CZ300722B6

CZ300722B6 - Zpusob prípravy inkluzního komplexu pentacyklických a tetracyklických terpenoidu a farmaceutického prostredku obsahujícího tento inkluzní komplex, inkluzní komplex pentacyklického nebo tetracyklického terpenoidu a farmaceutický prostredek obsahující

Info

Publication number: CZ300722B6
Application number: CZ20060606A
Authority: CZ
Inventors: Šarek@Jan; Hajdúch@Marian; Svoboda@Michal; Nováková@Katerina
Original assignee: Univerzita Karlova v Praze, Prírodovedecká fakulta; Univerzita Palackého v Olomouci; I.Q.A., A. S.
Priority date: 2006-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2009-07-22
Also published as: WO2008037226A2; CA2762911C; US8653056B2; US20090325919A1; JP2010504921A; WO2008037226A3; EP2068882B1; CA2666437A1; CA2762911A1; EP2068882A2; CA2666437C; CZ2006606A3

Abstract

Je popsán zpusob prípravy inkluzních komplexu pentacyklických a tetracyklických terpenoidu, pri nemž se ve vode nerozpustný pentacyklický nebo tetracyklický terpenoid mající volnou karboxylovou, hydroxylovou nebo amino funkcní skupinu derivatizuje na této funkcní skupine substituentem vybraným ze skupiny zahrnující substituenty obecného vzorce X.sup.a.n. pro navázání na hydroxyskupinu terpenoidu, kde X.sup.a.n. reprezentuje -OC-R.sup.1.n.-COOH, substituenty obecného vzorce X.sup.a.n. pro navázání na aminoskupinu terpenoidu, kde X.sup.a.n. je -OC-R.sup.1.n.-COOH, kvartérní amoniové substituenty obecného vzorce X.sup.b.n. pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu, kde X.sup.b.n. reprezentuje -(CH.sub.2.n.).sub.n.n.N.sup.+.n.R.sup.2.n..sub.3.n.Y.sup.-.n., kvartérní amoniové substituenty obecného vzorce X.sup.c.n. pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu, kde X.sup.c.n. reprezentuje -(CH.sub.2.n.).sub.n.n.(R.sup.3.n.).sup.+.n.Y.sup.-.n., substituenty obecného vzorce X.sup.d.n. pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu, kde X.sup.d.n. reprezentuje -R.sup.4.n.-COOH, glykosylové substituenty X.sup.e.n. pro navázání .alfa.- nebo .beta.-glykosidickou vazbou na hydroxyskupinu terpenoidu, kde X.sup.e.n. je vybrán ze skupiny zahrnující glukosyl, galaktosyl, arabinosyl, rhamnosyl, laktosyl, cellobiosyl, maltosyl a jejich 2-deoxyanaloga, a následne se pripravený derivát rozpustí v roztoku obsahujícím vodu a nativní nebo substituovaný .gama.-cyklodextrin za tvorby inkluzního komplexu s uvedeným cyklodextrinem, nacež se inkluzní komplex s uvedeným cyklodextrinem izoluje z vodného roztoku, s výhodou lyofilizací. Popsána je i príprava farmaceutického pros

Description

Způsob přípravy inkluzního komplexu pentacy klických a tetracy klič kých terpenoidů a farmaceutického prostředku obsahujícího tento inkluzní komplex, in kluzní komplex pentacy klického nebo tetracyklického terpenoidů a farmaceutický prostředek obsahující tento inlduzní komplex

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy rozpustných inkluzních komplexů pentacyklických a tetraio cyklických terpenoidů, které jsou samy o sobě ve vodě nerozpustné, způsobu přípravy farmaceutického prostředku obsahujícího tento inkluzní komplex, inkluzního komplexu pentacy klického nebo tetracyklického terpenoidů a farmaceutického prostředku obsahujícího tento inkluzní komplex.

Dosavadní stav techniky

Pentacyklické a tetracyklické terpenoidy představují skupinu přírodních látek - isoprenoidů s širokou paletou biologických aktivit (Dzubak, P.; Hajduch, M.; Vydra, D.; Hustova. A.; Kvasni20 ca, M.; Biedermann, D.; Markova, L.; Urban, M,; Šarek, J. Nat Prod. Rep. 2006, 23, 394-411), díky kterým se stávají středem zájmu farmaceutického průmyslu. Avšak ani modifikované ani sem Í syn tetické deriváty těchto přírodních látek většinou nemají optimální farmako logické vlastnosti. Mezi jejich nevýhody patří zejména nízká rozpustnost v médiích založených na vodné bázi a dále nevýhodné farmakokinetické ukazatele, jako např. nízká biologická dostupnost, krátký poločas vylučování a nedostatečná stabilita, které jsou naprosto nevhodné pro provádění in vivo testů na zvířatech, jakož i následné využití pro léčbu pacientů.

Pentacyklické a tetracy klické terpenoidy jsou jako slouěeniny s lipofilním rigidním skeletem, tvořeným 25 až 30 atomy uhlíku, ve vodě téměř nerozpustné, a to i když nesou polární funkční skupiny jako -OH, -COOH, =0, -NH₂ a další. Pro rozpouštění pro farmaceutické účely není možné využít rozpouštědel běžně používaných v chemické praxi, jako je chloroform, aceton, ethylacetát apod., z důvodu jejich inkompatibility s živými organismy. Z literatury je však známo, že pentacyklické triterpenoidní kyseliny vytvářejí v přítomnosti alkalických uhličitanů nebo hydrogenuhličitanu s cyklodextriny inkluzní sloučeniny, které jsou za přídavku vhodných aditiv rozpustné v médiích založených na vodné bázi (WO 92/09553). Je popsáno, že nejlepší rozpustnosti triterpenoidních kyselin lze dosáhnout použitím vyšších cyklodextrinů, jmenovitě β a γ, a jako aditiv je využíváno nižších alkoholů (methanol) nebo glykolů (propylenglykol, butandiol) (Uekama K., Hírayama F., Irie T.: Chem. Rev. 1998, 98, 2045-2076, Hedges A. R.: Chem. Rev. 1998, 98, 2035-2044). V používaných vehikulech dosahují triterpenoidní kyseliny rozpust40 nosti mezi 10 až 50 mg/ml (WO 92/09553). Inkluzní sloučeniny lze izolovat z jejich roztoků pomocí lyofilizace jako pevné látky ve formě prášků. Avšak takto lze rozpustit v médiích založených na vodné bázi pouze nativní triterpenoidní karboxylové kyseliny s volnou karboxylovou funkcí, nikoli jejich funkční deriváty nebo takové terpenoidy, které karboxylovou funkci nemají. Navíc ve farmaceutické praxi se často biologicky aktivní volné triterpenoidní kyseliny, které mají řadu nevýhodných farmako logických vlastností, např. obtížnou purifíkovatelnost a nestabilitu, převádějí na deriváty, které přinášejí často pomalejší metabolizací (zvýšení poločasu rozpadu), zvýšení stability nebo působí jako prodrug. Jedním typem takových derivátů jsou různé biologicky štčpitelné estery, jako např. morfolinoethylestery, acetoxymethytestery, heptylestery a další (Gewehr M„ Kunz H.: Synthesis 1997, 1499; Urban M., Šarek J., Tislerova I,, Dzubak P., Haj50 duch M.: Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5527). WO 03/026606 popisuje kosmetickou formulaci, obsahující sericosid nebo směsi terpenoidů rostlinného původu obsahující sericosid a cyklodextrin. US 6 403 816 popisuje formulaci některých derivátů betulinové kyseliny s β-cyklodextriny s příměsí methanolu, kde dochází až za sonifikace k tvorbě čirého roztoku.

Deriváty karboxylových kyselin jsou však obecně ještě méně kompatibilní s vodnými vehikuly než jsou volné kyseliny. Pro využití derivátů karboxylových kyselin ve farmaceutické praxi je tedy nezbytné nalézt formulaci, která umožní jejich použití s vehikuly na vodné bázi.

Z výše uvedených důvodů je zřejmé, že pro další vývoj je nutné připravit takové deriváty nerozpustných biologicky aktivních pentacyklíckých a tetracyklických terpenoidů, které jsou rozpustné v médiích založených na vodné bázi, jsou biodostupné (nejlépe orálně dostupné), mají vhodný poločas vylučování a jsou stabilní neboli mají optimální farmakokinetícké parametry.

io Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob přípravy inkluzních komplexů biologicky aktivních pentacyklických a tetracyklických terpenoidů, jehož podstata spočívá v tom, že se ve vodě nerozpustný terpenoid mající volnou karboxylovou, hydroxylovou nebo amino funkční skupinu derivatizuje na této funkční skupině substituentem vybraným ze skupiny zahrnující

a) substituenty obecného vzorce X\ kde X^a reprezentuje -OC RJ-COOH, kde R¹ je lineární či větvený C[ až C₈ alkylen, lineární či větvený C| až C₈ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na hydroxy20 skupinu terpenoidů:

zbytek / derivatizace zbytek / terpenoidů «t * terpenoidů ;

/ OH Z OX^a

b) substituenty obecného vzorce X^a, kde X^a je -OC-R'-COOH, kde R¹ je lineární či větvený

C) ažCg alkylen, lineární či větvený C| ažC₈ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na aminoskupinu terpenoidů:

zbytek / derivatizace zbytek / terpenoidů £ terpenoidů

Z NH₂ Z NHX^a

c) kvartémí amoniové substituenty obecného vzorce X^b, kde X^b reprezentuje -(CHjjnbfRSYX kde n je 2-8, R je lineární nebo větvený C[ až C₈ alkyl, případně substituovaný -OH, -NH? nebo halogenem, a Y“ je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidů:

zbytek terpenoidů derivatizace zbytek terpenoidů

CO₂H .

