SK283989B6 - Kombinovaný liekový prípravok na liečenie hyperproliferačných patologických stavov - Google Patents

Abstract

Kombinovaný liekový prípravok, ktorý tvorí jedna alebo niekoľko nukleových kyselín, ktoré inhibujú aspoň čiastočne signálne cesty onkogénnych buniek, a kde uvedená nukleová kyselina kóduje p53, a protirakovinové terapeutické činidlo. Tento kombinovaný liekový prípravok je určený na súčasné, oddelené alebo časovo oddialené použitie na liečenie hyperproliferatívnych patologických stavov.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka oblasti terapie hyperproliferatívnych patologických stavov. Vynález sa najmä týka nového spôsobu liečenia hyperproliferativnych patologických stavov, založeného na kombinovanom použití dvoch typov terapeutických činidiel.

Doterajší stav techniky

Napriek skutočnosti, že bol v uvedenej oblasti dosiahnutý výrazný pokrok, majú spôsoby, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii na liečenie rakoviny, stále ešte obmedzenú účinnosť. Rádioterapia a chemoterapia majú iste veľmi priaznivý vplyv na rozvoj rakoviny. Napriek tomu akútnym problémom pri liečení rakoviny je skutočnosť, že niektoré primáme nádory a/alebo výskyt nádorových rezistentných buniek sú po prvom cykle úspešných liečení necitlivé tak na rádioterapiu, ako aj na chemoterapiu.

Početné štúdie sa snažili objasniť molekulárne mechanizmy, ktoré by mohli stáť na začiatku týchto javov. Všeobecne boli tieto štúdie zamerané na spôsob, akým chemoterapeutické činidlá vstupujú do buniek, a na spôsob, akým tieto chemoterapeutické činidlá reagujú s cieľovými bunkovými objektmi (Chin a kol., Adv. Cancer Res. 60 (1993) 157 - 180; Chabner a Mayers v Cancer /Principles and practices of Oncology, De Vitá a kol. ed., J. B. Lippencott Co., str. 349-395, 1989). Napríklad bolo zistené, že veľmi vysoká miera expresic génu mdr‘ môže obmedziť vnútrobunkovú koncentráciu rôznych chemoterapeutických činidiel a môže prispievať k expresii globálnej rezistencie proti účinným látkam (Chin a kol. pozri skôr).

Dôkladnejšie objasnenie mechanizmov rezistencie proti chemoterapii a rádioterapii záleží na lepšom poznaní procesov bunkovej smrti, indukovaných uvedenými činidlami. Vzhľadom na to, že ionizačné žiarenie a početné protirakovinové činidlá spôsobujú poškodenie DNA, boli terapeutické účinky uvedených činidiel pripisované ich genotoxickým schopnostiam. Napriek tomu poškodenie buniek spôsobené týmito činidlami neumožňuje celkom vysvetliť ich terapeutickú účinnosť (Chabner a Mayers, pozri skôr). V posledných rokoch výskum a pochopenie mechanizmu programovanej smrti alebo apoptózy umožnili prehodnotiť mechanizmy, pomocou ktorých nádorové bunky získavajú alebo strácajú citlivosť proti cytotoxickým činidlám. Početné toxické stimuly indukujú totiž apoptózu aj pri dávkach, ktoré sú nedostatočné na indukciu metabolických disfunkcií. Schopnosť indukovať apoptóznu reakciu v nádorových bunkách by mohla stanoviť účinnosť liečenia.

Prihlasovateľ našiel teraz nový spôsob liečenia, ktorý je mimoriadne účinný pri deštrukcii hyperproliferativnych buniek. Ako bolo už uvedené, je spôsob liečenia podľa vynálezu v podstate založený na kombinovanom použití dvoch typov terapeutických činidiel, ktorými sú gény blokujúce signálne cesty onkogénnych buniek a chemoterapeutické a/alebo rádioterapeutické činidlá. Vynález v skutočnosti vychádza zo zistení, že v prípade uvedeného kombinovaného použitia uvedených typov činidiel dochádza ku obzvlášť významnej synergii.

Podstata vynálezu

Špecifickejšie definované, vynález sa týka nového spôsobu liečenia hyperproliferativnych patologických stavov, založeného na kombinovanom použití génov blokujúcich bunkové onkogénne signálne cesty a chemoterapeutického a/alebo rádioterapeutického činidla. Kombinované liečenia podľa vynálezu sú zvlášť účinné na deštrukciu buniek v štádiu hyperproliferácie, a to pri relatívne nízkych aplikačných dávkach. Vynález takto poskytuje nový spôsob liečenia hyperproliferativnych patologických stavov (rakovina, restenóza, atď.), ktorý je veľmi účinný, a pri ktorom sú obmedzené vedľajšie účinky.

Prvým predmetom vynálezu je lieková kombinácia jednej alebo niekoľkých nukleových kyselín inhibujúcich aspoň čiastočne signálne cesty onkogénnych buniek a protirakovinového terapeutického činidla, určená na súčasné, oddelené alebo časovo oddialené použitie pri liečení hyperproliferatívnych patologických stavov.

Ako bolo uvedené, vynález spočíva v podstate na objavení synergického účinku medzi produktom niektorých génov a činidiel protirakovinovej terapie. Týmto kombinovaným použitím sa dosiahne vyšší účinok pri nižších aplikačných dávkach uvedených činidiel. Vynález ponúka prostriedok na zvlášť účinné liečenie hyperproliferativnych patologických stavov.

Ako bude uvedené ďalej, môžu byť obidve zložky kombinovanej liečby podľa vynálezu použité v závislosti od zvoleného génu a chemoterapeutického alebo rádioterapeutického činidla súčasne, oddelene alebo v časovom odstupe. V prípade súčasného použitia sa obidve činidlá inkubujú v bunkách alebo sa podajú pacientovi súčasne. Podľa tejto formy uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu môžu byť obidve činidlá pripravené oddelene a potom bezprostredne pred podaním zmiešané a podané spolu. Všeobecnejšie povedané, tieto činidlá sú podané súčasne, ale oddeleným spôsobom. Najmä spôsoby podania obidvoch činidiel môžu byť odlišné. V rámci ďalšej formy uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu môže byť podanie obidvoch činidiel uskutočnené v časovom odstupe.

