SK283316B6

SK283316B6 - Substituované benzamidy a ich použitie

Info

Publication number: SK283316B6
Application number: SK1308-99A
Authority: SK
Inventors: Tieno Germann; Stefanie Frosch; Oswald Zimmer
Original assignee: Grnenthal Gmbh
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2003-05-02
Also published as: NO994626D0; DK0989121T3; DE19843793A1; EP0989121B1; CZ295496B6; AU750919B2; HUP9903216A2; PL194897B1; ZA996133B; NZ337531A; CZ338699A3; PE20001050A1; RU2221783C2; ATE309987T1; HUP9903216A3; NO312671B1; SK130899A3; KR20000023339A; IL132012A; SI0989121T1

Abstract

Sú opísané substituované benzamidy všeobecného vzorca (I), v ktorom majú substituenty významy uvedené v opise a ich použitie v liečivách, obzvlášť ako imunomodulátorov.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka substituovaných benzamidov všeobecného vzorca (I) a ich použitia v oblasti liečiv.

Doterajší stav techniky

Autoimunitné ochorenia vznikajú na základe reaktivity imunitného systému proti telesným štruktúram. Pritom dôjde k zrušeniu inak zvyčajnej tolerancie proti telesným tkanivám. V patogenéze rôznych autoimunitných ochorení zohrávajú vedľa protilátok rozhodujúcu úlohu obzvlášť T-lymfocyty a monocyty/makrofágy. Aktivované monocyty/makrofágy sccemujú veľké množstvo rôznych mediátorov podporujúcich zápalové procesy, ktoré sú priamo alebo nepriamo zodpovedné za zničenie tkanív postihnutých autoimunitným ochorením. Aktivácia monocytov/makrofágov a granulocytov indukovaná rôznymi bakteriálnymi produktmi je navyše charakteristická pre všeobecné zápalové reakcie.

Význam rovnováhy medzi cytokínmi podporujúcimi zápaly (napríklad inteleukín IL-12), cytokínmi tlmiacimi zápaly (napríklad interleukin IL-10) na vývoj a priebeh zápalov, prípadne autoimunitných ochorení je na základe mnohých zisťovaní pokusmi na zvieratách a prvých klinických vyšetrovaní jasne dokumentovaný. Na rozličných zvieracích modeloch pre ochorenia, ako Rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Diabetes mellilus a zápalové ochorenie kože a slizníc sa preukazuje patofyziologický význam IL-12 (Immunol. Today 16/8: 383-387, 1985; J. Immunol. 155: 4661-4668, 1995; J. Exp. Med. 182: 1281-1290, 1995; J. Exp. Med. 187/4: 537-546, 1998). Aplikáciou IL-12 je možné dané ochorenie vyvolať, prípadne po neutralizácii endogénnej IL-12 dochádza k oslabenému priebehu choroby až do vyliečenia zvieraťa.

Pri zápalových ochoreniach čriev sa nachádza tak pri chorých zvieratách, ako i pri pacientoch s Morbus Crohn v zápalových úsekoch čriev výrazne zvýšená reaktivita T-buniek. Tá je charakterizovaná zosilnenou expresiou IL-12 a IFN-gama v léziách. Oproti tomu je imunosuprimujúci cytokín IL-10 v léziách výrazne znížený (Imnunity 3: 171 -174, 1995; J. Exp. Med. 182: 1281-1290, 1995; Eur. J Immunol. 26: 1156-1163; Eur. J. Immunol. 28: 379-389, 1998). Význam imunosuprimujúceho cytokínu IL-10 pre vývoj zápalových ochorení čriev sa ukazuje tiež v tom, že myš „knockautovaná“ IL-10 vyvíja spontánny Colitis (Immunity 3: 171-174, 1995). Aktivácia T-buniek produkujúcich IFN-gawa v Lamina propria čreva spočíva v podstate na lokálnej tvorbe IL-12. Na zvieracom modeli alergénmi indukovanej Colitis mohlo byť ukázané, že trvalú ťažkú Colitis je možné podrobiť terapii protilátkami proti IL-12. Neutralizácia IL-12 protilátkami vedie ku klinickej a histopatologickej normalizácii nálezu v priebehu niekoľkých málo dní. V T-bunkách z Lamina propria myší ošetrených anit-IL-12 už nebolo možné preukázať tvorbu IFN-gama (J. Exp. Med. 182: 1281-1290).

