CZ298710B6

CZ298710B6 - Kombinovaný lékový prípravek

Info

Publication number: CZ298710B6
Application number: CZ0226297A
Authority: CZ
Inventors: Tocque@Bruno
Original assignee: Aventis Pharma S.A.
Priority date: 1995-01-17
Filing date: 1996-01-12
Publication date: 2008-01-02
Also published as: AU716364B2; FI119911B; US20050209177A9; DK0800399T3; HU229484B1; US20010021395A1; NO973197L; EP0800399B1; CZ226297A3; SK95797A3; WO1996022101A1; FI973023A; HUP9802423A3; EP0800399A1; NO325418B1; CA2209771C; US20040127437A1; JPH10512559A; JP5031921B2; JP4580469B2

Abstract

Kombinovaný lékový prípravek urcený pro soucasné,oddelené nebo casove oddálené použití úcinných složek, které tento prípravek obsahuje, jehož podstata spocívá v tom, že je tvoren alespon jednou nukleovou kyselinou inhibující alespon cástecne signální cesty onkogenních bunek, zvolenou z množiny zahrnující DNA kódující antimediátorovou RNA, DNA kódující ligand RNA, DNA kódující negativní dominant,DNA kódující ScFv, DNA kódující antinádorový supresorový protein a prípadne chemicky modifikovaný antimediátorový oligonukleotid, a protirakovinovým terapeutickým cinidlem.

Description

Kombinovaný lékový přípravek

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti terapie hyperproliferačních patologických stavů. Vynález se zejména týká nového způsobu léčení hyperproliferačních patologických stavů, založeného na kombinovaném použití dvou typů terapeutických činidel.

Specifičtěji definováno, týká se vynález nového způsobu léčení hyperproliferačních patologických stavů, založeného na kombinovaném použití genů blokujících buněčné onkogenní signální cesty a chemoterapeutického nebo/a radioterapeutického činidla. Kombinovaná léčení podle vynálezu jsou obzvláště účinná na destrukci buněk ve stadiu hyperproliferace, a to při relativně nízkých aplikačních dávkách. Vynález takto poskytuje nový způsob léčení hyperproliferačních patologických stavů (rakoviny, restenóza, atd.), který je velmi účinný a při kterém jsou omezeny vedlejší účinky.

Dosavadní stav techniky

Vzdor skutečnosti, že bylo v uvedené oblasti dosaženo výrazného pokroku, mají způsoby, které jsou v současné době k dispozici pro léčení rakovin, stále ještě omezenou účinnost. Radioterapie a chemoterapie jsou jistě účinné při potlačení rozvoje rakovin. Nicméně akutním problémem při léčení rakovin je skutečnost, že některé primární nádory nebo/a výskyt nádorových rezistentních buněk jsou po prvním cyklu úspěšných léčení necitlivé jak na radioterapii, tak i na chemoterapii.

Četné studie se snažily objasnit molekulární mechanismy, které by mohly stát u počátku těchto jevů. Obecně byly tyto studie zaměřeny na způsob, jakým chemoterapeutická činidla vstupují do buněk, a na způsob, jakým chemoterapeutická činidla vstupují do buněk, a na způsob, jakým tato chemoterapeutická činidla reagují s buněčnými cílovými objekty (Chin a kol., Adv. Cancer Res. 60 (1993) 157-180; Chabner a Mayers v Cancer/ Principles and practices of Oncology, De Vita a kol. ed., J. B. Lippencott Co., str. 349-395, 1989). Tak například bylo zjištěno, že příliš vysoká míra exprese genu mdrl může omezit vnitrobuněčnou koncentraci různých chemoterapeutických činidel a může přispívat k expresi globální rezistence vůči účinným látkám (Chin a kol. viz výše).

Úplnější objasnění mechanismů rezistence vůči chemoterapii a radioterapii záleží na lepším poznání procesů buněčné smrti, indukovaných uvedenými činidly. Vzhledem k tomu, že ionizační záření a četná protirakovinnová činidla způsobují poškození v DNA, byly terapeutické účinky uvedených činidel přičítány jejich genotoxickým schopnostem. Nicméně poškození buněk způso40 bená těmito činidly neumožňují zcela vysvětlit jejich terapeutickou účinnost (Chabner a Mayers, viz výše). V posledních letech výzkum a pochopení mechanismu programové smrti nebo apoptózy umožnily přehodnotit mechanismy, pomocí kterých nádorové buňky získávají nebo ztrácejí citlivost vůči cytotoxickým činidlům. Četné toxické stimuly indukují totiž apoptózu i při dávkách, které jsou nedostatečné pro indukci metabolických dysfunkcí. Schopnost indukovat apoptózní odezvu v nádorových buňkách by mohla stanovit účinnost léčení.

Přihlašovatel nyní našel nový způsob léčení, který je mimořádně účinný při destrukci hyperproliferačních buněk. Jak již bylo uvedeno výše, je způsob léčení podle vynálezu v podstatě založen na kombinovaném použití dvou typů terapeutických činidel, kterými jsou geny blokující signální cesty onkogenních buněk a chemoterapeutická nebo/a radioterapeutická činidla. Vynález je ve skutečnosti odvozen ze zjištění, že v případě uvedeného kombinovaného použití uvedených typů činidel dochází k obzvláště významné synergii.

-1 CZ 298710 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je kombinovaný lékový přípravek určený pro současně, oddělené nebo časově oddálené použití účinných složek, které tento přípravek obsahuje, jehož podstata spočívá v tom, že je tvořen alespoň jednou nukleovou kyselinou inhibující alespoň částečně signální cesty onkogenních buněk, zvolenou z množiny zahrnující DNA kódující antimediátorovou RNA, DNA kódující ligand RNA, DNA kódující negativní dominant, DNA kódující ScFv, DNA kódující antinádorový supresorový protein a případně chemicky modifikovaný antimediátorový oligonukleotid, a protirakovinovým terapeutickým činidlem.

Výhodně je nukleová kyselina inkorporovaná ve vektoru. Výhodně je tento vektor zvolen z množiny zahrnující liposom, nanočástici, peptidový komplex, kationtové lipidy a lipopolyaminy. Výhodně je vektorem virový vektor odvozený od retrovirů, adenovirů, herpesvirů, AAV a viru kravských neštovic. Kombinovaný lékový prostředek výhodně jako protirakovinové terapeutické činidlo obsahuje chemoterapeutické činidlo, zvolené z množiny zahrnující cisplatinu, taxoidy, etoposid, INF, adriamycin, kamptotecin, vince alkaloidy a navellein. Výhodněji je protirakovinovým chemoterapeutickým činidlem taxoid. Výhodně je protirakovinové chemoterapeutické činidlo zvoleno z množiny zahrnující taxol, docetaxel a paclitaxel.

