SK281127B6

SK281127B6 - Použitie inhibítora serínovej leukocytovej proteázy

Info

Publication number: SK281127B6
Application number: SK297-95A
Authority: SK
Inventors: Stephen Eisenberg; Sharon M. Wahl; Robert C. Thompson
Original assignee: Amgen Inc.; Dept. Of Health A. Human Services Office Of Technology
Priority date: 1992-09-09
Filing date: 1993-09-09
Publication date: 2000-12-11
Also published as: ES2197153T3; NO315546B1; PL307864A1; UA41338C2; NO950897D0; JPH08505042A; OA10133A; FI951078A; EP0666755B1; WO1994006454A2; DK0666755T3; DE69332904T2; RU95109909A; KR100273620B1; HUT75126A; RU2126266C1; CA2141951C; WO1994006454A3; CA2141951A1; JP3517238B2

Abstract

Použitie inhibítora serínovej leukocytovej proteázy alebo jeho analógu, alebo derivátu (SLPI) na výrobu liečiva na inhibovanie retrovírusovej infekcie, a teda na liečenie retrovírusových infekcií, najmä na liečenie infekcie spôsobenej vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV) a s ňou spojených ochorení, vrátane syndrómu získanej imunodeficiencie (AIDS).ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka použitia inhibítora serínovej leukocytovej proteázy alebo jeho analógu, alebo derivátu (SLPI) na výrobu liečiva na inhibovanie retrovírusovej infekcie, a teda na liečenie retrovírusových infekcií, najmä na liečenie infekcie spôsobenej vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV) a s ňou spojených ochorení, vrátane syndrómu získanej imunodeficiencie (AIDS).

Doterajší stav techniky

Retrovírusy boli zistené ako pôvodcovia radu ochorení vrátane rakoviny, autoimunitného ochorenia a AIDS. Vírusová infekcia vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV) pôsobí chronické progresívne ubúdanie CD4⁺ T-lymfocytov (CD4⁺ buniek) a infekciu makrofágov, vedúcu k syndrómu získanej imunodeficiencie. V súčasnosti je základným antivírusovým liekom používaným pri liečení HIV infekcie zidovudín (AZT), analóg timidínu, hoci sa používajú ešte dva iné preparáty s podobným mechanizmom účinku - dideoxyinozín (ddl) a dideoxycytozín (ddC) [Colley, T. P. a d’al., New Engl. J. Med. (1990) 322, 1340 - 45; Fischl, M. A a d’al., New Engl. J. Med. (1987) 317, 185 - 91], Tieto preparáty sú účinné pri inhibícii replikácie vírusu a môžu stabilizovať hladinu CD4⁺ buniek, ale nie sú schopné eliminovať jeden z hlavných zásobníkov vírusov, makrofágy nakazené HIV [Gartner, S. a d’al., Science (1986) 233, 215 až 19], S vysokými dávkami AZT, použitými na liečenie, je spojená tiež vysoká toxicita zasahujúca najmä kostnú dreň hostiteľa HIV a priaznivé účinky u AIDS pacientov sa znižujú po dlhšej liečbe. Pri liečených pacientoch sa taktiež pozorovali kmene HIV odolné proti AZT. Tieto zistenia podnietili výskum alternatívnych liekov na liečenie infekcie HIV, najmä látok s rôznym mechanizmom účinku.

Etiologickou príčinou AIDS je vírus ľudskej dcficiencie typu 1 (HIV-1), retrovírus. Obalový glykoproteín HIV-1, gpl20, sa špecificky viaže na CD4 receptory T-lymfocytov, na monocyty a makrofágy. Hoci infekcia T-lymfocytov vyžaduje množenie buniek a syntézu DNA, k produktívnej infekcii monocytov môže dôjsť nezávisle od syntézy bunkovej DNA [Wienberg, J. B. a kol. (1991), J. Exp. Med. 174, 1477 - 82], Keď HIV-1 infikuje aktivované CD4⁺ lymfocyty, je to smrteľné, ale nakazené monocyty sú relatívne odolné proti deštrukcii vírusom. V dôsledku toho bunky, pokiaľ sú raz nakazené HIV-1, slúžia ako zásobník vírusov. Tieto bunky sú nielen zdrojom replikácie vírusov, ale ich vírusmi spôsobená dysfunkcia môže prispieť k zvýšenej citlivosti na príležitostné infekcie, ktoré sú pre AIDS príznačné.

