CZ287370B6

CZ287370B6 - Medicament for reducing formation of amyloidal beta A4 when suffering from Alzheimer's disease

Info

Publication number: CZ287370B6
Application number: CZ19971251A
Authority: CZ
Inventors: Roger Edward Markwell; Julie Hawkins; Carol Wendy Gray
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 2000-11-15
Also published as: NO312055B1; EP0786998A1; NO971899D0; DE69526102T2; SK50497A3; DK0786998T3; HK1002057A1; AU698695B2; BR9509433A; MX9703077A; CN1085529C; CN1170365A; AU3843195A; GB9421472D0; WO1996012486A1; HUT77007A; NO971899L; ATE214926T1; NZ295155A; DE69526102D1

Description

Oblast vynálezu

Vynález se týká použití [R-(Z)]-alfa-(methoxyimino)-alfa-(l-azabicyklo[2,2,2]okt-3-yl)acetonitrilu k podpoření zpracování amyloidního proteinového prekurzoru po ne-amyloidogenní cestě u pacientů, trpících Alzheimerovou nemocí, nebo u pacientů, u nichž je riziko rozvinutí této nemoci.

Dosavadní stav techniky

Amyloidní proteinový prekurzor (APP) představuje integrální membránový glykoprotein, který je možno zpracovat několika způsoby. Proces štěpení beta a gama sekretázami vede v konečném stadiu k uvolnění beta-amyloidního proteinu (βΑ4), který se ukládá v mozku jedinců, trpících Alzheimerovou nemocí (AD). Alternativně rozštěpení alfa-sekretáz vede k uvolnění neamyloidogenních APP-fragmentů. Podle dosavadního stavu techniky bylo zjištěno, že muskarinní agonisty karbachol, bethanechol, AF-102B a xanomelin podporují tvorbu neamyloidogenních APP-fragmentů aktivací ml a/nebo m3 receptorových podtypů (viz Mitsch a kol., 1992, Buxhaum a kol., 1992, 1994, Haringakol, 1994, Growdon 1994).

V patentu EP-A-0392803 (přihlašovatel Beecham Group p.l.c.) se uvádí určité azabicyklické sloučeniny, které podporují acetylcholinovou funkci prostřednictvím působení na muskarinní receptory v centrálním nervovém systému, včetně [R-(Z)]-a-(methoxyimino)-a-(l-azabicyklo[2,2,2]-okt-3-yl)acetonitrilu (sloučenina vzorce I), a farmaceuticky přijatelných solí, a postup přípravy, vedoucí k získání těchto sloučenin.

V mezinárodní patentové přihlášce WO-93/17018 se uvádí alternativní postupy přípravy uvedených sloučenin obecného vzorce I.

Podstata vynálezu

Podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že sloučenina obecného vzorce I podporuje zpracovávání amyloidního proteinového rekurzoru po ne-amyloidogenní cestě, a z tohoto důvodu je tato sloučenina potenciálně použitelná k léčení Alzheimerovy nemoci snižováním tvorby βΑ4.

Vzhledem k výše uvedenému se tedy předmětný vynález týká použití sloučeniny vzorce I, [R(Z)-alfa-(methoxyimino)-alfa-(l-azabicyklo[2,2,2]okt-3-yl)-acetonitrilu, nebo farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny, pro přípravu léčiva pro podporování zpracovávání amyloidního proteinového prekurzoru po ne-amyloidogenní cestě u pacientů, trpících Alzheimerovou nemocí, nebo u nichž je riziko rozvinutí Alzheimerovy nemoci. Vynález se dále týká použití sloučeniny obecného vzorce I nebo farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny, pro léčení nebo profylaxi Alzheimerovy nemoci snížením tvorby βΑ4.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je uvedenou farmaceuticky přijatelnou solí monohydrochlorid.