CO₂X^b

d) kvartémí amoniové substituenty obecného vzorce X^c, kde X^c reprezentuje -(CH?)_n(R3)⁺Y, kde n je 2-8, (R'V je protonovaný dusíkatý heterocyklus obsahující 1 až 2 atomy N a 4 až 9 atomů C a obsahuje alespoň jeden aromatický cyklus a Y” je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidů:

zbytek terpenoidů derivatizace zbytek * terpenoidů

CO₂H ,

CO₂X^C

e) substituenty obecného vzorce X^d, kde X^d reprezentuje -R⁴COOH, kde R⁴ je lineární či větvený Ci až C₄ alkylen, lineární či větvený C| až C₄ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu:

zbytek terpenoidu derivatizace _r Zbytek * terpenoidu

CO₂H 1 'C0₂X^d

f) glykosy lové substituenty X^e kde X^e je vybrán ze skupiny zahrnující glukosy I, galaktosyl, arabinosyl, rhamnosyl, laktosyl, cellobiosyl, maltosyl ajejich 2-deoxyanaloga, pro navázání α nebo β glykosidickou vazbou na hydroxyskupinu terpenoidu:

zbytek terpenoidu derivatizace _ zbytek * terpenoidu

OH ^Xox^e reakcí se sloučeninou poskytující daný substítuent a následně se připravený derivát rozpustí v 15 roztoku obsahujícím vodu a nativní nebo substituovaný γ-cyklodextrin, načež se vzniklý inkluzní komplex s nativním nebo substituovaným γ-cyklodextrinem izoluje z vodného roztoku, s výhodou lyofilizací.

Ve výhodném provedení vynálezu se jako sloučenina poskytující substituční obecného vzorce X^a20 použije sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující sloučeniny poskytující sukcinát, ftalát nebo glutarát.

Ve výhodném provedení vynálezu se jako sloučenina poskytující substítuent obecného vzorce X^bpoužije sloučenina poskytující cholinový ester, kde n=2, R-CH₃.

²⁵

Ve výhodném provedení vynálezu se jako sloučenina poskytující substítuent obecného vzorce X^cpoužije sloučenina poskytující pyridiniovou sůl, kde n=2, (R³)⁺PyH⁺, Y”=Br“.

Ve výhodném provedení vynálezu se jako sloučenina poskytující substítuent obecného vzorce X^dso použije sloučenina poskytující glykolát, kde ⁴R=CH₂.

Ve výhodném provedení vynálezu se jako sloučenina poskytující substítuent obecného vzorce X^epoužije sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující sloučeniny poskytující glukosyl, galaktosyl, laktosyl ajejich 2-deoxy analoga.

Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy farmaceutického prostředku obsahujícího inkluzní komplex pentacyklického nebo tetracyklického terpenoidu s nativním nebo substituovaným γcyklodextrinem, jehož podstata spočívá v tom, že se ve vodě nerozpustný pentacyklický nebo tetracyklický terpenoid mající volnou karboxylovou, hydroxylovou nebo amino funkční skupinu derivatizuje na této funkční skupině substituentem vybraným ze skupiny zahrnující

a) substituenty obecného vzorce X\ kde X^a reprezentuje -OC-R^l-COOH, kde R¹ je lineární či větvený Ci ažC₈ alkylen, lineární či větvený C_t ažC₈ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na hydroxy45 skupinu terpenoidu;

b) substituenty obecného vzorce X^a kde X^a je -OC- R' COOH, kde R¹ je lineární či větvený Cj až C₈ alkylen, lineární či větvený C₍ až C_s alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či sub-3CZ 300722 B6 stituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupínou, pro navázání na aminoskupinu terpenoidu;

c) kvartérní amoniové substituenty obecného vzorce X^b, kde X^b reprezentuje -(CH₂)_nN^R²3Y\ ? kde n je 2-8, R lineární nebo větvený C| až C₈ alkyl, případně substituovaný -OH, -NH₂ nebo halogenem, a Y je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát, pro navázání na karboxy skupinu terpenoidu;

d) kvartérní amoniové substituenty obecného vzorce X^c, kde X^c reprezentuje -(CH₂)„(R3)⁺Y , io kde n je 2-8, (R³)⁺ je protonovaný dusíkatý heterocyklus obsahující 1 až 2 atomy N a 4 až 9 atomů C a obsahuje alespoň jeden aromatický cyklus a Y je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu;

e) substituenty obecného vzorce X^d, kde X^d reprezentuje -R⁴-COOH, kde R⁴ je lineární či větvený C] až C₄ alkylen, lineární či větvený C[ až C₄ alkeny len, C(> arylen nesubstiluovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupínou, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu;

f) glykosylové substituenty X^e, kde X^e je vybrán ze skupiny zahrnující glukosyl, galaktosyl, arabinosyl, rhamnosyl, laktosyl, cellobiosyl, maltosyl ajejich 2-deoxyanaIoga, pro navázání a- nebo β-glykosidickou vazbou na hydroxyskupinu terpenoidu;

reakcí se sloučeninou poskytující daný substituent a následně se připravený derivát rozpustí v roztoku obsahujícím vodu, nativní nebo substituovaný γ-cyklodextrin a alespoň jednu farmaceu25 ticky přijatelnou pomocnou látku.

Pomocnými látkami mohou být biokompatibilní organická rozpouštědla, např. ethanol nebo propylenglykol, a látky usnadňující tvorbu inkluzních komplexů, jako např. alkalické uhličitany nebo hydrogenuhličitany.

Předmětem vynálezu je dále inkluzní komplex pentacyklického nebo tetracyklického terpenoidu s lipofilním rigidním skeletem, tvořeným 25 až 30 atomy uhlíku, obsahujícího alespoň jeden z následujících substituentů:

a) -OX^a, kde X^a ~OC-R'-COOH, kde R¹ je lineární Či větvený C| ažC₈ alkylen, lineární či větvený C| ažC« alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupínou,

b) -NHX^a, kde X^a je -OC-R’-COOH, kde R¹ je lineární či větvený C] ažC₈ alkylen, lineární či větvený C| až C₈ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupínou,

c) -COOX^b, kde X^b je -(CH2)nN⁺R²3Y“, kde n je 2-8, R² je lineární nebo větvený Ci ažC₈alkyl, případně substituovaný -OH, -NH₂ nebo halogenem, a Y“ je anion vybraný ze skupi45 ny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát,

d) -COOX^C, kde X^c je -(CH₂)_n(R3)⁺Y, kde n je 2-8, (R’)’ je protonovaný dusíkatý heterocyklus obsahující 1 až 2 atomy N a 4 až 9 atomů C a obsahuje alespoň jeden aromatický cyklus a Y'je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát,

e) -COOX^d, kde X^d reprezentuje -R⁴-COOH, kde R⁴ je lineární či větvený Ci až C₄ alkylen, lineární či větvený C] až C₄ alkenylen, C₆ aiylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupínou,

f) -OX^e, kde X^eje vázán a nebo β glykosidickou vazbou aje vybrán ze skupiny zahrnující glukosyl, galaktosyl, arabinosyl, rhamnosyl, laktosyl, cellobiosyl, maltosy! a jejich 2-<Ieoxyanaloga, s nativním nebo substituovaným γ-cyklodextrinem vyrobený způsobem podle vynálezu.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou substituenty obecného vzorce X^a vybrány ze skupiny zahrnující sukcinát, ftalát nebo glutarát.

io Ve výhodném provedení jsou substituenty obecného vzorce X^b cholinové estery, kde n=2, r²=ch₃.

Ve výhodném provedení jsou substituenty obecného vzorce X^c pyridiniové soli, kde n=2, (R³)⁺=PyH⁺, Y”=Br”.

Ve výhodném provedení jsou substituenty obecného vzorce X^d glykoláty, kde R⁴=CH₂.

Ve výhodném provedení jsou substituenty obecného vzorce X^c vybrány ze skupiny zahrnující glukosyl, galaktosyl, laktosyl ajejich 2-deoxyanaloga.

Předmětem vynálezu je také farmaceutický prostředek, obsahující rozpustnou formulaci podle předloženého vynálezu, vodu a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, vyrobený způsobem podle vynálezu.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je farmaceuticky přijatelným rozpouštědlem voda.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I znázorňuje farmakokinetický profil hemísukcinátu 2b podávaného ve formě vodného roztoku inkluzního komplexu s 2-hydroxypropyPy-cyklodextrinem při orálním podání myším.

Obr. 2 ukazuje farmakokinetický profil aldehydu 3 podávaného ve formě vodného roztoku inkluzního komplexu s 2-hydroxypropyl-y-cyklodextrinem při orálním podání myším.

Obr. 3 ukazuje farmakokinetický profil hemísukcinátu 3b podávaného ve formě vodného roztoku inkluzního komplexu s 2-hydroxypropyl~Y-cyklodextrinem při orálním podání myším.

Obr. 4 znázorňuje farmakokinetický profil hemísukcinátu 5a podávaného ve formě vodného roztoku inkluzního komplexu s 2-hydroxypropyl-Y-cyklodextrinem při orálním podání myším.

Obr. 5 ukazuje farmakokinetický profil diketon-dihemisukcinátu 5e podávaného ve formě vodného roztoku inkluzního komplexu s 2“hydroxypropyl-y-cvklodextrinem při orálním podání myším.

Obr. 6 znázorňuje farmakokinetický profil pyrazinu 6a podávaného ve formě vodného roztoku inkluzního komplexu s 2-hydroxypropyl~7-cyklodextrinem při orálním podání myším.

Obr. 7 ukazuje farmakokinetický profil hemísukcinátu 8a podávaného ve formě vodného roztoku inkluzního komplexu s 2-hydroxypropyl-y-cyklodextrinem při orálním podání myším.