Nukleovou kyselinou, použitou v rámci vynálezu, môže byťdeoxyribonukleová kyselina (DNA) alebo ribonukleová kyselina (RNA). V prípade DNA môže ísť o komplementárnu DNA (cDNA), genómovú DNA (gDNA), hybridnú sekvenciu alebo o syntetickú alebo polosyntetickú sekvenciu. Okrem toho môže ísť o chemicky modifikovanú nukleovú kyselinu, ktorá je napríklad modifikovaná na zvýšenie jej rezistencie proti nukleázam, jej penetračnej schopnosti alebo jej zacielenosti do bunkového objektu, jej terapeutickej účinnosti a podobne. Tieto nukleové kyseliny môžu byť ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového, syntetického alebo iného pôvodu. Tieto nukleové kyseliny sa môžu získať ľubovoľnou, odborníkom známou technikou, najmä vytriedením bánk, chemickou syntézou alebo tiež zmiešanými metódami zahŕňajúcimi chemickú alebo enzymatickú modifikáciu sekvencii získaných vytriedením bánk. Ako je uvedené ďalej, môžu byť tieto nukleové kyseliny inkorporované do vektorov, akými sú plazmidovc, vírusové alebo chemické vektory.

Ako bolo už uvedené, nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu je nukleovou kyselinou, ktorá je schopná aspoň čiastočne inhibovať signálne dráhy v onkogénnych bunkách. Tieto nukleové kyseliny sú uvádzané pod označením „vnútrobunkové neutralizačné prvky onkogénov“ alebo skrátene EINO (Eléments Intracellulaires de Neutralisation des Oncogénes). Signálne dráhy, ktoré vedú k transformácii bunky sú viacpočetné. Bunková proliferácia využíva množinu faktorov, medzi ktoré patria membránové receptory (proteíny G), onkogény, enzýmy (proteínkinázy, famezyltransferázy, fosfolipázy a podobne), nukleozidy (ATP, AMP, GDP, GTP, atď.), transkripčné faktory, atď., aktivačné faktory [faktory výmeny guanozínov (GRF,

GAP, RAF, atď.), transkripčné faktory, atď.]. Poruchy, napríklad v štruktúre, aktivite a konformácii týchto jednotlivých faktorov sú pripisované deregulačným javom bunkovej proliferácie. Takto 90 % adenokarcinómov pankreasu vykazuje onkogén Ki-ra.s mutovaný na dvanástom kodóne (Almoguera a kol., Celí 53 (1988) 549). Rovnako bola preukázaná prítomnosť mutovaného génu ras v adenokarcinómoch hrubého čreva a pri rakovine štítnej žľazy (50 %) alebo v karcinómoch pľúc a pri myeloidných leukémiách (30%, Bos, J. L. Cancer Res., 49 (1989) 4682. Rovnako boli v súčasnosti identifikované ďalšie onkogény (myc,fos, jun, ras, myb, erb a ďalšie), o ktorých mutovaných formách sa predpokladá, že sú zodpovedné za poruchy bunkovej proliferácie. Rovnako sú pri mnohých rakovinách, akými sú najmä kolorektálna rakovina, rakovina prsníkov, rakovina pľúc, rakovina zažívacieho systému, rakovina žalúdka, rakovina pažeráka, lymfómy B, rakovina vaječníkov a rakovina močového mechúra, pozorované mutované formy p53.

Nukleovými kyselinami použitými v rámci vynálezu sú nukleové kyseliny, ktoré sú schopné interferovať s niektorým z uvedených faktorov implikovaných pri bunkovej proliferácii a inhibovať aspoň čiastočne jeho aktivitu. Faktormi, ktoré sú výhodne zamerané nukleovými kyselinami, sú faktory, ktoré sa prednostne alebo špecificky objavujú pri poruchách bunkovej proliferácie (aktivované onkogény, mutanty nádorových supresorov, atď.).

Nukleové kyseliny použité v rámci vynálezu môžu byť nukleovými kyselinami rôznych typov. Výhodne ide o:

- antimediátorové nukleové kyseliny,

- oligonukleotidy, ktoré sú schopné priamo viazať cieľové onkogénne proteíny na to, aby ich neutralizovali (ARN-ligand),

- nukleové kyseliny kódujúce proteíny dominantne negatívnej povahy a produkujúce takto neaktívny komplex,

- nukleové kyseliny kódujúce intraceluláme protilátky (napríklad variabilné fragmenty s jediným reťazcom z protilátky) namierené proti onkogénnemu proteínu (ScFv) a

- supresorové antionkogénne gény.

V rámci prvého výhodného uskutočnenia vynálezu je nukleovou kyselinou DNA alebo RNA kódujúca polypeptid alebo proteín inhibujúci aspoň čiastočne signálne dráhy onkogénnych buniek. Polypeptid a proteín sú zvolené najmä z množiny zahŕňajúcej negatívne dominanty, ScFv a nádorové supresory.

Ešte výhodnejší je negatívny dominánt tvorený N-terminálnou oblasťou proteínu GAP, proteínu Bbr3-3 alebo mutantov proteínov Ets. Pokiaľ ide o ScFv, ide výhodne o ScFv namierený proti mutovanému proteínu ras alebo proti faktoru GAP. Supresorový protinádorový proteín je výhodne tvorený p53, Rb, wafl, p21, DCC alebo MTS.

V rámci druhého výhodného uskutočnenia vynálezu je nukleovou kyselinou DNA kódujúca RNA inhibujúca aspoň čiastočne signálne dráhy onkogénnych buniek. Nukleovou kyselinou RNA je najmä komplementárna RNA cieľovej nukleovej kyseliny, ktorá je schopná blokovať transkripciu a/alebo transláciu uvedenej cieľovej nukleovej kyseliny (antimediátorová RNA), ribozým alebo RNA-ligand. Výhodným príkladom je antimediátorová RNA anti-Ki-ras.

V rámci výhodného uskutočnenia vynálezu je stále nukleovou kyselinou antimediátorový oligonukleotid, ktorý je prípadne chemicky modifikovaný. Môže ísť najmä o oligonukleotidy, ktorých fosfodiesterový skelet bol chemicky modifikovaný a akými sú napríklad fosfonátové, fosfotriesterové, fosforamidátové a fosforotioátové oligonukleotidy, ktoré sú opísané napríklad v patentovej prihláške W094/08003. Rovnako môže ísť o nukleotidy a alebo o nukleotidy konjugované s činidlami, akými sú akrylové zlúčeniny.

V rámci zvlášť výhodného uskutočnenia vynálezu je nukleová kyselina inkorporovaná vo vektore. Použitý vektor môže byť chemického pôvodu (lipozóm, nanočastice, peptidový komplex, katiónové lipidy, atď.), vírusového pôvodu (retrovírus, adenovírus, vírus herpes, AAV, vírus kravských kiahní, atď.) alebo plazmidového pôvodu. Nukleová kyselina použitá v rámci vynálezu môže byť formulovaná s ohľadom na jej topické, perorálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, intraokuláme, transdermálne a iné podanie. Výhodne sa nukleová kyselina použije v injikovateľnej forme. Táto kyselina sa môže združiť s ľubovoľným farmaceutický prijateľným nosičom vhodným na podanie injekciou, najmä priamou injekciou v úrovni ošetrovaného miesta. Môže najmä ísť o sterilné izotonické roztoky alebo o suché kompozície, najmä lyoíllizované, ktoré po pridaní sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku poskytnú injikovateľné roztoky. Priama injekcia nukleovej kyseliny do nádoru pacienta je výhodnou formou podania, pretože umožňuje koncentrovať terapeutický účinok v úrovni napadnutého tkaniva. Použité dávky nukleovej kyseliny budú závisieť od rôznych faktorov, najmä od použitého génu, vektora a spôsobu podania, od liečeného patologického stavu a tiež od požadovaného času liečenia.

