CZ295804B6

CZ295804B6 - Thiolová sloučenina, způsob její přípravy a prostředek, který ji obsahuje

Info

Publication number: CZ295804B6
Application number: CZ19982047A
Authority: CZ
Inventors: Franco Pellacini; Stefano Romagnano; Gabriele Norcini; Francesco Santangelo; Claudio Semeraro
Original assignee: Zambon Group S. P. A.
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2005-11-16
Also published as: HUP9903840A3; ITMI952772A0; EP0883612A1; EA002339B1; CN1108295C; US6166051A; CZ204798A3; CA2241452A1; EA199800546A1; HUP9903840A2; ZA9610819B; IT1277736B1; ATE289597T1; WO1997024341A1; AU706978B2; ITMI952772A1; KR19990076808A; MX9805168A; AU1369197A; DE69634387D1

Abstract

Popsány jsou sloučeniny o vzorci I, způsob jejich přípravy a farmaceutické prostředky, které je obsahují jako aktivní složky. Sloučeniny o vzorci I jsou obdařeny směsnou inhibiční aktivitou ACE a NEP a jsou vhodné k léčbě kardiovaskulárních onemocnění.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká thiolových derivátů, vykazujících aktivitu inhibující metalopeptidázu a konkrétněji se týká N-merkaptoacylalaninových derivátů, vhodných k léčbě kardiovaskulárních onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Farmakologická zajímavost studia molekul s aktivitou inhibující metalopeptidázy je dána rolí, kterou tyto enzymy uplatňují vzhledem k úrovni kardiocirkulačního systému.

Ve skutečnosti je dobře známo, že sloučeniny, vykazující aktivitu, která inhibuje enzym konvertuj ící angiotensin (ACE, angiotensin converting enzyme), jsou vhodné hlavně k léčbě vysokého tlaku (hypertenze), srdečního selhání a poinfarktového stavu z toho důvodu, že inhibují tvorbu angiotensinu II, látky, která zahrnuje několik účinků, mezi nimiž je i zvýšení krevního tlaku.

Sloučeniny, vykazující inhibiční aktivitu vzhledem k enzymu konvertujícímu endothelin (ECE), jsou vhodné jako anti-vasokonstrikční látky, neboť inhibují tvorbu endothelinu, peptidu o 21 aminokyselinách, který vykazuje vasokonstrikční aktivitu.

Sloučeniny s inhibiční aktivitou neutrálního endopeptidázového enzymu (NEP), zvaného také enkefalináza, jsou vhodné jako vasodilatační látky, neboť enzym NEP odpovídá za inaktivaci nejen endogenního enkefalinu, ale také některých natriuretických faktorů, v nichž například atriální faktor (ANF), hormon vylučovaný srdcem, který zvyšuje vasodilataci, na renální úrovni zvyšuje diurézu (vylučování moči ledvinami) a natriurézu (vylučování sodíku).

Proto jsou sloučeniny s aktivitou inhibující metalopeptidázu, i když jejich působení na kardiovaskulární systém vykazuje rozdílné mechanismy účinku, obecně používané, ať už samotné nebo ve vzájemné kombinaci, k léčbě vysokého tlaku, selhání ledvin, městnavého selhání srdce a ischemických kardiopatií.

Z thiolových derivátů, inhibitorů metalopeptidáz, jsou za mateřské sloučeniny inhibitorů NEP a inhibitorů ACE považovány Thiorphan f(DL-(3-merkapto-2-benzylpropanoyl)glycin], poprvé popsaný Roquesem se spoluautory v Nátuře 288, 286-288, 1988 a Kaptopril (Index Měrek vydání XI, č. 1773, str. 267).

Další molekuly, mající thiolovou strukturu obdařenou inhibiční aktivitou metalopeptidázy, byly popsány v literatuře.

N-Merkaptoacylové dipeptidy obdařené aktivitou, inhibující ECE a konkrétněji N-merkaptoacylové deriváty tryptofanu byly popsány S.R. Bertenshawen se spoluautory v Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 10, 1953-1958, 1993.

Patent US 4 401 677 (E.R. Squibb and Sons, lne.) popisuje merkaptoalkanoylové aminokyseliny, obdařené inhibiční aktivitou enkefalinázy.

