HUT77007A

HUT77007A - Az {[R-(Z)-alfa-(metoxi-imino)-alfa-(1-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril alkalmazása az amiloid bétaA4 képződésének csökkentésére Alzheimer-kórban

Info

Publication number: HUT77007A
Application number: HU9701815A
Authority: HU
Inventors: Carol Wendy Gray; Julie Hawkins; Roger Edward Markwell
Original assignee: Smithkline Beecham Plc.
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 1998-03-02
Also published as: HK1002057A1; AU3843195A; NZ295155A; GB9421472D0; CN1085529C; ES2173977T3; ZA958946B; NO971899L; DE69526102T2; NO971899D0; BG101500A; BR9509433A; ATE214926T1; KR100393365B1; DK0786998T3; EP0786998A1; CZ125197A3; EP0786998B1; CN1170365A; KR970706816A

Description

A találmány Alzheimer-kórban szenvedő betegekben az amiloid prekurzor protein nem-amiloidogén úton történő képződésének fokozására szolgáló, {[R-(F)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilt tartalmazó gyógyszerkészítményre vonatkozik.

Az amiloid prekurzor protein (APP) egy olyan, integrális membrán glikoprotein, amely többféle úton is képződhet. A β- és γ-szekretázokkal történő hasítás végül β-amiloid protein (βΑ4) felszabadulásához vezet; a βΑ4 lerakódik az Alzheimer-kórban (Alzheimer’s disease; AD) szenvedő betegek agyában. Az a-szekretáz által történő alternatív hasítás nem-amiloidogén APP fragmentumok szabaddá válását eredményezi. A muszkarin agonista carbacholról, bethanecholról, AF-102B-ről és xanomeline-ről bebizonyították, hogy az ml és/vagy m3 receptor altípusok aktiválása útján fokozzák a nem-amiloidogén APP fragmentumok képződését [Nitsch, R. M., Slack, Β. E., Wurtman, R. J., and Growdon,

J. H., Science, 258, 304-307 (1992); Buxbaum, J. D., Oishi, M.,

Chen, Η. I., Pinkas-Kramarski, R., Jaffe, E. A., Gandy, S. E., and Greengard, P., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 10075-10078 (1992); Haring, R., Gurwitz, D., Barg, J., Pinkas-Kramarski,

R., Heldman, E., Pittel, Z., Wengier, A., Meshulam, H., Marciano, D., Karton, Y., and Fisher, A., Biochem. Biophys. Rés. Commun ., 203 (1), 652-658 (1994); Growdon, J. H., Muscarinic agonists: Effects on APP processing, 4th International Meeting on

Alzheimer's Disease, Minneapolis, July 1994].

A 0 392 803. számú európai szabadalmi bejelentés olyan, aza-biciklusos vegyületeket ismertet, amelyek a központi idegV rendszerben lévő muszkarin receptorok aktiválása útján fokozzák az acetil-kolin-funkciót; a fenti szabadalmi bejelentés leírja — egyebek mellett — az {[A-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilt és gyógyszerészetileg elfogadható sóit, valamint az említett vegyületek előállítási eljárásait is.

A WO 93/17018. számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés az { [A-(Z) ]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril alternatív előállítási eljárásait ismerteti.

Felismertük, hogy az {[A-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril nem-amiloidogén úton fokozza az amiloid prekurzor protein képződését, és így a vegyület a βΑ4 termelés csökkentése révén felhasználható az Alzheimer-kór kezelésére.

A találmány egyik tárgya az { [A-(Z) ]-a-(metoxi-imino)-cc-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilnek vagy egy gyógyszerészetileg elfogadható sójának felhasználása Alzheimer-kórban szenvedő vagy az Alzheimer-kór kifejlődésével fenyegetett betegekben az amiloid prekurzor protein nem-amiloidogén úton történő képződésének fokozására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi az { [A— (Z) ]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilnek vagy egy gyógyszerészetileg elfogadható sójának a felhasználása az Alzheimer-kórnak a βΑ4 termelés csökkentése révén történő kezelésére és/vagy megelőzésére.

A találmánynak egy további tárgya eljárás Alzheimer-kórban szenvedő vagy az Alzheimer-kór kifejlődésével fenyegetett betegekben az amiloid prekurzor protein nem-amiloidogén úton történő képződésének fokozására, amelynek során a betegnek beadjuk az {[A-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril vagy egy gyógyszerészetileg elfogadható sójának hatásos, nemtoxikus mennyiségét. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás Alzheimer-kórban szenvedő vagy az Alzheimer-kór kifejlődésével fenyegetett betegekben az Alzheimer-kórnak a βΑ4 termelés csökkentése révén kezelésére és/vagy megelőzésére, amelynek során a betegnek beadjuk az {[A-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril vagy egy gyógyszerészetileg elfogadható sójának hatásos, nemtoxikus mennyiségét.