Protinádorovým terapeutickým činidlom použitým v rámci vynálezu môže byť ľubovoľné činidlo, ktoré je odborníkmi v danom odbore používané v rámci chemoterapie alebo rádioterapie. Najmä môže ísť o cisplatinu, taxoid, TNF, adriamycín, camptothecin, jed mitotického vretienka (vinca-alkaloidy, navellein, atď.), rôntgenové lúče, ultrafialové žiarenie, atď. Zvlášť zaujímavé výsledky sa dosiahnu v prípade, ak sa ako chemoterapeutické činidlo použije taxoid. Protirakovinové chemoterapeutické činidlo sa podáva klasickými spôsobmi. Všeobecne sa podáva parenterálne.

Ako bolo uvedené, môžu byť obidve činidlá použité súčasne, oddelene alebo v časovom odstupe. V rámci zvlášť výhodného uskutočnenia vynálezu je nukleová kyselina podávaná ako prvá, a potom, keď nukleová kyselina môže byť exprimovaná bunkami, až potom sa podá protirakovinové terapeutické činidlo.

Zvlášť výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka liekovej kombinácie jedného alebo niekoľkých protinádorových supresorových génov a taxoidu, určenej na súčasné, oddelené alebo časovo oddialené použitie pri liečení hyperproliferatívnych patologických stavov. Ešte výhodnejšie supresorový gén kóduje divú formu proteínu p52 alebo proteín wafl (p21).

Vynález takto poskytuje zvlášť účinný spôsob na deštrukciu hyperproliferatívnych buniek. Môže byť použitý in vitro alebo ex vivo, inkubáciou buniek súčasným alebo časovo oddialeným spôsobom v prítomnosti nukleovej kyseliny alebo nukleových kyselín a chemoterapeutických činidiel. V tomto ohľade je predmetom vynálezu rovnako spôsob deštrukcie hyperproliferatívnych buniek, ktorého podstata spočíva v tom, že sa uvedené bunky alebo ich časť uvedie do styku s nukleovou kyselinou a s uvedeným chemoterapeutickým činidlom.

Vynález sa výhodne použije in vivo na deštrukciu buniek v štádiu hyperproliferácie (t. j. pri abnormálnej proliferácii). Vynález je tiež aplikovateľný na deštrukciu nádorových buniek alebo buniek hladkého svalu vaskulámej steny (restenóza). Vynález je mimoriadne vhodný na liečenie rakovin, pri ktorých je implikovaný aktivovaný onkogén. Ako príklad môžeme uviesť adenokarcinóm hrubého čreva, rakovinu štítnej žľazy, pľúcny karcinóm, mycloidné leukémie, kolorektálnu rakovinu, rakovinu prsníkov, rakovinu pľúc, rakovinu zažívacieho ústrojenstva, rakovinu žalúdka, rakovinu pažeráka, lymfómy B, rakovinu vaječníkov, rakovinu močového mechúra a glioblastómy.

Použitie antimediátorových nukleových kyselín

Regulácia expresie cieľových génov pomocou antimediátorových nukleových kyselín predstavuje terapeutický pristúp, ktorý sa intenzívne rozvíja. Tento terapeutický prístup je založený na schopnosti nukleových kyselín špecificky hybridizovať s komplementárnymi oblasťami inej nukleovej kyseliny a takto inhibovať špecifickým spôsobom expresiu determinovaných génov. Táto intervencia môže prebiehať buď na úrovni translácie alebo na úrovni transkripcie.

Antimediátorovýmí nukleovými kyselinami sú nukleové sekvencie, ktoré sú schopné selektívnej hybridizácie s mediátorovou RNA cieľových buniek na inhibíciu ich translácie na proteín. Tieto nukleové kyseliny tvoria s cieľovou mRNA lokálnym spôsobom oblasti s dvojitým reťazcom typu RNA/mRNA alebo typu DNA/mRNA interakciou klasického Watson-Crickovho typu. Môže napríklad ísť o syntetické oligonukleotidy malej veľkosti, ktoré sú komplementárne s bunkovou mRNA a ktoré sú zavedené do cieľových buniek. Takéto oligonukleotidy boli napríklad opísané v patente EP 92 574. Rovnako môže ísť o sekvenciu DNA, ktorej cxpresia v cieľovej bunke generuje RNA, a ktoré sú komplementárne k bunkovým mRNA. Takéto sekvencie boli napríklad opísané v patente EP 140 308.

V poslednom čase bol preukázaný nový typ nukleových kyselín, ktorc sú schopné regulovať expresiu cieľových génov. Tieto nukleové kyseliny nehybridizujú s bunkovými mRNA, ale hybridizujú priamo s genómovou DNA v dvojitom reťazci. Tento nový prístup je založený na zistení, že niektoré nukleové kyseliny sú schopné špecifickej interakcie vo veľkej brázde dvojzávitnice DNA za lokálneho vzniku trojitých závitníc, vedúceho k inhibícii transkripcie cieľových génov. Tieto nukleové kyseliny selektívne rozpoznávajú dvojzávitnicu DNA na úrovni oligopurinooligopyrimidínových sekvencii, t. j. v úrovni oblastí majúcich oligopurinovú sekvenciu na jednom reťazci a oligopyrimidínovú sekvenciu na komplementárnom reťazci, a vytvárajú v týchto úrovniach lokálnym spôsobom trojitú závitnicu. Báza tretieho reťazca (oligonukleotidu) tvorí vodíkové väzby (Hoogsteenova väzba alebo Hoogsteenova reverzná väzba) s purinmi párov Watson-Crickových báz. Takéto nukleové kyseliny boli opísané najmä λ' AntiCancer drug design 6 (1991) 569.

Antimediátorové nukleové kyseliny podľa vynálezu môžu byť sekvenciami DNA kódujúce antimediátorové RNA alebo ribozómy. Takto produkované antimediátorové RNA môžu vstúpiť do interakcie s mRNA alebo cieľovou genómovou DNA a vytvoriť s ňou dvojité alebo trojité závitnice. Rovnako môže isť o antimediátorové sekvencie (oligonukleotidy), prípadne chemicky modifikované, ktoré sú schopné priamej interakcie s génom alebo s cieľovou RNA.