Při použití podle vynálezu dochází k podporování zpracovávání amyloidního proteinového prekurzoru po ne-amyloidogenní cestě u pacientů, postižených Alzheimerovou nemocí, nebo u lidí s rizikem rozvinutí Alzheimerovy nemoci, přičemž se při tomto ošetřování podává pacientům účinné množství sloučeniny obecného vzorce I nebo farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny. Při léčení nebo profylaxi Alzheimerovy nemoci snižování tvorby

-1 CZ 287370 B6 βΑ4 se pacientům, trpícím Alzheimerovou nemocí, nebo lidem s rizikem vyvinutí Alzheimerovy nemoci podává účinné netoxické množství sloučeniny vzorce I nebo farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny.

Sloučenina vzorce I může tvořit adiční soli se silnými kyselinami. Do rozsahu termínu farmaceuticky přijatelná sůl náleží solváty a hydráty.

Sloučenina vzorce I je výhodně k dispozici ve formě farmaceutického prostředku, který obsahuje tuto sloučeninu vzorce I nebo farmaceuticky přijatelnou sůl, odvozenou od této sloučeniny, a farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku.

Tento prostředek může být ve formě tablet, kapslí, prášku, granulí, pastilek, čípků, rekonstituovatelných prášků nebo kapalných přípravků, jako jsou například perorální nebo sterilní parenterální roztoky nebo suspenze.

Za účelem získání formy vhodné pro podávání je výhodné formulovat tento prostředek jako jednotkovou dávkovou formu.

Touto jednotkovou dávkovou formou, vhodnou pro perorální podávání, mohou být například tablety a kapsle, přičemž tyto formy mohou obsahovat běžně používané excipienty, jako jsou například pojivová činidla, například sirup, akácie, želatina, sorbitol, tragakant nebo polyvinylpyrrolidon, dále plniva, jako je například laktóza, cukr, kukuřičný škrob, fosforečnan vápenatý, sorbitol nebo glycin, dále tabletační maziva (neboli kluzné prostředky), jako je například stearát hořečnatý, dále dezintegrační činidla, jako je například škrob, polyvinylpyrrolidon, sodná sůl škrobového glykolátu nebo mikrokrystalická celulóza, nebo farmaceuticky přijatelná smáčecí činidla, jako je například laurylsulfát sodný.

Tyto perorální prostředky v pevné formě je možno připravit obvyklými metodami, známými a používanými podle dosavadního stavu techniky, jako je smíchávání, plnění, tabletování a podobně. Opakované promíchávání je možno použít v těchto případech, kdy je nutno distribuovat účinnou látku v celém prostředku, kdy se používá velkých množství plniva. Rovněž i tyto operace patří k běžně používaným postupům podle dosavadního stavu techniky. Tyto tablety je rovněž možno samozřejmě opatřit povlakem, přičemž při tomto postupu se opět použije metod, všeobecně známých a používaných podle dosavadního stavu techniky, zejména se to týká enterosolventních povlaků.

Perorální kapalné prostředky mohou mít formu například emulzí, sirupů nebo elixírů, nebo je možno připravit ve formě suchých produktů, které se potom před použitím rozředí vodou nebo jiným vhodným vehikulem. Tyto kapalné přípravky mohou obsahovat běžně používaná aditiva, jako je například suspendační činidla, například sorbitol, sirup, methylcelulóza, želatina, hydroxyethylcelulóza, karboxymethylcelulóza, gel na bázi stearátu hlinitého nebo hydrogenované jedlé oleje, emulgační činidla, jako je například lecithin, sorbitanmonooleát nebo akácie, dále nevodná vehikula (která mohou zahrnovat jedlé oleje), například mandlový olej, frakční destilací zpracovaný kokosový olej, estery olejů, jako je například estery glycerinu, propylenglykolu nebo ethylalkoholu, dále konzervační přísady, jako je například methylester nebo propylester kyseliny p-hydroxybenzoové nebo kyseliny sorbové, a kromě toho v případě potřeby i běžně používané aromatizační nebo barvicí prostředky.