Podle vynálezu je výhodný specificky kombinovaný lékový přípravek určený pro současné, oddělené nebo časově oddálené použití účinných složek, které tento přípravek obsahuje, jehož podstata spočívá v tom, že je tvořen alespoň jedním antinádorovým supresorovým genem a taxoidem, přičemž výhodně je antinádorovým supresorovým genem gen kódující divokou formu pro25 teinu p53 nebo protein wafl.

V kombinovaném lékovém přípravku je protirakovinovým terapeutickým činidlem výhodně radioterapeutické činidlo.

Jak již bylo uvedeno výše, spočívá vynález v podstatě na objevení synergického účinku mezi produktem některých genů a činidly protirakovinové terapie. Tímto kombinovaným použitím se dosáhne vyššího účinku při nižších aplikačních dávkách uvedených činidel. Vynález takto nabízí prostředek pro obzvláště účinné léčení hyperproliferačních patologických stavů.

Jak bude uvedeno dále, mohou být obě složky kombinované léčby podle vynálezu použity v závislosti na zvoleném genu a chemoterapeutickém nebo radioterapeutickém činidle současně, odděleně nebo v časovém odstupu. V případě současného použití se obě činidla inkubují v buňkách nebo podají pacientovi současně. Podle této formy provedení způsobu podle vynálezu mohou být obě činidla připravena odděleně a potom bezprostředně před podáním smíšena a podána společně. Obecněji řečeno, jsou tato činidla podána současně, avšak odděleným způsobem. Zejména způsoby podání obou činidel mohou být odlišné. V rámci další formy provedení způsobu podle vynálezu mohou být podání obou činidel provedena v časovém odstupu.

Nukleovou kyselinou, použitou v rámci vynálezu, může být desoxyribonukleová kyselina (DNA) nebo ribonukleová kyselina (RNA). V případě DNA se může jednat o komplementární DNA (DNAc), genomovou DNA (DNAg), hybridní sekvenci nebo o syntetickou nebo polosyntetickou sekvenci. Kromě toho se může jednat o chemicky modifikovanou nukleovou kyselinu, která je například modifikována za účelem zvýšení její rezistence vůči nukleázám, její penetrační schopnosti nebo její zacílitelnosti do buněčného objektu, její terapeutické účinnosti a podobně. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virového, syntetického nebo jiného původu. Tyto nukleové kyseliny mohou být získány libovolnou, odborníkům známou technikou, zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také smíšenými metodami zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank. Jak bude uvedeno dále, mohou být tyto nukleové kyseliny inkorporovány do vektorů, jaký55 mi jsou plazmidové, virální nebo chemické vektory.

-2CZ 298710 B6

Jak již bylo uvedeno výše, je nukleová kyselina podle vynálezu nukleovou kyselinou, která je schopna inhibovat alespoň částečně signální cesty onkogenních buněk. Tyto nukleové kyseliny jsou uváděny pod označením „nitrobuněčné neutralizační prvky onkogenů“ nebo zkráceně EINO (Eléments Intracellulaires de Neutralisation des Oncogěnes). Signální cesty vedoucí k transformaci buňky jsou vícečetné. Buněčná proliferace využívá množinu faktorů, mezi které patří membránové receptory (proteiny G), onkogeny, enzymy (protein-kinázy, famesyl-transferázy, fosfolipázy a podobně), nukleosidy (ATP, AMP, GDP, GTP, atd.), aktivační faktory (faktory výměny guanosinů (GRF, GAP, RAF, atd.), transkripění faktory, atd.). Poruchy, například ve struktuře, aktivitě a konformaci, těchto jednotlivých faktorů jsou přičítány deregulačním jevům buněčné proliferace. Takto 90 % adenokarcinomů pankreatu vykazuje onkogen Ki-ras mutovaný na dvanáctý kodon (Almoguera a kol., Cell 53 (1988) 549). Stejně tak byla prokázána přítomnost mutovaného genu ras v adenokarcinomech tračníku a při rakovině štítné žlázy (50 %) nebo v karcinomech plic a při myeloidních leukémiích (30 %, Bos, J. L. Cancer Res., 49 (1989) 4682). Rovněž byly v současnosti identifikovány další onkogeny (myc, fos, jun, ras, myb, erb, a další), o jejichž mutovaných formách se předpokládá, že jsou zodpovědné za poruchy buněčné proliferace. Stejně tak jsou při četných rakovinách, jakými jsou zejména kolorektální rakoviny, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny zažívacího systému, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny vaječníků a rakoviny močového měchýře, pozorovány mutované formy p53.

Nukleovými kyselinami použitými v rámci vynálezu jsou nukleové kyseliny, které jsou schopné interferovat s některým z uvedených faktorů implikovaných při buněčné proliferaci a inhibovat alespoň částečně jeho aktivitu. Faktory, které jsou výhodně zaměřeny nukleovými kyselinami, jsou faktory, které se přednostně nebo specificky objevují při poruchách buněčné proliferace (aktivované onkogeny, mutanty nádorových supresorů, atd.).

Nukleové kyseliny použité v rámci vynálezu mohou být nukleovými kyselinami různých typů. Výhodně se jedná o:

- antimediátorové nukleové kyseliny,

- oligonukleotidy, které jsou schopné přímo vázat cílové onkogenní proteiny za účelem jejich neutralizace (ARN-ligand),

- nukleové kyseliny kódující proteiny dominantně negativní povahy a produkující takto neaktivní komplex,

- nukleové kyseliny kódující intracelulámí protilátky (například variabilní fragmenty s jediným řetězcem od protilátky) řízené proti onkogennímu proteinu (ScFv) a

- supresorové antionkogenní geny.

V rámci prvního výhodného provedení vynálezu je nukleovou kyselinou DNA nebo RNA kódující polypeptid nebo protein inhibující alespoň částečně signální cesty onkogenních buněk. Poly45 peptid a protein jsou zejména zvoleny z množiny zahrnující negativní dominanty, ScFv a nádorové supresory.