Pretože monocyty-makrofágy slúžia ako rezervoár HIV-1, selektívne zameranie na túto populáciu popri T-lymfocytoch si zasluhuje ďalšiu úvahu (Finberg, R. N. a d’al., Science /1991/ 252, 1703 - 05). Prvé správy od skupiny Foxa(JADA 118, 709 - 11,1989) naznačovali, že jedna zložka ľudských slín blokuje replikáciu HIV.

Pri hľadaní rôznych potenciálnych modulátorov infekcie HIV-1 sa nedávno identifikoval endogénny zdroj inhibičnej aktivity, ktorá spomaľuje infekciu a/alebo replikáciu HIV-1.

Faktorom pôsobiacim antivírusovú aktivitu je inhibítor serínovej leukocytovej proteázy (SLPI). SLPI je silným inhibítorom ľudskej leukocytovej proteázy, katepsínu G a ľudského trypsínu a bol vyčistený z výlučkov príušnej žľazy (Thompson, R. C. a Ohlson, K. (1966) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6692 - 96 a US patent 4 760 130; obidva sú obsiahnuté v opise týmto odkazom). SLPI je teraz dostupný pripravením pomocou techniky rekombinantnej DNA, US patentová prihláška číslo 07/712,354 podaná 7. júna 1991, PCT prihláška číslo WO 86/03519 podaná 4. decembra 1985 a európska patentová prihláška číslo 85 905 953 7 podaná 4. decembra 1985, všetky sú zahrnuté do opisu týmto odkazom).

Schopnosť SLPI a/alebo jeho derivátov a analógov blokovať infekciu a/alebo replikáciu HIV-1 môže poskytnúť základňu terapeutickej intervencie pri infekcii HIV-1.

Podstata vynálezu

Tento vynález opisuje použitie inhibítora serínovej leukocytovej proteázy alebo jeho analógu, alebo derivátu na prevenciu alebo liečenie retrovírusových infekcií cicavčích buniek vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV) a s ňou spojených ochorení vrátane syndrómu získanej imunodeficiencie (AIDS).

Výraz „farmaceutický prijateľný nosič“, ako sa tu používa, znamená netoxické, všeobecne prijateľné vehikulum aktívnej zložky, ktoré nepriaznivo neovplyvňuje aktívnu zložku alebo pacienta, ktorému sa preparát podáva.

Výraz „účinné množstvo“, ako sa tu používa, znamená vopred stanovené množstvo SLPI alebo jeho analógu, resp. derivátu, postačujúce na vyvolanie účinku proti HIV in vito.

Podľa tohto vynálezu sa retrovírusová infekcia lieči podávaním antiretrovírusových činidiel v dávkach dostatočných na zníženie účinku takýchto infekcií. Retrovírusové infekcie sa podieľajú na celom rade ochorení vrátane rakoviny, autoimunitnej choroby a syndrómu získanej imunodeficiencie. Infekcia spôsobená vírusom ľudskej imunodeficiencie je podľa tohto vynálezu stredobodom zvláštneho záujmu.

V odbore je známy celý rad antiretrovírusových činidiel. Väčšina z nich inhibuje aktivitu retrovírusovej reverznej transkriptázy a zahrnujú zidovudín (AZT), analóg tymidínu, dideoxyinozín (ddl) a dideoxycytozín (ddC). Zidovudín je primárnym antivírusovým liekom používaným na liečenie HIV infekcie. Antiretrovírusové činidlá sú všeobecne účinne v dávkach v rozmedzí od asi 50 mg za deň do asi 1000 mg za deň, presnejšie od asi 100 mg za deň do asi 500 mg za deň a najmä v prípade zidovudínu od asi 300 mg za deň do asi 500 mg za deň. Tieto látky sa spravidla podávajú v perorálnej aplikačnej forme.