Pro parenterálního podávání se připravuje rovněž kapalná jednotková dávková forma, přičemž se při této přípravě použije vhodná účinná sloučenina a sterilní vehikulum. Tato sloučenina může být podle použitého vehikula a požadované koncentrace buďto suspendována nebo rozpuštěna v tomto vehikulu. Při přípravě roztoků pro parenterální podávání je možno tuto účinnou sloučeninu rozpustit ve vodě pro injekce a před plněním do vhodných ampulí a zapečetěním tyto roztoky sterilizovat zfíltrováním. Ve výhodném provedení podle uvedeného vynálezu je možno v tomto vehikulu rozpustit taková činidla, jako jsou lokální anestetika, konzervační přísady

-2CZ 287370 B6 a tlumicí činidla. Ke zvýšení stability je možno tyto prostředky zmrazit po naplnění do zkumavek a vodu odstranit za sníženého tlaku. Parenterální suspenze se připraví v podstatě stejným způsobem s tím rozdílem, že se účinná sloučenina suspenduje v použitém vehikulu místo toho, aby byla rozpuštěna, přičemž sterilizaci není možno provést filtrací. Tato sloučenina se sterilizuje vystavením působení ethylenoxidu před suspendováním ve sterilním vehikulu. Ve výhodném provedení se do prostředku podle uvedeného vynálezu vpraví povrchově aktivní látka nebo smáčecí činidlo k usnadnění rovnoměrného rozdělení sloučeniny.

Prostředek podle předmětného vynálezu může obsahovat 0,1 % až 99% hmotnostních účinné látky, ve výhodném provedení 10 % až 60 % hmotnostních účinné látky, což závisí na způsobu podávání.

Vynález se kromě toho dále týká farmaceutického prostředku, který byl definován výše, který je určen k použití pro podporování zpracovávání amyloidního proteinového prekurzoru po neamyloidogenní cestě u pacientů, trpících Alzheimerovou nemocí nebo s rizikem vzniku Alzheimerovy nemoci. Do rozsahu předmětného vynálezu dále náleží farmaceutický prostředek, který byl definován výše, pro léčení a/nebo profylaxi Alzheimerovy nemoci snižováním tvorby βΑ4.

Dávka aplikované sloučeniny se mění obvyklým způsobem v závislosti na vážnosti poruchy, na hmotnosti postiženého pacienta a na relativní účinnosti použité sloučeniny. Ovšem jako obecné vodítko k určení vhodné dávky je možno uvést, že tato dávka se může pohybovat v rozmezí od 5 do 300 pg, například v rozmezí od 10 do 200 pg, přičemž toto dávkové množství se může podávat víckrát než jednou denně, například dvakrát nebo třikrát denně, tak aby se celková denní dávka pohybovala v rozmezí od asi 30 pg do asi 600 pg, a tato terapie se může provádět po řadu roků.

V případě použití výše uvedených rozmezí dávkovaných množství nebyly zaznamenány žádné nepřijatelné toxikologické účinky v případě sloučeniny vzorce I.

V dalším jsou uvedeny farmakologické testy a výsledky těchto testů, ilustrujících předmětný vynález.

Farmakologické testy

Zpracovávání amyloidního proteinového prekurzoru za použití CHO buněk

Při tomto testu byl zkoumán účinek testované sloučeniny na APP zpracovávání v případě buněk vaječníku čínského křečka (CHO buňky), transferovaných lidskými muskarinními receptory, přičemž bylo použito metody „ Western blotting“. Skvrny byly kvantifikovány za použití laserového hustoměru na skanování imunoreaktivních pásů.

Použité materiály

Použity byly CHO buňky stabilně transfekované lidskými muskarinními receptory (Bonner 1988), které byly získány od firmy N.I.M.H. (Md. USA). Tkáňové kultivační médium a reakční činidla byla získána od firmy Gibco BRL (Skotsko). Obvykle používaná laboratorní činidla byla použita od firmy Sigma Chemical Co. (Dorset). Sloučenina monochlorid [R-(Z)]-a-(methoxyimino)-a-(l-azabicyklo[2,2,2]okt-3-yl)acetonitrilu je popisována v patentu EP-A-0392803 ve formě oxalátové soli.

