CZ286953B6 - Medicament for blocking retroviral infection - Google Patents

Description

Léčivo pro blokování retrovirové infekce

Oblast techniky

Vynález se týká použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy pro výrobu léčiva v oblasti léčení retrovirových infekcí, zejména léčení infekce virem lidské imunodefícience (HIV) a sní spojených nemocí včetně syndromu získané imunodefícience (AIDS).

Dosavadní stav techniky

Retroviry byly rozpoznány jako činidla v řadě nemocí včetně rakoviny, autoimunní nemoci a AIDS. Infekce virem lidské imunodefícience (HIV) působí chronické progresivní ubývání CD4⁺ T lymfocytů (CD4⁺ buněk) a infekci makrofágů vedoucí k syndromu získané imunodefícience. V současnosti je základním antivirovým lékem používaným pro léčení HIV infekce zidovudin (AZT), analog thymidinu, ačkoliv se používají ještě dvě jiná činidla s podobným mechanismem účinku, dideoxyinosin (ddl) a dideoxycytosin (ddC) Colley, T. P. aj., New Engl. J. Med. (1990) 322, 1340-45, Fischl, M. A. aj., New Engl. J. Med. (1987) 317, 185-91. Tyto léky jsou účinné při inhibici replikace viru a mohou stabilizovat hladinu CD4⁺ buněk, ale nejsou schopné eliminovat jeden z hlavních zásobníků virů, makrofágy nakažené HIV. Gartner, S. aj., Science (1986) 233, 215-19. S vysokými dávkami AZT ošetření je také spojena vysoká toxicita zvláště zasahující kostní morek hostitele HIV a příznivé účinky u AIDS pacientů se zmenšují po další terapii. U léčených pacientů se rovněž pozorovaly kmeny HIV odolné vůči AZT. Tato zjištění vyvolala výzkum alternativních léků pro léčení infekce HIV, zejména látek s různým mechanismem účinku.

Etiologickou příčinou AIDS je virus lidské imunodefícience typu 1 (HIV-1), retrovirus. Obalový glykoprotein HIV- 1, gp 120, se specificky váže na CD4 receptory T lymfocytů a na monocyty i makrofágy. Ačkoliv infekce T lymfocytů vyžaduje množení buněk a syntézu DNA, k produktivní infekci monocytů může dojít nezávisle na syntéze buněčné DNA (Weinberg, J. B., aj (1991) J. Exp. Med. 174, 1477-82). Když HIV-1 infikuje aktivované CD4⁺ lymfocyty, je to smrtelné, avšak nakažené monocyty jsou relativně odolné vůči destrukci virem. V důsledku toho tyto buňky, pokud jsou jednou nakažené HTV-1, slouží jako zásobník virů. Nejenom jsou tyto buňky zdrojem replikace viru, ale jejich viry způsobená dysfunkce může přispět ke zvýšené citlivosti k oportunním infekcím, které jsou příznačné pro AIDS.

Protože monocyty-makrofágy slouží jako reservoár HIV-1, selektivní zaměření na tuto populaci vedle T lymfocytů zasluhuje další úvahu (Finberg, R. N. aj., Science (1991) 252, 1703-05). Prvé zprávy od skupiny Foxe (JADA 118, 709- 11, 1989) naznačovaly, že jedna složka lidských slin blokuje replikaci HIV.

Při hledání různých potenciálních modulátorů infekce HIV-1 se nedávno podařilo identifikovat endogenní zdroj inhibiční aktivity, která zpomaluje infekci a nebo replikaci HIV-1.

Faktor působící antivirovou aktivitu je inhibitor serinové leukocytové proteázy (SLPI). SLPI je silným inhibitorem lidské leukocytové proteázy a katepsinu G a lidského trypsinu a byl přečištěn z výměšků příušní žlázy (Thompson, R. C. a K. Ohlsson (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 6692-96 a US patent 4,760,130, oba jsou zahrnuty do popisu tímto odkazem). SLPI je nyní dostupný výrobou pomocí techniky rekombinantní DNA, PCT přihláška WO86 03519, a evropská patentová přihláška EP 205475 obě jsou zahrnuty do popisu tímto odkazem).