Az {[A-(Z) ]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-bicikló[2.2.2]oktil )} -acetonitril erős savakkal savaddíciós sókat képezhet. A gyógyszerészetileg elfogadható só kifejezés magában foglalja a szolvátokat és hidrátokat is.

Az {[A-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil) [-acetonitrilt előnyösen gyógyszerkészítménnyé formáljuk, amely gyógyszerkészítmény egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval kombinálva az {[A-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilt vagy ennek egy gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazza.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények például tabletták, kapszulák, porok, granulák, gyógycukorkák, kúpok, helyreállítható porok, illetve folyékony készítményformákban, például orális vagy steril, parenterális oldatok vagy szuszpenziók fórmájában lehetnek.

A beadás egyenletességének biztosítása érdekében a kompozíciókat előnyösen egységdózisokká formáljuk.

Az orális beadásra szolgáló egységdózisformák például tabletták és kapszulák lehetnek, amelyek hagyományos vivőanyagokat tartalmazhatnak; ilyenek — egyebek mellett — például a következők: kötőanyagok, például cukorszirup, akácmézga, zselatin, szorbit, tragakantmézga vagy poli(vinil-pirrolidon); töltőanyagok, például laktóz, szacharóz, kukoricakeményítő, kalcium-foszfát, szorbit vagy glicin; tablettázó síkosítóanyagok, például magnézium-sztearát; szétesést elősegítő szerek, például keményítő, poli(vinil-pirrolidon), nátrium-keményítő-glikolát vagy mikrokristályos cellulóz; vagy gyógyszerészetileg elfogadható nedvesítőszerek, például nátrium-lauril-szulfát.

Az orális beadásra szolgáló szilárd készítményeket hagyományos keverési, töltési, tablettázási stb. eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő. Nagyobb mennyiségű töltőanyagok felhasználása esetén ismételt keverési műveleteket alkalmazhatunk a hatóanyag egyenletes eloszlása érdekében. Az ilyen műveletek természetesen jól ismertek a szakterületen. A tablettákat a szokásos gyógyszerészeti gyakorlatban jól ismert eljárásoknak megfelelően bevonattal, különösen bélben oldódó bevonattal is elláthatjuk.

Az orális beadásra szolgáló folyékony készítmények például emulziók, szirupok vagy elixírek lehetnek, illetve az ilyen kompozíciókat előállíthatjuk olyan, száraz termékek formájában is, amelyekből a felhasználás előtt víz vagy más alkalmas vivő-

• · β

anyag hozzáadásával állíthatjuk elő a kívánt készítményformát. Az ilyen folyékony készítmények szokásos adalékanyagokat, így szuszpendálószereket, például szorbitot, szirupot, metil-cellulózt, zselatint, (hidroxi—etil)-cellulózt, (karboxi-metil)-cellulózt, alumínium-sztearát-gélt vagy hidrogénezett ehető zsírokat, emulgeálószereket, például lecitint, szorbitán-monooleátot vagy akácmézgát,· nemvizes vivőanyagokat (köztük ehető olajokat), például mandulaolajat, frakcionált kókuszdióolajat, olajos észtereket, például glicerin-, propilénglikol- vagy etanolésztereket; tartósítószereket, például metil- vagy propil-p-hidroxi-benzoátot vagy szorbinsavat; továbbá kívánt esetben hagyományos ízesítőszereket vagy színezőszereket tartalmazhatnak .

A parenterális beadásra szolgáló folyékony egységdózisformák egy találmány szerinti vegyületet és egy steril vivőanyagot tartalmaznak. A vivőanyagtól és a koncentrációtól függően a vegyület szuszpendált vagy oldott formában lehet. A parenterális oldatokat szokásosan úgy állítjuk elő, hogy a hatóanyagot feloldjuk egy vivőanyagban, az oldatot szűréssel sterilizáljuk, majd alkalmas fiolákba vagy ampullákba töltjük, végül a tárolóedényeket lezárjuk.

A vivőanyagban előnyösen adjuvánsokat, például egy helyi érzéstelenítőt, tartósítószereket és pufferanyagokat is feloldunk. A stabilitás fokozása érdekében a fiolába történő betöltés után a készítményt lefagyaszthatjuk, majd a kompozícióból a vizet vákuum alatt eltávolíthatjuk.