Prvé použitie rekombinantného IL-10 na ľuďoch potvrdilo vlastnosti tlmenia zápalu. Po podaní IL-10 zdravým probandom je tvorba zápaly podporujúceho cytokínu TFN-alfa a IL-1 ex vivo pomocou monocytov aktivovaných LPS o 65 až 95 % redukovaná (J. Immunol. 154: 54925499, 1995). Použitie IL-10 u pacientov so steroidne refraktémym Mobus Crohn vedie ku zlepšeniu klinických symptómov (Gastroenterology, 113: 383-389). Pred nedávnom bolo referované tiež o subkutánnom použití IL-10 u troch pacientoch s Psoriasis. Došlo ku zlepšeniu symptó mov choroby. Ďalej bola znížená tvorba IL-12 a TNF a rovnako expresia povrchových molekúl na monocyty (J. Clin. Invest. 101: 783-794). Použitie protilátok na IL-12 pre človeka stojí v súčasnosti pred nami.

Súhrnne možno konštatovať, že nedostatok IL-10, prípadne prebytok IL-12, podmieňuje patofyziológiu veľkého množstva zápalových ochorení. Úsilia o normalizáciu rovnováhy IL-10/IL-12 majú preto značný terapeutický potenciál.

Základná úloha vynálezu spočíva teda vo vývoji nových imunomodulátorov, ktoré nevedú k všeobecnej imunosupresii a pritom ovplyvňujú normalizáciu rovnováhy IL-10/IL-12.

Podstata vynálezu

Teraz bolo objavené, že požiadavky kladené na vyvíjané látky môžu byť splnené určitými substituovanými benzamidmi.

Predmetom vynálezu sú podľa toho substituované benzamidy všeobecného vzorca (I):

kde znamená

R¹ skupinu vzorca COOR⁴, kde R⁴ znamená alkylový zvyšok s priamym alebo rozvetveným reťazcom s 1 až 6 uhlíkovými atómami, alebo skupinu vzorca CONR⁵R⁶, kde R⁵a R⁶ sú rovnaké alebo rozdielne a znamenajú alkylovú skupinu s 1 až 6 uhlíkovými atómami s priamym alebo rozvetveným reťazcom alebo spolu s dusíkovým atómom predstavujú pyrolidínový, piperidínový, hexametylénimínový alebo morfolínový kruh,

R² chlór, fluór, CF₃, alkylový zvyšok s 1 až 3 uhlíkovými atómami alebo vodík a

R³ hydroxylovú skupinu, alkylový alebo alkoxylový zvyšok s 1 až 6 uhlíkovými atómami (s priamym alebo rozvetveným reťazcom a prípadne substituovaný skupinou OH-, alkoxy-, ester- alebo amidovou skupinou s 1 až 6 uhlíkovými atómami s otvoreným reťazcom alebo cyklickou) alebo zvyšok CH₂-NR⁵R⁶, kde R⁵ a R⁶ sú definované ako skôr.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť tak v racemickej, ako i v enantiomémej forme alebo vo forme solí s farmaceutický akceptovateľnými kyselinami.

Výhodné sú substituované benzamidy, v ktorých zvyšok R¹ predstavuje skupinu vzorca COOR⁴, kde R⁴ je alkylový zvyšok s priamym alebo rozvetveným reťazcom s 1 až 6 uhlíkovými atómami, alebo skupinu vzorca CONR⁵R⁶, kde R⁵ a R⁶ spolu s dusíkovým atómom predstavujú morfolínový kruh, R² je vodík a R³ predstavuje hydroxylovú skupinu alebo zvyšok vzorca CH₂NR⁵R⁶, kde R⁵ a R⁶ spolu s dusíkovým atómom predstavujú morfolínový kruh.