Schopnost SLPI a nebo jeho derivátů a analogů blokovat infekci a nebo replikaci HIV-1 může poskytnout základnu pro terapeutickou intervenci při infekci HTV-1.

-1 CZ 286953 B6

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI pro výrobu léčiva k blokaci retrovirových infekcí, retrovirových infekcí savčích buněk virem lidské imunodeficience (HIV) a s ní spojených nemocí včetně syndromu získané imunodeficience (AIDS). S výhodou se použijí analogy nebo deriváty SLPI, které jsou vybrány ze skupiny sestávající z SLPI Phe 72 muteinu, SLPI Gly 20 muteinu, SLPI Gly 72 muteinu, SLPI Val 72 muteinu, CLPI Phe 25 muteinu, CLPI Gly 25 muteinu a CLPI Val 25 muteinu, přičemž CLPI je seříznutý SLPI protein, u něhož je prvních 47 aminokyselinových zbytků SLPI vypuštěno.

Výhodným provedením podle vynálezu je použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI pro přípravu léčiva k blokování funkce enzymu hostitelské buňky, kde funkce enzymu je nezbytná pro retrovirovou infekci buňky, přičemž hostitelská buňka je monocyt nebo buňka, která je prekurzorem monocytu. S výhodou je hostitelskou buňkou monocyt nebo promonocyt.

V rozsahu vynálezu jsou farmaceutické kompozice pro léčení retrovirových infekcí, zejména infekcí HTV u lidí, obsahující inhibitor serinové leukocytové proteázy (SLPI) nebo jeho analog či derivát a farmaceuticky přijatelný nosič.

Vynález poskytuje použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI pro blokování retrovirových infekcí HIV savčích buněk, zejména lidských buněk, a s nimi spojených nemocí včetně syndromu získané imunodeficience (AIDS).

Výraz „farmaceuticky přijatelný nosič“, jak se zde používá, znamená nejedovaté, obecně přijatelné vehikulum pro aktivní složku, které neovlivňuje nepříznivě aktivní složku nebo pacienta, kterému se formulace podává.

Podle vynálezu se retrovirové infekce léčí podáváním anti-retrovirových činidel v dávkách dostatečných k zmenšení účinku takových infekcí. Retrovirové infekce se podílejí na řadě nemocí včetně rakoviny, autoimunní nemoci a syndromu získané imunodeficience. Vynález je zaměřen zvláště na infekci virem lidské imunodeficience.

V oboru je známa řada anti-retrovirových činidel. Většina z nich inhibuje aktivitu retrovirové reverzní transkriptázy a zahrnují zidovudin (AZT), analog thymidinu, dideoxyinosin (ddl) a dideoxycytosin (ddC). Zidovudin je primárním antivirovým lékem užívaným pro léčení HIV infekce. Anti- retrovirová činidla jsou obecně účinná v dávkách v rozmezí asi od 50 mg za den do 1000 mg za den, přesněji asi od 100 mg za den do 500 mg za den a v případě zidovudinu jmenovitě asi od 300 mg za den do 500 mg za den. Tyto látky se zpravidla podávají v orálních formulacích.

Inhibitory proteázy podle vynálezu lze připravit způsoby odborníkům dobře známými (viz. například US patent 4,760,130, evropská patentová přihláška EP 205475, PCT přihláška WO 8603519. výše).

Vynález se týká inhibitorů proteázy, které se izolovaly ve vyčištěné formě. S výhodou jsou inhibitory serinové leukocytové proteázy podle vynálezu proteiny s jediným polypeptidovým řetězcem, které jsou podstatně homologenní a nejlépe pokud jsou biologicky ekvivalentní nativnímu inhibitoru serinové leukocytové proteázy izolovanému z výměšků lidské příušní žlázy. Nativní inhibitor serinové leukocytové proteázy se také označuje jako nativní parotidový inhibitor. „Biologicky ekvivalentní“, jak se používá v popisu a nárocích, se míní to, že kompozice jsou schopné inhibovat proteázy pocházející z monocytů, které jsou inhibovány SLPI,

-2CZ 286953 B6 nikoliv však nutně ve stejném stupni. „Deriváty“, jak se používá v následujícím popisu a nárocích, se míní stupeň homologie aminokyselin k nativnímu parotidovému inhibitoru, výhodně v 40 % přebytku, nejlépe v 50 % přebytku, se zejména výhodnou skupinou proteinů v 60% přebytku homologie k nativnímu parotidovému inhibitoru. Procenta homologie, jak jsou popsána výše, se počítají jako procenta složek nalezených v menší ze dvou sekvencí, které lze rovněž nalézt ve větší ze dvou sekvencí, složkou se rozumí sekvence čtyř následujících aminokyselin.