A parenterális beadásra szolgáló szuszpenziókat lényegében ··· · • · ·

- Ί azonos módon állíthatjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a vegyületet oldás helyett szuszpendáljuk a vivőanyagban, és a sterilizálást szűrés helyett a steril vivőanyagban történő szuszpendálás előtti etilén-oxidos kezeléssel végezzük el. A hatóanyag egyenletes eloszlásának biztosítása érdekében a készítmény előnyösen egy felületaktív anyagot vagy nedvesítőszert is tartalmaz.

A készítmény 0,1-99 tömeg%, előnyösen 10-60 tömeg% mennyiségben tartalmazza a hatóanyagot. A hatóanyag-koncentráció a beadás módjától függ.

A találmány magában foglal egy olyan, a fentiekben meghatározott gyógyszerkészítményt is, amely Alzheimer-kórban szenvedő vagy az Alzheimer-kór kifejlődésével fenyegetett betegekben az amiloid prekurzor protein nem-amiloidogén úton történő képződésének fokozására szolgál. Szintén a találmány tárgyát képezi egy olyan, a fentiekben meghatározott gyógyszerkészítmény, amely az Alzheimer-kórnak a βΑ4 csökkentése általi kezelésében és/vagy megelőzésében történő felhasználásra szolgál.

A vegyület dózisa szokásosan a rendellenesség súlyosságától, a kezelendő beteg testtömegétől, valamint a vegyület relatív hatékonyságától függ. Általában az alkalmas dózisok 5-300 μς, például 10-200 μρ mennyiségben tartalmazzák a hatóanyagot. Az ilyen dózisokat naponta egy vagy több, például két vagy három alkalommal adhatjuk be oly módon, hogy teljes napi dózis értéke körülbelül 30 pg és körülbelül 600 pg közötti értékű legyen. Az ilyen terápiát éveken keresztül folytathatjuk.

Az ([R-(2}]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]ok( ··· · til)}-acetonitrilt a fenti dózistartományokban alkalmazva elfogadhatatlan, toxikus hatásokat nem tapasztaltunk.

Az alábbi farmakológiai adatok a találmány illusztrálására szolgálnak.

FARMAKOLÓGIAI ADATOK

Amiloid prekurzor proteint termelő CHO sejtek

Western blotting technikák alkalmazásával megvizsgáltuk, hogy a tesztvegyület milyen hatást gyakorol a humán muszkarin receptorokkal transzfektált kínai hörcsög petefészek (Chinese hamster ovary; CHO) sejtekben történő amiloid prekurzor protein termelésre. Az immunreaktív sávok mennyiségi értékelését lézer-denzitométer alkalmazásával végeztük el.

Anyagok

A humán muszkarin receptorokkal [7-241 971. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (a bejelentés napja: 1988. 09. 08.)] stabilan transzfektált CHO sejteket a következő helyről szereztük be: N.I.M.H. (Md. USA). A szövettenyésztő médiumokat és reagenseket a következő helyről vásároltuk: Gibco BRL (Skócia, Nagy-Britannia). Az általános laboratóriumi reagensek beszerzési forrása a Sigma Chemical Co. (Dorset) volt.

Az oxalátsó formájában lévő {[R-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(1-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril—monohidroklorid leírása a 0 392 803. számú európai szabadalmi bejelentésben található .

λ • ·

A következő primer antitesteket alkalmaztuk: 22C11 egér monoklonális antitest (Boehringer Mannheim, Sussex, Nagy-Britannia), amely az amiloid prekurzor proteinnek egy amino-terminális epitópját ismeri fel [Weidemann, A., Konig, G., Búnké,

D., Fischer, P., Salbaum, J. M., Masters, C. L., and Beyreuther, K., Cell, 57, 115-126 (1989)]; patkány βΑ4 1-25-tel szemben kialakuló anti-pA4 1-25 nyúl poliklonális antitest; az amiloid prekurzor proteinnek egy karboxi-terminális epitópjával (az APP770 751-770 aminosavjaival) szemben kialakuló Ab45 nyúl poliklonális antitest.

A szekunder antitest nyúl vagy egér peroxidáz anti-peroxidázzal (PAP) (Sigma Chem. Co., Dorset, Nagy-Britannia) együtt alkalmazott anti-nyúl vagy anti-egér IgG (Sigma Chem. Co., Dorset, Nagy-Britannia) volt. Az alkalmazott szubsztrát a fokozott kemilumineszcensiás készlet (enhanced chemiluminescence kit; ECL) volt (RPN2106, Amersham, Bucks, Nagy-Britannia) . Az immunreaktív sávokat Hyperfilm-ECL (Amersham, Bucks, Nagy-Britannia) alkalmazásával detektáltuk.