Obzvlášť výhodné sú 2-(morfolín-4-karbonyl)-N-(l-morfolín-4-ylmetyl-2,6-dioxo-piperidíi-3-yl)-benzamid a metylester kyseliny N-(l-hydroxy-2,6-dioxo-piperidin-3-yl)-ftalamidovej.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (1) je možné získať tak, že sa karboxylová kyselina vzorca (Ha) alebo (Ilb).

SK 283316 Β6

najprv prevedú známym spôsobom na ester (R¹ = COOR⁴) alebo na amid (R¹ = CONR⁵R⁶). Pritom sa pri použití východiskovej látky karboxylovej kyseliny (Ilb) už získajú zlúčeniny podľa vynálezu. Do týchto zlúčenín odvodených zodpovedajúcim spôsobom od karboxylovej kyseliny (Ila) je rovnako možné známym spôsobom, napríklad Mannichovou reakciou s paraformaldehydom a sekundárnym amínom vzorca HNR⁵R⁶ zaviesť zvyšok R^J, ktorý je rôzny od hydroxylovej skupiny.

Ďalším predmetom vynálezu je použitie substituovaných benzamidov vzorca (I) v liečivách, obzvlášť ako imunomodulátory. Substancie podľa vynálezu zreteľne inhibujú tvorbu cytokínu IL-12 podporujúceho zápalové procesy pomocou humánnych monocytov aktivovaných LPS. Na druhej strane zvyšujú substancie tejto skupiny tvorbu cytokínu IL-10 tlmiaceho zápaly pomocou humánnych monocytov aktivovaných LPS. Toto odlišuje nové substancie od známych imunomodulátorov ako steroidy a inhibítory fosfordiesterázy, ktoré suprimujú syntézu tak IL-12, ako i IL-10. Na základe svojho charakteristického imunomodulátorneho účinku (tlmenie IL-12, zvyšovanie IL-10) sú substancie podľa vynálezu vhodné na ošetrovanie a/alebo profylaxiu zápalov, obzvlášť zápalov kože a slizníc, ciev a rovnako na ošetrovanie a/alebo proxylaxiu autoimunitných ochorení.

K týmto ochoreniam patria medzi iným zápaly kože (napríklad atopická Dermatitis, Psoriasis, ekzémy), zápaly ciest dýchacích (napríklad Bronchitis, Pneumonia, Asthma bronchiale, ARDS (Adult Respirátory Distress Syndróme), Sarkoidose, Silikose/Fibrose), zápaly gastrointestinálneho traktu (napríklad gastroduodenálna Ulcera, Morbus Crohn, ulceratívna Colitis), ďalej ochorenia ako Hepatitis, Pankreatitis, Appendicitis, Peritonitis, Nephritis, Aphthosis, Konjunktivitis, Keratitis, Uveitis, Rhinnitis.

Autoimunitné ochorenia zahrnujú napríklad ochorenia arthritického okruhu (napríklad reumatoidná Arhritis, asociované ochorenia HLA-B27), ďalej Multiple Sklerose, Diabetes mladistvých alebo Lupus erythematodes.

Ďalšími indikáciami sú Sepsis, bakteriálny Meningitis, Kachexia, odmietavé reakcie transplantátov, reakcie Graft verzus Host a reperfúzny syndróm a ateroskleróza.

Liečiva podľa vynálezu obsahujú popri najmenej jednej zlúčenine všeobecného vzorca (I) nosné materiály, plnivá, rozpúšťadlá, zrieďovadlá, farbivá a/alebo spojivá. Voľba pomocných látok a použité množstvo závisí od toho, či sa má liečivo podávať orálne, intravenózne, intraperitoneálne, intradermálne, intramuskuláme, intranazálne, bukálne alebo lokálne. Na orálnu aplikáciu sú vhodne prípravky vo forme tabliet, žuvacích tabliet, dražé, kapsúl, granulátu, kvapiek, štiav alebo sirupov, na parentálne, topické a inhalačné aplikácie roztoky, suspenzie, ľahko rekonštituovateľné suché prípravky a rovnako spreje. Príklady vhodných perkutánnych aplikačných foriem zlúčenín podľa vynálezu sú depotné dávky v rozpustenej forme, na nosnej fólii alebo náplasti, prípadne za prídavku prostriedkov podporujúcich penetráciu kožou. Z orálne alebo perkutánne použiteľných foriem prípravkov sa môžu zlúčeniny podľa vynálezu uvoľňovať s oneskorením.