Jedním užitečným derivátem SLPI je CLPI, useknutá SLPI molekula mající pouze posledních 60 aminokyselin nativního parotidového inhibitoru. Těchto 60 aminokyselin jsou:

Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys

Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met

Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys

Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys

Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala.

Následující nukleotidová sekvence se používala ke kódování výše uvedených 60 molekul aminokyselin:

CGT GAT CCT GTT GAC ACC CCA ACA CCA ACA AGG AGG AAG CCT GGG AAG TGC CCA GTG ACT TAT GGC CAA TGT TTG ATG CCT AAC CCC CCC AAT TTC TGT GAG ATG GAT GGC CAG TGC AAG CGT GAC TTG AAG TGT TGC ATG GGC ATG TGT GGG AAA TCC TGC GTT TCC CCT GTG AAA GCT.

CLPI se konstruovala z SLPI signální genové sekvence a nukleotidů odpovídajících prvým aminokyselinám zralého SLPI proteinu. CLPI lze rovněž připravit způsobem podle příkladu 8 popsaného jak v PCT přihlášce WO86 03519, tak evropské patentové přihlášce EP 205475. Ačkoliv příklad 8 v obou těchto přihláškách uvádí způsob výroby SLPI, tento způsob lze rovněž použít k výrobě CLPI. CLPI se může použít k vytvoření protilátek užitečných při čištění SLPI. Protilátky lze připravit například způsoby diskutovanými v E. Harlow a D. Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, str. 92-114 (Cold Springs Harbor Laboratory, 1988).

„Analogy“, jak se zde používá, znamenají jakoukoliv sloučeninu včetně například malých organických sloučenin, které jsou funkčně biologicky ekvivalentní SLPI při inhibici infekce HIV. Takové deriváty a analogy se mohou izolovat odborníkům dobře známými způsoby, včetně použití buněk monocytů, aby se hledaly sloučeniny, které brání SLPI, aby se na ně vázala. Analogy mohou rovněž zahrnovat specifické SLPI muteiny, které mají alespoň ekvivalentní a v některých případech větší aktivitu než nativní protein. Zvlášť užitečné SLPI muteiny zahrnují substituci následujících aminokyselin očíslovaných při poloze zbytku: Gly 20, Gly 72, Val 72 a Phe 72.

CLPI muteiny rovněž spadají do rozsahu vynálezu. CLPI muteiny odpovídající SLPI muteinům Gly 72, Val 72 a Phe 72 se zde uvádějí jako Gly 25, Val 25 a Phe 25. Některé zamýšlené CLPI muteiny mají následující sekvence aminokyselin:

Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys

Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys R8 R3

R9 Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu R4 Asp Gly Gin Cys

Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys R5 Gly R6 Cys Gly Lys

Ser Cys Val Ser Pro Val Lys R7.

kde R7 je alanin, a R3, R4, R5, R6 a R8 jsou stejné nebo různé aminokyseliny a jedna či více z R3, R4, R5, R6 a R8 mohou být methionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, lysin, glycin nebo arginin. Analogy také zahrnují například PEGylované formy SLPI nebo CLPI, které

