NO315546B1 - Inhibisjon av retro virusinfeksjon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelsen angår anvendelse av en serinleukocyttproteaseinhibitor (SLPI) eller SLPI mutein til å fremstille et legemiddel for å inhibere human immunsviktvirus (HIV) infeksjon.

Retrovirale midler er blitt implisert i et antall sykdommer, inkludert kreft, autoimmunsykdom og AIDS. Human immunsviktvirus (HlV)-infeksjon forårsaker kronisk progressiv uttømming av CD4<+> T-lymfocytter (CD4<+->celler) og infeksjon av makrofager, som resulterer i akvirert immunsviktsyndrom. For tiden er zidovudin (AZT), en analog av tymidin, det primære antivirale legemiddel anvendt ved behandling av HIV-infeksjon, skjønt to andre midler med en lignende virkningsmekanisme, dideoksyinosin (ddl) og dideoksycytosin (ddC) blir også brukt. Colley, T.P. et al, New Engl. J. Med. (1990) 322:1340-45; Fischl, M.A. et al, New Engl. J. Med. (1987) 317:185-91. Disse midler er effektive til å inhibere virusreplikasjon og kan stabilisere CD4<+->cellenivåene, men de er ute av stand til å eliminere en av de viktigste virusreservoarer, HIV-infiserte makrofager. Gartner, S. et al, Science (1986) 233:215-19. Alvorlig toksisitet, spesielt omfattende HIV-vertsbenmarg er også assosiert med behandling med høyere doser av AZT, og de gunstige virkningene av medikamentet i AIDS-pasienter avtar etter forlenget terapi; HIV-stammer, motstandsdyktige ovenfor AZT er også blitt observert i behandlede pasienter. Disse funn har tilskyndet søkingen etter alternative legemidler for behandling av HIV-infeksjon, spesielt midler med en forskjellig virkningsmekanisme.

Human immunsviktvirus type 1 (HIV-1), et retrovirus, er den etiologiske årsak til AIDS. HIV-1 omgivende glykoprotein, gpl20, bindes spesifikt til CD4-reseptorer på T-lymfocyttene og på monocytter og makrofager. Skjønt infeksjon av T-lymfocytter krever cellulær proliferering og DNA-syntese, kan produktiv infeksjon av monocytter skje uavhengig av cellulær DNA-syntese (Weinberg, J.B. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1477-82). Når HIV-1 infiserer aktiverte CD4<+->lymfocytter er det letalt, men infiserte monocytter blir relativt resistente til destruksjon av virus. Følgelig tjener disse celler, når de er infisert med HIV-1 som langlivede reservoarer for viruset. Ikke bare er disse celler en kilde til replikerende virus men deres virusmedierte dysfunksjon kan bidra til økt susceptibilitet til opportunistiske infeksjoner som er kjennetegnet til AIDS.

Fordi monocyttmakrofager tjener som reservoarer for HIV-1 gir selektiv målsøking av denne populasjon i tillegg til T-lymfocytter opphav til ytterligere vurderinger (Finberg, R.W., et al, Science 252:1703-05, 1991). Tidlige rapporter fra Fox gruppe (JADA 118:709-711, 1989) anga at en komponent av humant spytt blokkerer HIV-replikasjon. Mer nylig viste Hattori (FEBS Lett. 248:48-52, 1989) at en inhibitor av tryptase (et trypsin-lignende enzym) kan inhibere syncytiadannelse av T-celler indusert av HIV.

Ved å undersøke forskjellige potensielle modulatorer for HIV-1-infeksjon har vi nylig identifisert en endogen kilde til inhibitorisk aktivitet som forsinker HIV-1-infeksjon og/eller replikasjon.