Inhibítory proteázy podľa tohto vynálezu je možné pripraviť spôsobmi, ktoré sú odborníkom dobre známe (pozri napríklad US patent 4,760,130, európska patentová prihláška číslo 85 905953.7, PCT prihláška číslo WO 86/03519 a US patentová prihláška číslo 07/712,354, hore).

Tento vynález sa týka inhibítorov proteázy, ktoré sa izolovali vo vyčistenej forme. Podľa tohto vynálezu inhibítormi leukocytovej proteázy sú výhodne proteíny s jediným polypeptidovým reťazcom, ktoré sú v podstate homogénne, a najvýhodnejšie biologicky ekvivalentné natívnemu inhibítoru serínovej leukocytovej proteázy, izolovanému z výlučkov ľudskej príušnej žľazy. Natívny inhibítor serínovej leukocytovej proteázy sa tiež označuje ako natívny parotický (príušný) inhibítor. „Biologickým ekvivalentom“, ako sa používa v opise a nárokoch, sa myslí to, že zmesi sú schopné inhibovať proteázy pochádzajúce z monocytov, ktoré sú inhibované SLPI, ale nie nevyhnutne na rovnakej úrovni. „Derivátmi“, ako sa používa v nasledujúcom opise, sa myslí stupeň homológie aminokyselín k natívnemu parotickému inhibítoru, výhodne v 40 % prebytku,

SK 281127 Β6 najvýhodnejšie v 50 % prebytku, s hlavne výhodnou skupinou proteínov v 60 % prebytku homológie k natívnemu parotickému inhibítoru. Percentá homológie, ako sú opísané, sa počítajú ako percentá zložiek nájdených v menšej z dvoch sekvencií, ktoré je taktiež možné nájsť vo väčšej z dvoch sekvencií; zložkou sa rozumie sekvencia štyroch nasledujúcich aminokyselín.

Jedným použiteľným derivátom SLPI je CLPI, skrátená SLPI molekula majúca len posledných 60 aminokyselín natívneho parotického inhibítora. Týmito 60 aminokyselinami sú:

Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala.

Na kódovanie uvedenej molekuly so 60 aminokyselinami sa používala nasledujúca nukleotidová sekvencia: CGT GAT CCT GTT GAC ACC CCA ACA CCA ACA AGG AGG AAG CCT GGG AAG TGC CCA GTG ACT TAT GGC CAA TGT TTG ATG CCT AAC CCC CCC AAT TTC TGT GAG ATG GAT GGC CAG TGC AAG CGT GAC TTG AAG TGT TGC ATG GGC ATG TGT GGG AAA TCC TGC GTT TCC CCT GTG AAA GTC.

CLPI sa konštruovala tak, že sa z SLPI deletovala signálna génová sekvencia a nukleotidy zodpovedajúce prvým 47 aminokyselinám zrelého SLPI proteínu, ako je opísané v US patentovej prihláške 07/712,354. CLPI je taktiež možné pripraviť spôsobom podľa príkladu 8, opísaného jednak v PCT prihláške WO 86/0315 a jednak v európskej patentovej prihláške 85 905953.7. Hoci príklad 8 v obidvoch týchto prihláškach uvádza spôsob výroby SLPI, tento spôsob je možné použiť aj na výrobu CLPI. CLPI sa môže použiť na vytvorenie protilátok použiteľných pri čistení SLPI. Protilátky je možné pripraviť napríklad spôsobmi uvádzanými v Harlow, E. a Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, str. 92 - 114 (Cold Springs Harbor Laboratory, 1988).