Výhodne sú antimediátorové nukleové kyseliny podľa vynálezu namierené proti onkogénom alebo proti špecifickým oblastiam aktivovaných onkogénov, najmä proti onkogénu ras.

Použitie RNA-ligandov

RNA-ligandy sú oligoribonukleotidy malej veľkosti, ktoré sú veľmi špecifické, a ktoré majú značnú afinitu pre daný cieľový objekt, najmä proteínový cieľový objekt. Príprava a identifikácia takýchto RNA-ligandov boli opísané najmä v prihláške WO91/19813. V rámci špecifického uskutočnenia vynálezu je možné združiť krátku RNA špecifickú pre proteín Ki-ras, exprimovanú v bunkách s použitím adaptovaného vírusového alebo nevírusového vektora s opísanými chemoterapeutickými alebo rádioterapeutickými činidlami.

Negatívne dominanty

Negatívnym dominantom je polypeptidové antagonizujúce činidlo onkogénnych signálnych dráh. Tento antagonizmus sa realizuje v prípade, že sa polypeptid dostal do styku s kľúčovým prvkom onkogénnej signalizácie a vstupuje tak do konkurenčného vzťahu s polypeptidom, ktorý je prirodzene využívaný v bunke na uvedenú signalizáciu. Použitým polypeptidovým antagonizujúcim činidlom je veľmi často napodobneninou prirodzeného polypeptidu, ktorá je však zbavená domén, ktoré umožňujú onkogénnemu signálu šíriť sa cez takýto polypeptid.

Z negatívnych dominantov, ktoré sa môžu výhodne použiť v rámci vynálezu, jc možné uviesť nukleové kyseliny kódujúce terminálnu doménu NH₂ proteínu GAP pre proteín Grb3-3 alebo pre mutované formy proteínov ETS.

V patentovej prihláške WO94/03597 sa preukázalo, že nadmerná expresia terminálnej domény NH₂ proteínu GAPras by mohla špecificky blokovať tumorogemcitu buniek transformovaných následkom expresie mutovaného génu ras. Príklad 1 tejto prihlášky vynálezu teraz ukazuje, že nadexpresia domény GAP (170-702) indukuje apoptózu ľudských buniek (karcinóm H460). Príklad 2 navyše ukazuje, že apoptózny účinok indukovaný konštrukciou GAP (170-702) je veľmi výrazne prehĺbený pridaním produktov, medzi ktoré patri napríklad cisplatina, camptothecin alebo taxotere do kultivačného prostredia ľudských nádorových buniek, v koncentráciách týchto produktov, ktoré nemajú inak žiadny účinok na životnosť buniek.

Príklad 1 prihlášky vynálezu opisuje aktivitu génu Grb3-3 v bunkách H460. Predpokladaná sekvencia a funkcia Grb3-3 boli opísané v Science 1994. Príklad 2 rovnako ukazuje, že apoptózny účinok indukovaný prenosom génu Grb3-3 je výrazne prehĺbený pridaním produktov, akými sú napríklad cisplatina, camptothecin alebo taxotere, do kultivačného prostredia ľudských nádorových buniek, a to v koncentráciách týchto produktov, ktoré nemajú žiadny účinok na bunkovú životnosť.

Uvedené príklady jednoznačne dokazujú, že rôzne chemoterapeutické činidlá môžu byť účinne použité v kombinácii na realizáciu stratégie indukcie apoptózy mechanizmom transferu génov.

ScFv

Činidlá ScFv sú molekulami, ktoré majú väzbové vlastnosti porovnateľné s väzbovými vlastnosťami protilátok a sú intracelulárne aktívne. Ide najmä o molekuly vytvárané peptidom zodpovedajúcim väzbovému miestu variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky viazaným peptidovým linkerom k peptidu zodpovedajúcemu väzbovému miestu variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky. Prihlasovateľ preukázal, že takéto ScFv mohli byť produkované in vivo prenosom génu (pozri patentová prihláška WO 94/29446).

Prihláška vynálezu najmä ukazuje, že je možné neutralizovať onkogénne proteíny exprimovaním ScFv v rôznych bunkových oblastiach. V rámci jedného z uskutočnení vynálezu sa použije nukleová kyselina, umožňujúca intracclulámu produkciu činidla ScFv neutralizujúceho transformačnú kapacitu proteínov ras, v kombinácii s chemotera

SK 283989 Β6 peutickým činidlom. Takáto kombinácia umožňuje dosiahnutie významných synergických účinkov (pozri príklad 2).

Nádorové supresory

Zo supresorových protinádorových gcnov použiteľných v rámci vynálezu môžeme uviesť najmä gény p53, p21, Rb, rap\ A, DDC, WAF a MTS. Najmä sa môžu použiť p53, Rb alebo Waf.

Gén p53 kóduje jadrový proteín s veľkosťou 53 kDa. Forma tohto génu mutovaná deléciou a/alebo mutáciou je implikovaná pri rozvoji väčšiny ľudských rakovín (Baker a kol., Science 244(1989)217). Tieto mutované formy sú rovnako schopné kooperovať s onkogénmi ras v rámci transformácie murínnych fibroplastov. Divý gén kódujúci natívny p53 inhibuje zase tvorbu ložísk transformácie vo fibroplastoch hlodavcov transfekovaných rôznymi onkogénnymi kombináciami. Nedávne údaje potvrdzujú, že by proteín p53 mohol byť sám transkripčným faktorom a stimulovať tak expresiu ďalších supresorových protinádorových génov. Ostatne účinok p53 na proliferáciu vaskulárnych hladkých svalov bol v nedávnom čase preukázaný (Epstein a kol. Science 151 (1994)).

Gén Rb determinuje syntézu jadrového fosfoproteínu s asi 927 aminokyselinami (Friend a kol., Náture 323 (1996) 643), ktorého funkciou je potláčať delenie buniek tým, že ich nechá vstúpiť do pokojovej fázy. Inaktivované formy génu Rb boli implikované v rôznych nádoroch a najmä v retinoblastómoch alebo pri mezenchymálnych rakovinách, akými sú osteosarkómy. Opakované zavedenie tohto génu do nádorových buniek, kde bol inaktivovaný, má za následok návrat k normálnemu stavu a stratu tumorogenicity (Huang a kol., Science 242 (1988) 1563). Nedávno bolo preukázané, že normálny Rb, ale nie jeho mutované formy, potláča expresiu protoonkogénu c-fos. čo je gén, ktorý je zodpovedný za bunkovú proliferáciu.

Gény WAF a MTS a ich protinádorové vlastnosti už boli opísané v literatúre (Celí 75 (1993) 817; Science 264 (1994) 436).