Množstvo účinnej látky podávané pacientom sa mení v závislosti od hmotnosti pacienta, spôsobu aplikácie, indikácii a stupňa závažnosti ochorení. Obvykle sa aplikuje 1 mg/kg až 150 mg/kg najmenej jednej zlúčeniny podľa vynálezu vzorca I.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Tabuľka 1

Príklad č.	Štruktúra substancie vzorca 1, kde	Názov
1 porovnávací príklad	R¹ - COCH r² = h R³ = CH_Z-NR^SR·, pričom R^s a R⁶ spolu s atómom dusíka znamenajú morfolínový kruh	N-(1-1-rnorfolin-4-yl-metyl2,6-dioxo-piperidin-3-yl)ftalamidová kyselina
2 porovnávací príklad	R’ = H r² = h R³ = CH_rNR^sR‘ pričom R⁵ a R⁶ spolu s atómom dusíka znamenajú morfolínový kruh	N-(1-morfalín-4-yl-metyl- 2,6-dioxo-piperidín-3-yl)benzamid
3 podľa vynálezu	CO-NR^aR^B pričom R⁵ a R⁶ spolu s atómom dusíka znamenajú morfolínový kruh R² - H R³ = CH_rNR⁵R⁶ pričom R⁵ a R⁶ spolu s atómom dusíka značia morfolínový kruh	N-(1-morfolin-4-karbonyl)N-(1-morfolin-4-yl-metýl2,6-dioxo-piperidln-3-yl)benzamid
4 podľa vynálezu	R' - COCH, r² = h r³ = oh	Metylester kyseliny N-(1h yd roxy-2,6-d ioxopiperidín-3-yl)-ftalamidovej
5 podľa vynálezu	R'= CO-NR^bR^b pričom R⁵ a R⁶ spolu s atómom dusíka znamená morfolínový kruh r² = h R³ = CH_;-NR^sr“ pričom R⁵ a R⁶ spolu s atómom dusíka znamená piperidínový kruh	2-(morfolín-4-karbonyl)-N(1 -piperid ín-4-yl-metyl-2,6dí-oxo-piperidín-3-yl)benzamid
6 podľa vynálezu	R'= COCH, r² = h R³ = CH₂-NR⁵R⁶ pričom R^$ a R⁹ spolu s atómom dusíka znamenajú piperidínový kruh	Etylester kyseliny N-(2,6dioxo-1-piperidín-1-ylmetyl-piperidín-4yljftalamidovej

Substancie v tabuľke 1 boli charakterizované pomocou 'H-NMR spektroskopie (prístroj : DPX 300 Avancia firmy Bruker, 300 MHz, rozpúšťadlo DMSO-d₆, údaje o chemickom posune v ppm).

Príklad 1

1,97 - 2,16 (m, 2H, CH₂); 2,52 - 2,86 (m, 2H, CHJ;

3,20 - 3,75 (m, 8H, CHJ; 4,50 - 4,65 (m, 2H, NCH₂N);

4,64 - 4,82 (m, IH, CH); 7,49 - 7,66 (m, 3H, aromat.);

7.79 - 7,85 (d, IH, aromat.); 8,60 - 8,72 (d, 1 H,CONH).

Príklad 2

1,94 - 2,20 (m, 2H.CHJ; 2,68 - 2,95 (m, 2H, CHJ;

3,28 - 3,70 (m, 8H, CHJ; 4,52 - 4,65 (m, 2H, NCH₂N);

4,83 - 4,96 (m, IH, CH); 7,42 - 7,58 (m, 3H, aromat.);

7,85 - 7,92 (m, 2H, aromat.); 8,85 - 8,89 (d, IH, CONH).