Patent US 4 199 512 (E.R. Squibb and Sons, lne.) popisuje merkaptoalkanoylové aminokyseliny, obdařené aktivitou inhibující ACE.

Evropská patentová přihláška EP 0 566 157 (Schering Corporation) popisuje N-merkaptoacylové deriváty alaninu, obdařené aktivitou inhibující NEP.

-1 CZ 295804 B6

Evropská patentová přihláška EP 0 449 523 (E.R. Squibb and Sons, Inc.) popisuje merkaptonebo acylthiotrifluoromethylamidy s aktivitou inhibující NEP.

Evropská patentová přihláška EP 0 524 553 [Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)] popisuje acylmerkaptoalkanoylové dipeptidy, obdařené aktivitou, inhibující neutrální endopeptidázu a peptidylpeptidázu A.

Mezinárodní patentová přihláška WO 93/08162 [Rhone-Poulenc Rorer S.A.-Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)] popisuje β,β-disubstituované a-merkaptomethylpropionylamidy, obdařené směsnou inhibiční aktivitou vůči ACE/NEP.

Evropská patentová přihláška EP 0 419 327 (Societě Civile Bioproject) popisuje aminokyselinové deriváty jako například N-merkaptoacylové deriváty fenylalaninu, histidinu a tryptofanu, obdařené aktivitou, inhibující ACE a enkefalinázu.

α-Merkaptoacyldipeptidy, obdařené aktivitou inhibující ACE a NEP, jsou popsané rovněž S.S. Bhagwatem se spoluautory v Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 7, 735-738, 1995.

V této posledně jmenované práci bylo zjištěno, že zatímco přítomnost bifenylmethylové skupiny uděluje molekulám s α-merkaptoacyldipeptidovou strukturou zajímavou směsnou inhibiční aktivitu vzhledem k ACE/NEP, substituce bifenylové skupiny takovými skupinami jako a- nebo β-naftyl vyvolává významnou ztrátu aktivity.'

Podstata vynálezu

Byly zjištěny N-merkaptoacylalaninové deriváty, které jsou obdařené pozoruhodnou aktivitou, inhibující enzym konvertující angiotensin, stejně jako neutrální endopeptidázový enzym (podvojnou ACE/NEP inhibující aktivitu), což je činí zvláště vhodnými k léčbě kardiovaskulárních patologií.

Předmětem tohoto vynálezu jsou tedy sloučeniny obecného vzorce I ★

R-CHj-CH-CONH-CH-COOR, (I), * | ch₂-r₃ kde

R je merkaptoskupina nebo skupina R4COS, v organismu konvertibilní na merkaptoskupinu;

Ri je přímá nebo větvená C₂-C₄ alkylová skupina nebo aiylová či arylalkylová skupina s 1 až 6 uhlíkovými atomy v alkylové skupině, v níž arylem je fenyl nebo pěti či šestičlenný aromatický heterocyklus s jedním nebo dvěma heteroatomy, zvolenými z dusíku, kyslíku a síry, volitelně substituovaný jedním nebo více substituenty, totožnými nebo odlišnými, zvolenými z halogenových atomů, hydroxyskupin, alkoxylových skupin, alkylových skupin, alkylthioskupin, alkylsulfonylových nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 6 uhlíkovými atomy v alkylové skupině, C1-C3 alkylových skupin obsahujících jeden či více fluoridových atomů, karboxyskupin, nitroskupin, aminových nebo aminokarbonylových skupin, acylaminoskupin, aminosulfonylových

-2CZ 295804 B6 skupin, mono- či di-alkylaminových nebo mono- či dialkylaminokarbonylových skupin s 1 až 6 uhlíkovými atomy v alkylové skupině;

R₂ je vodíkový atom, přímá nebo větvená C1-C4 alkylová skupina nebo benzylová skupina;

R₃ je pěti či šestičetný aromatický heterocyklus s jedním nebo dvěma heteroatomy, zvolenými z dusíku, kyslíku a síry, volitelně substituovaný fenylovou skupinou, přičemž jsou fenyl a heterocyklická skupina volitelně substituované jedním nebo více substituenty, totožnými nebo odlišnými, zvolenými z halogenových atomů, alkylových skupin, alkoxylových skupin, alkylthioskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 3 uhlíkovými atomy v alkylové skupině;

R4 je přímá nebo větvená C1-C4 alkylová skupina nebo fenylová skupina;

uhlíkové atomy označené hvězdičkou jsou stereogenními centry (opticky aktivními uhlíkovými atomy);

a jejich farmaceuticky přijatelné sole;

za předpokladu, že R₃ není imidazolylovou nebo indolylovou skupinou.