Príklad 3 demonštruje účinný kombinačný typ medzi derivátom taxolu a génom p53. Taxol indukuje apoptózu v rôznych kultúrach nádorových bunkových línií (Proceedings of the Američan Association for Cancer Research, zv. 35, marec 1994, Bhalla a kol., str. 306, Seiter a kol., str. 314, Saunders a kol., str. 317). Činidlo p53 spúšťa mechanizmus apoptózy v rôznych bunkových typoch. Prihlasovateľ preukázal, že kombinácia derivátu taxolu a p53 indukuje apoptózu ľudských nádorových buniek. V prítomnosti rastúcich dávok taxotere boli kultivované špecifické klony buniek H460, ktoré sú rezistentné proti účinku p53. Príklad 3 jednoznačne dokazuje, že bunky umierajú následkom pôsobenia taxotere pri koncentráciách, ktoré sú celkom neúčinné v prípade buniek neexprimujúcich divý p53. Waf 1 (Wild-type p53 Activated Fragment Celí, 75, 817, 1993) alebo tiež p21 (Náture, 366, 701, 1993) sú indukované nadexpresiou divokého p53. Waf 1 sa objavuje v bunkách, ktoré sú zadržané vo fáze G1 alebo v štádiu apoptózy následkom nadexpresie divokého p53, nie však v bunkách, ktoré sú zadržané v G1 alebo v štádiu apoptózy mechanizmom nezávislým od p53 (Cancer Res., 54, 1169, 1994). Waf 1 obmedzuje rast nádorových buniek rovnako účinne ako divý p53. Kombinované použitie génu Waf 1 a derivátov taxolu rovnako indukuje synergický účinok na deštrukciu hyperproliferatívnych buniek.

Protirakovinové chemoterapeutické činidlá

Protirakovinové terapeutické činidlá použiteľné v rámci kombinovanej terapie podľa vynálezu môžu byť zvolené z množiny zahŕňajúcej chemoterapeutické a rádioterapeutické činidlá, ktoré sú odborníkom známe. Môže ísť najmä o cisplatinu, taxoid, etoposide, TNF, adriamycín, camptothecin, jed mitotického vretienka a o podobné činidlá. Tieto jednotlivé činidlá môžu byť získané z komerčných zdrojov.

Medzi týmito činidlami predstavujú taxoidy výhodnú formu uskutočnenia vynálezu. V tomto ohľade sú taxoidy, ktoré môžu byť zvlášť použité v rámci vynálezu, zlúčeniny všeobecného vzorca:

v ktorom R¹ a R² každý znamená atóm vodíka alebo jeden z R¹ alebo R² znamená atóm vodíka a druhý znamená hydroxyskupinu, acyloxyskupinu alebo acylkarbonyloxy skupinu alebo tiež R² znamená atóm vodíka a R¹ tvorí s atómom uhlíka metylovej skupiny v polohe a väzbu za vzniku cyklopropánového kruhu, jeden z R³ alebo R⁴ znamená atóm vodíka a druhý znamená hydroxyskupinu alebo tiež R³ a R⁴ tvoria spoločne karbonylovú skupinu,

R⁵ a R⁶ každý znamená atóm vodíka alebo jeden z R⁵ alebo R⁶ znamená atóm vodíka a druhý znamená hydroxyskupinu, acyloxyskupinu, acylkarbonyloxyskupinu alebo alkoxymetylkarbonyloxyskupinu alebo tiež R⁵ a R⁶ tvoria spoločne karbonylovú skupinu,

R⁸ a R⁵ každý znamená atóm vodíka alebo tiež R¹ a R⁸ tvoria väzbu,

R⁷ znamená alkoxyskupinu, alkenyloxyskupinu alebo cykloalkyloxyskupinu alebo fenylovú skupinu a

Ar znamená fenylovú skupinu, prípadne substituovanú jedným alebo niekoľkými rovnakými alebo rôznymi substituentmi zvolenými z množiny zahŕňajúcej atómy halogénov, alkylovú skupinu, alkoxyskupinu, dialkylaminoskupinu, acylaminoskupinu, alkoxykarbonylaminoskupinu a trifluórmetylovú skupinu, alebo 5-člennú heterocyklickú aromatickú skupinu obsahujúcu jeden alebo niekoľko rovnakých alebo rôznych heteroatómov zvolených z množiny zahŕňajúcej atómy dusíka, kyslíka a síry, pričom alkylové skupiny a alkylové zvyšky ostatných skupín obsahujú 1 až 8 uhlíkových atómov v priamom alebo v rozvetvenom reťazci a alkenylové skupiny obsahujú 2 až 8 uhlíkových atómov.

Zvlášť zaujímavými sú taxoidy uvedeného všeobecného vzorca, v ktorom R² znamená atóm vodíka, R¹ znamená atóm vodíka alebo hydroxyskupinu alebo tiež R¹ tvorí s uhlíkovým atómom metylovej skupiny v polohe ajednoduchú väzbu, R³ a R⁴ tvoria spoločne karbonylovú skupinu, R⁵ znamená atóm vodíka a R⁶ znamená atóm vodíka alebo hydroxyskupinu, acetyloxyskupinu alebo metoxyacetyloxyskupinu alebo tiež R⁵ a R⁶ tvoria spolu karbonylovú skupinu, R⁷ znamená terebutoxy skupinu alebo fenylovú skupinu.