„Analógy“, ako sa tu používajú, znamenajú akúkoľvek zlúčeninu vrátane napríklad malých organických zlúčenín, ktoré sú funkčne biologicky ekvivalentné SLPI pri inhibícii infekcie H1V. Takéto deriváty a analógy sa môžu izolovať spôsobmi, ktoré sú odborníkom dobre známe, vrátane použitia buniek monocytov, aby sa našli zlúčeniny, ktoré bránia SLPI, aby sa na ne viazala. Analógy môžu taktiež zahrnovať špecifické SLPI muteíny, ktoré majú aspoň ekvivalentný a v niektorých prípadoch vyšší účinok ako natívny proteín. Obzvlášť užitočné SLPI muteíny zahrnujú substitúciu nasledujúcich aminokyselinových zvyškov v polohách: Gly 20, Gly 72, Val 72 a Phe 72.

CLPI muteíny taktiež patria do rozsahu tohto vynálezu. CLPI muteíny, zodpovedajúce SLPI muteínom Gly 72, Val 72 a Phe 72, sa tu uvádzajú ako Gly 25, Val 25 a Phe 25. Niektoré uvedené CLPI muteíny majú nasledujúcu sekvenciu aminokyselín: Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys R⁸R⁹R’ Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu R⁴ Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys R⁵ Gly R⁴ Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys R⁷, kde R⁷ je alanín, R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁸ sú rovnaké alebo rôzne aminokyseliny a jedna alebo viaceré z R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁸môžu byť metionín, valín, alanín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán, lyzín, glycín alebo arginín. Analógy taktiež obsahujú napríklad PEGylované formy SLPI alebo CLPI, ktoré môžu mať lepšie terapeutické charakteristiky ako natívny SLPI proteín. Muteíny, ktoré môžu byť vhodné pre PEGyláciu, zahrnujú tie, ktoré majú cysteínový zvyšok v polohách 13, 23, 52, 58, 68 a/alebo 75 SLPI a na zodpoveda júcich miestach 5, 11, 21 a 28 v CLPI. Príprava cysteínových muteínov pre PEGyláciu je opísaná v PCT prihláške WO 92/16221 podanej 13. marca 1992, ktorá je špecificky zahrnutá do opisu týmto odkazom. Užitočným krokom pri príprave muteínov môže byť krok znovuformovania, keď sa pridáva cysteín k roztoku obsahujúcemu proteín. Cysteín môže pomôcť pri opätovnom formovaní a môže sa viazať na substituovaný voľný cysteín v muteíne. Taktiež je možné izolovať z monocytov inhibovatefný SLPI proteín (SIP) z ľudských buniek monocytov pri použití štandardných techník, odborníkom dobre známych a čistiť proteíny s proteolytickou aktivitou, ktorá je inhibovaná SLPI. Po čistení proteínu (a v prípade potreby po jeho sekvenovani, klonovaní jeho génu a jeho expresii v hostiteľských bunkách, napríklad rekombinantným získaním SIP) sa môžu testovať na inhibitory SIP spôsobmi odborníkom dobre známymi. Prípadne je možné stanoviť jeho štruktúru a navrhnúť podľa nej inhibitory, taktiež spôsobmi, ktoré sú odborníkom dobre známe.

Keď SLPI alebo jeho analóg, resp. derivát sa používa na boj s infekciou HTV ľudí, zlúčenina sa môže podávať perorálne alebo parenterálne vo vehikule obsahujúcom jeden alebo viac farmaceutický prijateľných nosičov, ktorých zastúpenie sa stanoví podľa rozpustnosti a chemickej povahy zlúčeniny, zvoleného spôsobu podávania a štandardnej biologickej praxe. Na perorálne podávanie sa SLPI alebo jeho analóg, resp. derivát môže upraviť na jednotkové dávkové formy, ako kapsuly alebo tablety, kde každá obsahuje vopred stanovené množstvo aktívnej zložky, v rozmedzí asi 10 až 1000 mg za deň na pacienta, výhodne asi 10 až 200 mg za deň na pacienta, ešte lepšie 20 až 200 mg za deň na pacienta vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