- s CZ 300722 B6

Obr. 8 ukazuje farmakokínetícké profily látek 5c, 5d, 6, 7, 8 podávané jako suspenze s karboxymethylcelulózou (CMC) orálně myším.

Příklady provedení vynálezu

Způsob přípravy farmaceutického prostředku s obsahem pentacykl ických a tetracykl ických terpenoidů se skládá ze dvou stupňů: a) derivatizace nerozpustné výchozí látky, b) příprava vodného roztoku inkluzního komplexu derivátu s nativním nebo substituovaným γ-cyklodextrinem.

Všechny v příkladech popisované sloučeniny a jejich zjišťované vlastnosti jsou shrnuty v Tabulce 1 a znázorněné ve vzorcích 1 až 8.

Jednotlivé obecné postupy derivatizace nerozpustných pentacykl ických a tetracykl ických tri15 terpenoidů jsou označeny H-l, H-l *, H-2, H-3, H—4, K-l, K-2 a jsou zde ukázány na konkrétních příkladech. Obecné postupy přípravy inkluzního komplexu, při níž dojde k rozpuštění látky, jsou označeny A a B. a) Derivatizace nerozpustné látky

Příklad 1

Příprava betulín-dihemisukcinátu (1 a) (postup H-l)

Do roztoku betulinu (1) (500 mg; 1,13 mmol) v pyridinu (20 ml) byl přidán sukcinanhydrid (1,2 g; 12,0 mmol) a V.V-dimethylaminopyridin, dále jen DMAP (1,2 g; 10,0 mmol) a reakční směs byla refluxována za míchání 12 h. Průběh reakce byl sledován pomocí tenkovrstvé chromatografíe, dále jen TLC (hexan/ethylacetát 1:1). Poté byla reakční směs ochlazena, zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl Čištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí z 20% ethylacetátu v hexanu do 100% ethylacetátu. Chromatografícky jednotný dihemisukcinát la byl lyofilizován z terc.butylalkoholu. Získaný hemisukcínát la (387 mg; 67%) měl t.t. 107 ’C, (a]_D = 10° (c = 0,44). ^|5C NMR spektrum: 14,8, 16,0, 16,1, 16,5, 18,1, 19,1, 20,8, 23,6, 25,2, 27,0, 27,9, 29,0, 29,0, 29,1, 29,3, 29,5, 29,6, 34,1, 34,4, 37,0, 37,6, 37,8, 38,4,40,9,42,7,46,4,47,7,48,8,50,3,55,4,63,2,81,5, 109,9,150,1, 171,8,172,4, 177,8, 177,8.

Příklad 2

Příprava hemisukcinátu 5a (postup H-l)

Do roztoku hydroxydiketonu 5 (500 mg; 1,0 mmol) ve směsi pyridinu (15 ml) a tetrahydrofuranu, dále jen THF (5 ml) byl přidán sukcinanhydrid (900 mg; 9,0 mmol) a DMAP (982 mg; 8,0 mmol) a reakční směs byla refluxována za míchání 12 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (hexan/ethylacetát 1:1). Poté byla reakční směs ochlazena a zpracována analogickým způsobem jako při přípravě sloučeniny la. Chromatografícky jednotný hemisukcínát 5a byl krystalizován ze směsi acetonitril/voda. Získaný hemisukcínát 5a (383 mg; 64 %) měl t.t. 154 až 157 °C, [a]_D = -99° (c = 0,24). ^I3C NMR spektrum: 16,1, 16,5, 16,7, 16,8, 18,0, 19,7, 19,8, 21,0, 23,5,

25,9,27,4, 27,8, 27,9, 28,4, 28,9, 29,2, 34,5, 37,1, 37,8, 38,5, 41,5, 45,5, 46,1, 50,8, 50,8, 53,4, 55,4,81,2, 150,6, 168,1,171,0, 171,9,177,6, 189,2, 194,3.

Příklad 3

Příprava hemisukcinátu 8a (postup H-l)

Do roztoku aminoalkoholu 8 (500 mg; 1,1 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml) byl přidán sukcinanhydrid (900 mg; 9,0 mmol) a reakční směs byla refluxována za míchání 5 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (hexan/ethylacetát Ll). Poté byla reakční směs ochlazena a zpracována analogickým způsobem jako při přípravě sloučeniny la. Chromatograficky jednotný hemtsukcinát 8a byl krystalizován ze směsi aceton itri 1/voda. Získaný hemisukcinát 8a (406 mg; 67 %) io měl t.t. 283 až 284 °C, [a]_D = +65° (c = 0,34).

Příklad 4

Příprava hemisukcinátu volné kyseliny 2e (postup H-l *)

Ke směsi kyseliny betulinové (2) (500 mg; 1,1 mmol) a uhličitanu draselného (276 mg; 2,0 mmol) v/V,/V-dimethylfonnamidu, dále jen DMF (20 ml) byl přidán benzylbromid (178 μΐ;

1,5 mmol) a reakční směs byla míchána za laboratorní teploty 24 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (toluen/diethylether 10:1), Poté byla reakční směs zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCl, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu, mobilní fází byl toluen. Získaný surový benzylbetulinát (517 mg; 86 %) byl použit bez čištění do dalšího kroku.

Do roztoku benzylbetulinátu (500 mg; 0,9 mmol) v pyridinu (20 ml) byl přidán sukcinanhydrid (900 mg; 9,0 mmol) a DMAP (982 mg; 8,0 mmol) a reakční směs byla refluxována za míchání 15 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (hexan/ethylacetát 1:1). Poté byla reakční směs ochlazena, zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCl, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu gradientovou elucí z 10% ethylacetátu v hexanu do 50% ethylacetátu. Chromatograficky jednotný hemisukcinát benzylbetulinátu byl použit bez čištění do dalšího kroku,

Do roztoku hemisukcinátu benzylbetulinátu (389 mg; 0,6 mmol) ve směsi tetrahydrofuranu (10 ml) a methanolu (5 ml) bylo přidáno palladium na uhlí (50 mg; 10%) a 1,4-cyklohexadien (568 μΙ; 6 mmol) a reakční směs byla míchána za laboratorní teploty 22 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (hexan/ethylacetát 1:1). Poté byla reakční směs zfiltrována přes křemelinu a eluát odpařen na rotační vakuové odparce. Krystalizací odparku z benzenu byl získán hemisukcinát 2e (366 mg; 91 %) o t.t. 265 °C, [a]_D = 15°(c = 0,37). ^bC NMR spektrum: 14,6, 16,2, 16,2, 16,6, 18,2, 19,3, 20,9, 23,6, 25,4, 28,0, 29,2, 29,4, 29,7, 30,5, 32,1, 34,1, 37,1, 37,1, 37,9, 38,2,

38,4, 40,7, 42,4, 46,9, 49,2, 50,2, 55,3, 56,5, 81,5, 109,7, 150,3, 171,7, 178,3, 182,7.

Příklad 5

Příprava hemiftalátu 2c (postup H-2)

Do roztoku ethylbetulínátu 2a (500 mg; 1,0 mmol) v pyridinu (20 ml) byl přidán ftalanhydrid 50 (1,48 g; 10,0 mmol) a DMAP (366 mg; 3,0 mmol) a reakční směs byla refluxována za míchání 28

h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (hexan/ethylacetát 1:1). Poté byla reakční směs ochlazena a zpracována a produkt čištěn analogickým způsobem jako při přípravě sloučeniny la.

Chromatograficky jednotný hemiftalát 2c byl lyofilizován z terc.butylalkoholu. Získaný hemiftalát 2c (335 mg; 53 %) měl t.t. 131 °C, [a]_D - 26° (c = 0,45).

-7 CZ 300722 B6

Příklad 6

Příprava betulin-dihemiftalátu (lb) (postup H-2)

Do roztoku betulinu (1) (500 mg; 1,13 mmol) v pyridinu (20 ml) byl přidán ftalanhydrid (1,33 g; 9,0 mmol) a DMAP (366 mg; 3,0 mmol) a reakční směs byla refluxována za míchání 37 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (hexan/ethylacetát 1:1). Poté byla reakční směs ochlazena a zpracována a produkt čištěn analogickým způsobem jako při přípravě sloučeniny la. Chromato10 graficky jednotný dihemiftalát lb byl lyofilizován z tercbutylalkoholu. Získaný dihemiftalát lb (633 mg; 76 %) měl t.t. 178 až 180 °C, [a]_D = 28° (c = 0,55).

Příklad 7

Příprava glukosidu 4i (postup H-3)

i) Do roztoku ethylesteru 4g (1,00 g; 2,07 mmol) v bezvodém acetonitrilu (25 ml) byl přidán

2,3,4,6-tetraacetyl-a-D-glukopyranosylbromid (1,7 g; 4,1 mmol) a kyanid rtuťnatý (782 mg;

3,1 mmol) a směs byla poté refluxována pod zpětným chladičem s vyloučením vzdušné vlhkosti.

Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (toluen/ether 6:1). Poté byla ochlazená reakční směs probublána vlhkým sulfanem, zfiltrována na křemelině, filtrát byla zředěn desetinásobkem vody a extrahován do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čiš25 těn sloupcovou chromatografií na silikagelu, mobilní fází byl toluen $ gradientem diethyletheru. Získaný acetylovaný glukosid 4h (550 mg; 33 %) o t.t. 110 °C, [a]_D = -33° (c = 0,32). IR spekl· rum: 1246 (C-O); 1609 (C=C); 1697, 1754 (C=O). 'H NMR spektrum: 0,73 s, 3H; 0,87 s, 3H; 0,90 s, 3H; 0,92 s, 3H; 1,02 s, 3H; 1,20 s, 3H; 1,22 s, 3H; (7xCH₃); 1,26 t, 3H (J= 7,4; -CH₂CHj); 2,01 s, 3H; 2,03 s, 3H; 2,04 s, 3H; 2,09 s, 3H (4xCH₃COO); 2,46 d, IH (J=l8,6; H-22b);

2,46 m, IH (Σ>12,0; Η-16β); 2,68 dd, IH (J,= 12,7, J₂=3.2; Η-13β); 3,08 m, IH, (ZJ-16,4; H3a); 3,20 septet, IH (J=7,1; H-20); 3,69 m, IH (J=20,0; H-5'); 4,10-4,28 m, 4H (O-CH₂, H6'a,b); 4,54 d, IH (J=8,l; H-l'): 5,01-5,09 m, 2H (H-4', H-2'); 5,18-5,24 m, IH (SJ=24; H3 ). MS ESI m/z (%): [Pro C₄₆H_M5O,₃. M* 828], 829 ([M+Hf, 10); (851 ([M+Naf, 40). Elementární analýza pro C46H_mOi₃: vypočteno C 66,64 %, H 8,27 %; nalezeno C 61,97 %, H

8,12%.

ii) Získaný acetylovaný glukosid 4h (330 mg; 0,39 mmol) byl smíchán s bezvodým methanolem (10 ml) a do směsi byl přidán kovový sodík (5 mg). Průběh reakce byl sledován reverzní TLC (voda/THF 1:1). Reakční směs byla poté okyselena kyselinou octovou na pH 6 a odpařena na rotační vakuové odparce. K odparku byla přidána voda a vzniklá suspenze byla odsáta a promyta vodou. Sraženina byla vysušena v exsikátoru nad oxidem fosforečným. Získaný volný glukosid 4i (180 mg; 0,28 mmol), 68 %) měl t.t. 196,0 °C, [a]_D = -46° (c = 0,29). IR spektrum: 1609 (C=C); 1697, 1724 (C-O); 3411 (O-H). Ή NMR spektrum: 0,82 s, 3H; 0,89 s, 3H; 0,93 s, 3H;

l, 02 s, 3H;l,03 s,3H; 1,20 s,3H; 1,21 s,3H(7xCH₃); 1,25 t, 3H (>7,2;-CHr-CH₃); 2,14 d, IH (>18,5; H-22b); 2,45 d, IH (>18,8; H-22a); 2,42-2,52 m, IH (Σ>40; Η-16β); 2,68 dd, IH

0.=12,8, J₂=2.6; Η^13β); 3,13-3,50 m, 6H (H-3a, H-20, H-5', H-3', H-4', H-2'); 3,75-3,87 m, 2H (H-6'a,b); 4,10-4,24 m, 2H (O-CH₂); 3,79 d, IH (>7,ó; H-l'). MS ESI m/z (%): [Pro CisHóoOq, M⁺ 660], 683 ([M+Na]⁺, 60). Elementární analýza pro Ο₃₈Η₆₀θ9: vypočteno C 66,06 %, H 9,15 %; nalezeno C 66,39 %, H 8,98 %.

Příklad 8

Příprava bisglukosidu 7e, 7f (postup H-3)

i) Do suspenze diolu 7a (2,00 g; 3,92 mmol) v bezvodém acetonitrilu (25 ml) byl přidán

2,3,4,6-tetraacetyI-a-D-gIukopyranosylbromid (6,4 g; 15,7 mmol) a kyanid rtuťnatý (3,0 g; 11,8 mmol) a směs byla poté refluxována pod zpětným chladičem s vyloučením vzdušné vlhkosti. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (toluen/ether 6:1). Poté byla ochlazená reakční směs probublána vlhkým sulfanem, zfiltrována na křemelině, filtrát byla zředěn desetinásobkem vody a extrahován do ethylaeetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čištěn sloupcovou chromatografií na silíkagelu, mobilní fází byl toluen s gradientem diethyletheru. Získaný acetylovaný bisglukosid 7d (2,50 g; 54 %) měl t.t. 102,7 °C, [a]o - +14° (c = io 0,28). IR spektrum: 1234 (C-O); 1603 (C=C); 1755 (CO). ^]H NMR spektrum: 0,73 s, 3H; 0,87 s, 3H; 0,89 s, 3H; 0,90 s, 3H; 1,09 s, 3H (5xCH₃); 1,99 s, 3H; 2,01 s, 3H; 2,02 s, 3H; 2,02 s, 3H; 2,03 s, 3H; 2,03 s, 3H; 2,04 s, 3H; 2,08 s, 3H (8xCH₃COO); 2,38 dt, IH (3)=14,0, 3₂=4,9; H16a); 3,58 dd, IH (3,=11,8, J₂=3,5; Η-13β); 3,07 dd, IH (J,=l 1,6, 3₂=4,9; H-3a); 3,51 m, IH (Σ3=16,8; H-5'); 3,67 m, IH (ZJ-17,7; H-5'); 3,99 d, IH (3=1 1,0; H-28a); 4,11 m, 2H (H15 6'a,b); 4,20 d, 1H (J= 10,7; H-28b); 4,25 m, 2H (H-6'a,b); 4,53 d, IH (J=7,9; H-l'); 4,63 d, IH (3=8,2; H-l'); 4,89 dd, IH (3,=9,5, J₂=7,9; H-3'); 5,03 m, 1H (223=24,0; H-3'); 5,07-5,16 m, 3H (2x H-2'); 5,17-5,23 m, 2H (2x H^f); 5,19 bs, 2H (Bn); 7,37 m, 5H (Ph). MS ESI m/z (%): [Pro CóoH8₂0₂₃, M⁺ 1170], 1193 ([M+Na]⁺, 60). Elementární analýza pro C₍,oH₈₂0_?.₃: vypočteno C 61,53 %, H 7,06 %; nalezeno C 63,86 %, H 7,52 %.

ii) Získaný acetylovaný bisglukosid 7d (2,30 g; 1,97 mmol) byl smíchán s bezvodým methanolem (250 ml) a do směsi byl přidán kovový sodík (10 mg). Průběh reakce byl sledován reverzní TLC (voda/THF 1:1). Reakční směs byla poté okyselena kyselinou octovou na pH 6 a odpařena na rotační vakuové odparce. K. odparku byla přidána voda a vzniklá suspenze byla odsáta a pro25 myta vodou. Sraženina byla vysušena v exsikátoru nad oxidem fosforečným. Získaný volný bisglukosid 7e (1,36 g; 54 %) měl t.t, 186 °C, [afo = +5° (c - 0,33). IR spektrum (měřeno technikou ATR): 1034, 1076 (CO); 1708, 1726 (C-O); 3403 (O-H). *H NMR spektrum: 0,84 s, 3H; 0,89 s, 3H; 0,93 s, 3H; 1,02 s, 3H; 1,12 s, 3H (5xCH₃);2,39 dt, IH (3,=13,0, J₂=3,7; H-16a); 2,71 d, IH (3=9,0; Η-13β); 3,17m, IH (H-3a); 3,24-3,34 m, 4H (2xH-5\ 2xH-2'); 3,36-3,48 m, 4H (H-3', H-4'); 3,68-3,80 m, 2H (H-6'a,b); 3,84 m, 2H (H-6'a,b); 3,94 d, IH (3=9,8; H-28a);

4,30 d, IH (3=10,0; H-28b); 4,33 d, IH (J=7,6; H-l'); 4,34 d, IH (3=7,6; H-l') 5,20 bs, 2H (Bn); 7,35 m, 5H (ZJ=3,2; Ph). ^!3C NMR spektrum je uvedeno v tabulce 3. MS ESI m/z (%): [Pro C44H6óO|s, M⁺ 834], 858 ([M+Naf, 40). Elementární analýza pro C44H₆₆O,₅: vypočteno C 63,29 %, H 7,97 %; nalezeno C 63,44 %, H 7,52 %.

iii) Bisglukosid 7e (1,10 g; 1,32 mmol) byl rozpuštěn ve směsi THF (10 ml) a methanolu (10 ml) a benzylová skupina odchráněna v autoklávu za přítomnosti Pd/C (100 mg; 10%) pod přetlakem vodíku (0,6 MPa) za stálého míchání. Průběh reakce byl kontrolován reverzní TLC (voda/THF 1:1). Po 24 h byl autokláv otevřen a reakční směs zfiltrována přes sloupec křemeliny.

Eluát byl odpařen na rotační vakuové odparce a odparek překrystalizován z methanolu. Získaná bisglukosidická kyselina 7f (785 mg; 42 %) měla t.t. 194 °C, [a]_D = +19 (c = 0,31). IR spektrum (měřeno technikou ATR): 1033, 1079 (C-O); 1693, 1707 (CO); 3386 (O-H). Ή NMR spektrum: 0,85 s, 3H; 0,93 s, 3H; 0,96 s, 3H; 1,05 s, 3H; 1,18 s, 3H (5xCH₃); 2,32-2,45 m, IH (H16a); 2,87 dd, IH 0,=11,2, 3₂=2,8; Η-13β); 3,11-3,15 m (Σ3=17,2; H-3a); 3,15-3,22 m, 4H;

3,24-3,30 m, 4H; 3,65 d, 2H (J=4,7; 2xH-6'a); 3,68 d, 2H (3=4,9; 2xH-ó'b); 3,85 d, IH (3=12,4;

H-28a); 4,29 d, 2H (J=8,l; H-l'); 4,31 d, IH (3=13,7; H-28b); 4,32 d, IH (3=7,7; H-l'). MS ESI m/z (%): [Pro C₃₇H₆₀O₁₅, M⁺ 734], 767 ([M+Na]⁺ 40). Elementární analýza pro C^H^O^: vypočteno C 59,66 % , H 8,12 %; nalezeno C 59,93 %, H 8,01 %.