Možné je uviesť najmä nasledujúce produkty: (2R,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 β,Ίβ. 10/3-trihydroxy-9-oxo-11 -taxén-13a-yl -3 ’-tcrc .butoxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát (docetaxel alebo Taxotere), (2R,3S)-4-10/3-diacetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3-dihydroxy-9-oxo-11 -taxén-13a-yl-3'-benzoylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát (paclitaxel), (2R,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-l/3,10/3-dihydroxy-7/3,10/3-metylén-l 9-nor-9-oxo-l 1-taxén-13a-yl-3'-tcrc.butoxyamino-3’-fenyl-2'-hydroxypropionát, (27?,3S)-4,10/3-diacetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-l/3-hydroxy-7B, 1 Οβ-metylén-19-nor-9-oxo-11 -taxén-13o-yl-3'-terc.butoxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2ŕí,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy- i /3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l 1-taxén-13a-yl-3'-terc.butoxykarbonylamino-3’-(2-fluórfenyl)-2’-hydroxypropionát, (2R,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-l /3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l 1-taxén-13a-yl-3'-terc.butoxykarbonylamino-3'-(4-chlórfenyl)-2'-hydroxypropionát, (2/?,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-l/3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l 1 -taxén-13a-3'terc.butoxykarbonylamino-3’-(4-metoxyfenyl)-2’-hydroxypropionát, (27?,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l 1-taxén-13a-yl-3'-terc.butoxykarbonylamino-3'-(4-fluórfenyl)-2'-hydroxypropionát, (2Ä,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1/3,7/3,10/3-lrihydroxy-9-oxo-11 -taxén-13a-3'-adamantyloxykarbonylamino-3'-fenyl-2^,-hydroxypropionát, (2R,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l 1 -taxén- 13a- yl-3 '-terc, pentyloxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2/?,35)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l 1 -taxén-13a-yl-3'-(l -metylcyklohexyl)-oxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2R,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3, 10/3-trihydroxy-9-oxo-l 1 -taxén- 13a-yl-3'(l -metylcyklopropyl )-oxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2Ä,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1/3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-11 -taxén-13a-yl-3'-( 1 -metylcyklopentyl)oxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2R,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l l-taxén-13a-yl-3'-(l,l-dimetyl-2-propín)yl-oxokarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2Ä,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-l /3,7/3,10/3-tetrahydroxy-11 -taxén-13a-yl-3'-terc.butoxykarbonylamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2/?,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3-dihydroxy-9-oxo-l 1 -taxén-13a-yl-3'-terc.butoxykarbonyiamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2Ä,35)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1 /3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-l l-taxén-13a-yi-3'-terc.butoxykarbonylamino-3'-(2-tienyl)-2'-hydroxypropionát, (2Λ,35)-4-acetoxy-2a-bcnzoyloxy-5/3,20-epoxy-1/3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-11 -taxén-13a-3'-terc. butoxykarbonylamino-3'-(2-furyl)-2'-hydroxypropionát, (2ff,3₁S’)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1/3,7/3,10/3-trihydroxy-9-oxo-11 -taxén-13a-yl-3'-terc.butoxykarbonylamino-3'-(3-tienyl)-2'-hydroxypropionát, (2Ä,3Sj-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-1/3,10/3-dihydroxy-9-oxo-11 -taxén-13 a-yl-3 'terc.butoxykarbonylamino-3’-fenyl-2'-hydroxypropionát, (2Ä,3ó’)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5|3,20-epoxy-1 /3,7/3-dihydroxy-9,10-dioxo-l 1 -taxén-13a-yl-3'terc.butoxykarbonylamino-3’-fenyl-2'-hydroxypropionát a (2Ä,3S)-4-acetoxy-2a-benzoyloxy-5/3,20-epoxy-l/3-hydroxy-9-oxo-l 1 -taxén- 13a-yl-3 '-terc, butoxyamino-3'-fenyl-2'-hydroxypropionát.

Tieto jednotlivé zlúčeniny sa môžu získať spôsobmi opísanými v patentových prihláškach WO94J3654 a WO92/09589.

V rámci vynálezu je zvlášť výhodné použiť taxol, docetaxol alebo paclitaxol.

Vektory na podanie nukleovej kyseliny

Nukleová kyselina sa môže injikovať samotná v mieste, ktoré má byť liečené alebo sa môže inkubovať priamo s bunkami, ktoré majú byť liečené alebo zničené. Bolo v skutočnosti opísané, že jednoduché nukleové kyseliny môžu prenikať do buniek bez toho, aby boli inkorporované do nejakého špecifického vektora. Napriek tomu sa v rámci vynálezu dáva prednosť použitiu aplikačného vektora, umožňujúceho zlepšiť I) účinnosť penetrácie do bunky, 2) zacielenie bunky a 3) extra- a intracelulámu stabilitu.

V uvedenom ohľade môžu sa použiť rôzne typy vektorov. Môže ísť o vírusové alebo nevirusové vektory.

Vírusové vektory

Použitie vírusových vektorov je založené na prirodzených transfekčných vlastnostiach vírusov. Takto je možné použiť adenovirusy, herpetické vírusy (alebo tiež herpes vírusy), retrovírusy a v nedávnom čase tiež adenopridružené vírusy. O týchto vektoroch je preukázané, že sú zvlášť výkonné v rovine transfekcie.

V prípade adenovirusov boli charakterizované rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa iba málo líšia. Z týchto sérotypov sa v rámci vynálezu dáva prednosť použitiu ľudských adenovirusov typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovirusov zvieracieho pôvodu (pozri WO94/26914). Ako príklady adenovirusov zvieracieho pôvodu, ktoré sú použiteľné v rámci vynálezu, môžeme uviesť adenovirusy, psieho, bovínneho, murínneho (príklad: Mavl, Beard a kol., Virology 75 (1990)81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho (príklad: SAV) pôvodu. Výhodným adenovirusom zvieracieho pôvodu je psí adenovírus, výhodne adenovírus CAV2 [kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR800) je vhodným príkladom takéhoto adenovírusu]. Výhodne sa v rámci vynálezu používajú adenovirusy ľudského alebo psieho alebo zmiešaného pôvodu.

Výhodne defektné adenovirusy podľa vynálezu obsahujú 1TR, čo je sekvencia umožňujúca enkapsidáciu a zainteresovanú nukleovú kyselinu. Ešte výhodnejšie je oblasť EI v genóme adenovirusov podľa vynálezu nefunkčná. Uvažovaný vírusový gén sa môže stať nefunkčným použitím ľubovoľnej známej techniky a najmä úplnou elimináciou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo niekoľkých báz uvažovaného génu alebo génov. Takéto modifikácie sa môžu získať in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad pomocou techník genetického inžinierstva. alebo tiež pôsobením mutagénnych činidiel. Ostatné oblasti (E2, E3, E4, L1-L5, atď.) je možné tiež modifikovať.

Defektné rekombinantné adenovirusy podľa vynálezu sa môžu pripraviť ľubovoľnou známou technikou (Levrero a koľ, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Takéto rekombinantné adenovirusy sa môžu pripraviť homologickou rekombináciou medzi adenovirusom a plazmidom nesúcim medzi iným tiež zainteresovanú sekvenciu DNA. K homologickej rekombinácii dochádza po kotransfekcii uvedeného adenovírusu a plazmidu do príslušnej bunkovej línie. Použitá bunková línia musí výhodne 1) byť transformovateľná uvedenými prvkami a 2) zahŕňať sekvencie schopné komplementovať časť genómu defektného adenovírusu, výhodne v integrovanej forme na elimináciu rizík rekombinácii. Ako príklad použiteľnej bunkovej línie môžeme uviesť ľudskú embryonálnu rcnálnu líniu 293 (Graham a kol., J.Gen.Virol.36 (1977) 59), ktorá obsahuje najmä v integrovanej forme vo svojom genóme ó

ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12 %). Stratégie konštrukcií vektorov odvodených od adenovírusov boli rovnako opísané v patentových prihláškach WO94/26914 a FR 93 08596.

Potom sa adenovírusy, pri ktorých došlo k multiplikácii, izolujú a purifikujú klasickými postupmi molekulárnej biológie, ktoré sú ilustrované v príkladoch.