Faktoren som er ansvarlig for antivirus aktivitet er serinleukocyttproteaseinhibitor (SLPI). SLPI er en kraftig inhibitor for human leukocytt elastase og katepsin G og av humant trypsin, og er blitt renset fra parotide sekreter (Thompson, R.C. og K. Ohlsson, (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:6692-96; og US-PS 4 760 130, hvorav begge er inkorporert heri ved referanse). SLPI er nå tilgjengelig gjennom produksjon med rekombinant-DNA-teknikker; US patentsøknad nr. 07/712 354, innsendt 7. juni 1991, PCT-søknad nr. WO86/03519, innsendt 4. desember 1985, og europeisk patentsøknad 85 905 953.7, innsendt 4. desember 1985, hvorav hver er inkorporert heri ved referanse).

Evnen til SLPI og/eller dens derivater og analoger til å blokkere HIV-1-infeksjon og/eller replikasjon kan tilveiebringe basis for terapeutisk intervensjon i HIV-1-infeksjon.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe anvendelse av SLPI til å fremstille legemidler for behandling av HIV. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse av SLPI eller SLPI mutein for fremstiling av legemidler for hindre infeksjon av humane celler med humant immunsviktvirus (HIV).

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1. SLPI blokkerer HIV-replikasjon i monocytter på en doseavhengig måte. Elutrierte humane monocytter ble platet og eksponert for HIV + SLPI i en time ved 37°C, vasket og inkubert ved 37°C, supernatantene ble.trukket av og det ble tilsatt friskt medium hver fjerde dag. EC50 for dette eksperimentet var <0,1 jig/ml (8,5 nM) med fullstendig inhibering ved 10 ug/ml (850 nM). Fig. 2. Den SLPI-inhibitoriske virkning varer lenge. På 18-dags tidspunkt er HIV fremdeles 90% inhibert.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av SLPI eller SLPI mutein til fremstillinger av et legemiddel til å hindre HIV-infeksjon av humane celler.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabel bærer" som anvendt heri betyr en ikke-toksisk, generelt inert vehikkel for den aktive ingrediens, som ikke på en skadelig måte påvirker ingrediensen eller pasienten som formuleringen blir administrert til. Betegnelsen "effektiv mengde" som anvendt heri betyr en forutbestemt mengde av SLPI eller en analog eller derivat derav, tilstrekkelig til å være effektiv mot HIV in vivo.

I henhold til teknikkens stand blir retrovirusinfeksjoner behandlet ved å administrere anti-retrovirusmidler i doser som er tilstrekkelig til å forminske virkningen av slik infeksjon. Retrovirusinfeksjoner er innblandet i et antall sykdommer, inkludert men ikke begrenset til kancer, autoimmunsykdom og akvirert immunsviktsyndrom. Human immunsviktvirusinfeksjon er av spesiell interess i henhold til foreliggende oppfinnelse.

En variasjon av anti-retrovirusmidler er kjent på området. Mesteparten av disse inhiberer aktiviteten til retrovirus revers transkriptase og inkluderer zidovudin (AZT), en analog av tymidin, dideoksyinosin (ddl), og dideoksycytosin (ddC). Zidovudin er det primære antiviruslegemiddel som brukes ved behandling av HIV-infeksjon. Antiretrovirusmidler er generelt virksomme i en dose som strekker seg fra ca. 50 mg/dag til ca. 1000 mg/dag, mer foretrukket fra ca. 100 mg/dag til ca. 500 mg/dag, og i tilfelle av zidovudin, spesifikt ca. 300 mg/dag til ca, 500 mg/dag. Disse midler blir generelt administrert i orale formuleringer.

Proteaseinhibitorene anvendt i foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hjelp av midler som er kjent for de som har fagkunnskap på området (se f.eks. TJS-PS 4 760 130; europeisk patentsøknad nr. 85 905 953.7, PCT-søknad WO86/03519, og US patentsøknad 07/712 354, supra).