Príklad 3

1,92 - 2,24 (m, 2H, CHJ; 2,69 - 3,02 (m, 2H, CHJ;

3,12 (s, 2H, CHJ; 3,35 - 3,77 (m, 12H, CHJ; 4,52 - 4,68 (m, 2H, NCH₂N); 4,74 - 4,98 (m, IH, CH); 7,28 - 7,32 (d, IH, aromat.); 7,45 - 7,59 (m, 2H, aromat.); 7,74 - 7,80 (d, IH, aromat.); 8,78 - 8,88 (d, IH, CONH).

Príklad 4

2,01 - 2,18 (m, 2H, CHJ; 2,58 - 2,88 (m, 2H, CHJ;

3.79 (s, 3H, COOCH₃); 4,70 - 4,80 (m, IH, CH);

7,54 - 7,72 (m, 3H, aromat.); 7,77 - 7,81 (d, IH, aromat.);

8,77 - 8,72 (d, IH, CONH); 10,21 (s, IH, NOH).

Príklad 5

1,38 - 1,46 (m, 6H, CHJ; 1,96-2,16 (m, 2H, CHJ; 2,20 - 2,32 (m, 4H, CHJ; 2,60 - 2,92 (m, 2H, CHJ; 3,26 - 3,75 (m, 8H, CHJ; 4,57 - 4,70 (m, 2H, NCH₂N); 4,72 - 4,88 (m,

IH, CH); 7,28 - 7,30 (d, IH, aromat.); 7,43 - 7,57 (m, 2H, aromat.); 7,70 - 7,74 (m, IH, aromat. ); 8,75 - 8,78 (d, IH, CONH).

Príklad 6

1,18 - 1,26 (t, 3H, CH₃); 1,36 - 1,48 (m, 6H, CH₂); 1,95 - 2,16 (m, 2H, CH₂); 2,22 - 2,34 (m, 4H, CH₂); 2,60 - 2,90 (m, 2H, CH₂); 4,08 - 4,18 (q, 2H, OCH₂); 4,55 - 4,68 (m, 2H, NCH₂N); 4,70 - 4,80 (m, IH, CH), 7,54 - 7,72 (m, 3H, aromat.); 7,78 - 7,83 (d, IH, aromat.); 8,78 - 8,82 (d, IH, CONH).

Zisťovanie imunomodulatorickej účinnosti

Humánne monocyty sa izolujú z periférnych krvných mononukleárnych buniek (PBMC), ktoré sa získajú Ficoll-centrifugáciou na základe hustotného gradientu z heparinizovanej úplnej krvi. K tomu sa inkubujú PBMC monoklonálnou protilátkou, ktorá je orientovaná proti povrchovej molekule CD14 špecifickej pre monocyty a je napojená na supermagnetickom Microbead (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach). K pozitívnej selekcii označených monocytov zo zmesi buniek PBMC sa všetka bunková suspenzia nanesie na stĺpec s fcromagnetickou nosnou matricou a umiestni sa do magnetického poľa. Pritom sú bunky, ktoré boli obohatené Microbead, viazané na nosnú matricu, neoznačené bunky prechádzajú stĺpcom a odstránia sa. Po vybratí matrice z magnetického poľa sa bunky obsahujúce protilátky eluujú premytím pufrom z už demagnetizovaného stĺpca. Čistota takto získanej CD14-pozitívnej populácie monocytov je asi 95 až 98 %. Tieto monocyty sa inkubujú v hustote 10⁶ buniek/ml média kultúry (RPMI, suplementované 10 % fetálnym hovädzím sérom) so skúšanými látkami rozpustenými v DMSO počas 1 hodiny pri teplote 37 °C a 5 % CO₂. Následne sa pridá 20 pg/ml LPS z E. coli. Po 24 hodinách sa vyberú zvyšky kultúry neobsahujúce bunky a testujú sa na obsah cytokínov IL-12 a IL-10.