-3 CZ 286953 B6 mohou mít lepší terapeutické charakteristiky než nativní SLPI protein. Muteiny, které mohou být vhodné pro PEGylaci zahrnují ty, které mají cysteinový zbytek v polohách 13, 23, 52, 58, 68 a nebo 75 SLPI a na odpovídajících místech 5, 11,21 a 28 v CLPI. Příprava cysteinových muteinů pro PEGylaci je popsána vPCT přihlášce WO 92/16221, podané 13. března 1992, která je 5 specificky zahrnuta do popisu tímto odkazem. Užitečný krok při přípravě muteinů může zahrnovat přesmykový krok, kdy se přidává cystein k roztoku obsahujícímu protein. Cystein může pomoci při seskupení a může se vázat na substituovaný volný cystein v muteinu. Rovněž lze izolovat z monocytů protein inhibovatelný SLPI (SIP) z lidských buněk monocytů při použití standardních technik dobře známých odborníkům a čistit proteiny s proteolytickou aktivitou, ío která se inhibuje SLPI. Po čištění proteinu (a v případě potřeby jeho řetězení, klonování jeho genu a jeho expresi v hostitelských buňkách, například rekombinantním získáním SIP) se mohou testovat na inhibitoiy SIP způsoby odborníkům dobře známými. Případně lze stanovit jeho strukturu a navrhnout podle ní inhibitory, rovněž způsoby odborníkům dobře známými.

Když SLPI nebo jeho analog či derivát se užívá pro boj s infekcí HIV u lidí, sloučenina se může podávat orálně nebo parenterálně ve vehikulu obsahujícím jeden či více farmaceuticky přijatelných nosičů, jejichž proporce se stanoví podle rozpustnosti a chemické povahy sloučeniny, vybrané cesty podávání a standardní biologické praxe. Pro orální podávání se SLPI nebo jeho analog či derivát může upravit do jednotkových dávkových forem, jako kapslí nebo 20 tablet, každá obsahující předem stanovené množství aktivní složky, v rozmezí asi 10 až 1000 mg za den na pacienta, s výhodou asi 10 až 200 mg za den na pacienta, ještě lépe 20 až 200 mg za den na pacienta ve farmaceuticky přijatelné nosiči.

Při parenterálním podávání se SLPI nebo jeho analog či derivát podává buď injekcemi 25 intravenosními, podkožními, nebo vnitrosvalovými ve směsích s farmaceuticky přijatelnými vehikuly nebo nosiči. Pro injekční podávání se dává přednost použití sloučeniny v roztoku ve sterilním vodném vehikulu, které též může obsahovat jiné látky, jako jsou ústoje nebo konzervační činidla, jakož i dostatečná množství farmaceuticky přijatelných solí nebo glukózy, aby byl roztok izotonický. Dává se přednost podkožním injekcím. Dávky jsou podstatně sodné 30 jak byly uvedeny shora pro orální podávání.

Vhodné vehikuly nebo nosiče pro shora uvedené formulace lze nalézt ve standardních farmaceutických textech, například v „Remington s Pharmaceutical Sciences“, 16 ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1980, který je zahrnut do popisu tímto odkazem.

Dávka sloučeniny se bude měnit podle formy podávání a dané vybrané aktivní látky. Dále se bude měnit podle konkrétního léčeného pacienta či hostitele (včetně savců zahrnujících lidi). Obecně se léčení zahajuje malými dávkami podstatně nižšími než optimální dávka sloučeniny. Pak se dávka zvyšuje po malých přírůstcích až se dosáhne optimální účinek za daných okolností. 40 Zpravidla se sloučenina podává nejlépe na úrovni koncentrací, které obecně zajistí účinně antivirový účinek bez vyvolání jakýchkoliv škodlivých nebo zhoubných postranních účinků. Je žádoucí udržovat hladinu sloučeniny v krvi na úrovni dostatečné k inhibici retrovirové infekce v hostitelské buňce. Tu lze určit zkoušením množství sloučeniny, které je účinné k prevenci retrovirové infekce hostitelských buněk, například HIV do monocytů in vitro, a pak podle 45 standardních farmakokinetických technik stanovením množství sloučeniny, které je potřebné k udržení hladiny v plazmě na stejné inhibiční úrovni, nebo až 10 až 100 krát vyšší.

Ačkoliv výše popsané formulace jsou účinná a relativně bezpečná léčiva pro léčení HIV infekcí, není vyloučena možnost současného podávání těchto formulací s jinými antivirovými léky či 50 činidly, aby se dosáhly prospěšné výsledky. Takové další retrovirové léky či činidla zahrnují rozpustnou CD4, zidovudin, dideoxycytidin, fosfonomravenčan, ribavarin, antivirové interferony (například alfa-interferon nebo interleukin-2) nebo aerosolový pentamidin.