Módszerek

Sejttenyésztés

A hml, hm2, hm3 és hm4 humán muszkarin receptor altípusokkal transzfektált CHO sejteket 10 cm átmérőjű sejttenyésztő edényekben, ribonukleozidokkal és dezoxiribonukleozidokkal, 10 % foetalis borjúszérummal, 100 egység/ml penicilinnel és 100 pg/ml streptomycinnel kiegészített ct-Minimum Essential Médium (aMEM) közegben konfluenssé válási növesztettük.

- 10 A tesztvegyülettel végzett sejtkezelés

A sejteket a fentieknek megfelelően konfluenssé válásig növesztettük, majd a szérumtartalmú médiumot eltávolítottuk, és a sejteket 5 ml szérummentes médiumban kétszer mostuk. Ezt követően a sejteket a tesztvegyület megfelelő koncentrációját tartalmazó szérummentes médium 5 milliliternyi mennyiségével kezeltük és 3 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.

A kondicionált médiumot összegyűjtöttük, jégre helyeztük, majd proteáz inhibitorokat [1 mM benzil-szulfonil-fluorid (PMSF), 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), 1 pg/ml leupeptin] adtunk hozzá. A sejttöredékek eltávolítása érdekében a médiumot 4 ’C hőmérsékleten 3000 G érték mellett 15 percen keresztül centrifugáltuk. A felül úszó folyadékot Centricon 10 koncentrátorok (Amicon, Gloucestershire, Nagy-Britannia) alkalmazásával, 4 ’C hőmérsékleten 3000 G érték mellett 90 percen keresztül végzett centrifugálással századrésznyi térfogatra töményítettük. A visszamaradt anyagot részletekre osztva -20 ’C hőmérsékleten tároltuk az elektroforézis végrehajtásáig.

A sejteket 5 ml szérummentes médiumban kétszer mostuk, lekapartuk, majd 4 °C hőmérsékleten 3000 G érték mellett 5 percen keresztül centrifugáltuk, és így egy sejtpelletet nyertünk. A felül úszó folyadékot eltávolítottuk, majd a sejtpelletet hatszoros térfogatú lizáló pufferben [1 % Triton XlOO-at, 5 mM EDTA-t, 1 mM PMFS-t és 1 pg/ml leupeptint tartalmazó 0,1 M Tris (pH 7,5)] szuszpendáltuk. A lizátumot időnként megforgatva 30 percen keresztül jégen tartottuk, majd a sejttöredékek eltávolítása érdekében 4 °C hőmérsékleten 10 000 G érték mellett 5 ···

- 11 percen keresztül centrifugáltuk. A felül úszó folyadékot kinyertük, majd részletekre osztva -20 °C hőmérsékleten tároltuk az elektroforézis végrehajtásáig.

Proteinvizsgálat

A gélen végzett kezelések közötti egyenlő proteinterhelés biztosítása érdekében a gélelektroforézis előtt a proteinre nézve megvizsgáltuk a sejtlizátum és a betöményített tenyésztőközeg mintáit. A proteineket a Bradford-féle festékkötési eljárással [Bradford, M., Anal. Biochem., 72, 248-254 (1988)] mértük, amelynek során Bio-Rad (Herts, Nagy-Britannia) festékreagens-koncentrátumot alkalmaztunk. A vizsgálatot mikrotiterlemezen hajtottuk végre. Az abszorbancia 590 nm hullámhosszon történő leolvasásához egy, az eredmények kiértékelésére alkalmas számítógépes programmal rendelkező Titretek Multiskan Plus MklI lemezleolvasót alkalmaztunk. Mivel a különféle reagensek, különösen a felületaktív anyagok jelentősen befolyásolhatják a Bradford-féle vizsgálat eredményét, a megfelelő minta vivőanyagában kalibrálást hajtottunk végre.

SDS-PAGE

A proteineket egy Novex mini-gel (R&D Systems Europe Ltd, Oxon, Nagy-Britannia) rendszer alkalmazásával frakcionáltuk. Az azonos gélen végzett kezelések közötti összehasonlításhoz azonos proteinmennyiségeket vittünk fel a gélekre. A mintákat redukáló minta pufferrel [0,1 M Tris (pH 6,8), 10 % nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 0,1 % glicerines brómfenolkék-oldat és 50 % β-merkapto-etanol] kétszeres térfogatra hígítottuk. A proteinek elválasztását 100 voltos feszültség mellett 90 percen keresztül

- 12 egy SDS-t tartalmazó 6 % Tris-glicin poliakrilamid-gélen [Laemmli, U. K., Natúré, 227, 680-685 (1970)] hajtottuk végre. A vizsgálatok során ismert molekulatömegű proteinstandardokat (Sigma) is alkalmaztunk.