Sloučeniny o vzorci I obsahují dvě stereogenní centra a mohou tedy existovat ve formě stereoizomerů.

Předmětem tohoto vynálezu jsou tedy sloučeniny o vzorci I ve formě stereoizomemí směsi, stejně jako ve formě jednotlivých stereoizomerů.

Sloučeniny o vzorci I, předmět tohoto vynálezu, jsou obdařeny podvojnou (duální), inhibiční aktivitou vůči ACE/NEP a hodí se k léčbě kardiovaskulárních onemocnění.

Pokud není uvedeno jinak, je v předkládaném vynálezu výrazem přímá nebo větvená alkylová skupina míněn alkyl jako je methyl, ethyl, w-propyl, izopropyl, w-butyl, sekundární butyl, terciární butyl, izobutyl, w-pentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, izopentyl, terciární pentyl, w-hexyl a izohexyl; výrazem přímá nebo větvená alkoxylová skupina je míněna alkoxylová skupina jako methoxylová, ethoxylová, n-propoxylová a izopropoxylová skupina; výrazem halogenový atom se míní fluorový, chlorový, bromový nebo jodový atom; výrazem acyl se míní acylová skupina, odvozená od alifatické nebo aromatické karboxylové kyseliny jako je kyselina octová, propionová, máselná a benzoová; výrazem pěti nebo šestičetný aromatický heterocyklus s jedním nebo dvěma heteroatomy, zvolenými z dusíku, kyslíku a síry, se míní skupina jako thiazol, izoxazol, oxazol, izothiazol, pyrazol, imidazol, thiofen, pyrrol, pyridin, pyrimidin, pyrazin, pyridazin a furan, volitelně benzokondenzovanou.

Příklady farmaceuticky přijatelných solí sloučenin o vzorci I jsou sole s alkalickými kovy nebo s kovy alkalických zemin a sole s farmaceuticky přijatelnými organickými bázemi.

Upřednostňovanými sloučeninami obecného vzorce I jsou sloučeniny, kde R₃ je pěti nebo šestičetná aromatická heterocyklická skupina s jedním nebo dvěma heteroatomy, zvolenými z dusíku, kyslíku a síry.

Stále upřednostňovanějšími sloučeninami jsou v rámci této třídy sloučeniny obecného vzorce I, kde Ri představuje fenylalkylovou skupinu, volitelně substituovanou jedním či více substituenty, stejnými nebo rozdílnými, zvolenými z halogenových atomů, hydroxylových, alkylových či alkoxylových skupin.

-3CZ 295804 B6

Upřednostňovanými příklady farmaceuticky přijatelných solí sloučenin o vzorci I jsou sole s alkalickými kovy, jako je sodík, lithium a draslík.

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že sloučeniny o vzorci I, kde R je skupina R4COS, která je v organismu přeměnitelná (konvertibilní) na merkaptoskupinu, stejně jako sloučeniny obecného vzorce I, kde R₂ je alkylová nebo benzylová skupina, jsou biologickými prekurzory (předchůdci) odpovídajících sloučenin o vzorci I, kde R je merkaptoskupina (R=SH) anebo R₂ je vodíkový atom.

Specifickými příklady upřednostňovaných sloučenin o vzorci I, předmětem předkládaného vynálezu, jsou:

methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(2-thienyl)alaninu;

methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(4-thiazolyl)alaninu;

methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2~fenylmethylpropionyl)-(2-pyridyl)alaninii;

methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(3-pyridyl)alaninu;

methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(2-furyl)alaninu;

N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(2-thienyl)alanin;

N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(4-thiazolyl)alanin;

N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(2-pyridyl)alanin;

N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(3-pyridyl)alanin;

N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(2-furyl)alanin.