Pri parenterálnom podávaní sa SLPI alebo jeho analóg, resp. derivát podáva buď intravenóznymi injekciami, podkožnými alebo vnútrosvalovými injekciami, v zmesiach š. farmaceutický prijateľnými vehikulami alebo nosičmi. Pri injekčnom podávaní sa dáva prednosť použitiu zlúčeniny y roztoku v sterilnom vodnom vehikule, ktoré tiež môže ob-₄sahovať iné látky, ako sú tlmivé roztoky alebo konzervačné činidlá, ako aj dostatočné množstvo farmaceutický prijateľných solí alebo glukózy, aby bol roztok izotonický. Prednosť sa dáva podkožným injekciám. Dávky sú v podstate rovnaké, ako boli uvedené pri perorálnej aplikácii.

Vhodné vehikulá alebo nosiče uvedených aplikačných foriem je možné nájsť v štandardnej farmaceutickej literatúre, napríklad v „Remington’s Pharmaceutical Sciences“, 16 ed. Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980, ktorý je do opisu zahrnutý týmto odkazom.

Dávka zlúčeniny sa bude meniť podľa liekovej formy a danej vybranej aktívnej zložky. Ďalej sa bude meniť podľa konkrétneho liečeného pacienta či hostiteľa (vrátane cicavcov zahrnujúcich ľudí). Vo všeobecnosti sa liečba začína nízkymi dávkami, podstatne nižšími, ako sú optimálne dávky zlúčeniny. Potom sa dávka po malých prírastkoch zvyšuje, až sa dosiahne za daných okolností optimálny účinok. Spravidla sa zlúčenina podáva najlepšie na úrovni koncentrácií, ktoré všeobecne zaistia účinný antivírusový účinok bez vyvolania akýchkoľvek škodlivých alebo zhubných vedľajších účinkov. Je žiaduce udržovať hladinu zlúčeniny v krvi na úrovni, ktorá postačuje na inhibíciu retrovírusovej infekcie v hostiteľskej bunke. Tu sa dá skúšaním určiť množstvo zlúčeniny, ktoré je účinné na prevenciu retrovírusovej infekcie hostiteľských buniek, napríklad HIV do monocytov in vitro, a potom štandardnými farmakokinetickými technikami, stanovením množstva zlúčeniny, ktoré je potrebné na udržanie hladiny v plazme na rovnakej inhibičnej úrovni alebo až 10- až 100-krát vyššej.

Hoci uvedené aplikačné formy sú účinné a relatívne bezpečné liečivá na liečenie HIV infekcií, nie je vylúčená možnosť podávania týchto liečiv s inými antivírusovými liekmi alebo činidlami, aby sa dosiahli blahodarné výsledky. Takýmito ďalšími antivírusovými liekmi, resp. preparátmi sú rozpustný CD4, zidovudín, dideoxycytidín, fosfonomravčan, ribavarín, antivírusové interferóny (napríklad alfa-interferón alebo interleukín-2) alebo aerosólový pentamidín.

nečnej koncentrácii 100 mikrogramov ihneď po resuspendovaní (T = 0) alebo 2 dni po resuspendovaní (T = 2). Supematant sa zhromaždil a kultúry sa vyživovali každé 2 dni. Supernatant zhromaždený 8 dní po infekcii sa testoval na aktivitu reverznej transkriptázy meraním príjmu tríciovaného tymidínu na poly(rA)-oligo(dT) matrici.

Ako je uvedené v tabuľke 1, pri bunkách vopred ošetrených SLPI inhiboval SLPI replikáciu na približne 62 %, keď sa pridal hneď po infekcii, a na 54 %, keď sa pridal 2 dni po infekcii.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1:

SLPI blokuje replikáciu HIV v monocytoch v závislosti od dávky. Elutriované ľudské monocyty sa uložili na misky a vystavili HIV ±SLPI počas jednej hodiny pri 37 °C, premyli a inkubovali sa pri 37 °C. Supernatant sa odsával a Čerstvé médium sa pridávalo každé štyri dni. EC_S0 v tomto pokuse bolo menej ako 0,1 mikrogramu/ml (8,5 nM) s úplnou inhibíciou pri 10 mikrogramoch/ml (850 nM).