Den foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av proteaseinhibitorer som er blitt isolert i en renset form. Fortrinnsvis er serinproteaseinhibitorene i henhold til foreliggende oppfinnelse enkelt-polypeptid-kjedede proteiner som er hovedsakelig homologe til, og mest foretrukket biologisk ekvivalente til, den native serinproteaseinhibitor, isolert fra humane parotidesekresjoner. Den native serinproteaseinhibitor blir også referert til som den native parotideinhibitor. Ved "biologisk ekvivalent" som anvendt i fremstillingen er det ment at blandingene ér i stand til å inhibere den monocytt-avledede protease som blir inhibert av SLPI, men ikke nødvendigvis i samme grad. Ved "derivater" som anvendt i den følgende fremstilling er det ment en grad av aminosyrehomologi til den native parotideinhibitor, fortrinnsvis større enn 40%, mest fortrinnsvis større enn 50%, med en spesielt foretrukket gruppe av proteiner som er mer enn 60% homologe med den native parotidinhibitor. Prosentandel homologi, som beskrevet ovenfor, blir beregnet som prosentandelen av komponentene funnet i den mindre av de to sekvenser som også kan finnes i den større av de to sekvenser, idet en komponent er forstått som en sekvens på fire tilstøtende aminosyrer.

Et nyttig SLPI-derivat er CLPI, et trunkert SLPI-molekyl som har bare de 60 siste aminosyrer til den native parotidinhibitor. Disse 60 aminosyrer er:

Den følgende nukleotidsekvens er blitt anvendt til å kode det ovenstående molekyl med 60 aminosyrer:

CLPI er blitt konstruert ved å deletere fra SLPI-genet signalsekvensen og nukleotidene som tilsvarer de første 47 aminosyrer i det modne SLPI-protein som beskrevet i US patentsøknad 07/712 354. SLPI kan også fremstilles ved fremgangsmåten angitt i eksempel 8, beskrevet både i PCT-søknad WO86/03519 og europeisk patentsøknad 85 905 953.7. Skjønt eksempel 8 i disse to søknader beskriver en fremgangsmåte til å fremstille SLPI, kan denne fremgangsmåte også anvendes til å fremstille CLPI. CLPI kan anvendes til å danne antistoffer som er nyttige til å rense SLPI. Antistoffer kan fremstilles f.eks. ved fremgangsmåten diskutert i E. Harlow & D. Lane, Antibodies:

A Laboratory Manual, side 92-114 (Cold Springs Harbor Laboratory, 1988).

Ved "analoger" som anvendt heri er det ment enhver forbindelse inkludert f.eks. små organiske forbindelser, som er funksjonelt biologisk ekvivalente til SLPI til å inhibere HIV-infeksjon. Slike derivater og analoger kan isoleres med fremgangsmåter som er velkjent for de med kunnskap på området, inkludert anvendelse av monocyttceller til å screene for forbindelser som hindrer SLPI fra å bindes dertil. Analoger kan også inkludere spesifikke SLPI-muteiner som har minst ekvivalent, og i noen tilfelle, større aktivitet enn det native protein. Spesielt nyttige SLPI-muteiner inkluderer substitusjon av de følgende aminosyrer på de nummererte restposisjoner: Gly 20, Gly 72, Val 72 og Phe 72.

CLPI-muteiner er også innenfor området til oppfinnelsen. CLPI-muteiner som tilsvarer SLPI-muteinene Gly 72, Val 72 og Phe 72 blir heri referert til som Gly 25, Val 25 og Phe 25. Noen vurderte CLPI-muteiner har den følgende aminosyresekvens:

hvori R7 er alanin og R3, R4, R5, R6 og R8 er de samme eller forskjellige aminosyrer og en eller flere av R3, R4, R5, R6 og R8 kan være metionin, valin, alanin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, lysin, glycin eller arginin. Analoger inkluderer også f.eks. PEGylerte former av SLPI eller CLPI som kan ha forbedrede terapeutiske egenskaper over det native SLPI-protein. Muteiner som kan være egnet for PEGylering inkluderer de som har en cysteinrest i posisjoner 13, 23, 52, 58, 68 og/eller 75 i SLPI og på de tilsvarende setene 5, 11, 21 og 28 i CLPI. Fremstilling av cysteinmuteiner for PEGylering er beskrevet i PCT-søknad W092/16221, innsendt 13. mars 1992, som er spesifikt inkorporert heri ved referanse, Et nyttig trinn i muteinproduksjon som inkluderer et refoldingstrinn, i hvilket cystein blir satt til oppløsningen som inneholder proteiner. Cystein kan assistere i refolding og kan bindes til det substituerte frie cystein i muteiner. Man kan også isolere fra monocytter det SLPI-inhiberbare protein (SIP) fra humane monocyttceller ved å bruke standard biokjemisk teknikk som er velkjent for de som har kunnskap på området å rense proteinene som har proteolyttisk aktivitet som blir inhibert av SLPI. Etter rensing av proteinet (og dersom nødvendig, sekvensering av det, kloning av dets gen og uttrykk av det i vertsceller, dvs. å produsere SIP-rekombinant) kan man screene for inhibitorer av SIP ved midler som er kjent for de som har kunnskap på området. Alternativt kan man bestemme dets struktur og konstruere inhibitorer fra det, også ved hjelp av midler som er velkjent for de som har kunnskap på området.

Når SLPI eller en analog eller derivat derav blir anvendt til å bekjempe HIV-infeksjoner i et menneske kan forbindelsen administreres oralt eller parenteralt, i en vehikkel som omfatter en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, forholdet til hvilke,her bestemt av oppløseligheten og kjemisk natur til forbindelsen, valgt administrasjonsrute og standard biologisk praksis. For oral administrering kan SLPI eller analog eller derivat derav formuleres i enhetsdoseformer, såsom kapsler eller tabletter hvor hver inneholder en forutbestemt mengde av den aktive ingrediens, som strekker seg fra ca. 10 til 1000 mg, mer fortrinnsvis 10 til 200 mg pr. dag pr. pasient, enda mer fortrinnsvis 20 til 200 mg pr. dag pr. pasient, i en farmasøytisk akseptabel bærer.

For parenteral administrering blir SLPI eller analog eller derivat derav administrert ved enten intravenøst, subkutan eller intramuskulær injeksjon, i blandinger med farmasøytisk akseptable vehikler eller bærere. For administrasjon ved injeksjon er det foretrukket å anvende forbindelsen i en oppløsning i en steril vandig vehikkel som også kan inneholde andre oppløste midler, såsom buffere eller preserverende midler såvel som tilstrekkelige mengder av farmasøytisk akseptable salter eller av glukose for å gjøre oppløsningen isoton. Subkutan injeksjon er den foretrukne administrasjonsrute. Dosene blir essensielt de samme som de fremsatt ovenfor for oral administrering.

Egnede vehikler eller bærere for de ovenfor fremførte formuleringer kan finnes i standard farmasøytiske lærebøker, f.eks. i "Remington's Pharmaceutical Sciences," I6th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980 og inkorporert heri ved referanse.

Forbindelsens dose vil variere med administrasjonsformen og det spesielle aktive middel valgt. Videre vil det variere med den spesielle pasient eller vert (inkludert pattedyr, inkludert mennesker) under behandling. Generelt blir behandling initiert med små doser, betydelig mindre enn den optimale dose av forbindelsen. Deretter blir dosen økt ved små økninger inntil den optimale virkning under foreliggende om-stendigheter blir nådd. Generelt er forbindelsen mest ønskelig administrert på et konsentrasjonsnivå som generelt vil oppnå effektive antivirusresultater uten å forårsake skadelige eller ødeleggende bivirkninger. Det er ønskelig å opprettholde blodnivå av forbindelsen på et nivå som er tilstrekkelig til å hindre . retrovirusinfeksjon i. vertscellen. Dette kan beregnes ved å assaye mengden av forbindelse som er effektivt til å hindre retrovirusinfeksjon i vertsceller, f.eks. HIV i monocytter, in vitro og deretter ved å benytte standard farmakokinetisk teknikk bestemme mengden av forbindelse som er nødvendig for å opprettholde plasmanivåer på det samme inhibitoriske nivå eller opptil 10-100 ganger mer.