-4CZ 286953 B6

Přehled obrázků na výkrese

Obr. 1: SLPI blokuje replikaci HTV v monocytech v závislosti na dávce. Elutriované lidské monocyty se daly na misky a vystavily HTV + SLPI po jednu hodinu při 37 °C, promyly a inkubovaly se při 37 °C. Supematant se odsával a čerstvé médium se přidávalo každé čtyři dny. EC₅o u tohoto pokusu bylo pod 0,1 pg/ml (8,5 nM) s úplnou inhibicí při 10 pg/ml (850 nM).

Obr. 2: Inhibiční účinek SLPI je dlouhodobý. Po 18 dnech bylo ještě 90 % HIV inhibováno.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Periferní krevní monocyty (PBM) se izolovaly od zdravých dárců elutriací, daly se na kultivační misky a inkubovaly se několik dní. SLPI se smíchal s HIV (Bal) a aplikoval se na PBM po jednu hodinu při 37 °C. Buňky se promyly a dále inkubovaly s výměnou média a stanovením reverzní transkriptázy každé tři dny. Zjistili jsme, že SLPI účinně blokuje replikaci HIV v koncentraci 1 pg/ml (Obr. 1). Při koncentracích pod 20 pg/ml SLPI inhibice je snížená. Inhibiční účinek je dlouhodobý, s významnou inhibicí pozorovanou po 18 dnech (Obr. 2).

Příklad 2

PBM se daly na kultivační misky a inkubovaly jako v příkladu 1. SLPI se aplikoval na buňky po jednu hodinu. Buňky se promyly a reagovaly s HIV. Výměna média a stanovení se prováděly jako v příkladu 1. Zjistily jsme, že SLPI účinněji blokovala HIV, když buňky napřed reagovaly s SLPI, než když reagovaly se směsí SLPI a HTV.

Příklad 3

Také jsme dokázali s použitím podstatně stejného protokolu jako v příkladu 1, že SLPI účinně blokuje replikaci HTV v T-buňkách.

Příklad 4

Lidské T lymfocytové buňky se udržovaly v suspenzní kultuře v RPMI 1640 s 10% fetálním jehněčím sérem (FCS) a 200 pg/l gentamicinu. SLPI se přidal ke kultivačnímu médiu v konečné koncentraci 100pg/ml. Po 24 hodinách se buňky se promyly a inokulovaly po čtyři hodiny s HIV, kmen IIIB, znovu se promyly a resuspendovaly se na hustotu 500000 buněk na mililitr. Médium se doplnilo a udržovalo se s SLPI v konečné koncentraci 100 pg/ml ihned po resuspendování (T=0) nebo 2 dny po resuspendování (T=2). Supematant z kultury se shromažďoval a kultury se krmily každé 2 dny. Supematant sebraný 8 dní po infekci se testoval na aktivitu reverzní transkriptázy měřením záchytu triciovaného thymidinu na poly(rA)oligo(dT)matrici.

Jak je ukázáno v Tabulce 1, u buněk předem ošetřených SLPI, SLPI inhiboval replikaci na přibližně 62 %, když se přidal ihned po infekci, a 54 % když se přidal 2 dny po infekci.

-5CZ 286953 B6

Tabulka 1

Buňky předem ošetřené SLPI

	Negativní kontrola	Pozitivní kontrola	T = 0	T = 2
Aktivita RT (střední cpm)	995	86,205	32,594	39,554
Standardní odchylka	±330	± 9,676	± 7,220	± 8,737

Příklad 5

Pokus se prováděl jako v příkladu 4 s tím rozdílem, že se inkuboval 1000 krát koncentrovanější HIV, kmen IIIB, se 100 pg/ml SLPI po 6 hodin na ledu před inokulováním. Tato HTV/SLPI směs se zředila 1000 krát před čtyřhodinovým inokulováním.