K provedení testu byly použity následující protilátky: 22C11 myší monoklonální protilátky (Boehringer Mannheim Sussex, Velká Británie), která rozpoznává amino-terminální epitop APP (Weidemann a kol., 1989); anti 4βΑ4 1-25 králičí polyklonální protilátka, působící proti kiysímu

-3CZ 287370 B6 βΑ4 1-25; Ab54 králičí polyklonální protilátka, působící proti karboxy-terminálnímu epitopu APP (aminokyseliny 751-770 v APP770).

Sekundárními protilátkami byly anti-králičí a anti-myší IgG (Sigma Chem. Co., Dorset, Velká Británie) po králičí nebo myší peroxidáze/anti peroxidáze (PAP) (Sigma Chem. Co., Dorset, Velká Británie). Použitým substrátem byl zvětšený chemoluminiscenční kit (ECL) (RPN 2106), (Amersham Bucks, Velká Británie) a imunoreaktivní pásy byly určovány pomocí HyperfilmECL (Amersham, Bucks, Velká Británie).

Použití metody

Buněčná kultura

CHO buňky, transfekované lidskými muskarinními receptorovými podtypy hml, hm2, hm3 a hm4, byly pěstovány do spojené formy na tkáňových kultivačních miskách (v průběhu 10 centimetrů) v α-minimálním esenciálním médiu (aMEM) s ribonukleosidy a deoxyribonukleosidy, 10% fetálním kravským sérem, penicilinem 100 jednotek/mililitr a streptomycinem 100 pg/mililitr.

Zpracování buněk testovanou sloučeninou

Buňky byly pěstovány do spojení, jak bylo uvedeno výše, načež bylo médium, obsahující sérum, odstraněno a potom následovalo promytí buněk dvakrát v 5 mililitrech média, neobsahujícího sérum. Tyto buňky byly potom ošetřeny 5 mililitry média, neobsahujícího sérum a obsahujícího vhodnou koncentraci testované sloučeniny, přičemž inkubování bylo provedeno při teplotě 37 °C po dobu tří dnů.

Kondicionované médium bylo shromážděno a umístěno na led, přičemž byly přidány inhibitory proteázy (1 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 5 mM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), 1 pg/mililitr leupeptinu). Tato média byla potom odstřeďována po dobu 15 minut při 3000 G a teplotě 4 °C za účelem odstranění zbytků buněk. Supematant byl odstraněn a stokrát zkoncentrován za použití 10 koncentrátorů Centricon (Amicon, Gloucestershire, Velká Británie) odstřeďováním při 3000 G po dobu 90 minut při teplotě 4 °C. Zadržený podíl byl shromážděn a uchováván ve formě alikvotních podílů při teplotě -20 °C do stavu vhodného pro elektroforézu.

Tyto buňky byly dvakrát promyty 50 mililitry média, neobsahujícího sérum, setřeny a odstřeďovány po dobu 5 minut při 3000 G a při teplotě 4 °C za účelem získání pelet z buněk. Kapalina nad usazeninou byla odstraněna a pelety z buněk byly resuspendovány v šestinásobném objemu lyzového pufru (0,1 M Tris pH 7,5 obsahující 1 % Triton XI00, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 pg/ml leupeptinu). Lyzát byl udržován na ledu po dobu 30 minut za přerušovaného promíchávání, načež následovalo odstřeďování, prováděné po dobu 5 minut při 10 000 G a při teplotě 4 °C za účelem odstranění buněčných zbytků. Supematant byl oddělen a uchováván v alikvotních podílech při teplotě -20 °C do stavu, vhodného pro elektroforézu.

Proteinový test

Buněčný lyzát a koncentrované vzorky kultivačního média byly testovány na protein před provedením gelové elektroforézy k zajištění ekvivalentního proteinového zatížení mezi zpracováními na gelu. Proteiny byly stanoveny za pomoci Bradfordova testu na vázání barviva (Bradford, 1976) a za použití Bio-Rad barvivového reakčního koncentrátu (Herts, Velká Británie). Tento test byl proveden na mikrotitračním platu s odečtem absorbance při 590 nm a za použití snímače plata s odpovídajícím softwarem Titretek Multiskan Plus MklI k analyzování získaných výsledků. Vzhledem ktomu, že různá reakční činidla, zejména detergenty, ruší provádění tohoto Brandfordova testu, byly kalibrace prováděny ve vhodném vehikulu vzorků.