Western-blot analízis

Az SDS-PAGE végrehajtása után a géleket 20 percen keresztül transzferpufferben [2,5 mM Tris, 19,2 mM glicin, 20 % metanol (pH 8,3)] mostuk. A proteineket egy Bio-rad félszáraz rendszer alkalmazásával a gélről 2 óra alatt, 0,8 mA/cm áramsűrűség mellett Immobilon P poli (vinilidén-difluorid) (PVDF) membránra [Millipore, Herts, Nagy-Britannia) vittük át. Az átvitelt követően a proteineket festéssel láthatóvá tettük a membránon, amelynek során 2 percen keresztül Ponceau S (Sigma) oldatot alkalmaztunk. A festék feleslegét desztillált vizes öblítéssel távolítottuk el.

A membránt szobahőmérsékleten, legalább egy órán keresztül 0,1 % Tween 20-t és 5 1 szárított tejport tartalmazó, foszfátpufferelt nátrium-klorid-oldatban (PBS) blokkoltuk. Ezt követően kétszer 30 másodperces mosást végeztünk 0,1 % Tween 20-t tartalmazó PBS-ben (PBST), majd a primer antitestet 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk. Valamennyi antitestet 2 1 bovin-szérumalbumint (Sigma) tartalmazó PBST-ben állítottuk elő. A membránokat előbb egy percen keresztül, majd kétszer 5 percen át PBST-ben mostuk. A membránokhoz szobahőmérsékleten egy óra időtartamra 1/3000 vagy 1/5000 hígításban szekunder antitestet, anti-egér vagy anti-nyúl IgG-t (Sigma) adtunk. Ezt követően a membránokat a fentieknek megfelelően mostuk, majd

- 13 szobahőmérsékleten egy óra időtartamra 1/3000 hígításban egér vagy nyúl peroxidáz anti-peroxidázt (Sigma) adtunk hozzá. Csak PBS-ben egy végső mosási lépést végeztünk, majd a membránokat az ECL szubsztrát (Amersham) hozzáadása céljából egy tiszta edénybe helyeztük át. Az immunreaktív sávokat Hyperfilm-ECL (Amersham) alkalmazásával detektáltuk; a film előhívását egy automata berendezéssel (Kodak) hajtottuk végre.

Denzitometriás analízis

Az amiloid prekurzor protein (APP) mennyiségeinek változásait egy lézer-denzitométerrel mértük. Az immunreaktív sávokat egy, az adatok feldolgozására alkalmas Gelscan XL programmal rendelkező számítógéphez kapcsolt Pharmacia LKB Ultrascan XL berendezéssel szkenneltük. A lézersugarat átjuttattuk a mintán, majd a fénydiódával mértük az átjutott fény mennyiségét, és így meghatároztuk az elnyelt fénymennyiséget. Az abszorbancia leolvasások értékeit integrálva a görbe alatti terület értékét kaptuk meg. A vivőanyag és a tesztvegyület esetén nyert eredményeket három kísérlet ± középhiba (standard error of the mean; SEM) átlagaként fejeztük ki.

In vitro ligandkötési vizsgálatok

Hím Hooded Lister patkányokból (Olac, Nagy-Britannia) kimetszettük az agykérget, amelyet ezt követően a nedves tömegre vonatkoztatott 2,5-szeres mennyiségű jéghideg 50 mM Tris-be (pH 7,7) helyeztünk. Homogenizálás után 4 °C hőmérsékleten 24 000 G érték mellett 15 percen keresztül centrifugálást végeztünk. Az üledéket 2,5-szeres mennyiségben szuszpendáltuk, majd a homogenizátumot 1 ml-es részletekben -20 °C hőmérsékleten tároltuk a ··· ·♦·

- 14 felhasználásig.

A [ Η]-OXO-M kötéshez 2 mM magnezium-kloridot tartalmazó jéghideg 50 mM Tris 2 ml-es össztérfogatában inkubálást végezβ tünk. A [ H]-OXO-M-acetátot (New England Nuclear; fajlagos aktivitás 87 Ci/mmol) 1,88 nM koncentrációban alkalmaztuk. Az agykéreg-homogenizátumot az eredeti nedves tömegre vonatkoztatva 300-szoros végkoncentrációban használtuk (ez a mennyiség 0,145 mg protein/ml koncentrációval ekvivalens). A nem-specifikus kötést 10 mikromól (μΜ) oxotremorin-szeszkvifumarát alkalmazásával határoztuk meg. Az inkubálásokat 37 °C hőmérsékleten az egyensúlyi állapot eléréséig, 30-45 percen keresztül végeztük. A mintákat olyan Watman GF/B szűrőkön szűrtük keresztül, amelyeket a [ H]-OXO-M-nek az üvegszálakon történő adszorpciója megakadályozása érdekében előzetesen 30 percen keresztül 0,05

7-os vizes poli(etilén-imin)-oldatba merítettünk.