Příklad 9

Příprava 2-deoxygalaktosidu 4k (postup H^l)

-9CZ 300722 B6

i) Do roztoku triterpenického hydroxyderivátu 4g (500 mg; 1,0 mmol) v suchém aeetonitrilu (30 ml) byl přidán tri-O-acetylgalaktal (1,2 mmol), molekulové síto 4A (500 mg), bromid lithný (730 mg) a vysušený katex v H' cyklu (900 mg). Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě 12 hodin. Průběh reakce byl kontrolován tenkovrstvou chromatografií s mobilní fází hexan :ethy lacetát 2:1. Reakční smés pak byla zfiltrována přes vrstvu křemeliny a sloupec byl promyt ethylaeetátem. Reakční směs byla zředěna vodou (50 ml), extrahována ethylaeetátem (2x 20 ml) a organická fáze odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl rozpuštěn v chloroformu (5 ml) a roztok byl prolit přes krátký sloupec silikagelu (eluce ethylaeetátem). Eluát byl odpařen na rotační vakuové odparce. Surový produkt byl poté separován sloupcovou chromatoio grafit na silikagelu, eluce toluenem. Produkt byl poté lyofilizován z 2-methylpropan-2-olu, byl získán bílý lyofilizát 4j (360 mg; 47 %) s teplotou tání 100,8 °C, [a]_D - +38,9° (c 0,52).

i i) 2-deoxygalaktosid 4j (200 mg; 0,26 mmol) byl rozpuštěn suchém methanolu (300 ml) a do roztoku bylo přidáno katalytické množství sodíku (5 mg). Průběh reakce byl sledován tenkovrst15 vou chromatografií na reverzní fázi (mobilní fáze voda/tetrahydrofuran 1:1). Reakční směs byla zneutralizována kyselinou octovou a odpařena na rotační vakuové odparce, K odparku byla přidána voda (300 ml) a vyloučená sraženina produktu odfiltrována. Filtrační koláč byl promýván vodou. Byl získán bílý krystalický 2-deoxyglukosid 4k (161 mg; 97 %) s teplotou tání 158,0 °C a [a]_D = +17,2° (c-0,51).

Příklad 10

Příprava 2-deoxygl úkos idu 4m (postup FM)

i) Do roztoku triterpenického hydroxyderivátu 4d (500 mg; 1,0 mmol) v suchém aeetonitrilu (30 ml) byl přidán tri-O-acety lgl ukal (1,2 mmol), molekulové síto 4A (500 mg), bromid lithný (730 mg) a vysušený katex v H⁺ cyklu (900 mg). Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě 12 hodin. Průběh reakce byl kontrolován tenkovrstvou chromatografií s mobilní fází hexan:ethylacetát 2:1. Reakční směs pak byla zfiltrována přes vrstvu křemeliny a sloupec byl promyt ethylaeetátem. Reakční směs byla zředěna vodou (50 ml), extrahována ethylaeetátem (2x 20 ml) a organická fáze odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl rozpuštěn v chloroformu (5 ml) a roztok byl prolit přes krátký sloupec silikagelu (eluce ethylaeetátem). Eluát byl odpařen na rotační vakuové odparce. Surový produkt byl poté separován sloupcovou chromato35 grafu' na silikagelu, eluce toluenem. Produkt byl poté lyofilizován z 2-methylpropan- 2-olu, byl získán bílý lyofilizát 41 (245 mg; 34 %), teplota tání 204,1 °C, [a]_D = +24,2 (c - 0,43).

ii) 2-deoxyglukosid 41 (60 mg; 0,08 mmol) byl rozpuštěn suchém methanolu (100 ml) a do roztoku bylo přidáno katalytické množství sodíku (5 mg). Průběh reakce byl sledován tenkovrstvou chromatografií na reverzní fázi (mobilní fáze voda:tetrahydrofuran 1:1). Reakční směs byla zneutralizována kyselinou octovou a odpařena na rotační vakuové odparce. K odparku byla přidána voda (100 ml) a vyloučená sraženina produktu odfiltrována. Filtrační koláč byl promýván vodou. Byl získán bílý krystalický 2-deoxyglukosid 4m (39 mg; 74 %) s teplotou tání 208,0 °C, [a]_D = +14,0 (c = 0,40). ^L,C NMR spektrum: 15,7, 16,1, 16,5, 16,6, 18,0, 19,7, 19,8, 21,0, 21,6,

24,9, 27,5, 28,3, 28,9, 33,5, 34,7, 37,0, 37,6, 38,2, 38,3, 41,1, 45,1, 45,2, 47,4, 50,9, 52,4, 53,0, 55,4, 62,7,68,6,71,2, 72,1,81,4,93,1, 174,9, 145,5, 172,7,208,0.

MS m/z (%): [Pro C,₇H_S8O₈, M⁺ 630], 653 ([M+Na]*, 30), 631 ([M+H]*, 30). Pro C„H_S8O₈(630,9) vypočteno: C 70,44 %, H 9,27 %. Nalezeno: C 70,58 %, H 9,13 %.

Příklad 11

Příprava glykolátu 4a (postup K-l) cz. jwi/zz Bb

i) Ke směsi 21-oxokyseliny 4 (500 mg; 0,98 mmol) a uhličitanu draselného (276 mg; 2,0 mmol) v dichlormethanu (10 ml) a acetonitrilu (5 ml) byl přidán benzylbromacetát (240 μ|;

1,5 mmol) a reakční směs byla míchána za laboratorní teploty 24 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (toiuen/diethylether 6:1). Poté byla reakční směs zředěna desetinásobkem vody a extrahována do dichlormethanu. Spojené organické podíly byly jednou vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu, mobilní fází byl toluen. Získaný surový benzylglykolát 21-oxokyseliny (509 mg; 79 %) byl použit do dalšího kroku.

io ii) Do roztoku benzyl-glykolátu 21-oxokyseliny (350 mg; 0,5 mmol) ve směsi tetrahydrofuranu (20 ml) a methanolu (10 ml) bylo přidáno palladium na uhlí (75 mg; 10%) a 1,4-cyklohexadien (473 μΙ; 5 mmol) a reakční směs byla míchána za laboratorní teploty 20 b. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (toiuen/diethylether 4:1). Poté byla reakční smčs zfiltrována přes křemelinu a eluát odpařen na rotační vakuové odparce. Krystalizaci odparku ze směsi aceton/voda byl získán glykolát 21-oxokyseliny 4a (272 mg; 90 %) o t.t. 267 až 269 °C, [ol]d - -33° (c = 0,39). ”c NMR spektrum: 15,9, 16,5, 16,6, 16,8, 18,1, 20,0, 20,1, 21,2, 21,3, 27,7, 29,0, 23,6, 25,1, 27,9,33,5,34,9,37,1,37,7,38,5,41,4,45,3,45,3,47,3,51,1,53,1,55,4,60,4,80,8, 146,0, 171,2,

171,7, 172,4, 173,7, 208,0. MS, m/z (%): [Pro Cí₄H_S0O₇, M* 570], 570 (M⁺, 18), 527 (5), 510 (22), 495 (6), 467 (23), 375 (4), 359 (3), 320 (16), 307 (98), 229 (10), 203 (31), 189 (52). Pro CmHmO, (570.4) vypočteno: 71,55 % C, 8,83 % H; nalezeno: 71,52 % C, 8,85 % H.

Příklad 12

Příprava glykolátu 7d (postup K-l)

i) Ke směsi pentanorkyseliny 7 (600 mg; 1,2 mmol), uhličitanu stříbrného (440 mg;

1,6 mmol) ve směsi chloroformu (10 ml) a acetonitrilu (7 ml) byl přidán benzylbromacetát (260 μΙ; 1,6 mmol) a reakční směs byla míchána 28 h za laboratorní teploty. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (toiuen/diethylether 6:1). Poté byla reakční směs zfiltrována přes křemelinu a filtrát zpracován a produkt čištěn analogickým způsobem jako při přípravě benzylglykolátu 21-oxokyseliny. Získaný surový benzylglykolát pentanorkyseliny (358 mg; 46%) o t.t. 156 až 157 °C (methanol), [a]_D = +57° (c = 0,31) byl použit do dalšího kroku.

ii) Do roztoku benzylglykolátu pentanorkyseliny (300 mg; 0,5 mmol) ve směsi tetrahydrofuranu (10 ml) a methanolu (3 ml) bylo přidáno palladium na uhlí (75 mg; 10%) a reakční směs byla hydrogenována vodíkem v autoklávu za míchání za teploty místnosti 5 h. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (chloroform). Poté byla reakční směs zfiltrována přes křemelinu a eluát odpařen na rotační vakuové odparce. Krystalizaci odparku ze směsi aceton/voda byl získán glykolát 7d (215 mg; 83 %) o t.t. 230 až 230 °C, [a]_D = 66° (c = 0,23). ⁿC NMR spektrum: 16,0, 16,2,

16.5, 16,7, 18,1, 19,7, 20,7, 21,3, 21,8, 23,6, 26,5, 27,1, 27,9, 34,0, 37,1, 37,8, 38,5, 41,0,46,7,

50.5, 50,4, 55,4, 61,0,63,2, 80,6,170,2, 170,7, 171,0, 171,2,210,5. MS, m/z (%): [ProC.nH^O,, M⁺ 562], 562 (M⁺, 1), 516 (36), 502 (38), 487 (18), 459 (19), 415 (10), 339 (8), 313 (54), 223 (11), 204 (15), 189 (70). Pro C31H49O9 (562,3) vypočteno: 66,17 % C, 8,24 % H; nalezeno: 66,24 %C, 8,31 % H.