Ještě výhodněji je negativní dominant tvořen N-terminální oblastí proteinu GAP, proteinu Bbr33 nebo mutantů proteinů Ets. Pokud jde o ScFv, jedná se výhodně o ScFv řízený proti mutova50 němu proteinu ras nebo proti faktoru GAP. Supresorový protinádorový protein je výhodně tvořen p53, Rb, wafl, p21, DCC nebo MTS.

V rámci druhého výhodného provedení vynálezu je nukleovou kyselinou DNA kódující RNA inhibující alespoň částečně signální cesty onkogenních buněk. Nukleovou kyselinou RNA je zejména komplementární RNA cílové nukleové kyseliny, schopná blokovat transkripci nebo/a

-3 CZ 298710 B6 translaci uvedené cílové nukleové kyseliny (antimediátorová RNA), rybozym nebo RNA-ligand. Výhodným příkladem je antimediátorová RNA anti-Kiras.

Stále v rámci výhodného provedení vynálezu je nukleovou kyselinou antimediátorový oligo5 nukleotid, který je případně chemicky modifikován. Zejména se může jednat o oligonukleotidy, jejichž fosfodiesterový skelet byl chemicky modifikován a jakými jsou například fosfonátové, fosfotriesterové, fosforamidátové a fosforthioátové oligonukleotidy, které jsou popsané například v patentové přihlášce WO 94/08003. Rovněž se může jednat o nukleotidy alfa nebo o nukleotidy konjugované s činidly, jakými jsou akrylové sloučeniny.

V rámci obzvláště výhodného provedení vynálezu je nukleová kyselina inkorporovaná ve vektoru. Použitý vektor může být chemického původu (liposom, nanočástice, peptidový komplex, kationtové lipidy, atd.), virového původu (retrovir, adenovir, vir herpes, AAV, vir kravských neštovic, atd.) nebo plazmidového původu. Nukleová kyselina použitá v rámci vynálezu může být formulovány s ohledem na její topické, perorální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraokulámí, transdermální a jiné podání. Výhodně se nukleová kyselina použije v injikovatelné formě. Tato kyselina může být sdružena s libovolným farmaceuticky přijatelným nosičem vhodným pro podání injekcí, zejména přímou injekci v úrovni ošetřovaného místa. Může se zejména jednat o sterilní izotonické roztoky nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku poskytnou injikovatelné roztoky. Přímá injekce nukleové kyseliny do nádoru pacienta je výhodnou formou podání, neboť umožňuje koncentrovat terapeutický účinek v úrovni napadené tkáně. Použité dávky nukleové kyseliny budou záviset na různých faktorech, zejména použitém genu, vektoru a způsobu podání, na léčeném patologickém stavu a také na požadované době léčení.

Protinádorovým terapeutickým činidlem použitým v rámci vynálezu může být libovolné činidlo, které je odborníky v daném oboru používané v rámci chemoterapie nebo radioterapie. Zejména se může jednat o cis-platinu, taxoid, TNF, adriamycin, camptotecin, jed mitotického vřeténka (vinca-alkaloidy, navellein, atd.), rentgenové paprsky, ultrafialové záření, atd. Obzvláště zajíma30 vých výsledků se dosáhne v případě, kdy se jako chemoterapeutické činidlo použije taxoid. Protirakovinové chemoterapeutické činidlo se podává klasickými způsoby. Obecně se podává parenterálně.

Jak již bylo uvedeno výše, mohou být obě činidla použita současně, odděleně nebo v časovém odstupu. V rámci obzvláště výhodného provedení vynálezu je nukleová kyselina podávána jako první a potom, když nukleová kyselina může být exprimována buňkami, se teprve podá protirakovinové terapeutické činidlo.

Obzvláště výhodné provedení vynálezu se týká medikamentózní kombinace jednoho nebo několi40 ka protinádorových supresorových genů a taxoidu, určené pro současné, oddělené nebo časově oddálené použití při léčení hyperproliferačních patologických stavů. Ještě výhodněji supresorový gen kóduje divokou formu proteinu p52 nebo protein wafl (p21).

Vynález takto poskytuje obzvláště účinný způsob pro destrukci hyperproliferativních buněk.

Může být použit in vitro nebo ex vivo, inkubací buněk současným nebo časově oddáleným způsobem v přítomnosti nukleové kyseliny nebo nukleových kyselin a chemoterapeutických činidel.

V tomto ohledu je předmětem vynálezu rovněž způsob destrukce hyperproliferačních buněk, jehož podstata spočívá v tom, že se uvedené buňky nebo jejich část uvede do s tyku s nukleovou kyselinou a výše uvedeným chemoterapeutickým činidlem.

Vynález se výhodně použije in vivo pro destrukci buněk ve stadiu hyperproliferace (tj. při abnormální proliferaci). Vynález je také aplikovatelný na destrukci nádorových buněk nebo buněk hladkého svalu vaskulámí stěny (restenóza). Vynález je mimořádně vhodný pro léčení rakovin, u kterých je implikován aktivovaný onkogen. Jako příklad lze uvést adenokarcinomy tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomy plic, myeloidní leukémie, kolorektální rakoviny, rakoviny prsu,

-4CZ 298710 B6 rakoviny plic, rakoviny zažívacího ústrojí, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny vaječníků, rakoviny močového měchýře a gluoblastomy.

Použití antimediátorových nukleových kyselin

Regulace exprese cílových genů pomocí antimediátorových nukleových kyselin představuje terapeutický přístup, který se intenzivně rozvíjí. Tento terapeutický přístup je založen na schopnosti nukleových kyselin specificky se hybridizovat s komplementárními oblastmi jiné nukleové kyseliny a takto inhibovat specifickým způsobem expresi determinovaných genů. Tato intervence může probíhat buď na úrovni translace nebo na úrovni transkripce.

Antimediátorovými nukleovými kyselinami jsou nukleové sekvence, které jsou schopné selektivní hybridizace s mediátorovou RNAs cílových buněk za účelem inhibice jejich translace na protein. Tyto nukleové kyseliny tvoří s cílovou RNAm lokálním způsobem oblasti s dvojím řetězíš cem typu RNA/RNAm nebo typu DBA/RNAm interakcí klasického Watson-Crick-ova typu.