Obrázok 2:

Inhibičný účinok SLPI je dlhodobý. Po 18 dňoch bolo ešte 90 % HIV inhibované.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi.

Príklad 1

Periférne krvné monocyty (PBM) sa izolovali od zdravých darcov elutriáciou, uložili sa do kultivačných nádob a niekoľko dní sa inkubovali. SLPI sa zmiešal s HIV (Bal) a aplikoval sa v priebehu jednej hodiny pri 37 °C na PBM. Bunky sa premyli a ďalej inkubovali s výmenou média a stanovením reverznej transkriptázy každé tri dni. Zistilo sa, že SLPI účinne blokuje replikáciu HIV v koncentrácii 1 mikrogram/ml (obrázok 1). Pri koncentráciách < 20 mikrogramov/ml SLPI je inhibícia znížená. Inhibičný účinok je dlhodobý, s významnou inhibíciou pozorovanou po 18 dňoch (obrázok 2).

Príklad 2

PBM sa vložili do kultivačnej nádoby a inkubovali sa ako v príklade 1. SLPI sa aplikoval na bunky v priebehu jednej hodiny. Bunky sa premyli a reagovali s HIV. Výmena média a stanovenia sa vykonali ako v príklade 1. Zistilo sa, že SLPI blokovala HIV účinnejšie vtedy, keď bunky najskôr reagovali s SLPI, než keď reagovali so zmesou SLPI a HIV.

Príklad 3

S použitím v podstate rovnakého pracovného postupu ako v príklade 1 sa dokázalo, že SLPI účinne blokuje replikáciu HIV v T-bunkách.

Príklad 4

Ľudské T-lymfocytové bunky sa udržovali v suspenznej kultúre v RPMI 1640 s 10 % fetálnym jahňacím sérom (FCS) a 200 mikrogramami gentamycínu na liter. SLPI sa pridal ku kultivačnému médiu v konečnej koncentrácii 100 mikrogramov na ml. Po 24 hodinách sa bunky premyli a inokulovali počas štyroch hodín s HIV, kmeň IIIB. opäť sa premyli a resuspendovali sa na hustotu 500 000 buniek na mililiter. Médium sa doplnilo a udržiavalo sa s SLPI na koTabuľka 1

Bunky vopred ošetrené SLPI

	Negatívna kontrola	Pozitívna kontrola	T = 0	T = 2
Aktivita RT [stred cpm]	995	86,205	32,594	39,554
Štandardná odchýlka	±330	±9,676	±7,220	±8,737

Príklad 5

Pokus sa vykonal ako v príklade 4 s tým rozdielom, že sa inkuboval lOOOx koncentrovanejší HIV, kmeň IIIB, so 100 mikrogramami/ml SLPI počas 6 hodín na ľade pred inokuláciou. Táto HľV/SLPI zmes sa zriedila lOOOx pred štvorhodinovým inokulovaním.

Ako je uvedené v tabuľke 2, pri použití vírusu a buniek vopred ošetrených SLPI, SLPI inhiboval replikáciu na približne 64 %, keď sa pridal hneď po infekcii, a na 26 %, keď sa pridal 2 dni po infekcii.

Tabuľka 2

Bunky a vírus vopred ošetrené SLPI

	Negatívna kontrola	Pozitívna kontrola	T-0	T-2
Aktivita RT [stred cpm]	2,889	59,004	20,676	43,432
Štandardná odchýlka	±565	±10,988	+4,111	+14,982

Príklad 6

Pokus sa robil ako v príklade 5 s tým rozdielom, že bunky boli čisté, napríklad sa nepestovali s SLPI pred inokuláciou. Použitím čistých buniek a vírusu vopred ošetreného SLPI inhiboval replikáciu vírusu na približne 59 % vtedy, keď sa pridal ihneď po infekcii, a na 32 %, keď sa pridal 2 dni po infekcii (Tabuľka 3).