Příklad 13

Příprava kvartémí amoniové soli 2f (postup K-2)

i) Do suspenze kyseliny betulinové 2 (1*37 g; 3 mmol) ve směsi dichlormethanu (15 ml) a acetonitrilu (1 ml) byl přidán uhličitan draselný (0,42 g; 3 mmol) a 1,2-dibromethan (550 μΙ;

4,5 mmol) a reakční směs byla míchána za teploty místnosti. Průběh reakce byt sledován pomocí

TLC (toluen/ether 6:1). Poté co byla veškerá výchozí látka spotřebována, byla filtrací odstraněna použitá báze, směs byla zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (gradient ethylacetátu v hexanu). Získaný 2'-bromethylbetulinát (480 mg; 28 %) měl t.t, 184 °C, [a]_D = +7° (c = 0,24).

io ii) 2 '-brorncthyl betu línat (200 mg; 0,35 mmol) byl rozpuštěn v DMF (5 ml). K roztoku byl přidán trimethylamin (0,5 ml; 5,67 mmol), reakění nádoba byla uzavřena a ponechána 1 h při 60 °C. Po ochlazení byla reakční směs zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byt čištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (gradient methanolu v chloroformu). Získaná kvartémí amoniová sůl 2f (163 mg; 75 %) měla t.t. 155 až 156 °C, [a]_D = +22° (c = -0,40). ¹³C NMR spektrum:

15.1, 16,1, 16,6, 16,7, 19,3, 19,5, 21,9, 26,6, 27,9, 28,6, 30,8, 31,3, 32,7, 35,4, 37,5, 38,2, 39,3, 39,8, 39,9, 41,8, 43,4, 50,5, 51,8, 54,4, 56,6, 57,7, 58,4, 59,5, 65,9, 78,7, 79,1, 79,4, 79,5, 110,5,

128.1, 137,3, 151,2, 176,1. Elementární analýza pro C₃₅H₆₀BrNO3: vypočteno C 67,50 %, H 9,71 %; nalezeno C 67,46 %, H 9,68 %.

Příklad 14

Příprava kvartémí amoniové soli 2g (postup K-2)

2'-bromethylbetulinát z příkladu 12 (285 mg; 0,46 mmol) byl rozpuštěn v DMF (5 ml), k roztoku byl přidán pyridin (Iml; 9,49 mmol), reakční nádoba byla uzavřena a ponechána 4 dny při 60 °C. Po ochlazení byla reakční směs zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (gradient methanolu v chloroformu). Získaná kvartémí amoniová sůl 2g (527 mg; 86 %) měla t.t. 186 až 187 °C, [a]_D = +45° (c = 0,39). ¹³C NMR spektrum: 15,0, 16,1, 16,7, 16,7, 19,4, 19,4, 21,9, 26,6, 28,0, 28,6, 30,8, 31,4, 32,7, 35,5, 37,5, 38,2, 39,5, 39,9, 40,0, 41,8, 43,4, 50,6, 51,8, 56,7, 57,9, 61,5, 63,6, 79,5, 79,5, 110,5, 129,7, 146,6, 147,7,

151,4, 176,3. Elementární analýza pro C^Hs^BrNOj: vypočteno C 69,14 % , H 8,78 %; nalezeno C69,18%, H 8,76 %.

Příklad 15

Příprava kvartémí amoniové soli 4o (postup K-2)

i) Do suspenze kyseliny 4 (5,0 g; 10 mmol) ve směsi dichlormethanu (150 mí) a acetonitrilu (5 ml) byl přidán uhličitan draselný (2 g; 14,2 mmol) a 1,2-dibromethan (1,65 ml; 13,5 mmol) a reakční smčs byla míchána při teplotě místnosti. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (toluen/ether 6:1). Poté co byla veškerá výchozí látka spotřebována, byta filtrací odstraněna použitá báze, směs byla zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (gradient ethylacetátu v hexanu). Získaný 2'-bromethylester kyseliny 4 (2,3 mg; 37 %) měl t.t. 210 °C, [a]_D = 23° (c = 0,35).

ii) Získaný 2 -bromethyl ester kyseliny 4 (285 mg; 0,46 mmol) byl rozpuštěn v DMF (5 ml). K roztoku byl přidán triethylamin (0,5 ml; 3,39 mmol), reakční nádoba byla uzavřena a ponechána 4 dny při 60 °C. Po ochlazení byla reakční směs zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce. Odparek byl čišCZ 300722 B6 těn sloupcovou ehromatografíí na sílikagelu (gradient methanolu v chloroformu). Získaný kvartémí amoniový ester 4o (68 mg; 19 %) měl t.t, 183 °C, [a]_D - +15° (c = 0,31). ^l3C NMR spektrum: 16,4, 16,8, 17,2, 17,2, 18,7, 20,1, 21,4, 218, 24,2, 257, 28,3, 29,6, 29,8, 33,9, 35,5, 37,8,

38,4, 42,0, 45,9, 51,7, 53,9, 56,1, 65,3, 78,0, 78,3, 78,6, 81,9, 146,5, 172,5, 174,6, 209,1. Elementární analýza pro C^HbéBrNOj: vypočteno C 66,65 % , H 9,23 %; nalezeno C 66,66 %, H 9,26 %.

Příklad 16 io

Příprava kvartérní amoniové soli 4p (postup K-2)

2'-bromethyiester kyseliny 4 získaný v příkladu 14 (285 mg; 0,46 mmol) byl rozpuštěn v DMF (5 ml). K roztoku byl přidán triethanolamin (500 mg; 4,7 mmol), reakční nádoba byla uzavřena a is ponechána 10 dní při 60 ^ŮC. Po ochlazení byla reakční směs zředěna desetinásobkem vody a extrahována do ethylacetátu. Spojené organické podíly byly třikrát vytřepány s 5% HCI, třikrát vodou, vysušeny síranem horečnatým a rozpouštědla byla odpařena na rotační vakuové odparce.

Odparek byl čištěn sloupcovou ehromatografíí na sílikagelu (gradient methanolu v chloroformu). Získaný kvartérní amoniový ester 4p (134 mg; 41 %) měl t.t. 162 až 163 °C, [a]_D = +28° (c 20 0,13). ^ftC NMR spektrum 16,5,17,0,17,3, 17,4,19,2,20,3,20,6,21,1,22,4,2,6,26,4,28,4,28,8,

3,2, 34,5, 36,0, 38,3, 38,9, 39,6, 42,6, 46,0, 46,5, 46,8, 52,3, 54,3„54,5, 56,7, 57,9, 60,8, 64,6, 79,5, 146,8, 172,8, 14,4, 15,5, 209,7. Elementární analýza pro C₄₀H₆₆BrNO₈: vypočteno C 62,49 %, H 8,65 %; nalezeno C 62,52 %, H 8,62 %.

b) Příprava farmaceutického prostředku

Postup A: Ve směsi vody (26,0 ml), roztoku hydrogenuhličitanu sodného (5,0 ml; nasycený roztok) a ethanolu (7,0 ml; 99%) se za intenzivního míchání při teplotě 50 ^PC rozpustí 2- hydroxypropypy-cyklodextrin (10,0 g). Do vzniklého bezbarvého, viskózního roztoku se poté přidá najednou rozpustný derivát triterpenu (1,50 g) a opět se intenzivně míchá při teplotě 50 °C. K úplnému rozpuštění je většinou potřeba 20 až 40 min. Po úplném rozpuštění triterpenoidu se vzniklý čirý roztok ochladí na laboratorní teplotu, zfíltruje filtrem pro injekční stříkačku (hydrofilní, velikost pórů 0,22 pm), aby byl sterilní a umístí do chladničky. Získaný roztok lze bez znatelného rozkladu přechovávat v mrazničce při - 20 °C až do dalšího použití.

Postup B: Ve směsi vody (14,0 ml) a propylenglykolu (6,0 ml) se za intenzivního míchání při teplotě 50 °C rozpustí 2-hydroxypropyPy-cyklodextrin (7,00 g). Do vzniklého bezbarvého, viskózního roztoku se poté přidá najednou rozpustný derivát triterpenu (1,00 g) a opět se intenzivně míchá při teplotě 50 °C. K úplnému rozpuštění je většinou potřeba 20 až 40 min. Po úplném roz40 puštění triterpenoidu se vzniklý čirý roztok ochladí na laboratorní teplotu, zfíltruje filtrem pro injekční stříkačku (hydrofilní, velikost pórů 0,22 pm), aby byt sterilní a umístí do chladničky. Získaný roztok lze bez znatelného rozkladu přechovávat v mrazničce při - 20 °C po dobu několika měsíců.

Stanovení biodostupností a farmakokinetického profilu při orálním podání sloučenin pokusným myším

Rozpustné cyklodextrinové formulace terpenoidních sloučenin, připravené podle výše uvedených postupů A nebo B, byly neředěné podány outbredním myším CD-I intragastricky (200 μΐ v jedi50 né dávce) jako vodné roztoky injekční stříkačkou s žaludeční sondou. Nerozpustné sloučeniny byly podávány taktéž intragastricky (200 μΐ v jediné dávce), ale jako vodné suspenze v 0,5 až 1% karboxymethylcelulose. V časových intervalech 2, 4, 6, 8, 12 a 24 h byla myším odebrána krev, která byla centr Ífugována a získaná plasma následně analyzována technikou HPLC-ESI MS.