Může se například jednat o syntetické oligonukleotidy malé velikosti, které jsou komplementární s buněčnou RNAm a které jsou zavedeny do cílových buněk. Takové oligonukleotidy byly například popsány v patentu EP 92 574. Rovněž se může jednat o sekvence DNA, jejichž exprese v cílové buňce generuje RNA a které jsou komplementární k buněčným RNAm. Takové sekvence byly například popsané v patentu EP 140 308.

V poslední době byl prokázán nový typ nukleových kyselin, které jsou schopné regulovat expresi cílových genů. Tyto nukleové kyseliny nehybridizují s buněčnými RNAm, avšak hybridizují pří25 mo s genomovou DNA ve dvojím řetězci. Tento nový přístup je založen na zjištění, že některé nukleové kyseliny jsou schopné specifické interakce ve velké brázdě dvoušroubovice DNA za lokálního vzniku trojných šroubovic, vedoucího k inhibici transkripce cílových genů. Tyto nukleové kyseliny selektivně rozpoznávají dvoušroubovici DNA v úrovni oligopurino-oligopyrimidinových sekvencí, tj. v úrovni oblastí majících oligopurinovou sekvenci na jednom řetězci a oligopyrimidinovou sekvenci na komplementárním řetězci, a vytvářejí v těchto úrovních lokálním způsobem trojnou šroubovici. Báze třetího řetězce (oligonukleotid) tvoří vodíkové vazby (Hoogsteenova vazba nebo Hoogsteenova inverzní vazba) s puriny párů Watson-Crick-ových bází. Takové nukleové kyseliny byly zejména popsány v Anti-Cancer drug design 6 (1991) 569.

Antimediátorové nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být sekvencemi DNA kódující antimediátorové RNA nebo ribozomy. Takto produkované antimediátorové RNA mohou vstoupit v interakci s RNAm nebo cílovou genomovou DNA a vytvořit s ní dvojité nebo trojné šroubovice. Rovněž se může jednat o antimediátorové sekvence (oligonukleotidy), případně chemicky modifikované, které jsou schopné přímé interakce s genem nebo cílovou RNA.

Výhodně jsou antimediátorové nukleové kyseliny podle vynálezu řízeny proti onkogenům nebo proti specifickým oblastem aktivovaných onkogenů, zejména proti onkogenu ras.

Použití RNA-ligandů

RNA-ligandy jsou oligoribonukleotidy malé velikosti, které jsou velmi specifické a které mají značnou afinitu pro daný cílový objekt, zejména proteinový cílový objekt. Příprava a identifikace takových RNA-ligandů byly popsané zejména v přihlášce WO 91/19813. V rámci specifického provedení vynálezu je možné sdružit krátkou RNA specifickou pro protein Ki-ras, exprimovanou v buňkách za použití adaptovaného virového nebo nevirového vektoru s popsanými chemoterapeutickými nebo radioterapeutickými činidly.

-5CZ 298710 B6

Negativní dominanty

Negativním dominantem je polypeptidové antagonizující činidlo onkogenních signálních cest.

Tento antagonismus se realizuje v případě, že se polypeptid dostal do styku s klíčovým prvkem onkogenní signalizace a vstupuje tak do konkurenčního vztahu s polypeptidem, který je přirozeně využíván v buňce pro uvedenou signalizaci. Použitým polypeptidovým antagonizujícím činidlem je velmi často napodobenina přirozeného polypeptidu, která je však zbavena domén, které umožňují onkogennímu signálu šířit se přes takový polypeptid.

Z negativních dominantů, které lze výhodně použít v rámci vynálezu, lze uvést nukleové kyseliny kódující terminální doménu NH₂ proteinu GAP pro protein Grb3-3 nebo pro mutované formy proteinů ETS.

V patentové přihlášce WO 94/03597 bylo prokázáno, že by nadměrná exprese terminální domény NH₂ proteinu GAP-Ras mohla specificky blokovat tumorogenicitu buněk transformovaných následkem exprese mutovaného genu ras. Příklad 1 této přihlášky vynálezu nyní ukazuje, že nadexprese domény GAP( 170-702) indukuje apoptózu lidských buněk (karcinom H460). Příklad 2 ukazuje navíc, že apoptózní účinek indukovaný konstrukcí GAP (170-702) je velmi výrazně prohlouben přidáním do kultivačního prostředí lidských nádorových buněk produktů, mezi které patří například cis-platina, camptotecin nebo taxoter při koncentracích těchto produktů, které jinak nemají žádný účinek na životnost buněk.

Příklad 1 přihlášky vynálezu popisuje aktivitu genu grb3-3 v buňkách H460. Předpokládaná sekvence a funkce Grb3-3 byly popsány v Science 1994. Příklad 2 rovněž ukazuje, že apoptózní účinek indukovaný přenosem genu Grb3-3 je výrazně prohlouben přidáním do kultivačního prostředí lidských nádorových buněk produktů, jakými jsou například cis-platina, camptotecin nebo taxoter, a to v koncentracích těchto produktů, které nemají žádný účinek na buněčnou životnost.

Uvedené příklady jednoznačně prokazují, že různá chemoterapeutická činidla mohou být účinně použita v kombinaci za účelem realizace strategie indukce apoptózy mechanismem transferu genů.

ScFv

Činidla ScFv jsou molekulami majícími vazebné vlastnosti srovnatelné s vazebnými vlastnostmi protilátek a jsou intracelulámě aktivní. Jedná se zejména o molekuly tvořené peptidem odpovídajícím vazebnému místu variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky vázaným peptidovým linkerem k peptidu odpovídajícímu vazebnému místu variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky.

Přihlašovatelem bylo prokázáno, že takové ScFv mohly být produkovány in vivo přenosem genu (o tom viz patentová přihláška WO 94/29446).

Tato přihláška vynálezu zejména ukazuje, že je možné neutralizovat onkogenní proteiny exprimováním ScFv v různých buněčných oblastech. V rámci jednoho z provedení vynálezu se použi45 je nukleová kyselina, umožňující intracelulámí produkci činidla ScFv neutralizujícího transformační kapacitu proteinů ras, v kombinaci s chemoterapeutickým činidlem. Taková kombinace umožňuje dosažení významných synergických účinků (viz příklad 2).

Nádorové supresory

Ze supresorových protinádorových genů použitelných v rámci vynálezu lze zejména uvést geny p53, p21, Rb, raplA, DDC, WAF a MTS. Zejména lze použít p53, Rb nebo Waf.