-4CZ 287370 B6

SDS-PAGE

Proteiny byly fraktionovány za použití mini-gelového systému Novex (R & D Systems Europe Ltd, Oxon, Velká Británie). Použita byla ekvivalentní množství proteinu k porovnání výsledků mezi jednotlivými zpracováními na stejném gelu. Vzorky byly zředěny ve dvojnásobném redukčním vzorku pufru, obsahujícím 0,1 M Tris o pH 6,8, 10% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,1 % bromfenolové modři v glycerolu a 50 % β-merkaptoethanolu. Proteiny byly oddělovány na 6 % Tris-glycin-polyakrylamidovém gelu, obsahujícím SDS (Laemmli, 1970), po dobu 90 minut při 100 voltech. Použití byly rovněž proteinové standardy o známé molekulové hmotnosti (Sigma).

Analýza „Western Blot“

Po SDS-PAGE byly gely promývány po dobu 20 minut v transferovém pufru, obsahujícím 2,5 mM Tris, 19,2 mM glycinu, 20 % methanolu o pH 8,3. Proteiny byly převedeny z gelu na Immobilon P Polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu (Millipore, Herts, Velká Británie) za použití Bio-rad polo-suchého systému, což bylo prováděno 2 hodiny při 0,8 mA/cm². Po převedení byly proteiny vizualizovány na membráně vyvoláním skvrny za použití 10% roztoku Ponceau S (Sigma), což bylo prováděno po dobu 2 minut. Tyto skvrny byly odstraněny opláchnutím destilovanou vodou.

Tato membrána byla blokována pomocí slaného roztoku s fosforečnanem jako pufrem (PBS), obsahujícím 0,1 % Twen 20 a 5 % sušeného mléka ve formě prášku, což bylo prováděno po dobu přinejmenším 1 hodiny při teplotě místnosti. Potom následovalo dvakrát prováděné promytí v PBS, obsahujícím 0,1 % Tween 20 (PBST) a potom byly primární protilátky inkubovány po dobu přes noc při teplotě 4 °C. Všechny tyto protilátky byly připraveny v PBST, obsahujícím 2 % bovinního sérového albuminu (Sigma). Membrány byly promývány v PBST po dobu 1 minuty, načež následovalo promývání po dobu pěti minut, což bylo prováděno dvakrát. Sekundární protilátky, proti-myší a proti—králičí IgG (Sigma), byly přidávány při odpovídajícím zředění 1/3000 nebo 1/5000 po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Membrány byly promyty stejným způsobem, jako bylo uvedeno shora, načež byla myší nebo králičí peroxidáza/antiperoxidáza (Sigma) přidávána při zředění 1/3000 po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Finální promývací stupeň byl proveden pouze v PBS, načež byly membrány převedeny do čisté misky k dodání ECL substrátu (Amersham). Imunoreaktivní pásy byly stanoveny pomocí Hyperfilm-ECL (Amersham), přičemž vyvolání bylo provedeno automatickým procesorem (Kodak).

Analýzy provedené hustoměrem

Změny úrovně APP byly měřeny za použití laserového hustoměru. Imunoreaktivní APP pásy byly skanovány za použití Pharmacia LKB Ultrascan XL, napojeného na počítač se softwarem Gelscan XI ke zpracovávání dat. Laserový paprsek, který prošel vzorkem a množství transmitovaného světla bylo měřeno fotodiodou, čímž byla stanovena úroveň absorbce. Hodnoty absorbance byly integrovány, čímž byly zjištěny hodnoty, týkající se plochy pod křivkou. Výsledky pro vehikulum a pro testovanou sloučeninu jsou vyjádřeny jako střední hodnota ze experimentů ± standardní odchylka od střední hodnoty (SEM).

