gg/ml 104 99 0,66 pg/ml 102 109 0,22 gg/ml 99 114 Dle pří- 10 gg/ml 30 127 kladu 3 2 gg/ml 46 121 0,4 gg/rnl 87 108 Dle pří- 6,0 gg/ml 49 131 kladu 3 2,0 pg/ml 53 133 (druhý 0,66 gg/ml 59 123 pokus) 0,22 gg/ml 64 117 Dle pří- 10 gg/ml 23 112 kladu 4 2 gg/ml 40 189 0,4 gg/ml 66 122 Dle pří- 6,0 gg/ml 47 134 kladu 5 2,0 μζ/ml 57 134 0,66 jig/ml 67 122 0,22 gg/ml 88 115 Dle pří- 6,0 gg/ml 38 130 kladu 6 2,0 gg/ml 47 124 0,66 gg/ml 61 132 0,22 gg/ml 79 102 Dexamet- 1 μΜ 6 34 hason 0,1 μΜ 6 35 0,01 μΜ 20 64 0,001 μΜ 83 105 Pentoxi- 50 μg/ml 74 74 fyllin 5 μg/πll 72 81 Rolipram 50 μΜ 32 28 0,5 μΜ 30 79 0,005 μΜ 58 92 13 13 • · • · · · • φ φ φ Φ · I · · • · · · · · ··· φ φ Φ · Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ • φ · · · · Φ·Φ Φ · Φ Φ ·· Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazují, že známé imunomo-dulátory jako Dexamethason, Pentoxifyllin a Rolipram potlačují u LPS aktivovaných monocytů jak tvorbu IL-12 tak i tvorbu IL-10. Ve srovnání vykazují strukturně blízké benza-amidy substituované karboxylovými skupinami (Příklad 1) při vysokých dávkách jen nepatrný účinek. Překvapivě jsou estery podle vynálezu (Příklady 4 a 6) a amidy podle vynálezu (Příklady 3 a 5) substituovaných ben-zamidů ve zkoumaném modelu imunomodulárně účinné. Sloučeniny tohoto druhu brzdí syntézu IL-12 LPS-aktivovanými monocy-ty v koncentracích 10, 6 případně 2 μg/ml účinným způsobem. V protikladu ke známým imunomodulátorům zvyšují ale také syntézu IL-10. Tento charakteristický model (zřetelné tlumení IL-12, zvýšení IL-10 ve stejných koncentračních oblastech substancí) charakterizuje nový typ imunomodulátoru.

Claims (4)

14

PATENTOVÉ NÁROKY 1. Substituované benzamidy vzorce I :

R·*· skupinu vzorce COOR^1, kde R^ znamená alkylový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 uhlíkovými atomy, nebo skupinu vzorce CONR^R^, kde R^ a R^ jsou stejné nebo rozdílné a znamenají alkylovou skupinu s 1 až 6 uhlíkovými atomy s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo spolu s dusíkovým atomem představují pyrrolidinový, piperidinový, hexamethyleniminový nebo morfolinový kruh, R^ chlor, fluor, CF^, alkylový zbytek s 1 až 3 uhlíkovými atomy nebo vodík a R hydroxylovou skupinu, alkylový nebo alkoxylový zbytek s 1 až 6 uhlíkovými atomy (s přímým nebo rozvětveným řetězcem a případně substituovaný skupinou OH-, alko-xy-, ester- nebo amidovou skupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy s otevřeným řetězcem nebo cyklickou) nebo zbytek CT^-NR^R^, kde R^ a R^ jsou definovány jako výše.

2. Substituovaný benzamid vzorce I podle nároku 1, ve kterém představuje skupinu vzorce COOR^1, kde R^ je alkylový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 uhlíkovými atomy, nebo skupinu vzorce CONR^R^, kde R^ a R^ spolu s dusíkovým atomem představují morfolinový kruh, O R je vodík a R^ představuje hydroxylovou skupinu nebo zbytek Cí^NR^R^, kde R^ a R^ spolu s dusíkovým atomem představují morfolinový kruh.

3. Použití substituovaného benzamidu vzorce I podle nároku 1 nebo 2 jako účinné látky v léčivu.

4. Použiti podle nároku 3, vyznačující se tím, že léčivo je imunomodu-látor.