Jak je ukázáno v Tabulce 2, při použití viru a buněk předem ošetřených SLPI, SLPI inhiboval replikaci na přibližně 64 %, když se přidal ihned po infekci, a 26 % když se přidal 2 dny po infekci.

Tabulka 2

Buňky a virus předem ošetřené SLPI

	Negativní kontrola	Pozitivní kontrola	T = 0	T = 2
Aktivita RT (střední cpm)	2,889	59,004	20,676	43,432
Standardní odchylka	±565	± 10,988	±4,111	± 14,982

Příklad 6

Pokus se prováděl jako v příkladu 5 s tím rozdílem, že buňky byly čisté, například se napěstovaly s SLPI před inokulováním. Použitím čistých buněk a viru předem ošetřeného SLPI inhiboval replikaci viru na přibližně 59 %, když se přidal ihned po infekci, a 32 % když se přidal 2 dny po infekci (Tabulka 3).

Tabulka 3

Virus předem ošetřený SLPI

	Negativní kontrola	Pozitivní kontrola	T = O	T = 2
Aktivita RT (střední cpm)	4,763	70,076	28,383	47,436
Standardní odchylka	± 1,698	± 15,803	± 5,520	± 11,679

Příklad 7

Pokus se prováděl jako v příkladech 4-6 s tím rozdílem, že ani buňky ani virus se nevystavily SLPI před inokulováním. Při použití čistých buněk a čistého viru SLPI inhiboval replikaci viru na přibližně 50 %, když se přidal ihned po infekci, a 42 % když se přidal 2 dny po infekci (Tabulka 4).

-6CZ 286953 B6

Tabulka 4

Čisté buňky a virus	Negativní kontrola	Pozitivní kontrola	T = 0	T = 2
Aktivita RT (střední cpm)	531	79,356	38,969	46,004
Standardní odchylka	± 186	± 17,497	± 7,700	± 8,492

Tabulka 5 ukazuje aktivitu reverzní transkriptázy přítomnou v supematantu z kultury testované 4, 6 a 8 dní po infekci.

Tabulka 5

Čisté buňky a virus

	Negativní kontrola	Pozitivní kontrola	T = 0	T = 2
Den 4 (střední cpm)	435	1,556	797	1,287
Standardní odchylka	±85	±300	±222	±204
Den 6 (střední cpm)	952	72,085	15,846	41,240
Standardní odchylka	±715	± 12,219	± 5,644	± 14,542
Den 8 (střední cpm)	1,519	13,853	7,617	11,946
Standardní odchylka	±475	±3,458	±3,031	± 2,889

Příklad 8

Zkoumal se rovněž účinek SLPI muteinů na replikaci viru. Čisté H-9 buňky se inkubovaly s čistým virem jako v příkladu 7. Po promytí se buňky resuspendovaly na hustotu 500 000 buněk na mililitr v médium s SLPI nebo SLPI muteiny v koncentraci 30 pg/ml, jak je ukázáno v Tabulce 6. Supematant se testoval na aktivitu reverzní transkriptázy 8 dní později (Tabulka 6).

Tabulka 6

	Negativní kontrola	Pozitivní kontrola	Divoký typ	Gly20	Gly72	Val72	Lys72	Phe72
Aktivita RT (střední cpm)	4,815	55,126	39,323	39,387	40,549	36,077	52,239	8,384
Standardní odchylka	± 2,849	± 6,637	± 10,933	± 11,143	±3,537	± 7,859	± 5,863	± 1,924

Příklad 9

Pokus se prováděl jako v příkladu 8 s tím rozdílem, že se buňky po inokulování resuspendovaly v médiu s SLPI nebo muteinem Phe 72 v koncentraci 100 mikrogramů na mililitr. Supematant se testoval na aktivitu reverzní transkriptázy 2, 4, 6, 8 a lOdní po infekci (Tabulka 7). Tabulky 6 a 7 ukazují, že účinek muteinu Phe 72 byl zvlášť výrazný.