Testy na ligandové vazby provedené in vitro

Cerebrální kontex byl oddělen od samečků krys Hooded Lister (Olac, Velká Británie) a přemístěn do 2,5 objemu (v porovnání s hmotností za vlhka) na ledu ochlazeného 50 mM tris o pH 7,7. Tento podíl byl potom homogenizován a odstřeďován při 24 000 G po dobu 15 minut při teplotě °C. Získaná peleta byla resuspendována ve 2,5 objemu a potom byly homogenáty uchovávány v 1 mililitru alikvotních podílů při teplotě -20 °C až do doby, kdy byly použity pro další účely.

-5CZ 287370 B6

Inkubace pro stanovení [³H]-OXO-M vazeb byly připraveny v celkovém objemu 2 mililitry ledově chladného 50 mM tris, obsahujícího 2 mM chloridu hořečnatého. Tento [³H]-OXO-M acetát (New England Nuclear, specifická aktivita 87 Ci/mmol) byl přidáván až do dosažení koncentrace 1,88 nM. Kortexový homogenát měl finální koncentraci 300 objemů, vztaženo na původní vlhkou hmotnost (ekvivalent 0,145 miligramů proteinu/mililitr). Nespecifické vazby byly definovány za použití 10 mikromolámího (μΜ) seskvifumarátu oxotremorinu. Inkubace byly prováděny do rovnovážného stavu při teplotě 37 °C po dobu rozmezí od 30 do 45 minut. Vzorky byly potom zfiltrovány pomocí filtrů Watman GF/B, které byly předem podrobeny nasakování po dobu 30 minut v 0,05% vodném roztoku polyethyleniminu k zabránění absorpce [³H]-OXO-M na skleněná vlákna.

Test na [³H]-QNB (specifická aktivita 44 Ci/mmol, finální koncentrace 0,27 nM) vazby byl proveden stejným způsobem, jako bylo provedeno výše s tím rozdílem, že nebyl použit chlorid hořečnatý a zředění homogenátu bylo zvýšeno na 1500 objemů (7,8 pg proteinu/mililitr). Nespecifické vazby byly definovány za pomoci 1 pM sulfátu atropinu.

Hodnoty, týkající se vazeb v případě uvedené testované sloučeniny, jsou uvedeny v následující tabulce 5.

Výsledky

Za použití výše uvedených metod byl zjištěn účinek testované sloučeniny, monohydrochloridu sloučeniny vzorce I, na zpracovávání amyloidního proteinového prekurzoru.

Celková délka APP s molekulovou hmotností 108 kD a dvěma pásy secemovaného APP s molekulovými hmotnostmi 108 kD a 118 kD byly zjištěny ve všech transfekovaných CHO buňkách.

CHOhml

Celková délka APP v buněčné membráně byla snížena účinkem monohydrochloridu sloučeniny I v rozsahu dávky 10'⁶ až W⁴ M po 3 hodinách zpracovávání. V kultivačním médiu bylo účinkem testované sloučeniny zvýšeno množství secemovaného APP 6 až 10-ti násobně v porovnání s koncentračním rozsahem (tabulka 1).

CHOhm2

Nenastala žádná změna v celkové délce APP v buněčné membráně, ovšem secemované APP se dvakrát zvýšilo v kultivačním médiu po zpracování za pomoci 1 x 10⁴ M monohydrochloridu sloučeniny I po 3 hodinách (tabulka 2).

CHOhm3

Celková délka APP v buněčné membráně se snížila účinkem monohydrochloridu sloučeniny I v rozsahu dávky 10’⁶ až 10^-4 M po 3 hodinovém zpracovávání. V kultivačním médiu se účinkem testované sloučeniny zvýšilo množství secemovaného APP přibližně na 20-ti násobek v porovnání s koncentračním rozsahem (tabulka 3).

CHOhm4

Nebyla zaznamenána žádná změna, pokud se týče celkové délky APP v buněčné membráně nebo pokud se týče secemovaného APP v kultivačním médiu po zpracování za použití 1 x ÍO^M monohydrochloridu sloučeniny I po 3 hodinách (tabulka 4).