Gen p53 kóduje jádrový protein 53 kDa. Forma tohoto genu mutovaná delecí nebo/a mutací je implikována při rozvoji většiny lidských rakovin (Baker a kol., Science 244(1989) 217). Tyto

-6CZ 298710 B6 mutované formy jsou rovněž schopné kooperovat s onkogeny ras v rámci transformace murinních fibroplastů. Divoký gen kódující nativní p53 inhibuje zase tvorbu ložisek transformace ve fibroplastech hlodavců transfekovaných s různými onkogenními kombinacemi. Nedávné údaje potvrzují, že by protein p53 mohl být sám transkripčním faktorem a stimulovat tak expresi dalších supresorových protinádorových genů. Ostatně účinek p53 na proliferaci vaskulámích hladkých svalů byl v nedávné době prokázán (Epstein a kol. Science 151 (1994)).

Gen Rb determinuje syntézu jádrového fosforoproteinu s asi 927 aminokyselinami (Friend a kol., Nátuře 323 (1996) 643), jehož funkcí je potlačovat dělení buněk tím, že je nechá vstoupit do ío kviescentní fáze. Inaktivované formy genu Rb byly implikovány v různých nádorech a zejména v retinoblastomech nebo při mesenchymálních rakovinách, jakými jsou osteosarkomy. Opětovné zavedení tohoto genu do nádorových buněk, kde byl inaktivován, má za následek návrat k normálnímu stavu a ztrátu tumorogenicity (Huang a kol., Science 242 (1988) 1563). V nedávné době bylo prokázáno, že normální Rb, avšak nikoliv jeho mutované formy, potlačuje expresi proto15 onkogenu c-fos, což je gen, který je zodpovědný za buněčnou proliferaci.

Geny WAF a MTS a jejich protinádorové vlastnosti již byly popsané v literatuře (Cell 75(1993)817; Science 264 (1994)436).

Příklad 3 demonstruje účinný kombinační typ mezi derivátem taxolu a genem p53. Taxol indukuje apoptózu v různých kulturách nádorových buněčných řad (Proceedings of the American Association for cancer Research, sv. 35, březen 1994, Bhalla a kol., str. 306, Seiter a kol., str. 314, Saunders a kol., str. 317). Činidlo p53 spouští mechanismus apoptózy v různých buněčných typech. Přihlašovatel nyní mohl prokázat, že kombinace derivátu taxolu a p53 indukuje apoptózu lidských nádorových buněk. V přítomnosti rostoucích dávek taxoteru byly kultivovány specifické klony buněk H460, které jsou rezistentní vůči účinku p53. Příklad 3 jednoznačně dokazuje, že buňky umírají následkem působení taxoteru při koncentracích, které jsou zcela neúčinné v případě buněk neexprimujících divoký p53.

Waf 1 (Wild-type p53 Activated Fragment Cell, 75, 817, 1993) nebo také p21 (Nátuře, 366, 701, 1993) jsou indukovány nadexpresí divokého p53. Waf 1 se objevuje v buňkách, které jsou zadrženy ve fázi G1 nebo ve stadiu apoptózy následkem nadexprese divokého p53, avšak nikoliv v buňkách, které jsou zadrženy v G1 nebo ve stadiu apoptózy mechanismem nezávislým na p53 (Cancer Res., 54, 1169, 1994). Waf 1 omezuje růst nádorových buněk stejně účinně jako divoký p53. Kombinované použití genu Waf 1 a derivátů taxolu rovněž indukuje synergický účinek na destrukci hyperproliferačních buněk.

Protirakovinová chemoterapeutická činidla

Protirakovinová terapeutická činidla použitelná v rámci kombinované terapie podle vynálezu mohu být zvolena z množiny zahrnující chemoterapeutická a radioterapeutická činidla, která jsou odborníkům známa. Může se jednat zejména o cis-platinu, taxoid, etoposid, TNF, adriamycin, camptotecin, jed mitotického vřeténka a o podobná činidla. Tato jednotlivá činidla mohou být získána z komerčních zdrojů.

Mezi těmito činidly představují taxoidy výhodnou formu provedení vynálezu. V tomto ohledu jsou taxoidy, které mohou být obzvláště použity v rámci vynálezu, sloučeniny obecného vzorce

-7CZ 298710 B6

ve kterém

Ri a R₂ každý znamená atom vodíku nebo jeden z Ri nebo R₂ znamená atom vodíku a druhý znamená hydroxy-skupinu, acyloxy-skupinu nebo acylkarbonyloxy-skupinu anebo také R₂znamená atom vodíku a Ri tvoří s atomem uhlíku methylové skupiny v poloze alfa vazbu za vzniku cyklopropanového kruhu, jeden z R₃ nebo R4 znamená atom vodíku a druhý znamená hydroxy-skupinu nebo také R₃ a R4 tvoří společně karbonylovou skupinu,

R5 a Ré každý znamená atom vodíku nebo jeden z R₅ nebo R<, znamená atom vodíku a druhý znamená hydroxy-skupinu, acyloxy-skupinu, acylkarbonyloxy-skupinu nebo alkoxy15 methylkarbonyloxy-skupinu nebo také R₅ a R_fi tvoří společně karbonylovou skupinu,

Ri a Rs každý znamená atom vodíku nebo také Ri a R§ tvoří vazbu,

R₇ znamená alkoxy-skupinu, alkenyloxy-skupinu nebo cykloalkyloxy-skupinu nebo fenylovou skupinu a

Ar znamená fenylovou skupinu, případně substituovanou jedním nebo několika stejnými nebo různými substituenty zvolenými z množiny zahrnující atomy halogenů, alkylovou skupinu, alkoxy-skupinu, dialkylamino-skupinu, acylamino-skupinu, alkoxykarbonylamino-skupinu a trifluormethylovou skupinu, nebo 5-ělennou heterocyklickou aromatickou skupinu obsahující jeden nebo několik stejných nebo odlišných heteroatomů zvolených z množiny zahrnující atomy dusíku, kyslíku a síry, přičemž alkylové skupiny a alkylové zbytky ostatních skupin obsahují 1 až 8 uhlíkových atomů v přímém nebo rozvětveném řetězci a alkenylové skupiny obsahují 2 až 8 uhlíkových atomů.