Pokiaľ ide o adenopridružené vírusy (AAV), ide o vírusy s relatívne redukovanou DNA, ktoré sa inkorporujú do genómu buniek, ktoré infikujú, stabilným a lokálne špecifickým spôsobom. Tieto adenovírusy sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby mali vplyv na rast, morfológiu alebo diferenciáciu buniek. Nezdá sa, že by boli implikované do patologických stavov u človeka. Genóm adenopridružených vírusov bol klonovaný, sekvenovaný a charakterizovaný. Obsahuje asi 4700 báz a má na každom konci invertovanú repetitívnu oblasť (ITR) s asi 145 bázami, slúžiacimi ako replikačný počiatok pre vírus. Zvyšok genómu je rozdelený na 2 hlavné oblasti nesúce enkapsidačné funkcie: ľavá časť genómu, ktorá obsahuje gén rep implikovaný pri vírusovej replikácii a expresii vírusových génov a pravá časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci proteíny kapsidu vírusu.

Použitie vektorov odvodených od AAV na prenos génov in vitro a in vivo už bolo opísané v literatúre (pozri najmä WO 91/18088, WO 93/09239, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). Tieto patentové prihlášky opisujú rôzne konštrukcie odvodené od AAV, v ktorých sú gény rep a/alebo cap podrobené delécii a nahradené zainteresovaným génom, a ich použitie na prenos zainteresovaného génu in vitro (do buniek v bunkovej kultúre) alebo in vivo (priamo do organizmu). Defektné rekombinantné AAV podľa vynálezu sa môžu pripraviť kotransfekciou plazmidu obsahujúceho zainteresovanú nukleovú sekvenciu ohraničenú dvoma opakovanými invertovanými repetitivnymi oblasťami (ITR) vírusov AAV a plazmidu nesúceho enkapsidačné gény (gény rep a cap) vírusov AAV do bunkovej línie infikovanej pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom). Získané rekombinantné AAV sa potom purifikujú klasickými technikami.

Pokiaľ ide o herpetické vírusy a retrovírusy, bola konštrukcia rekombinatných vektorov v širokej miere opísaná v literatúre (pozri najmä Breakfíeld a kol., New Biologist 3 (1991)203; EP 453242, EP 178220, Bemstein a kol. Genet.Eng.7 (1985)235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atď.). Retrovírusy sú najmä integračnými vírusmi infikujúcimi selektívne bunky v štádiu delenia. Takto tvoria žiaduce vektory pre rakovinové aplikácie. Genóm uvedených retrovírusov v podstate obsahuje dve LTR, enkapsidačnú sekvenciu a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env}. V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovírusov sú gény gag, pol a env všeobecne odstránené deléciou a nahradené zainteresovanou heterológovou sekvenciou nukleovej kyseliny. Tieto vektory sa môžu realizovať s použitím rôznych typov retrovírusov, akými sú najmä MoMuLV (vírus murínnej Moloneyovej leukémie, tiež označovaný ako MoMLV), MSV (vírus murínneho Moloneyovho sarkómu), HaSV (vírus Harveiovho sarkómu), SNV (vírus nekrózy sleziny), RSV (vírus Rousovho sarkómu) alebo tiež Friendov vírus.

Na konštrukciu rekombinantných retrovírusov obsahujúcich zainteresovanú sekvenciu sa najskôr skonštruuje plazmid obsahujúci najmä LTR, enkapsidačnú sekvenciu a uvedenú zainteresovanú sekvenciu a potom sa použije na transfekciu tzv. enkapsidačnej bunkovej línie, schopnej priniesť deficitné retrovirálne funkcie do plazmidu. Všeobecne sú uvedené enkapsidačné línie schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie boli opísané v rámci doterajšieho stavu techniky a sú nimi najmä línie PA317, (US 4,861,719), PsiCRIP (W090/02806) a GP+envAm-12 (W089/07150). Inak môžu rekombinantné retrovírusy zahŕňať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity, ako aj rozľahlej enkapsidačnej sekvencie obsahujúcej časť génu gag (Bender a kol., J.Virol.61 (1987)1639). Získané rekombinantné retrovírusy sa potom purifikujú klasickými technikami.

V rámci uskutočnenia vynálezu je zvlášť výhodné použiť defektný rekombinantný adenovírus. Tieto vektory majú skutočne zvlášť zaujímavé vlastnosti na prenos génov do nádorových buniek.

Nevirusové vektory

Vektorom podľa vynálezu môže byť rovnako nevírusové činidlo schopné podporovať prenos nukleových kyselín do eukaryotických buniek a expresiu týchto kyselín v eukaryotických bunkách. Chemické alebo biochemické vektory predstavujú zaujímavú alternatívu k prirodzeným vírusom, a to najmä vzhľadom na ľahšiu a bezpečnejšiu manipuláciu a tiež s ohľadom na skutočnosť, že tu neexistuje teoretická hranica týkajúca sa veľkosti DNA určenej na transfekciu.

Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie a síce, obsiahnuť transfekovanú nukleovú kyselinu a podporiť jej väzbu v bunke, ako aj jej prechod cez plazmatickú membránu a pripadne cez obidve jadrové membrány. Na elimináciu polyaniónového charakteru nukleových kyselín majú nevirusové vektory polykatiónové náboje.

Z vyvinutých syntetických vektorov sú najvýhodnejšie katiónové polyméry typu polylyzin, (LKKL)_n, (LKLK)_n, polyetylénimín a dextrán DEAE, alebo tiež katiónové alebo lipofekčné lipidy (lipofectants). Tieto vektory majú schopnosť kondenzovať DNA a podporovať jej asociáciu s bunkovou membránou. Ako posledné z uvedených vektorov môžeme uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, transfektám, atď.) a rôzne katiónové alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE, atď ). V poslednom čase bol vyvinutý koncept cielenej transfekcie mediovanej receptorom, ktorý využíva princíp kondenzovania DNA prostredníctvom katiónového polyméru, čím sa zacieľuje naviazanie komplexu na membránu ako výsledok chemickej kopulácie medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora, prítomným na povrchu bunkového typu, ktorý má byť očkovaný. Rovnako bolo opísané zacielenie receptora transferínu, receptora inzulínu a receptora asialoglykoproteinov hepatocytov.

Aplikačný protokol

Vhodným spôsobom podania v rámci vynálezu je najskôr podanie nukleovej kyseliny, a až potom podanie terapeutického činidla. Pri výhodnom uskutočnení sa podanie transgénu opakuje, aby sa dosiahla maximálna expresia v maximálnom počte buniek v štádiu delenia (napríklad päť dní po sebe), až potom sa realizuje chemoterapeutická liečba.