Hasonló módon végeztük a [ H]-QNB (fajlagos aktivitás: 44

Ci/mmol); végkoncentráció: 0,27 nM) kötését, azzal az eltéréssel, hogy ebben az esetben elhagytuk a magnézium-kloridot, és a homogenizátum hígítását 1500-szorosra emeltük (7,8 pg protein/ml). A nem-specifikus kötést 1 pM atropin-szulfáttal határoztuk meg.

A vizsgált vegyület kötési adatait az 5. táblázatban mutatjuk be.

Eredmények

A fentiekben ismertetett módszerek alkalmazásával megvizsgáltuk a teszvegyületnek, azaz {[A-(Z)]-a-(metoxi-imino)-α-(1- 15 -

-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril—monohidrokloridnak az amiloid prekurzor protein képződésére gyakorolt hatásait.

Valamennyi transzfektált CHO sejtben egy 108 kD molekulatömegű teljes hosszúságú APP-t és két, 108 kD és 118 kD molekulatömegű szekretált APP sávot detektáltunk.

CHOhml

Az { [R- (Z) ]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]ok“6 “4 til)}-acetonitril—monohidrokloriddal 10 -10 M dózistartományban három órán keresztül végzett kezelés csökkentette a sejtmembránban a teljes hosszúságú APP mennyiségét. A tesztvegyület a megadott koncentrációtartományban a tenyésztőközegben β-10-szeresre növelte a szekretált APP mennyiségét (1. táblázat) .

CHOhm2

A sejtmembránban lévő teljes hosszúságú APP mennyiségében nem történt változás, de az {[Λ-(2)]-a-(metoxi-imino)-α-(1-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril-monohidrokloriddal ΙχΙΟ^-4 M koncentrációban 3 órán keresztül végzett kezelés után a szekretált APP mennyisége megkétszereződött a tenyésztőközegben (2. táblázat).

CHOhml

Az {[R-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil )} -acetonitril—monohidrokloriddal 10 ⁶-10 ⁴ M dózistartományban három órán keresztül végzett kezelés csökkentette a sejtmembránban a teljes hosszúságú APP mennyiségét. A tesztvegyület a megadott koncentrációtartományban a tenyésztőközegben hozzávetőleg 20-szorosra növelte a szekretált APP mennyiségét

- 16 (3. táblázat) .

CH0hm4

A sejtmembránban lévő teljes hosszúságú APP mennyiségében nem történt változás. Az {[R-(Σ) ]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril—monohidrokloriddal 1χ10~⁴ M koncentrációban 3 órán keresztül végzett kezelés után a szekretált APP mennyisége sem változott a tenyésztőközegben (4. táblázat) .

Ligandkötési vizsgálatok

A ligandkötési adatok (5. táblázat) azt mutatják, hogy az { [R- (Z) ]-a- (metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil) }-acetonitril—monohidroklorid 22-es értékű QNB/OXO-M aránnyal rendelkezik, ami részleges agonista tulajdonságokra utal [Brown, F., Clark, M., Graves, D., Hatcher, J., McArthur, R.,

Riley, G., and Semple, J., Drug Dev. Rés., 14, 343-347 (1988) ] .

Értékelés

Az {[R-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril—monohidroklorid az ml és m3 receptor altípusok stimulációja révén megváltoztatja az amiloid prekurzor protein termelését. A szekretált APP fokozott szabaddá válása, különösen ahogyan azt az anti~PA4 1-25 antitesttel (ami nem ismerné fel a β-szekretázzal hasított APP-t) detektáltuk, igen erőteljesen arra utal, hogy a folyamat egy nem-amiloidogén úton megy végbe.

Az { [R- ( Z) ] -ot- (metoxi-imino) -ct- (l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitril—monohidroklorid az agyban történő βΑ4 terme« · _e.

- 17 lésnek a fokozott nem-amiloidogén APP termelés eredményeként fellépő csökkenése révén felhasználható az Alzheimer-kór kezelésére .

TÁBLÁZATOK

A táblázatokban az { [A-(Z) ]-ot-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilt I. vegyületként rövidítjük.