-13CZ 300722 B6

Analytické stanovení koncentrace rozpuštěného triterpenoidu v aplikační formě a vzorcích plazmy

Ke stanovení koncentrace rozpuštěných triterpenoidů byla použita technika HPLC-ESI MS. 5 Vzorky byly měřeny v jedné analytické šarži s kalibračními roztoky a slepým vzorkem. Vzorek pro měření byl připraven z 50 μΐ vodného roztoku obsahujícího inkluzní sloučeninu naředěním methanolem na 10 ml. Následně se 10 μ 1 roztoku vzorku po prvním ředění dále zředí na 1 ml mobilní fází. Slepý vzorek byl získán z 50 μΙ připraveného vodného roztoku 2-hydroxypropyl~ycyklodextrinu naředěním methanolem na 10 ml. Následně se 10 μΙ roztoku slepého vzorku po io prvním ředění dále zředí na 1 ml methanolem. Zásobní roztoky standardů (koncentrace

0,2 mg/ml) byly připraveny navážením 2,00 mg analytu do 10 ml odměrné baňky a rozpuštěním v methanolu. Naředěním zásobního roztoku mobilní fází byly poté připraveny kalibrační vzorky (0,4 resp. 4 pg/ml).

ií Analýza byla prováděna na koloně ODS Hypersil 125 x 2,1 mm, 5um, SN 0745415X, Thermo

EC, předkofona ODS 4,0 x 3,0 mm, Phenomenex, mobilní fáze A - 100 mmol/L roztok mravenčanu amonného ve vodě, pH se upraví na 5 kyselinou mravenčí, B l00 mmol/L roztok mravenčanu amonného v methanolu, teplota kolony: 25 °C, lineární gradientova nebo isokratická eluce, velikost nástřiku 30 μΐ. Koncentrace byla stanovena srovnáním se standardem a přepočtena na zo původní roztok obsahující inkluzní sloučeninu.

Farmakokinetické profily vybraných derivátů při jejich orálním podání myším (látky 2b, 3, 3b,

5a, 5f, 6a, 8a byly podány jako cyklodextrinové formulace, sloučeniny 5c, 5d, 6, 7, 8 jako suspenze s karboxymethylcelulosou) jsou znázorněny na obr. 1 až 8. Výsledky prokazují orální dos25 tupnost rozpustných cyklodextrinových formulací terpenoidů, nikoliv však nerozpustných suspenzí.

t 4

CZ JW/ZZ BO

Tabulka 1: Příklady rozpustnosti biologicky aktivních triterpenů (n=koncentrace nižší než detekční limit, tzn. 1 ng/ml; měsíce znamená dva a více měsíců)

Výchozí sloučenina Rozpustný derivát	DerivatizaČní postup	Rozpouštěcí postup	Koncetrace rozp. látky	Stabilita roztoku pfi -20 °C
		mg/ml	dny
Betulin	-	B	n	-
Betulin l/betulin-dihcmisukcinát la	H-l	A	54	měsíce
Betulin 1/ betulin-dihemiftalát lb	H-2	A	39	měsíce
Betulin 1/betulin-diglukosid lc	H-3	B	55	měsíce
Rthyl-betulinát 2a	-	B	n	-
Ethy l-bctulinát 2a/ hemisukcínát 2b	H-l	A	45	měsíce
Elhyl-betulinát 2a/ hemiftalát 2c	H-2	A	41	měsíce
Ethyl-betulinát 2a/ glukosid 2d Kyselina betulinová 2	H-3	B	43	měsíce
A	38	měsíce
kyselina betulinová 2 / hemisukcínát 2e	H-l*	A	51	měsíce
kyselina betulinová 2 / ethy Itri methy lamoium bromíd-betulinát 2f	K-2	B	55	měsíce
kyselina betulinová 2 / ethylpyridinium bromid-betulinát 2g	K-2	B	31	měsíce
Aldehyd 3	-	A	35	měsíce
Ethy l-ester 3a	-	B	π	-
Ethyl-ester 3a 3 / hemisukcínát 3b	H-l	A	55	měsíce
Ethyl-esler 3a/ hemiftalát 3b	H-2	A	40	měsíce
21-oxokyselina 4		A	48	měsíc
21 -oxokvselina 4 / glykolát 4a	K-l	A	59	měsíc
21-oxokyselina 4/ethy Itri methy lamoium bromidová sůl 4b	K-2	B	47	měsíce
21 oxokvselina 4/ethylpyridinium bromidová sůl 4c	K-2	B	33	měsíce
21-oxokyselina 4/ethyltriethy lamoium bromidová sůl 4o	K-2	B	37	měsíce
2I-ůxokyselina 4/ethyÍtriethanolarooium bromidová sůl 4p	K-2	B	41	měsíce
Ethyl-ester 4d	-	B	n	-
Ethyl-ester 4gz hemisukcínát 4e	H-l	A	53	měsíce
Ethyl-ester 4g/ hemiftalát 41'	H-2	A	28	měsíce
ethyl-ester 4g / glukosid 4i	H-3	B	56	měsíce
ethyl-ester 4g / 2-deoxygalaktosid 4j	H-4	B	60	měsíce
methyl-esler 4d / 2-deoxyglukosid 41H-4		H	61	měsíce
Diketon 5		B	n	-
diketon 5 ί diketon-hemisukcínát 5a	H-l	A	50	měsíc
diketon 5 / glukosid 5b	H-3	B	51	měsíce
diketon 5 / diketon-díhemisukcinát 5e	H-l	A	69	měsíce
Pyrazin 6	-	A	1,2	měsíce
pyrazin 6 / pyrazín-glykolát 6a	K-l	A	56	měsíce
pyrazin 6 / elhy Itrimethy lethy lamoníum bromidová sůl 6b	K-2	B	49	měsíce
Pentanorkyselina 7	-	Λ	68	týden
pentanorkyselina 7 / dihemisukcinát 7c	H-l*	A	73	měsíc
pentanorkyselina 7/diglukosid 7f	11-3	A/B	72/79	měsíce
pentanorkyselina 7 / glykolát 7d	K-l	A	75	měsíc
aminoalkohol 8 / hemisukcínát 8a	H-l	A	37	měsíce

-15CZ 300722 B6

ta, R = CO(CH₂)₂CO₂H lb. R = CO(C₆H₄)CO₂H lc. R * 1 β-D-glukosyl,

2, r’ = r2 = h

2a, R’=H, R² = CH2CH3 2b. R¹ - CO(CH2)₂CO₂H, R² = CH2CH3 2c, R¹ = CO(C6H₄)CO₂H, R² = CH2CH3 2d, R¹ = 1 β-D-glukosyl, R² = CH2CH₃2e, R¹ = CO(CH2)2CO2H. R² = H 2f, R¹ = H, R² - (CH2)₂N⁺(CH3)3Br2g, R¹-H, R² = (CH2)₂N⁺C₅H₅Br

3, R¹ = R² = H

3a.Ri»H, R² = CH₂CH₃

3b, R¹ * CO(CH2)2CO2H, R² = CH2CH₃

3c, R¹ = C0(CflH4)CO2H, R² - CH2CH₃

5, R'- K. R¹ - COjCH,

5a, R' COfCH,),COjH. R³ - CO,CH,

Sb. ft’ 1|)-D-glufceiy1. R’ ’ CO^Hj 5c, R' - Ac, R¹ - COjCHj 5«f, R' - H, R^J« CHjOH

5a, R’ * CtXCH^COiH. R’ -C^qcOJCHjJjCOiH

4. R¹»Ac,R^a»H

4a, R¹=AC, R^Z = CH₂CO₂K

46, R* - AC, R² = (CHj)jN*(CH₃)3Br

4c, R¹ » Ac, R² = (CH2feN⁺C9H₅Br

4d, R¹ = H, R² = CHj

4e, R¹ = CO(CH2)2CO;H, R^z = CH2CHj

4f, R¹ * CO(C6H4>CO2H, R² = CH2CH₃

4g, R* - H, R² » CHjCHj

4h, R¹ = 2.3.4r6-tetra-O-aeatyl-10-D-glukosyl, R² « CH2CH₃4i, R’ =» 10-O-glukosyl. R² = CH₂CH₃

4), R¹ » 3,4,e-tri-O-acetyk2-deoxy*1a-D-galaWosyl, R² = CH_?CH₃

4k, R¹ 2-tíeoxy-1a-D-galakto$ylr R² = CH2CH₃

4I, R¹ · SA.e-tn-O-acetyhZ-deoxy-la-O-glukosyl, R² a CK₃

4m, R¹ = 2-deoxy-1a-D-glukosyl, R² CH₃

4o, R’ - Ac, R^z ’ (CH₂}₂N*{CH₂CH₃)₃Br

4p, R¹ ~ Ac, R² = (CH₂)_:N*(CH₂CH₂OH)₃Br

6, R = H

6a, R — CH₂CO₂H 6b, R = {CH₂)₂N⁺C₅H₅Br-

7, R¹ = Ac, R² = H

7a, R^H, R²*CH₂C₆H₅

7b, R¹ = CO(CH2)2CO2H, R² = CH2C_eH_s

7c. R’ = CO(CHj)jCO₂H, R² = H

74, R¹ = 2,3,4.e4etfa-O-acetynp-O-flluko»yl, R² = CH2CeHs 7e, R¹ = 10-0-glukosyl, R² = CHSC₆H_S7f, R¹ 10-D-glukoayl, R² = H

8, r1 _{= R}2 _{= h}

8a, R¹ = CO(CH₂)₂CO₂H, R² = H zr

CZ JUU/ZZ uo

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy inkluzních komplexů pentacyklických a tetracyklických terpenoidů s nativními nebo substituovanými γ-cyklodextriny, vyznačený tím, že se ve vodě nerozpustný pentacyklický nebo tetracyklický terpenoid mající volnou karboxýlovou, hydroxylovou nebo amino funkční skupinu derivatizuje na této funkční skupině substituentem vybraným ze skupiny