Koncentrácie IL-12 a IL-10 vo zvyškoch bunkových kultúr boli stanovené pomocou Sandwich-ELISA s použitím dvojakých anti-IL-12, prípadne anti-IL-10 monoklonálnych protilátok (Biosource Európe, Fleurus, Belgie). Bola zahrnutá refrenčná štandardná krivka s humánnym IL-12, prípadne IL-10. Detekčný limit pre IL-12 ELISA je 10 pg/ml, detekčný limit IL-10 ELISA 15 pg/ml.

Tabuľka 2

Substancia	Koncentrácia	Produkcia IL-12 v % kontroly (= 100 %)	Produkcia IL-12 v % kontroly (=100 %)
Podľa príkladu	10 pg/ml	76	109
1	2 pg/ml	78	84
	0.4 pg/ml	90	87
Podľa príkladu	6,0 pg/ml	105	69
2	2.0 pg/ml	104	99
	0.66 pg/ml	102	109
	0.22 pg/ml	99	114
Podľa príkladu	10 pg/ml	30	127
3	2 pg/ml	46	121
	0,4 pg/ml	37	108
Podľa príkladu	6,0 pg/ml	49	131
3	2,0 pg/ml	53	133
(druhý pokus)	0.66 pg/ml	59	123
	0,22 pg/ml	64	117
Podľa príkladu	10 pg/ml	23	112
4	2 pg/ml	40	189
	0.4 pg/ml	66	122
Podľa príkladu	6.0 pg/ml	47	134
5	2,0 pg/ml	57	134
	0,66 pg/ml	67	122
	0,22 pg/ml	38	115
Podľa príkladu	6,0 pg/ml	38	130
6	2,0 pg/ml	47	124
	0,66 pg/ml	61	132
	0,22 pg/ml	79	102

Dexametazón	1 μΜ	6	34
	0,1 μΜ	6	35
	0,01 μΜ	20	64
	0,001 μΜ	83	105
Pentoxifylín	50 pg/ml	74	74
	5 pg/ml	72	81
Rolipram	50 μΜ	32	28
	0,5 μΜ	30	79
	0,005 μΜ	58	92

Výsledky uvedené v tabuľke 2 ukazujú, že známe imunomodulátory ako Dexametazón, Pentoxifylín a Rolipram potlačujú u LPS aktivovaných monocytov tak tvorbu IL-12, ako i tvorbu IL-10. V porovnaní majú štruktúrne blízke benzamidy substituované karboxylovými skupinami (príklad 1) pri vysokých dávkach len nepatrný účinok.

Prekvapivo sú estery podľa vynálezu (príklady 4 a 6) a amidy podľa vynálezu (príklady 3 a 5) substituovaných benzamidov v skúmanom modeli imunomodulárne účinné. Zlúčeniny tohto druhu brzdia syntézu IL-12 LPS-aktivovanými monocytmi v koncentráciách 10, 6 pripadne 2 pg/ml účinným spôsobom. V protiklade k známym imunomodulátorom zvyšujú ale tiež syntézu IL-10. Tento charakteristický model (zreteľné tlmenie IL-12, zvýšenie IL-10 v rovnakých koncentračných oblastiach substancií) charakterizuje nový typ imunomodulátora.

Claims

1. Substituované benzamidy vzorca (I):

kde znamená

2. Substituovaný benzamid vzorca (I) podľa nároku 1, v ktorom

R¹ predstavuje skupinu vzorca COOR⁴, kde R⁴ je alkylový zvyšok s priamym alebo rozvetveným reťazcom s 1 až 6 uhlíkovými atómami, alebo skupinu vzorca CONR⁵R^S, kde R⁵ a R⁶ spolu s dusíkovým atómom predstavujú morfolínový kruh,

R² je vodík a

R³ predstavuje hydroxylovú skupinu alebo zvyšok CH₂NR⁵R⁶, kde R⁵ a R⁶ spolu s dusíkovým atómom prestavujú morfolínový kruh.

SK 283316 Β6

3. Substituovaný benzamid všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo 2 na použitie ako liečivo.

4. Substituovaný benzamid všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo 2 na použitie ako imunomodulátor.