Výroba sloučenin obecného vzorce I, předmětu předkládaného vynálezu, se provádí syntetickým postupem, při němž se ponechá reagovat sloučenina o vzorci II

Γ

R-CH₂-CH-COOH (II), kde

R a Rj mají dříve uvedené významy;

a alaninový derivát o vzorci III ★

H_zN-CH-COOR₂ (III), ch₂-r₃ kde R₂ a R₃ mají dříve uvedené významy.

-4CZ 295804 B6

Kondenzační reakce se provádí běžnými postupy, užívanými v chemii peptidů.

Před provedením reakce je vhodné důkladně chránit volitelné funkční skupiny, které by s reakcí mohly interferovat.

Volitelná ochrana se provádí běžnými postupy. Sloučeniny, kde R je skupina R4COS, jsou tedy s výhodou užívány jako meziprodukty o vzorci II, čímž se získávají odpovídající sloučeniny obecného vzorce I, kde R=RiCOS, z nichž lze hydrolýzou získat sloučeniny obecného vzorce I, kde R=SH.

Stanovení užitečnosti volitelné ochrany a výběru typu přijaté ochrany v závislosti na reakci která má proběhnout a s ohledem na funkční skupiny, které mají být chráněny, patří k normálním znalostem odborníka v oboru.

Odstranění volitelných ochranných skupin se provádí běžnými postupy.

Jako obecný odkaz k užívání ochranných skupin v organické chemii viz publikace Theodory W. Greene a Patera G. M. Wutse „Protective Groups in Organic Synthesis“, vyd. John Wiley and Sons, Inc, druhé vydání, 1991.

Sloučeniny o vzorcích II a III jsou známé nebo se snadno připravují běžnými metodami.

Jako příklad, sloučeniny o vzorci II mohou být připraveny podle popisu v britském patentu GB 1576161 firmy E.R. Squibb and Sons Inc.

Sloučeniny obecného vzorce I ve formě jednotlivých stereoizomerů se připravují stereoselektivní syntézou nebo separací směsi stereoizomerů za použití běžných postupů.

Běžnými postupy se provádí rovněž příprava solí sloučenin o vzorci I, předmětu předkládaného vynálezu.

Sloučeniny obecného vzorce I, předmět předkládaného vynálezu, jsou obdařeny duální aktivitou inhibující ACE i NEP a jsou vhodné k léčbě kardiovaskulárních onemocnění.

Inhibiční aktivita sloučenin o vzorci I byla stanovena pomocí testů v uspořádání in vitro.

Konkrétně byla inhibiční aktivita sloučenin o vzorci I stanovena ve srovnání s dříve zmíněnými látkami Thiorphan a Kaptopril.

Inhibiční aktivita sloučenin obecného vzorce I v podmínkách in vitro, vyjádřená hodnotou IC₅₀, je farmakologicky významná v tom, že se pohybuje v nanomolámích koncentracích. Uvedená aktivita je srovnatelná s aktivitou Kaptoprilu pokud jde o inhibiční aktivitu ACE a s aktivitou Thiorphanu, pokud jde o inhibiční aktivitu NEP.

Pro praktické léčebné použití mohou být sloučeniny obecného vzorce I formovány do pevných nebo kapalných farmaceutických prostředků, vhodných k orálnímu nebo parenterálnímu podávání.

Farmaceutické prostředky, obsahující terapeuticky účinné množství sloučeniny obecného vzorce I ve směsi s nosičem pro farmaceutické použití jsou proto dalším předmětem předkládaného vynálezu.

-5CZ 295804 B6

Specifickými příklady farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu jsou tablety, potahové tablety, kapsle, granuláty, roztoky a suspenze, vhodné k orálnímu podávání a roztoky a suspenze vhodné k parenterálnímu podávání.

Farmaceutické prostředky, předmět předkládaného vynálezu, se připravují běžnými postupy.

Denní dávka sloučeniny obecného vzorce I nebo odpovídající látky, z níž vzniká, bude záviset na více faktorech, jako je závažnost onemocnění, individuální citlivost pacienta nebo druh prostředku, ale obvykle se pohybuje mezi 0,1 mg a 10 mg na kilogram tělesné hmotnosti a je rozděluje se do 1 dávky nebo do více dávek podávaných v jednom dni.