Skjønt formuleringene beskrevet ovenfor er effektive og relativt sikker medikasjon for behandling av HIV-infeksjoner er den mulige samtidig administrering av disse formuleringer med andre antivirusmedikamenter eller midler for å oppnå gunstige resultater ikke ekskludert. Slike andre antiviruslegemidler eller midler inkluderer oppløselig CD4, zidovudin, dideoksycytidin, fosfonoformat, ribavarin, antivirusinterferoner (f.eks. alfa-interferon eller interleukin-2) eller aerosolpentamidin.

Oppfinnelsen er eksemplifisert ved de følgende illustrerende eksempler:

Eksempel 1

Perifere blodmonocytter (PBM) ble isolert fra sunne givere ved elutriering, platet på kulturskåler og inkubert i flere dager. SLPI ble blandet med HIV (Bal) og applisert på PBM i en time ved 37°C. Celler ble vasket og inkubert i ytterligere tid, med forandringer av media og revers transkriptasebestemmelser på supernatanter foretatt hver tredje dag. Vi fant at SLPI effektivt blokkerte HIV-repIikasjon ved en konsentrasjon på 1 u.g/ml (Fig. 1). Ved konsentrasjoner > 25 ug/ml, ble SLPI-inhibisjonen redusert. Den inhibitoriske virkning er lengevarende med betydelig inhibisjon observert ut til 18 dager (Fig. 2).

Eksempel 2

PBM ble platet og inkubert som i eksempel 1. SLPI ble applisert på celler i ca. en time, cellene ble deretter vasket og behandlet med HIV. Medium ble forandret og assays foretatt som i eksempel 1. Vi fant at SLPI var mer effektivt til å blokkere HIV når cellene ble forbehandlet med SLPI enn når cellene ble behandlet med en blanding av SLPI og HIV.

Eksempel 3

Vi har også demonstrert ved å anvende essensielt den samme protokoll som i eksempel 1, men ved å substituere T-celler for monocytter, at SLPI er effektivt til å inhibere HIV-replikasjon i T-celler.

Eksempel 4

En human T-lymfocytcellelinje (H-9) ble opprettholdt i suspensjonskultur i

RPMI 1640 med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 200 ug pr. liter gentamicin. SLPI ble satt til kulturmediet i en endelig konsentrasjon på 100 u.g pr. ml. Etter 24 timer ble celler vasket, inokulert i fire timer med HIV-stamme IIIB, vasket igjen og fesuspendert i en tetthet på 500000 celler pr. ml. Media ble supplementert og opprettholdt med SLPI i en endelig konsentrasjon på 100 fig pr. ml. umiddelbart etter resuspensjon (T=0) eller 2 dager etter resuspensjonen (T=2). Kultursupernatant ble oppsamlet og kulturer ble foret hver annen dag. Supernatant oppsamlet 8 dager etter infeksjon ble assayet for revers transkriptaseaktivitet ved å måle opptaket av tritiert thymidin på en poly(rA)-oligo(dT) templat.

Som vist i tabell 1, i SLPI-forbehandlede celler, inhiberte SLPI virusreplikasjonen ca. 62% og 54% når det tilsettes henholdsvis øyeblikkelig etter infeksjon og 2 dager etter infeksjon.

Eksempel 5

Eksperimentet ble utført som beskrevet i eksempel 4 med unntagelse av at 1000 ganger konsentrerte HIV-stamme UIB ble inkubert med 100 ug pr. ml SLPI i 6 timer på is før inokuleringen. Denne HIV/SLPI-blanding ble fortynnet 1000 ganger før fire timers inokuleringen.

Som vist i tabell 2, ved å anvende SLPI forbehandlet virus og celler, inhiberte SLPI virusreplikasjon med tilnærmet 64% og 24% når det tilsettes henholdsvis øyeblikkelig etter infeksjon og 2 dager etter infeksjon.