Obzvláště zajímavými jsou taxoidy uvedeného obecného vzorce, ve kterém R₂ znamená atom vodíku, Ri znamená atom vodíku nebo hydroxy-skupinu nebo také Ri tvoří s uhlíkovým atomem methylové skupiny v poloze alfa jednoduchou vazbu, R₃ a R4 tvoří společně karbonylovou skupinu, R₅ znamená atom vodíku a R^ znamená atom vodíku nebo hydroxy-skupinu, acetyloxy35 skupinu nebo methoxyacetyloxy-skupinu nebo také R₅ a Rf, tvoří dohromady karbonylovou skupinu, R₇ znamená terc.butoxy-skupinu nebo fenylovou skupinu.

Lze zejména uvést následující produkty:

-(2R,3R)-4-acetoxy-2alfa-benzyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxo1 l-taxen-13alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát (docetaxel nebo Taxotere),

-8CZ 298710 B6

-(2R,3 S)-4,10beta-diacetoxy-2alfa-benzyloxy-5beta,20-epoxy-1 beta,7beta-dihydroxy-9-oxoll-taxen-13alfa-yl-3'-benzoylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát (paclitaxel),

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta, 10beta-dihydroxy-7beta, 1 Obeta5 methylen-19-nor-9-oxo-11 -taxen-13 alfa-y 1-3 '-terc-butoxyamino-3 '-feny 1-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4,10beta-diacetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta-hydroxy-7beta, 1 Obetamethylen-19-nor-9-oxo-11 -taxen-13 alfa-y 1-3 '-terc-butoxykarbony lamino-3 '-feny 1-2 'ío hydroxypropionát,

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-lbeta,7beta,10beta-trihydroxy-9-oxoll-taxen-13a-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-fenyl-(2-fluorfenyl)-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-lbeta,7beta,10beta-trihydroxy-9-oxo1 l-taxen-13alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-(4-chlorfenyl)-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxo11-taxen-13 alfa-y 1-3 '-terc-butoxykarbonylamino-3 '-(4-methoxyfenyl)-2'-hydroxypropÍonát,

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa—benzoyloxy-5beta,20-epoxy-1 beta,7beta,10beta-trihydroxy-9-oxoI l-taxen-13alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-(4-fluorfenyl)-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxo25 11-taxen-l 3alfa-yl-3 '-adamantyloxykarbonylamino-3 '-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxoII -taxen-13 alfa-yl-3 '-terc-pentyloxykarbonylamino-3 '-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxo1 l-taxen-13alfa-yl-3'-(l-methylcyklohexyl)oxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-1 beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxoll-taxen-13alfa-yl-3'(l-methylcyklopropyl)oxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxo11-taxen-l 3alfa-yl-3'-(l-methylcyklopentyl)oxykarbonylamino-3 '-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20—epoxy-1 beta, 7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxoll-taxen-13alfa-yl-3'-(l,l-dimethyl-2-propin)yloxokarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-tetrahydroxy-1145 taxen-13alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta-dihydroxy-9-oxo-l 1 taxen-13alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxo11-taxen-l 3alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-(2-thienyl)-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3 S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-l beta,7beta, 1 Obeta-trihydroxy-9-oxo11-taxen-l 3alfa-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-(2-furyl)-2'-hydroxypropionát,

-9CZ 298710 B6

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-lbeta,7beta,10beta-trihydroxy-9-oxoll-taxen-13alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-(3-thienyl)-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-lbeta,10beta-dihydroxy-9-oxo-l 1taxen-13alfa-yl-3'-terc-butoxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát,

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-lbeta,7beta-dihydroxy-9,10-dioxo11 -taxen-13 alfa-y 1-3'-terc-butoxykarbonylamino-3 '-fenyl-2'-hydroxypropionát a

-(2R,3S)-4-acetoxy-2alfa-benzoyloxy-5beta,20-epoxy-lbeta-hydroxy-9-oxo-l 1-taxen13 alfa-y 1-3 '-terc-butoxyamino-3 '-feny 1-2 '-hydroxypropionát.

Tyto jednotlivé sloučeniny mohou být získány způsoby popsanými v patentových přihláškách

WO 94/13654 a WO 92/09589.

V rámci vynálezu je obzvláště výhodné použít taxol, docetaxel nebo paclitaxel.

Vektory pro podání nukleové kyseliny

Nukleová kyselina může být injikována jako taková v úrovni léčeného místa nebo může být inkubována přímo s buňkami, které mají být zničeny. Bylo ve skutečnosti popsáno, že prosté nukleové kyseliny mohou pronikat do buněk, aniž by byly inkorporovány do nějakého specifického vektoru. Nicméně se v rámci vynálezu dává přednost použití aplikačního vektoru, umožňujícího zlepšit 1) účinnost penetrace do buňky, 2) zacílení buňky a 3) extra- a intracelulámí stabilitu.

Ve výše uvedeném ohledu mohou být použity různé typy vektorů. Může se jednat o virové nebo nevirové vektory.

Virové vektory

Použití virových vektorů je založeno na přirozených transfekčních vlastnostech virů. Takto je možné použít adenoviry, viry herpes (nebo také herpesviry), retroviry a v nedávné době také adeno-přidružené viry. O těchto vektorech je prokázáno, že jsou obzvláště výkonné v rovině transfekce.

V případě adenovirů byly charakterizovány různé sérotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud málo liší. Z těchto sérotypů se v rámci vynálezu dává přednost použití lidských adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5) nebo adenovirů zvířecího původu (o tom viz WO 94/26914).

Jakožto příklady adenovirů zvířecího původu, které jsou použitelné v rámci vynálezu, lze uvést adenoviry psího, bovinního, murinního (příklad: Mávl, Beard a kol., Virology 75 (1990)81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího (příklad: SAV) původu. Výhodným adenovirem zvířecího původu je psí adenovir, výhodně adenovir CAV2 /kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800) je vhodným příkladem takového adenovirů/. Výhodně se v rámci vynálezu používají adenoviry lidského nebo psího anebo smíšeného původu.

Výhodně defektní adenoviry podle vynálezu obsahují ITR, což je sekvence umožňující enkapsidaci, a zainteresovanou nukleovou kyselinu. Ještě výhodněji je oblast El v genomu adenovirů podle vynálezu nefunkční. Uvažovaný virový gen může být učiněn nefunkčním libovolnou zná50 mou technikou a zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo několika bází do zvažovaného genu nebo zvažovaných genů. Takové modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, například pomocí technik genetického inženýrství, nebo také působením mutagenních činidel. Ostatní oblasti (E2, E3, E4, L1-L5, atd.) mohou být také modifikovány.