K dokreslení předkládaného vynálezu jsou nyní uvedeny následující příklady.

Pokud není uvedeno jinak, bleskové chromatografie byly prováděny za použití silikagelu pro bleskovou chromatografíi od firmy Baker (kód 7024-00).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava methylesteruN-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(4-thiazolyl)-Lalaninu (sloučeniny I)

Roztok hydroxybenzotriazolu (1,25 g; 9,25 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) a následně roztok dicyklohexylkarbodiimidu (1,81 g, 9,25 mmol) v methylenchloridu (10 ml) byly při 0 °C a za míchání přidány ke směsi, tvořené kyselinou 3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionovou (2,78 g; 9,25 mmol), methylesterem (4-thiazolyl)-L-alaninu (2,40 g; 9,25 mmol), získaným působením methanolu a thionylchloridu na methylester N-íerc-butoxykarbonyl-(4-thiazolyl)L-alaninu (od firmy Sinthetech lne., Oregon), triethylaminem (2,58 ml; 18,5 mmol) v tetrahydrofuranu (25 ml) a methylenchloridem (40 ml).

Reakční směs byla udržována za míchání při teplotě místnosti po dobu 20 hodin, poté byla odfiltrována dicyklohexylmočovina a rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku. Zbytek byl shromážděn za pomoci ethylacetátu a roztok byl promyt vodným roztokem 20% chloridu sodného, 5% hydrogenuhličitanu sodného a opět 20% roztokem chloridu sodného.

Po oddělení fází a odpaření organické fáze byla výsledná pevná látka čištěna bleskovou chromatografíí (silikagel, eluent ethylacetát:hexan v poměru 1:1, tlak dusíku 0,01 MPa), poskytující tak jako olejovitý produkt methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropiony 1)-(4thiazolyl)-L-alaninu (3,85 g; 88% výtěžek).

Požadovaný produkt byl působením ethyletheru a hexanu na olejovitý produkt a následnou filtrací získán jako pevná látka (2,2 g; poměr stereoizomerů 2S:2R= 85:15).

‘H-NMR (200 MHz, CDC1₃): δ (ppm): 2,67-3,30 (m, 7H), CH₂-CH-CH₂, CHj-thiazolyl; 3,6 (s, 3H, OCH₃); 4,77-4,89 (m, 1H, CONH-CH); 6,53 (s, 1H, NH); 7,15-7,90 (m, 10H, fenyl); 6,928,51 (m, 2H, thiazolyl).

Z matečných výluhů byl jako olejovitý produkt izolován další podíl sloučeniny 1 (1,5 g; stereoizomerní poměr 2S:2R = 65:35).

-6CZ 295804 B6

Analogickým způsobem byly připraveny následující sloučeniny:

methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(2-thienyl)-L-alaninu (sloučenina 2) teplota tání 68 až 70 °C

Ή-NMR (200 MHz, CDC1₃): δ (ppm): 2,65-3,40 (m, 7H), CH₂-CH-CH₂, CH₂-thienyl; 3,61 a 3,62 (2s, 3H, OCH₃); 4,70-4,90 (2m, 1H, CONH-CH); 5,85-5,90 a 5,95-6,02 (2m, 1H, NH); 6,60-7,05 (m, 3H, thienyl); 7,10-8,00 (m, 10H, fenyl);

methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(2-pyridyl)-L-alaninu (sloučenina 3) teplota tání 84 až 86 °C

Ή-NMR (200 MHz, CDCI3): δ (ppm): 2,70-3,30 (m, 7H CH₂-CH-CH₂, CHj-pyridyl; 3,59 (s, 3H, OCH3); 4,71-4,92 (m, 1H, CONH-CH); 6,90-8,28 (m, 15H, NH, fenyl, pyridyl).

Příklad 2

Příprava N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(4-thiazolyl)-L-alaninu (sloučeniny 4)

Methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(4-thiazolyl)-L-alaninu (1,20 g; 2,56 mmol), připravený tak, jak je popsáno v Příkladu 1, byl suspendován v ethanolu (30 ml) a odplyněn probubláním dusíkem k odstranění kyslíku.