10 zahrnující

a) substituenty obecného vzorce X^a, kde X^a reprezentuje -OC-R’-COOH, kde R¹ je lineární či větvený C₍ až C₈ alkylen, lineární či větvený C₍ až C₈ alkeny len, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na hydroxy15 skupinu terpenoidů;

b) substituenty obecného vzorce X^a, kde X^a je -OC-R^OOH, kde R¹ je lineární či větvený Ci ažC₈ alkylen, lireámí či větvený Ci ažC₈ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na aminoskupinu

20 terpenoidů;

c) kvartémí amoniové substituenty obecného vzorce X^b, kde X^b reprezentuje -(ChDnN+R^Y“, kde n je 2-8, R² je lineární nebo větvený C] až C₈ alkyl, případně substituovaný -OH, -NH₂nebo halogenem, a Y” je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogen25 sulfát a triflát, pro navázání na karboxy skupinu terpenoidů;

d) kvartémí amoniové substituenty obecného vzorce X’, kde X^c reprezentuje -(CH2)„(R³)⁺Y“, kde n je 2-8, (R³)⁺ je protonovaný dusíkatý heterocyklus obsahující l až 2 atomy N a 4 až 9 atomů C a obsahuje alespoň jeden aromatický cyklus a Y“ je anion vybraný ze skupiny zahr30 nující halogenid, sulfát, hydrogen sulfát a triflát, pro navázání na karboxyskupínu terpenoidů;

e) substituenty obecného vzorce X^d, kde X^d reprezentuje -R⁴^COOH, kde R⁴ je lineární či větvený C_t až C₄ alkylen, lineární či větvený C| až C₄ alkenylen, C_ó arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na karboxy35 skupinu terpenoidů;

f) glykosylové substituenty X\ kde X^e je vybrán ze skupiny zahrnující glukosyl, galaktosyl, arabinosyl, rhamnosyl, laktosyl, cellobiosyl, maltosy 1 ajejich 2-deoxyanaIoga, pro navázání a- nebo β-glykosidickou vazbou na hydroxyskupinu terpenoidů;

reakcí se sloučeninou poskytující daný substituent a následně se připravený derivát rozpustí v roztoku obsahujícím vodu a nativní nebo substituovaný γ-cyklodextrin, načež se vzniklý inkluzní komplex s nativním nebo substituovaným γ-cyklodextrinem izoluje z vodného roztoku, s výhodou lyofilizaci.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se jako sloučenina poskytující substituent obecného vzorce X^a použije sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující sloučeniny poskytující sukcinát, ftalát nebo glutarát.

50
3. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se jako sloučenina poskytující substituent obecného vzorce X^b použije sloučenina poskytující cholinový ester, kde n-2, R-CH₃.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se jako sloučenina poskytující substituent obecného vzorce X^c použije sloučenina poskytující pyridiniovou sůl, kde n=2, (R³)^-PyH⁺, Y

55 =Br‘.

-17CZ 300722 B6
5. Způsob podle nároku I,vyznačený tím, že se jako sloučenina poskytující substituent obecného vzorce X^J použije sloučenina poskytující glykolát, kde R⁴=CH₂.

5
6, Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se jako sloučenina poskytující substituent obecného vzorce X^L' použije sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující sloučeniny poskytující glukosyl, galaktosyl, laktosyl ajejich 2-deoxyanaloga.
7. Způsob přípravy farmaceutického prostředku obsahujícího inkluzní komplex pentacyklicio kého nebo tetracyklického terpenoidu s nativním nebo substituovaným γ-cyklodextrinem, vyznačený t í m , že se ve vodě nerozpustný pentacyklický nebo tetracyklický terpenoid mající volnou karboxylovou, hydroxylovou nebo amino funkční skupinu derivatizuje na této funkční skupině substituentem vybraným ze skupiny zahrnující

15 a) substituenty obecného vzorce X\ kde X^a reprezentuje -OC-R'-COOH, kde R^! je lineární či větvený Ci až C₈ alkylen, lineární či větvený C| až Cg alkeny len, C₆ ary len nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na hydroxyskupinu terpenoidu;

20 b) substituenty obecného vzorce X^a, kde X^a je -OC-R‘-COOH, kde R¹ je lineární či větvený C| až Cg alkylen, lineární či větvený C[ až Cg alkenylen, Q arylen nesubstituovaný Či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na aminoskupinu terpenoidu;

25 c) kvartérní amoniové substituenty obecného vzorce X^b, kde X^h reprezentuje -(CHo^N^^Y^-, kde n je 2—S, R² je lineární nebo větvený C) až C₈ alkyl, případně substituovaný -OH, -NH₂nebo halogenem, a Y je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu;

30 d) kvartérní amoniové substituenty obecného vzorce X^c, kde X^c reprezentuje -(CH2)n(R³)⁺Y”, kde n je 2-8, (R³)⁺ je protonovaný dusíkatý heterocyklus obsahující 1 až 2 atomy N a 4 až 9 atomů C a obsahuje alespoň jeden aromatický cyklus a Y“ je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu:

35 e) substituenty obecného vzorce X^d, kde X^d reprezentuje -R-COOH, kde R⁴ je lineární či větvený C| až C₄ alkylen, lineární či větvený C₍ až C₄ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou, pro navázání na karboxyskupinu terpenoidu;

40 f) glykosylové substituenty X\ kde X^e je vybrán ze skupiny zahrnující gl úkosy I, galaktosyl, arabinosyl, rhamnosyl, laktosyl, ceilobiosyl, maltosyl ajejich 2-deoxyanaloga, pro navázání a- nebo β-glykosidickou vazbou na hydroxyskupinu terpenoidu;

reakcí se sloučeninou poskytující daný substituent a následně se připravený derivát rozpustí v

45 roztoku obsahujícím vodu, nativní nebo substituovaný γ-cyklodextrin a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že pomocnými látkami jsou biokompatibilní organická rozpouštědla a/nebo alkalické uhličitany nebo hydrogenuhličitany.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že biokompatibilními organickými rozpouštědly jsou ethanol nebo propylenglykol.

1 o

CZ 3UU7Z2 Bb
10. Inkluzní komplex pentacyklického nebo tetracyklického terpenoídu s lipofitním rigidním skeletem, tvořeným 25 až 30 atomy uhlíku, obsahujícího alespoň jeden z následujících substituentů:

5 a) -OX^a, kde X^a je ^OC-R'-COOH. kde R¹ je lineární či větvený C| až C₈ alkylen, lineární či větvený Ci ažC₈ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou,

b) -NHX^a, kde X^a je -OC-R'-COOH, kde R¹ je lineární či větvený Ci azC₈ alkylen, lineární io či větvený C| až C₈ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný Či substituovaný halogenem, hydroxy lem nebo aminoskupinou,

c) -COOX^b, kde X^b je -(CH2)nN⁺R²3Y; kde n je 2-8, R² je lineární nebo větvený C, až C₈alkyl, případně substituovaný -OH, -NH₂ nebo halogenem, a Y“ je anion vybraný ze sku15 piny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát,

d) -COOX\ kde X^c je 4CH₂)_n(R³)⁺Y“, kde n je 2-8, (R³)⁺ je protonovaný dusíkatý heterocykl us obsahující 1 až 2 atomy N a 4 až 9 atomů C a obsahuje alespoň jeden aromatický cyklus a Y~ je anion vybraný ze skupiny zahrnující halogenid, sulfát, hydrogensulfát a triflát,

e) -COOX^d, kde X^d reprezentuje -R⁴-COOH, kde R⁴ je lineární Či větvený C_t až C₄ alkylen, lineární či větvený Ci až C₄ alkenylen, C₆ arylen nesubstituovaný či substituovaný halogenem, hydroxylem nebo aminoskupinou,

25 f) -OX^e, kde X^e je vázán a nebo β glykosidickou vazbou aje vybrán ze skupiny zahrnující glukosyl, galaktosyl, arabinosyl, rhamnosyl, laktosyl, cellobiosyl, maltosyI ajejich 2-deoxyanaloga, s nativním nebo substituovaným γ-cyklodextrinem, vyrobený způsobem podle nároku 1.
11. Inkluzní komplex podle nároku 10, vyznačený tím, že substituenty obecného vzorce X^a jsou vybrány ze skupiny zahrnující sukcinát, ftalát nebo glutarát.
12. Inkluzní komplex podle nároku 10, vyznačený tím, že substituenty obecného vzorce

35 X^b jsou cholinové estery, kde n=2, R²=CH₃.
13. Inkluzní komplex podle nároku 10, vyznačený tím, že substituenty obecného vzorce X^c jsou pyridiniové soli, kde n-2, (R³)⁺=PyH⁺, Y=Br'.

40
14. Inkluzní komplex podle nároku 10, vyznačený tím, že substituenty obecného vzorce

X^d jsou glykoláty, kde R^4;=CH₂.
15. Inkluzní komplex podle nároku 10, vyznačený tím, že substituenty obecného vzorce X^c jsou vybrány ze skupiny zahrnující glukosyl, galaktosyl, laktosyl ajejich 2-deoxyanaloga.
16. Inkluzní komplex podle kteréhokoliv z nároků 10 až 15 pro použití jako léčivo.
17. Farmaceutický prostředek, vyznačený tím, že obsahuje inkluzní komplex podle kteréhokoliv z nároků 10 až 15, vodu a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku,

50 vyrobený způsobem podle nároku 7.
18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačený tím, že pomocnými látkami jsou biokompatibilní organická rozpouštědla a/nebo alkalické uhličitany nebo hydrogenuhličitany.

- 19CZ 300722 B6
19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, vyznačený tím, že biokompatibilními organickými rozpouštědly jsou ethanol nebo propylenglykol.