- 10CZ 298710 B6

Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny libovolnou známou technikou (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573·; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Takové rekombinantní adenoviry mohou být zejména připraveny homologovou rekombinací mezi adenovirem a plazmidem nesoucím mezi jiným také zainteresovanou sekvenci DNA.

Khomologové rekombinaci dochází po ko-transfekci uvedeného adenoviru a plazmidu do příslušné buněčné řady. Použitá buněčná řada musí výhodně 1) být transformovatelná uvedenými prvky a 2) zahrnovat sekvence schopné komplementovat část genomu defektního adenoviru, výhodně v integrované formě za účelem eliminace rizik rekombinací. Jakožto příklad použitelné buněčné řady lze uvést lidskou embryonální renální řadu 293 (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 ío (1977) 59), která zejména obsahuje v integrované formě ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %). Strategie konstrukcí vektorů odvozených od adenovirů byly rovněž popsané v patentových přihláškách WO 94/26914 a FR 93 08596.

Potom se adenoviry, u kterých došlo k multiplikaci, izolují a purifikují klasickými postupy mole15 kulámí biologie, které jsou ilustrovány v příkladech.

Pokud jde o adeno-přidružené viry (AAV), jedná se o viry s relativně redukovanou DNA, které se inkorporují do genomu buněk, které infikují, stabilním a lokálně specifickým způsobem. Tyto adenoviry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by měly vliv na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Ostatně se nezdá, že by byly implikovány do patologických stavů u člověka. Genom adeno-přidružených virů byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje asi 4700 bází a má na každém konci opakovanou inverzní oblast (ITR) s asi 145 bázemi, sloužící jako replikační počátek pro vir. Zbytek genomu je rozdělen na 2 hlavní oblasti nesoucí enkapsidační funkce: levá část genomu, která obsahuje gen rep implikovaný při virové replikaci a expresi virových genů, a pravá část genomu, která obsahuje gen cap kódující proteiny kapsidy viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo již bylo popsáno v literatuře (o tom viz zejména WO 91/18088, WO 93/09239, US 4 797 368, US 5 139 941,

EP 488 528). Tyto patentové přihlášky popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých jsou geny rep nebo/a cap podrobeny deleci a nahrazeny zainteresovaným genem, a použití uvedených virů pro přenos in vitro (na buňky v buněčné kultuře) nebo in vivo (přímo do organismu) zainteresovaného genu. Defektní rekombinantní AAV podle vynálezu mohou být připraveny kotransfekcí do buněčné řady infikované pomocným lidským virem (například adenovir) plazmidu obsahujícího zainteresovanou nukleovou sekvenci ohraničenou dvěma opakovanými inverzními sekvencemi (ITR) virů AAV a plazmidu nesoucího enkapsidační geny (geny rep a cap) virů AAV. Získané rekombinantní AAV se potom purifikují klasickými technikami.

Pokud jde o herpesviry a retroviry, byla konstrukce rekombinantních vektorů v široké míře popsána v literatuře (o tom viz zejména Breakfield a kol., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bemstein a kol., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd.). Retroviry jsou zejména integračními viry infikujícími selektivně buňky ve stadiu dělení. Tvoří takto žádoucí vektory pro rakovinové aplikace. Genom uvedených retrovirů v podstatě obsahuje dvě LTR, enkapsidační sekvenci a tři kódující oblasti (gag, pol a env).

V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů jsou geny gag, pol a env obecně odstraněny deleci a nahrazeny zainteresovanou heterologovou sekvencí nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být realizovány za použití různých typů retrovirů, jakými jsou zejména MoMuFV (vir murinní Moloneyovy leukemie, také označovaný jako MoMLV), MSV (vir murinního Moloneyova sarkomu), HaSV (vir Harveyova sarkomu), SNV (vir nekrózy sleziny), RSV (vir Rou50 sova sarkomu) nebo také Friendův vir.

Za účelem konstrukce rekombinantních retrovirů obsahujících zainteresovanou sekvenci se nejdříve zkonstruuje plazmid obsahující zejména FTR, enkapsidační sekvenci a uvedenou zainteresovanou sekvenci a potom použije pro transfekci tak zvané enkapsidační buněčné řady, schop55 né přinést deficitní retrovirální funkce do plazmidu. Obecně jsou uvedené enkapsidační řady

-11 CZ 298710 B6 schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takové enkapsidační řady schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takové enkapsidační řady byly popsané v rámci dosavadního stavu techniky ajsou jimi zejména řady PA317 (US 4 861 719), PsiCRIP (W090/02806) a GP+envAm-12 (WO 89/07150). Jinak mohou rekombinantní retroviry zahrnovat modifikace v úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity, jakož i rozlehlé enkapsidační sekvence obsahující část genu gag (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987) 1639). Získané rekombinantní retroviry se potom purifikují klasickými technikami.

V rámci provedení vynálezu je obzvláště výhodné použít defektní rekombinantní adenovir. Tyto ío vektory mají skutečně obzvláště zajímavé vlastnosti pro přenos genů do nádorových buněk.

Nevirové vektory

Vektorem podle vynálezu může rovněž být nevirové činidlo schopné podporovat přenos nukleo15 vých kyselin do eukaryontních buněk a expresi těchto kyselin v eukaryontních buňkách. Chemické nebo biochemické vektory představují zajímavou alternativu k přirozeným virům a to zejména vzhledem k jejich snadnější a bezpečnější manipulaci a také s ohledem na skutečnost, že zde neexistuje teoretická hranice týkající se velikosti DNA určené k transfekci.

Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce, a sice obsáhnout transfekovanou nukleovou kyselinu a podpořit její vazbu v buňce, jakož i její průchod skrze plazmovou membránu a případně skrze obě jádrové membrány. Za účelem eliminace polyaniontového charakteru nukleových kyselin mají nevirové vektory polykationtové náboje.

Z vyvinutých syntetických vektorů jsou nej výhodnější kationtové polymery typu polylysin (LKKL)_n, (LKLK)n, polyethylenimin a dextran DAAE, nebo také kationtové nebo lipofekční lipidy. Tyto vektory mají schopnost kondenzovat DNA a podporovat její asociaci s buněčnou membránou. Z posledně uvedených vektorů lze uvést lipopolyaminy (lipofektamin, transfektam, atd.) a různé kationtové nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE, atd.). V poslední době byl vyvinut koncept cílené transfekce mediované receptorem, který využívá principu kondenzování DNA díky kationtovému polymeru zcela takto řídícímu fixování komplexu na membránu díky chemické kopulaci mezi kationtovým polymerem a ligandem membránového receptoru, přítomným na povrchu buněčného typu, který má být roubován. Rovněž bylo popsáno zacílení receptoru transferinu, receptoru inzulínu a receptoru asialoglykoproteinů hepatocytů.