K suspenzi byl při 0 °C po kapkách a pod dusíkovou atmosférou přidán odplyněný roztok IN (7,68 ml) hydroxidu sodného.

Reakční směs byla za míchání udržována 4 hodiny při teplotě místnosti, poté byla ochlazena na 0°C a okyselena předem odplyněným roztokem 10% kyseliny chlorovodíkové (5 ml) a vody (5 ml).

Směs byla za sníženého tlaku odpařena do sucha, zbytek byl shromážděn za pomoci acetonitrilu a opět odpařen do sucha.

Zbytek, shromážděný za pomoci směsi methanohmethylenchlorid (1:1, 15 ml), byl zfíltrován k odstranění anorganických solí a poté byl roztok za sníženého tlaku odpařen do sucha.

Zbytek byl následně shromážděn za pomoci vody, obsahující kyselinu chlorovodíkovou (20 ml) a methylenchlorid (20 ml).

Fáze byly odděleny a organická fáze byla za sníženého tlaku odpařena do sucha, což poskytlo zbytek (0,81 g), z něhož byl působením terciárního butyletheru, filtrací a vysušením získán N(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(4-thiazolyl)-L-alanin (0,52 g; 58% výtěžek; stereoizomemí poměr 2S:2R= 90:10).

teplota tání 145 až 147 °C

Ή-NMR (200 MHz, CDCI3): δ (ppm): 1,53 (t, 1H, JHH=8,4 Hz, SH); 2,51-2,98 (m, 5H, CH₂CH-CH₂); 3,39-3,51 (ABX, 2H, Jab=14,7 Hz, Jax=3,4 Hz, Jbx=5,9 Hz, CHj-thiazolyl); 4,634,71 (m, 1H, HCOO); 6,51 (d, 1H, JHH=5,8 Hz, CONH); 7,09-7,30 [m, 6H, fenyl, CH(thiazolyl)]; 8,85 [d, 1H, JHH=2,0 Hz, CH(thiazolyl)].

-7CZ 295804 B6

Analogickým způsobem byly připraveny následující sloučeniny:

N-(2-fenylmethy l-3-merkaptopropionyl)-(2-thienyl)-L-alanin (sloučenina 5) ‘Η-NMR (200 MHz, CDC1₃): δ (ppm): 1,40-1,61 (m, 1H, SH); 2,47-3,46 (m, 7H, CH₂-CHCH₂, CHr-CH-COO); 4,78-4,91 (m, 1H, CHCOO); 6,00-6,06 (m, 1H, CONH); 6,40-7,33 (m, 8H, aromatický); 7,50 (bs, 1H, COOH).

N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(2-pyridyl)-L-alanin (sloučenina 6) teplota tání 164 až 166 °C

Ή-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ (ppm): 1,78-1,86 (m, 1H, SH); 2,20-2,89 (m, 5H, CH₂-CHCH₂); 2,95-3,26 (m, 2H, Cfb-pyridyl); 4,64-4,75 (m, 1H, COCOO); 8,33 (d, 1H, JHH=8,1 Hz, NH); 7,10-8,47 (m, 9H, aromatický); 12,7 (bs, 1H, COOH).

Příklad 3

Stanovení farmakologické aktivity v podmínkách in vitro

a) inhibiční aktivity NEP

Inhibiční aktivita NEP byla stanovována v membránách kůry ledvin potkana albína, připravovaných postupem, popsaným T. Maedou a spoluautory v Biochim. Biophys. Acta 731(1), 115— 120,1983.

Ledviny byly odejmuty samcům potkana albína druhu Sprague-Dawley, jejichž hmotnost činila přibližně 300 g a poté byly uchovávány při teplotě 4 °C.

Ledvinová kůra byla pečlivě oddělena, jemně nakrájena a suspendována v homogenizačním pufru (10 mmol.Γ¹ fosfát sodný o pH 7,4, obsahující 1 mmol.f¹ MgCl2, 30 mmol.f¹ NaCl a 0,02% NaN3) v poměru hmotnosti a objemu 1:15.

Poté byla tkáň za studená 30 sekund homogenizována za použití homogenizéru Ultra-Turrax.