Tabuľka 3

Vírus vopred ošetrený SLPI

	Negatívna kontrola	Pozitívna kontrola	T = 0	T = 2
Aktivita RT [stred cpm]	4,763	70,076	28,383	47,436
Štandardná odchýlka	±1,698	±15,803	±5,520	±11,679

Príklad 7

Pokus sa robil ako v príkladoch 4 - 6 s tým rozdielom, že ani bunky ani vírus sa nevystavili vplyvu SLPI pred inokuláciou. Pri použití čistých buniek a čistého vírusu SLPI inhiboval replikáciu vírusu na približne 50 % vtedy, keď sa pridal hneď po infekcii, a na 42 %, keď sa pridal 2 dni po infekcii (Tabuľka 4). Tabuľka 5 ukazuje aktivitu reverznej transkriptázy, prítomnej v supematante z kultúry, testovanej 4, 6 a 8 dní po infekcii.

SK 281127 Β6

Tabuľka 4

Čisté bunky a vírus

	Negatívna kontrola	Pozitívna kontrola	T = 0	T = 2
Aktivita RT [stred epmj	531	79,356	38,969	46,004
Štandardná odchýlka	±186	±17,497	±7,700	±8,492

Tabuľka 5

Čisté bunky a vírus

	Negatívna kontrola	Pozitívna kontrola	T = 0	T = 2
Po 4 dňoch [stred cpm]	435	1,556	797	1,287
Štandardná odchýlka	±85	±300	±222	±204
Po 6 dňoch [stred cpm]	952	72,085	15,846	41,240
Štandardná odchýlka	±715	±12,219	±5,644	±14,542
Po 8 dňoch [stred cpm]	1,519	13,853	7,617	11,946
Štandardná odchýlka	+475	±3,458	±3,031	±2,889

Príklad 8

Sledoval sa taktiež účinok SLPI muteínov na replikáciu vírusu. Čisté H-9 bunky sa inkubovali s čistým vírusom ako v príklade 7. Po premytí sa bunky resuspendovali na hustotu 500 000 buniek na mililiter média s SLPI alebo s SLPI muteínmi v koncentrácii 30 mikrogramov na mililiter, ako je uvedené v Tabuľke 6. Supematant sa testoval na aktivitu reverznej transkriptázy po 8 dňoch (Tabuľka 6).

Tabuľkaó

	Neg. kortr.	Poz. kcnír.	Div> ký typ	Gly 20	Gly 72	Val 72	Lys 72	Phe 72
Aktivita ístiedcpm]	RT	4,815	55,126	39323	39387	4Q549	36,077	52239	8384
Standaidná chýlka	od-	12,849	115,637	+1Q933	±11,1«	13537	±7Í®	Asa	±1,924

Príklad 9

Pokus sa vykonával ako v príklade 8 s tým rozdielom, že bunky sa po inokulácii resuspendovali v médiu s SLPI alebo s muteínom Phe 72 v koncentrácii 100 mikrogramov na mililiter. Supematant sa testoval na aktivitu reverznej transkriptázy 2, 4, 6, 8 a 10 dní po infekcii (Tabuľka 7). Tabuľky 6 a 7 ukazujú, že účinok muteínu Phe 72 bol zvlášť výrazný.

Tabuľka 7

Čisté bunky a vírus

	Negatívna kontrola	Pozitívna kontrola	T=0	T=2
Po 2 dňoch [stred cpm]		1,386	995	897
Štandardná odchýlka		±914	±246	±472
Po 4 dňoch [stred cpm]		1,356	1,087	1,380
Štandardná odchýlka		±370	±414	±442