Tabulka 7

Čisté buňky a virus

	Negativní kontrola	Pozitivní kontrola	SLPI	Phe72
Den 2 (střední cpm)		1,386	995	897
Standardní odchylka		±914	±246	±472
Den 4 (střední cpm)		1,356	1,087	1,380
Standardní odchylka		±370	±414	±442
Den 6 (střední cpm)	1,142	2,103	1,526	748
Standardní odchylka	±389	±498	±508	±243
Den 8 (střední cpm)		77,931	25,241	3,491
Standardní odchylka		± 9,779	8,399	1,086
Den 10 (střední cpm)		21,431	12,499	2,239
Standardní odchylka		± 1,890	± 3,495	±444

Příklad 10

Aby se stanovil účinek samotného SLPI, vyhodnocovalo se množení H-9 buněk kultivovaných s 10 100 pg/ml SLPI nebo bez SLPI. Kultury se proháněly s médiem obsahujícím 2,5 mikrocurie triciovaného thymidinu ve dnech 0, 1 a 2, zachycené počty se měřily ve dnech 1, 2 a 3. Jak je ukázáno v Tabulce 8, SLPI není vůči těmto buňkám toxický.

Tabulka 8

Aktivita RT (střed cpm)

Množení H-9 buněk

	Den 1	Den 2	Den 3
Kontrola (- SLPI)	20,860	67,401	53,326
Standardní odchylka	±581	± 2,529	± 3,783
+ SLPI 100 pg/ml	20,437	61,892	54,592
Standardní odchylka	± 1,503	±216	±2,781

Příklad 11

Zkoumala se rovněž inhibice produkce viru z chronicky infikovaných buněk s použitím promonocytové buněčné linie Ul. Suspenzní kultury U1 se udržovaly vRPMI s 10% FCS a 200 pg/l gentamicinu. Buňky se sklidily, promyly a suspendovaly se na hustotu 2,5 milionu buněk na mililitr. Suspendované buňky se kultivovaly přes noc v médiu obsahujícím 100 nebo 200 pg/ml SLPI nebo v samotném médiu. Virus se indukoval přídavkem 13-forbol-1230 myristátacetátu (PMA) na konečnou koncentraci 1 μΜ. Po 48 hodinách se supematant z kultury testoval na aktivitu reverzní transkriptázy jako v příkladech 4 až 9. Tabulka 9 ukazuje, že SLPI významně inhiboval produkci viru z těchto chronicky infikovaných buněk.

-8CZ 286953 B6

Tabulka 9

	-PMA -SLPI	-PMA + SLPI (200 pg/ml)	+ PMA -SLPI	+ PMA + SLPI (200 pg/ml)	+ PMA + SLPI (100 pg/ml)
Aktivita RT (střed cpm)	1,052	994	5,052	2,864	2,648
Standardní odchylka	±352	±447	± 2,053	±403	±374

Předcházející popis je příkladem pro účel osvětlení a vysvětlení. Mělo by být chápáno, že lze provést různé modifikace, aniž by to bylo mimo duch a rozsah vynálezu. Proto následující nároky by měly být vykládány a interpretovány tak, aby zahrnoval všechny takové modifikace.

Claims (6)

1. Použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI pro výrobu léčiva pro blokování retrovirové infekce.

2. Použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI podle nároku 1, kde retrovir je virus lidské imunodefícience HIV.

3. Použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI podle nároku 1, kde analog či derivát SLPI je vybrán ze skupiny sestávající z SLPI Phe 72 mutein, SLPI Gly 20 mutein, SLPI Gly 72 mutein, SLPI Val 72 mutein, CLPI Phe 25 mutein, CLPI Gly 25 mutein a CLPI Val 25 mutein, přičemž CLPI je seříznutý SLPI protein, u něhož je prvních 47 aminokyselinových zbytků SLPI vypuštěno.

4. Použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI podle nároku 1, pro přípravu léčiva k blokování funkce enzymu hostitelské buňky, kde funkce enzymu je nezbytná pro retrovirovou infekci buňky, přičemž hostitelská buňka je monocyt nebo buňka, která je prekurzorem monocytu.

5. Použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI podle nároku 4, kde hostitelská buňka je monocyt.

6. Použití inhibitoru serinové leukocytové proteázy nebo jeho analogu či derivátu SLPI podle nároku 4, kde hostitelská buňka je promonocyt.