Přibližně 10 ml homogenátu bylo převrstveno na 10 ml sacharózy (41% hmotnost/objem) a odstřeďováno rychlostí 31 200 otáček za minutu (rpm) po dobu 30 minut při 4 °C v pevném úhlovém rotoru.

Membrány byly shromážděny z rozhraní pufru a sacharózy, dvakrát promyty 50 mmol.l¹TRIS/HC1 pufrem (pH 7,4) a opět suspendovány ve stejném pufru pro skladování alikvotních částí při -80 °C až do jejich použití.

Inhibiční aktivita NEP byla stanovována metodou, popsanou C. Lorensem a spoluautory v Eur. J. Pharmacol. 69, 113-116,1981, jak bude uvedeno dále.

Alikvotní části membránové suspenze, připravené tak, jak bylo popsáno dříve (koncentrace bílkovin 5pg/ml) byly preinkubovány v přítomnosti inhibitoru aminopeptidázy (Bestatin 1 mmol.l¹) po dobu 10 minut při teplotě 30 °C.

K získání konečného objemu 100 ul byly přidány r³H][Leu⁵l-enkefalin (lSnmol.l'¹) a pufr TRIS/HC1 pH 7,4 (50 mmol.F¹).

-8CZ 295804 B6

Enzymová reakce byla po 20 minutách inkubace při 30 °C zastavena přídavkem 0,1 mol.F¹ HCI (100 μΐ).

Tvorba metabolitu [³H]Tyr-Gly-Gly byla po oddělení nezreagovaného substrátu chromatografíí na polystyrénových sloupcích (Porapak Q) kvantifikována měřením relativní radioaktivity pomocí kapalinové scintilace.

Procento inhibice tvorby metabolitu v membránových preparátech ovlivněných sloučeninou o vzorci I a srovnávacími sloučeninami, vztažené k neovlivněným membránovým preparátům, bylo vyjádřeno jako hodnota IC₅o (nmolT¹).

b) inhibiční aktivita ACE

Inhibiční aktivita ACE byla stanovována metodou, popsanou v literatuře B. Holmquistem a spoluautory v Analytical Biochemistry 95, 540-548, 1979.

pmol.l'¹ ACE (250mU/ml, purifíkace: králičí plíce, EC 3.4.15.1. SIGMA) bylo preinkubováno s 50 μΐ sloučeniny o vzorci I nebo srovnávací sloučeniny nebo odpovídajícího prostředí v termostatovaných kyvetách při 37 °C.

Reakce byla zahájena přídavkem 500 μΐ 0,8 mmol.F¹ furylakryloylfenylalanylglycylglycinu (FAPGG-SIGMA).

Současně byla, za použití spektrofotometru Beckman DU-50, vybaveného programem pro výpočet delta A/minuty a regresních koeficientů křivek enzymových kinekit, spojitě po dobu 5 minut zaznamenávána absorbance při 340 nm.

Procento inhibice v preparátech inkubovaných se sloučeninami o vzorci I nebo se srovnávacími sloučeninami, vztažené k preparátům, inkubovaným s vehikulem, bylo vyjádřeno jako hodnota IC₅₀ (nmol.f¹).

V následující tabulce 1 autoři uvádějí hodnoty IC₅₀ (nmol.l¹), týkající se aktivity inhibující NEP a aktivity inhibující ACE u sloučenin 4, 5 a 6 a srovnávacích sloučenin Thiorphanu a Kaptoprilu.

Tabulka 1

Inhibiční aktivita ACE a inhibiční aktivita NEP, vyjádřené jako IC₅₀ (nmol.f¹), sloučeniny 4, sloučeniny 5, sloučeniny 6, Thiorphanu a Kaptoprilu.

sloučenina	inhibiční aktivita ACE IC₅₀ (nmol.f¹)	inhibiční aktivita NEP IC₅₀ (nmol.f¹)
4	12	4,7
5	6,5	5,5
6	23	7,1
Thiorphan	99	18
Kaptopril	4,6	neaktivní

Údaje uvedené v Tabulce 1 ukazují, že sloučeniny obecného vzorce I, předmět předkládaného vynálezu, jsou obdařeny významnou duální inhibiční aktivitou ACE/NEP. Uvedená aktivita je výsledně srovnatelná s aktivitou Kaptoprilu, pokud jde o aktivitu inhibující ACE, a s aktivitou Thiorphanu, pokud jde o aktivitu inhibující NEP.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Thiolová sloučenina o vzorci *1