Výhodne sa nukleová kyselina alebo nukleové kyseliny podávajú priamo v oblasti poškodenia, a to buď priamou intratumorovou injekciou do niekoľkých miest lézie alebo v prípade ateromatóznej lézie pomocou vankúša upraveného na takýto druh podania. Chemoterapeutické činidlo sa aplikuje podľa platných klinických nariadení.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou patentových nárokov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 sú znázornené výsledky, ktoré reprezentujú kvantifikáciu počtu Neo^R kolónií v rôznych transfekčných podmienkach (pSV₂-Oli: kontrolný plazmid, ktorý nemá žiadnu predmetnú cDNA a ktorý takto umožňuje kontrolu účinnosti selekcie geneticínom).

Na obr. 2 sú znázornené výsledky reprezentatívnej štúdie kvantifikácie počtu kolónií po rôznych spracovaniach uvedených v príklade 2.

Na obr. 3 sú zhrnuté výsledky reprezentatívnej štúdie, ktoré znázorňujú jednak počet kolónií získaných po transfekcii pcDNA3 alebo pcDNA3-p53^HT (A) a jednak citlivosť izolovaných klonov proti pôsobeniu taxotere (B).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Bunky H460, kultivované v kultivačnom médiu RPMI 1640, ktoré obsahuje 10% fetálneho teľacieho séra, sa transfekujú s cDNA, ktorá kóduje doménu GAP[170-702] alebo proteín Grb3-3 v kombinácii s génom zaisťujúcim pozitívne transfekovaným bunkám rezistenciu proti geneticínu (Neo). Uvedené cDNA, vložené do plazmidu, pričom ich expresia je pod kontrolou vírusových promótorov (pSV₂-GAP[ 170-702], pSV₂-Grb3-3 a pSV₂-Neo), sa zavedú do buniek H460 pomocou lipofectamínu (lipofectAMINE) ako transfekčného činidla. Bunky H460'Nco^R (rezistentné na prítomnosť 400 /zg/ml geneticínu v kultivačnom médiu) sa selektujú a kvantifikujú 15 až 20 dní po transfekcii.

Príklad 2

Bunky H460, ktoré sa transfekujú spôsobom opísaným v príklade 1, sa podrobia v priebehu selekcie gcncticínom niekoľkodennému pôsobeniu rôznych koncentrácií taxotere, cisplatiny alebo camptothecinu. Bunky H460/Neo^R rezistentné proti chemoterapeutickým činidlám sa kvantifikujú spôsobom opísaným v príklade 1. Citlivosť na taxotere (A), cisplatinu (B) alebo na camptothecin (C) buniek H460 transfekovaných pSV₂-Neo (plný krúžok), pSV₂-Neo+ pSV₂-GAP[ 170-702] (plný trojuholník s vrcholom hore) alebo pSV₂-Neo+ pSV₂-Grb3-3 (plný trojuholník s vrcholom dole) je vyjadrená relatívne k rovnakým spôsobom transfekovaným bunkám, ale bez pôsobenia chemoterapeutických činidiel.

Príklad 3

Bunky H460 sa transfekujú s cDNA, ktorá kóduje divý proteín p53 (p53^Hľ), vloženou do plazmidu pcDNA3 pod kontrolu promótora CMV. Plazmid pcDNA3 obsahuje tiež gén Neo vložený pod kontrolu promótora SV40. Bunky transfekované pcDNA3 alebo pcDNA3-p53^WT sa selektujú a izolujú spôsobom opísaným v príklade 1. V bunkách transfekovaných pcDNA3-p53¹¹' a rezistentných proti geneticínu sa overí prítomnosť p53 westemovým blotom pomocou špecifických protilátok.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kombinovaný liekový prípravok, vyznačujúci sa tým, že je vytvorený jednou alebo niekoľkými nukleovými kyselinami kódujúcimi proteín p53, ktoré inhibujú aspoň čiastočne onkogénne signálne dráhy a protirakovinovým terapeutickým činidlom a je určený na súčasné, oddelené alebo časovo oddialené použitie na liečenie hyperproliferatívnych patologických stavov.
2. 2. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako nukleovú kyselinu obsahuje DNA kódujúcu antimediátorovú RNA.
3. 3. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako nukleovú kyselinu obsahuje DNA kódujúcu ligand RNA.
4. 4. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako nukleovú kyselinu obsahuje DNA kódujúcu negatívnu dominantu.
5. 5. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako nukleovú kyselinu obsahuje DNA kódujúcu ScFv.
6. 6. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako nukleovú kyselinu obsahuje DNA kódujúcu antinádorový supresorový proteín.
7. 7. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako nukleovú kyselinu obsahuje prípadne chemicky modifikovaný antimediátorový oligonukleotid.
8. 8. Kombinovaný liekový prípravok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina je inkorporovaná vo vektore.
9. 9. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že vektor je zvolený z množiny zahŕňajúcej lipozóm, nanočasticu, peptidový komplex, katiónové lipidy a lipopolyamíny,
10. 10. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, žc vektorom je vírusový vektor odvodený od retrovírusov, adenovírusov, herpetických vírusov, AAV a vírusu kravských kiahní.
11. 11. Kombinovaný liekový prípravok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu vo forme vhodnej na mtratumorové podanie.
12. 12. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako protirakovinové terapeutické činidlo obsahuje chemoterapeutické činidlo zvolené z množiny zahŕňajúcej cisplatinu, taxoidy, etoposide, TNF, adriamycín, camptothecin, vinea alkaloidy a navellein.
13. 13. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že protirakovinovým chemoterapeutickým činidlom je taxoíd.
14. 14. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že protirakovinové chemoterapeutické činidlo jc zvolené z množiny zahŕňajúcej taxol, docetaxel a paclitaxel.
15. 15. Kombinovaný liekový prípravok podľa niektorého z nárokov 12 až 14, vyznačujúci sa tým, že protirakovinové chemoterapeutické činidlo jc vo forme vhodnej na parenterálne podanie.
16. 16. Kombinovaný liekový prípravok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina a protirakovinové chemoterapeutické činidlo sú použité súčasne.
17. 17. Kombinovaný liekový prípravok podľa niektorého z nárokov lažl 5, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina je podaná pred protirakovinovým chemoterapeutickým činidlom.
18. 18. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku I, vyznačujúci sa tým, že je tvorený jedným alebo niekoľkými antinádorovými supresorovými génmi a taxoidom a určený na súčasné, oddelené alebo časovo od8 dialené použitie na liečenie hyperproliferatívnych patologických stavov.
19. 19. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že supresorový gén kóduje divú formu proteínu p53.
20. 20. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že supresorový gén kóduje proteín wafl.
21. 21. Kombinovaný liekový prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že protirakovinovým terapeutickým činidlom je rádioterapeutické činidlo.