Eksempel 6

Eksperimentet ble utført som i eksempel 5 unntagen at cellene var rene, dvs. ikke dyrket med SLPI før inokulering. Ved å bruke rene celler og SLPI-forbehandlet virus, inhiberte SLPI virusreplikasjon med ca. 59% og 32% når det ble tilsatt henholdsvis øyeblikkelig etter infeksjon og 2 dager etter infeksjon (tabell 3).

Eksempel 7

Eksperimentet ble utført som i eksempler 4-6 med unntagelse av at hverken celler eller virus ble eksponert for SLPI før inokulering. Ved å anvende rene celler og ren virus inhiberte SLPI virusreplikasjon med ca. 50% og 42% når det ble tilsatt henholdsvis øyeblikkelig etter infeksjon og 2 dager etter infeksjon (tabell 4). Tabell 5 viser revers transkriptaseaktivitet som var til stede i kultursupernatanten assayet 4, 6, og 8 dager etter infeksjon.

Eksempel 8

Virkningen av forskjellige SLPl-muteiner på virusreplikasjon ble også undersøkt. Rene H-9-celler ble inkubert med ren virus i 4 timer som i eksempel 7. Etter vasking ble cellene resuspendert med en tetthet på 500000 celler pr. ml i media som inneholder 30 u,g pr. ml SLPI eller SLPI-muteiner vist i tabell 6. Kultursupernatant ble assayet for revers transkriptaseaktivitet etter 8 dager (tabell 6).

Eksempel 9

Eksperimentet ble utført som i eksempel 8 med unntagelse av at etter inokulering ble cellene resuspendert i media som inneholdt 100 u.g pr. ml SLPI eller Phe 72-muteinet. Kultursupernatant ble assayet for revers transkriptaseaktivitet 1, 4, 6, 8 og 10 dager etter infeksjon (tabell 7). Tabell 6 og 7 viser at effekten av Phe-72-muteinet var spesielt uttalt.

Eksempel 10

For å bestemme virkningen av SLPI alene ble H-9 celleproliferering evaluert ved thymidininkorporeringsassayer ved å anvende 200000 H-9-celler dyrket med 100 jo.g pr. ml SLPI og uten SLPI. Kulturene ble pulsert med media som inneholder 2,5 mikrocouri tritiert thymidin på dag 0, 1 og 2; inkorporerte tellinger ble målt på dag 1, 2 og 3. Som vist i tabell 8 er ikke SLPI toksiske for disse celler.

Eksempel II

Vi undersøkte også inhibering av virusproduksjon fra kronisk infiserte celler ved å anvende promonocytt-cellelinje Ul. Suspensjonskultur av Ul ble opprettholdt i RPMI med 10% FCS og 200 jig pr. liter gentamicin. Cellene ble høstet, vasket og suspendert ved en tetthet på 2,5 millioner celler pr. ml. Suspenderte celler ble dyrket natten over i media som inneholdt 100 eller 200 ug pr. ml SLPI eller media alene. Virus ble indusert ved tilsetting av 13-forbol-12-myristatacetat (PMA) til en endelig konsentrasjon på 1 mikromolar. Etter 48 timer ble cellekultursupernatanten assayet for revers transkriptaseakti vitet som i eksempler 4-9. Som vi st. i tabell 9 inhiberte SLPI signifikant virusproduksjon fra disse kronisk infiserte celler.

Claims (12)

1. Anvendelse av en serinleukocyttproteaseinhibitor (SLPI) eller SLPI mutein til å fremstille et legemiddel for å inhibere human immunosviktvirus (HIV) infeksjon.

2. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori HIV er HIV-1.

3. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI blir administrert intrapeirtonealt.

4. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI blir administrert intravenøst.

5. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI blir administrert subcutant.

6. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI muteinet er SLPI Phe 72.

7. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI muteinet er SLPI Gly 20.

8. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI muteinet er SLPI Gly 72.

9. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI muteinet er SLPI Val 72.

10. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI muteinet er CLPI Phe 25.

11. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI muteinet er CLPI.Gly 25.

12. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori SLPI muteinet er CLPI Val 25.