I

R-CH₂-CH-CONH-CH-COOR₂ (I), ch₂-r₃ kde

R je merkaptoskupina nebo skupina R4COS,

R] je přímá nebo větvená C₂-C₄ alkylová skupina nebo arylová či arylalkylová skupina s 1 až 6 uhlíkovými atomy v alkylové skupině, v níž arylem je fenyl nebo pěti či šestičlenný aromatický heterocykl s jedním nebo dvěma heteroatomy, zvolenými z dusíku, kyslíku a síry, volitelně substituovaný jedním nebo více substituenty, totožnými nebo odlišnými, zvolenými z halogenových atomů, hydroxyskupin, alkoxylových skupin, alkylových skupin, alkylthioskupin, alkylsulfonylových nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 6 uhlíkovými atomy v alkylové skupině, C1-C3 alkylových skupin obsahujících jeden či více fluoridových atomů, karboxyskupin, nitroskupin, aminových nebo aminokarbonylových skupin, acylaminoskupin, kde acylová skupina je odvozena od karboxylové kyseliny, zvolené ze skupiny, sestávající z kyseliny octové, propionové, máselné a benzoové, aminosulfonylových skupin, mono- či dialkylaminových nebo mono- či dialkylaminokarbonylových skupin s 1 až 6 uhlíkovými atomy v alkylové skupině;

R₂ je vodíkový atom, přímá nebo větvená Cj-C₄ alkylová skupina nebo benzylová skupina;

R₃ je pěti či šestičetný aromatický heterocyklus s jedním nebo dvěma heteroatomy, zvolenými z dusíku, kyslíku a síry, volitelně substituovaný fenylovou skupinou, přičemž fenyl a heterocyklická skupina jsou volitelně substituované jedním nebo více substituenty, totožnými nebo odlišnými, zvolenými z halogenových atomů, alkylových skupin, alkoxylových skupin, alkylthioskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 3 uhlíkovými atomy v alkylové skupině;

R₄ je přímá nebo větvená Ci-C₄ alkylová skupina nebo fenylová skupina;

uhlíkové atomy označené hvězdičkou jsou stereogenními centry;

a její farmaceuticky přijatelné sole;

za předpokladu, že R₃ není imidazolylovou nebo indolylovou skupinou.
2. Thiolová sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce I, kde R₃ je pěti či šestičetný aromatický heterocykl s jedním nebo dvěma heteroatomy, zvolenými z dusíku, kyslíku a síry.
3. Thiolová sloučenina podle nároku 2 obecného vzorce I, kde R] je fenylalkylová skupina, volitelně substituovaná jedním nebo více substituenty, totožnými nebo odlišnými, zvolenými z halogenových atomů, hydroxylových, alkylových skupin nebo alkoxylových skupin.

-10CZ 295804 B6
4. Thiolová sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce I ve formě sole s alkalickým kovem, zvoleným ze sodíku, lithia a draslíku.
5. Způsob výroby thiolové sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nechá reagovat sloučenina o vzorci II

R_x

I

R-CH₂-CH-COOH (II), *

kde

R a Ri mají významy, uvedené v nároku 1;

a alaninový derivát o vzorci III ★

H₂N-CH-COOR₂ (III), ch₂-r₃ kde R2 a R₃ mají významy, uvedené v nároku 1.
6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, ve směsi s nosičem pro farmaceutické použití.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 pro léčbu kardiovaskulárních onemocnění.
8. Použití sloučeniny podle nároku 1 k výrobě léčiva pro léčbu kardiovaskulárních onemocnění.
9. Methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(4-thiazolyl)alaninu.
10. Methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(2-thienyl)alaninu.
11. Methylester N-(3-fenylkarbonylthio-2-fenylmethylpropionyl)-(2-pyridyl)alaninu.
12. N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(4-thiazolyl)alanin.
13. N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(2-thienyl)alanin.
14. N-(2-fenylmethyl-3-merkaptopropionyl)-(2-pyridyl)alanm.