-6CZ 287370 B6

Testy na ligandové vazby

Hodnoty, týkající se ligandových vazeb (tabulka 5), ukazují, že monohydrochlorid sloučeniny I vykazuje QNB/OXO-M poměr 22, což naznačuje na vlastnosti částečného aganisty (Brown a kol. 1988).

Závěr

Účinkem monohydrochloridu sloučeniny I se dosáhne změny zpracovávání APP stimulací ml a m3 receptorových podtypů. Ze zvýšeného uvolňování secemovaného APP, což je možno zjistit zejména pomocí βΑ4 1-25 protilátký (není rozpoznáván APP rozštěpený β-sekretázou), je zcela zřetelné, že proces probíhá ne-amyloidogenní cestou.

Z výše uvedeného je patrné, že monohydrochlorid sloučeniny I má potenciální využitelnost pro léčení Alzheimerovy nemoci snižováním tvorby βΑ4 v mozku jako výsledek ne-amyloidogenního zpracovávání APP.

Odkazy:

- Bonner, T (1988), NIH patent, č. PB89-125652, patentová přihláška US Appl-7-241 791, podaná 8.9.1988.

-Brodford, M. (1976) Anal Biochem., 72, 248-254, Brown, F., Clark, M. GravesD., Hatcher, J., McArthur, R. Riley, G. aSempleJ. (1988) Drug Dev Res, 14, 343-347,

- Buxbaum, J. D., Oishi, M., Chen, Η. I., Pinkas-Kramarski, R., R. Jaffe, E.A., Gandy, E.e. a Greengard, P. (1992) Proč. Nati. Acad., Sci., 89, 10075-10078,

- Buxbaum, J.D., Fuefli, A.A., Parker,C.A., Cypress, A.M. a Greengard, P. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci., 91, 4489-4493,

- Growdon, J.H. (1994), „Muscarinic agonists: Effects on APP processing 4^th International Meeting on Alzheimer's Disease, Minneapolis, červenec 1994,

- Haring, R., Gurwith, D., Barg, J., Pinkas-Kramarski, R, Heldman, E., Pittel, Z., Wengier, A., Meshulam, H, Marciano, D., Karton, Y, a Fisher, A. (1994) Biochem. Biophys. Res. Momm. 203(1), 652-658,

-Nitsh, R.M., Slack, B.E., Wurtman, Rj. a Growdon, J.H. (1992) Science, 258. 304-307,

- Weidemann, A., Konig, G. Bunke, D. Fischer, P., Salbaum, J.M., Masters, C.L. a Beyreuther, K. (1989), Cell, 57, 115-126.

Vysvětlivky k tabulkám:

Tabulka 1 - CHOhml dávková odezvy

Výsledky představují střední hodnoty tří experimentů a jsou vyjádřeny jako změny od kontrolní APP úrovně. (1-násobné zvýšení secemovaného APP = žádná změna od základní úrovně). Použitými protilátkami byly Ab54 v buněčných lyzátech ke zjištění celkové délky APP a 22C11 ke zjištění secemovaného APP.

-7CZ 287370 B6

Tabulka 2 - CHOhm2 odezva

Použité protilátky byly stejné jako v případě tabulky 1. Výsledky představují průměrné hodnoty ze tří experimentů a jsou vyjádřeny jako změny od kontrolní úrovně APP (1-násobné zvýšení secemovaného APP = žádná změna od základní úrovně).

Tabulka 3 - CH0hm3 dávková odezva

Použitými protilátkami byly Ab54 v buněčných lyzátech ke zjištění celkové délky APP a anti βΑ4 1-25 ke zjištění secemovaného APP. Experimenty byly prováděny třikrát. Výsledky představují průměrné hodnoty ze tří experimentů a jsou vyjádřeny jako změny od kontrolní úrovně APP (1-násobné zvýšení secemovaného APP = žádná změna od základní úrovně).