1. táblázat - CHOhml dózis válaszreakció

Az eredmények három kísérlet átlagára vonatkoznak, és a kontroll APP értékeihez viszonyított eltéréseket fejezik ki.

(Egyszeres növekedés a szekretált APP értékében = nincs változás az alapértékhez képest.)

A teljes hosszúságú APP detektálásához a sejtlizátumokban lévő Ab54, míg a szekretált APP detektálásához 22C11 antitesteket alkalmaztunk.

2. táblázat - CH0hm2 válaszreakció

Az 1. táblázatban szereplő antitesteket alkalmaztuk. Az eredmények három kísérlet átlagára vonatkoznak, és a kontroll

APP értékeihez viszonyított eltéréseket fejezik ki. (Egyszeres növekedés a szekretált APP értékében = nincs változás az alapértékhez képest.)

3. táblázat - CHOhm3 dózis válaszreakció

A teljes hosszúságú APP detektálásához a sejtlizátumokban lévő Ab54, míg a szekretált APP detektálásához βΑ4 1-25 anti«· ’t

- 18 testeket alkalmaztunk. Három párhuzamos kísérletet végeztünk. Az eredmények a három kísérlet átlagára vonatkoznak, és a kontroll APP értékeihez viszonyított eltéréseket fejezik ki. (Egyszeres növekedés a szekretált APP értékében = nincs változás az alapértékhez képest.)

4. táblázat - CH0hm4 válaszreakció

A 3. táblázatban szereplő antitesteket alkalmaztuk. Az eredmények három kísérlet átlagára vonatkoznak, és a kontroll

5. táblázat - Az I. vegyület ligandkötési adatai [³H]-OXO-M [³H]-QNB qnb/oxo-m ^IC50 ^IC50

I. vegyület* 14 309 22 *

: monohidrát

OXO-M = oxotremorin-M, agonista ligand

QNB = kinuklidinil-benzilát, antagonista ligand

A QNB/OXO-M arány a vegyületek funkcionális hatékonyságára utal. A 100-nál nagyobb értékű arány tiszta agonista jelleget jelent, míg az antagonisták 1-hez közeli arányokat mutatnak. A köztes értékek a részleges agonista jelleget jelzik.

»··· ·« • * « ··» ···» ···

- 19 Φ

Φ

O-i	cn					O-i	cn
(X	Ό					O-i	'Φ
<	Ό					<	Ό	—
Φ	cn					Φ	cn
4-J	44	:0				4-1	44	:O
1—1	Φ	b				1-1	φ	b
'CO	>	:O	θ'	po	kO	X	>	:O
4-1	:O	N		4-1	:O	Cd
dl b	b	cn X	r-	kO	o t—1	Φ b	b	cn X
44	cn	X				44	cn	Xi
<D	o	O				Φ	o	:O
Cd	Cn	4->				N	Cn	4->
cn	(Ö					cn	rO	—

4-1 '(0

CN +J '(Ö

Ό •H □

λ:

(0 <d

P

N (0 (0 rb 'rt >

Cn			_1	OO	LO	!-1		Cn
'Φ			τ—1 Q\l	r-~	CM	k£>		'Φ
cn	' ·		LM		K	K		cn
X b	CM^	£	I-1	CD	r-	c—4 r-H	Ό •H	X b
X cn	r \	w CQ	+1	+1	-H	+1	0 44	x cn
4-J o	kJ b>	+1	σ Cd	’nT LO	CO	cd	(0 <D P	4-1 o
ι—1				r-	d	N	td	ι—1
CQ			CM	ι—1	c—1	Cd	cn	CQ
						(Ö

£ w

ω +i ©

LO o

+i

N rCd

O co +1 ©

Γ—

Lf) táblázat - CHOhml dózis

X
'<Ö		Φ
cn		cn
X	cn	'Φ
N	O	b
cn	cn	φ
cn	Φ	44	CD
O	l—1	44
X	4-1	Ό	o
cn	’fO	cn O
Φ	(X
m	ex	cn
1-1	<	o
Φ		1
-Ρ		dP

co n

CN cd

4J Π5 N '(0 ι—I

Λ '(0

-P

CN cn 'Φ cn

X b

X cn

4-J

O r—d

CQ

N £

H ω

+i

CO +1

N

ΓΟΟ

Cd [—Cd r+l co o

N σ

F,

LO +1

CM cn

CM o

CM θ' +1 co

Ό •rd b

o ·—I X

x
Cn
'«3		Φ
cn		cn
X	cn	'Φ
N	o	b
cn	Cn	φ
cn	(0	44
O	ι—1	44	LO
X	4-1	=O	V
	'C0	cn
cn		υ
Φ	ex
ι—ι	ex	cn
1-1		o
Φ		1
4-J		U\O