Aplikační protokol

Výhodným způsobem podání v rámci vynálezu je podání nejdříve nukleové kyseliny a teprve potom podání terapeutického činidla. Při výhodném provedení se podání transgenu opakuje, aby se dosáhlo maximální exprese v maximálním počtu buněk ve stadiu dělení (například pět dnů po sobě), načež se realizuje chemoterapeutická léčba.

Výhodně se nukleová kyselina nebo nukleové kyseliny podávají přímo v oblasti léze a to buď přímou intratumorální injekcí do několika míst léze nebo v případě ateromální léze pomocí polštářku upraveného pro takový typ podání. Chemoterapeutické činidlo se aplikuje podle platných klinických nařízení.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.

- 12CZ 298710 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Buňky H460, kultivované v kultivačním prostředí RPMI 1640 obsahujícím 10 % fetálního telecího séra, se transfekují s DNAc kódující doménu GAP/170-702/ nebo protein Grb3-3 v kombinaci s genem zajišťujícím pozitivně transfekovaným buňkám rezistenci vůči geneticinu (Neo). ío Uvedené DNAc, vložené do plazmidu /přičemž jejich exprese je pod kontrolou virových promotorů (pSV₂-GAP/l 70-702/, pSV₂-Grb3-3 a pSV₂-Neov, se zavedou do buněk H460 pomocí lipofectaminu použitého jako transfekční činidlo. Buňky H460/Neo^R (rezistentní vůči přítomnosti

400 pg geneticinu v kultivačním prostředí) se selektují a kvantifikují 15 až 20 dnů po transfekci. Výsledky reprezentativní studie kvantifikace počtu kolonií Neo^R za různých transfekčních pod15 mínek jsou shrnuty na obr. 1 (pSV₂-Oli: kontrolní plazmid nemající žádnou zainteresovanou DNAc a umožňující takto kontrolu účinnosti selekce geneticinem).

Příklad 2

Buňky H460, transfekované způsobem popsaným v příkladu 1, se podrobí v průběhu selekce geneticinem několikadennímu působení různých koncentrací taxoteru, cis-platiny nebo camptotecinu. Buňky H460/Neo^R rezistentní vůči chemoterapeutickým činidlům se kvantifikují způsobem popsaným v příkladu 1. Citlivost vůči taxoteru (A), cis-platině (B) nebo vůči camptotecinu (C) buněk H460 transfekovaných s pSV₂-Neo (plný kroužek), pSV₂-Neo+pSV₂-GAP/l 70-702/ (plný trojúhelníček s vrcholem vzhůru) nebo pSV₂-Neo+pSV₂-Grb3-3 (plný trojúhelníček s vrcholem dolů) je vyjádřena relativně ke stejným způsobem transfekovaným buňkám, avšak bez působení chemoterapeutických činidel. Výsledky reprezentativní studie kvantifikace počtu kolonií po různých uvedených zpracováních jsou uvedeny na obr. 2.

Příklad 3

Buňky H460 se transfekují s DNAc kódující divoký protein p53 (p53^WT) vloženou do plazmidu pcDNA3 pod kontrolou promotoru CMV. Plazmid pcDNA3 obsahuje také gen Neo vložený pod kontrolou promotoru SV₄₀. Buňky transfekované pomocí pCDNA3 nebo pcDNA3-p53^WT se selektují a izolují způsobem popsaným v příkladu 1. V buňkách transfekovaných pomocí pcDNA3-p53^WT a rezistentních vůči geneticinu se ověří přítomnost p53 westernovým přenosem pomocí specifických protilátek. Na obr. 3 jsou shrnuty výsledky reprezentativní studie, v rámci které jsou zde uvedeny jednak počet kolonií získaných po transfekci pcDNA3 nebo pcDNA3p53^WT (A) a jednak citlivost izolovaných klonů vůči působení taxoteru (B).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Kombinovaný lékový přípravek určený pro současné, oddělené nebo časově oddálené použití účinných složek, které tento přípravek obsahuje, vyznačený tím, že je tvořen alespoň jednou nukleovou kyselinou inhibující alespoň částečně signální cesty onkogenních buněk, zvolenou z množiny zahrnující DNA kódující antimediátorovou RNA, DNA kódující ligand RNA, DNA kódující negativní dominant, DNA kódující ScFv, DNA kódující antinádorový supresorový ío protein a případně chemicky modifikovaný antimediátorový oligonukleotid, a protirakovinovým terapeutickým činidlem.
2. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 1, vyznačený tím, že nukleová kyselina je inkorporovaná ve vektoru.
3. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 2, vyznačený tím, že vektor je zvolen z množiny zahrnující liposom, nanočástici, peptidový komplex, kationtové lipidy a lipopolyaminy.

20
4. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 2, vyznačený tím, že vektorem je virový vektor odvozený od retrovirů, adenovirů, herpesvirů, AAV a viru kravských neštovic.
5. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 1, vyznačený tím, že jako protirakovinové terapeutické činidlo obsahuje chemoterapeutické činidlo, zvolené z množiny zahrnující

25 cisplatinu, taxoidy, etoposid, TNF, adriamycin, kamptotecin, vinca alkaloidy a navellein.
6. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 5, vyznačený tím, že protirakovinovým chemoterapeutickým činidlem je taxoid.

30
7. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 6, vyznačený tím, že protirakovinové chemoterapeutické činidlo je zvoleno z množiny zahrnující taxol, docetaxel a paclitaxel.
8. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 1, určený pro současné, oddělené nebo časově oddálené použití účinných složek, které tento přípravek obsahuje, vyznačený tím, že je

35 tvořen alespoň jedním antinádorovým supresorovým genem a taxoidem.
9. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 8, vyznačený tím, že obsahuje supresorový gen kódující divokou formu proteinu p53.

40
10. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 8, vyznačený tím, že obsahuje supresorový gen kódující protein wafl.
11. Kombinovaný lékový přípravek podle nároku 1, vyznačený tím, že protirakovinovým terapeutickým činidlem je radioterapeutické činidlo.