Tabulka 4 - CHOhm4 odezva

Použité protilátky byly stejné jako v případě tabulky 3. Výsledky představují průměrné hodnoty ze tří experimentů a jsou vyjádřeny jako změny do kontrolní úrovně APP (1-násobné zvýšení secemovaného APP = žádná změna od základní úrovně).

Tabulka 5 - Hodnoty týkající se ligandových vazeb při použití sloučeniny vzorce I

	[³H]-OXO-M IC50	[³H]-QNB IC50	QNB/OXO-M
Sloučenina vzorce I*	14	309	22

* monohydrochlorid,

OXO-M = oxotremorin-M, agonistový ligand,

QNB = chinuklidinylbenzilat, agonistový ligand,

QNB/OXO-M poměr je vodítkem pro vyjádření funkční účinnosti uvedené sloučeniny. Poměr větší než 100 se vztahuje na plné agonisty, antagonisty mají poměry blíže jednotce a mezilehlé hodnoty znamenají částečné agonisty.

Tabulka 1

CHOhml dávková odezva

	Hustota skvrny (AUC mm²) (±SEM)	Průměrné % snížení celkové délky APP	Hustota skvrny (AUC mm²) (±SEM)	Průměrný násobek zvýšení secemovaného APP
Kontrolní
sloučenina	23,74±6,84		2,29+1,21
Sloučenina I*
lxlO^M	14,03 ±7,27	40,9	17,54+9,78	7,7
1x10'⁵M	12,32±5,91	48,1	14,48+7,25	6,3
lxl O’⁶ M	16,84±7,20	29,1	24,2±11,61	10,6

* monohydrochlorid.

-8CZ 287370 B6

Tabulka 2

CHOhm2 odezva

	Hustota skvrny (AUC mm²) (±SEM)	Průměrné % snížení celkové délky APP	Hustota skvrny (AUC mm²) (+SEM)	Průměrný násobek zvýšení secemovaného APP
Kontrolní sloučenina	12,61+1,0		2,74+0,55
Sloučenina I* lxlO^M	12,04+2,56	4,5	5,75+1,60	2,1

* monohydrochlorid.

Tabulka 3

CHOhm3 dávková odezva

	Hustota skvrny (AUC mm²) (+SEM)	Průměrné % snížení celkové délky APP	Hustota skvrny (AUC mm²) (+SEM)	Průměrný násobek zvýšení secemovaného APP
Kontrolní
sloučenina	23,06+3,78		0,85+0,18
Sloučenina I*
1x10⁴M	4,95+1,14	78,5	15,81+7,87	18,6
1x10'⁵M	5,51+1,18	76,1	15,60+2,27	18,4
lxl O’⁶ M	7,46+3,36	67,7	16,33+5,37	19,2

* monohydrochlorid.

Tabulka 4

CHOhm 4 odezva

	Hustota skvrny (AUC mm²) (+SEM)	Průměrné % snížení celkové délky APP	Hustota skvrny (AUC mm²) (+SEM)	Průměrný násobek zvýšení secemovaného APP
Kontrolní sloučenina	25,24+0,68		20,80+4,42
Sloučenina I* lxlO^M	24,62+0,94	2,5	22,59+10,28	1,1

* monohydrochlorid.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití [R-(Z)]-a-(methoxyimino)-a-(l-azabicyklo[2,2,2]okt-3-yl)acetonitrilu nebo farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny, pro přípravu léčiva pro zlepšení zpracovávání amyloidního proteinového prekurzoru po ne-amyloidogenní cestě u pacientů, trpících Alzheimerovou nemocí, nebo u pacientů, u nichž je riziko rozvinutí Alzheimerovy nemoci.
2. Použití [R-(Z)]-a-(methoxyimino)-a-(l-azabicyklo[2,2,2]okt-3-yl)acetonitrilu nebo farmaceuticky přijatelné soli, odvozené od této sloučeniny, pro přípravu léčiva k léčení nebo profylaxi Alzheimerovy nemoci snížením tvorby βΑ4.
3. Použití podle některého z předcházejících nároků, kde farmaceuticky přijatelnou solí je monohydrochlorid.