Cn >Φ cn

X b

X cn

4-J o

r-H

CQ £

ω

cd +1

Cd

	» Ο Φ	2	2	2	0 b Ό		* 4-J <D	£
	ι—(		in	CO	•rri		1—1	•xr
1—1	X	1	1	1	xí	1—1	X	l
<—1	>1	o	o	o	o	l-1	^*1	o
o	Cn	r-H	c—1	t—1	£	0	Cn	i—1
b	Φ	X	X	X	o	b	Φ	X
4-J	>	r-M	r—1	γ·M	£	4-J	>	r—í
b						b
o						0	•
tx	H				*		hb

monohidroklorid .! ···:

»>· «··

Ό •H fO <D

P

N (0 (0 r-I '(β táblázat - CHOhm3 dózis

cd	Φ
CQ	co					CQ	co
CQ	'CD					CQ	Ό
	Ό						b	.—.
	CD	co					CD	co
QJ	44	•o				QJ	44	b
I-1	CD	P				ι—1	CD	P
'(0	>	:O	LO		CN	'(0	>	:O
QJ	:O	N				QJ	:O	N
CD	0	in	CO	co	0Ί	CD	0	co
P		Ά	5-1	ι—1	t—1	P		b
44	co	b				44	co	b
CD	o	:O				CD	O	:O
N	Oi	QJ				N	o	QJ
C0	05	—-				co	cö	—
	1-1						«Ή
<	QJ					<	P
'f0						'CO

Oi 'CD co		CO ϊ—1
b	CN	--V.
	g	o
b co	O	w CQ	+1
QJ o	§	+1	LO co
r—i CQ			o

l>	r-~	Γ-
co	O]	ΓΟ
K.	K	K
Γ	CN	LO
+1	+1	+1
1—1	o	00
co	ld	oo
V.	V	*k
LO	LO	LO
ι—1	τ—1	,—1

'0 •H u 44 Ιβ 0) P N <0 (0 r—I '(« >

Cn

Ό

CO bS

P

-O co qj o

I—ι cq g

ω cq +ι

CN +1 o

co o

CN

CO

CN +1 σι

LO

CN

Ό

O⁷

'fO	ω
co		in
Ό	co	'CD
N	O	C
in	Oi	CD
in	<0	44	LO	Γ—1
o	1-1	44
b	QJ	Ό	CO	LD
in	'CÖ	in	θ'	Γ
	u
CD	CQ
ro	CQ	in
1-1	<	0
CD	1
QJ		cp

<

	Gr
§	OJ		<D
b	co		co
O	Ό	CO	'CD
K	N	0	G
o	CO	o	CD
	co	(Ö	44
1	o	l—1	44	LO
	b	P	b
Q>		Ό	CO	CN
IÖ	co		υ
N	CD	CQ
'(0	ro	CQ	(0
ρ—1	(-1		o
b	CD		1
'(0	QJ		jp

<

Ol 'CD co '0

P 'Ό co

QJ o

CQ +i co γγο +i co o

n

CN p co co r-l r-l Π ι—ι ι—ι ro +1 +1 Ή lío i—ι co

Ű1 Ld T

Oi

l-1

CQ o

P

QJ o

g

QJ CD r—I b

>1

Oi

CD >

sr lo rΌ

-P

P o

1-1

	CD
	LO	<T>

g	O	O
ω CQ	+1	+1
+1	bT	CN
CN	LO

	lO
	CN	CN

o	*
2	2	2	P b		QJ CD	2
	LD	L0	1—1		1—1
1 o	1 o	1 o	2 Q	1-1 ι—1	b >1	1 o
t—1	c—1	«—1	£	o	o>	i—l
X	X	X	o	P	CD	X
1-1	<—1	x—1	g	QJ G	>	v—1
				O	•
			*	b	1—1

monohidroklorid

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Gyógyszerkészítmény, amely { [R-(Z) ]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilt tartalmaz vagy ennek egy gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazza, Alzheimer-kórban szenvedő vagy az Alzheimer-kór kifejlődésével fenyegetett betegekben az amiloid prekurzor protein nem-amiloidogén úton történő képződésének fokozására történő felhasználásra .
2. Gyógyszerkészítmény, amely {[R-(Z)]-a-(metoxi-imino)-a-(l-aza-3-biciklo[2.2.2]oktil)}-acetonitrilt tartalmaz vagy ennek egy gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazza, az Alzheimer-kórnak a βΑ4 termelés csökkentése általi kezelésében és/vagy megelőzésében történő felhasználásra.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerészetileg elfogadható só a monohidroklorid.