	Negatívna kontrola	Pozitívna kontrola	T = 0	T = 2
Po 6 dňoch [stred cpm]	1,142	2,103	1,526	748
Štandardná odchýlka	±389	±498	±508	±243
Po 8 dňoch stred cpm]		77,931	25,241	3,491
Štandardná odchýlka		+9,779	±8,399	±1,086
Po 10 dňoch [stred cpm]		21,431	12,499	2,239
Štandardná odchýlka		±1,890	±3,495	±444

Príklad 10

Aby sa stanovil účinok samotného SLPI, vyhodnocovalo sa množenie H-9 buniek kultivovaných so 100 mikrogramami na mililiter SLPI alebo bez SLPI. Kultúry sa kontaktovali s médiom obsahujúcim 2,5 mikroeurie tríciovaného tymidínu v dňoch 0, 1 a 2; zachytené počty sa merali v dňoch 1, 2 a 3. Ako ukazuje tabuľka 8, SLPI nie je proti týmto bunkám toxický.

Tabuľka 8

Aktivita RT [stred cpm] Bujnenie H-9 buniek

	Deň 1	Deň 2	Deň 3
Kontrola (-SLPI)	20,860	67,401	53,326
Štandardná odchýlka	±581	±2,529	±3,783
+ SLPI 100 Mg/ml	20,437	61,892	54,592
Štandardná odchýlka	±1,503	±216	±2,781

i $

i

Príklad 11

Taktiež sa sledovala inhibícia produkcie vírusu z chronicky infikovaných buniek s použitím promonocytovej bunkovej línie Ul. Suspenzné kultúry U1 sa udržovali v RPMI s 10 % FCS a 20 mikrogramami na liter gentamycínu. Bunky sa odobrali, premyli a suspendovali sa na hustotu 2,5 milióna buniek na mililiter. Suspendované bunky sa kultivovali cez noc v médiu obsahujúcom 100 alebo 200 mikrogramov na mililiter SLPI alebo v samotnom médiu. Vírus sa indukoval prídavkom 13-forbol-12-myristát-acetátu (PMA) na konečnú koncentráciu 1 mikromol. Po 48 hodinách sa supematant z bunkovej kultúry testoval na aktivitu reverznej transkriptázy ako v príkladoch 4 až 9. Tabuľka 9 ukazuje, že SLPI významne inhiboval produkciu vírusu z týchto chronicky infikovaných buniek.

Tabuľka 9

	-PMA -SLPI	-PMA +SLPI [200gg/ml]	+PMA -SLPI	+PMA +SLPI [200gg0nll	+PMA +SLPI [lOOMg/’ml]
Aktivita RT [stred cpm]	1,052	994	5,052	2,864	2,648
Štandardná odchýlka	±352	±447	±2,053	±403	±374

Predchádzajúci opis je vzorový kvôli ilustrácii a vysvetleniu. Malo by byť jasné, že je možné uskutočniť rôzne modifikácie bez toho, aby došlo k odchýlke od ducha a rozsahu tohto vynálezu. Nasledujúce nároky by preto mali byť

SK 281127 Β6 vykladané a interpretované s obsiahnutím všetkých takýchto modifikácií.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie inhibítora serínovej leukocytovej proteázy alebo jeho analógu, alebo derivátu (SLPI) na výrobu liečiva na inhibovanie retrovírusovej infekcie.
2. Použitie podľa nároku 1, pričom retrovírusom je vírus ľudskej imunodeficiencie.
3. Použitie podľa nároku 1, pričom analóg alebo derivát SLPI je vybraný zo skupiny zahrnujúcej SLPI Phe 72 muteín, SLPI Gly 20 muteín, SLPI Gly 72 muteín, SLPI Val 72 muteín, CLPI Phe 25 muteín, CLPI Gly 25 muteín a CLPI Val 25 muteín.
4. SLPI alebo jeho analógy a deriváty podľa nárokov 1 až 3 na použitie ako prostriedok na inhibovanie funkcie enzýmu hostiteľskej bunky, kde funkcia enzýmu je nevyhnutná na retrovírusovú infekciu bunky, pričom hostiteľskou bunkou je monocyt alebo bunka, ktorá j e prekurzorom monocytu.