HU218892B

HU218892B - SLPI alkalmazása és eljárás retrovírus-fertőzés gátlására szolgáló gyógyászati készítmény előállítására

Info

Publication number: HU218892B
Application number: HU9500682A
Authority: HU
Inventors: Stephen Eisenberg; Robert C. Thompson; Sharon M. Wahl
Original assignee: Amgen Inc.; The United States Of America Dept. Of Health & Human Services
Priority date: 1992-09-09
Filing date: 1993-09-09
Publication date: 2000-12-28
Also published as: ES2197153T3; NO315546B1; PL307864A1; UA41338C2; NO950897D0; JPH08505042A; OA10133A; FI951078A; EP0666755B1; WO1994006454A2; DK0666755T3; DE69332904T2; RU95109909A; KR100273620B1; HUT75126A; RU2126266C1; CA2141951C; WO1994006454A3; CA2141951A1; JP3517238B2

Description

A találmány tárgya szerin leukocita proteáz inhibitor (SLPI) alkalmazása gazdasejtek retrovírussal való fertőződésének, előnyösen humán sejtek HIV-vírussal való fertőződésének gátlására szolgáló gyógyászati készítmények előállítására, továbbá eljárás ilyen készítmények előállítására.

Retrovírusok szerepét számos betegségben, például karcinómákban, autoimmun betegségekben, valamint az AIDS-ben kimutatták. A humán immunhiányvírus (HÍV) fertőzés a CD4+ T-limfociták (CD4+ sejtek) számának krónikus folyamatos csökkenését, valamint a makrofágok fertőzését okozza, és a szerzett immunhiány szindrómát hozza létre. Jelenleg a zidovudine (AZT), amely egy timidinanalóg, a HIV-fertőzés kezelésében elsődlegesen használt vírusellenes gyógyszer, bár két hasonló működési elven ható anyagot, a didezoxiinozint (ddl) és a didezoxicitozint (ddC) is alkalmazzák [Colley T. P. és munkatársai, New Engl. J. Med., 322, 1340-1345 (1990); FischI M. A., New Engl. J. Med., 317,185-191 (1987)]. Ezek az anyagok hatásosan gátolják a vírusreplikációt és stabilizálják a CD4+ sejt szintet, azonban nem képesek az egyik fő vírusrezervoár, a HIV-vírussal fertőzött makrofágok eliminálására [Gartner S. és munkatársai, Science, 233, 215-219 (1986)]. Az AZT-kezeléssel - különösen nagyobb adagok esetén - súlyos toxikus tünetek, elsősorban a HIV-gazdaszervezet csontvelejét érintő tünetek is járnak, és az AIDS-betegekben a gyógyszer előnyös hatásai hosszabb kezelést követően megszűnnek; a kezelt betegek között AZT-rezisztens HIV-törzseket is találtak. Ezek a megfigyelések sürgették HlV-fertőzés kezelésére alkalmazható egyéb gyógyszerek kutatását, különösen más működési elven alapuló gyógyszerekét.

Az AIDS kórokozója az 1. típusú humán immunhiányvírus (HIV-1), amely egy retrovírus. A gpl20 jelzésű HIV-1 burok glikoprotein fajlagosan kötődik a Tlimfocitákon, monocitákon és makrofágokon található CD4 receptorokhoz. Bár a T-limfociták fertőzéséhez sejtproliferációra és DNS-szintézisre van szükség, a monociták produktív fertőzése a sejt DNS-szintézisétől függetlenül mehet végbe [Weinberg J. B. és munkatársai, J. Exp. Med., 174, 1477-1482 (1991)]. Az aktivált CD4+ limfocitákra a HIV-1 fertőzés letális hatású, azonban a fertőzött monociták viszonylag rezisztensek a vírus pusztító hatásával szemben. Következésképp, ezek a sejtek a HIV-1 vírussal való fertőződést követően hosszú életű vírusraktárakként szolgálnak. Ezek a sejtek nemcsak replikálódó vírusok forrását képezik, hanem a vírus által közvetített működési zavaruk hozzájárulhat az AIDS-re jellemző opportunista fertőzésekkel szembeni fokozott fogékonysághoz.

Mivel a monocitamakrofágok képezik a HIV-1 raktárakat, ennek a populációnak, valamint a T-limfocitáknak a szelektív célzott kezelése további megfontolást érdemel [Finberg R. W. és munkatársai, Science, 252, 1703-1705 (1991)]. Fox csoportjának korábbi közleményei [JADA, 118, 709-711 (1989)] szerint a humán nyál egyik alkotórésze gátolja a HÍV replikációját. Nemrégiben Hattori [FEBS Lett., 248, 48-52 (1989)] kimutatta, hogy egy triptáz (egy tripszinhez hasonló enzim) inhibitora gátolhatja T-sejtek HÍV által indukált szinciciumképzését.

Különböző lehetséges HÍV-1 fertőzést befolyásoló anyag vizsgálata során egy olyan gátlóaktivitással rendelkező endogén forrást azonosítottunk, amely lassítja a HIV-1 fertőzés előrehaladását és/vagy a vírusreplikációt.

A vírusellenes aktivitásért felelős faktor egy szerin leukocita proteáz inhibitor (SLPI). Az SLPI a humán leukocita elasztáz, a katepszin G, valamint a humán tripszin hatásos inhibitora, amelyet fultőmirigy-szekrétumból tisztítottak [Thompson R. C. és Ohlsson K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6692-96 (1986); 4 760 130 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Jelenleg rekombináns DNS-eljárással előállított SLPI is hozzáférhető [a WO-86/03519 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés (közzétéve: 1986. 06. 19-én)].

Az SLPI-nek és/vagy származékainak, valamint analógjainak az a képessége képezheti a HÍV-1 fertőzési folyamatba való terápiás célú beavatkozás alapját, hogy blokkolja a HIV-1 fertőzést és/vagy replikációt.

A találmány tárgyát emlőssejtek retrovírussal való fertőződésének megakadályozására vagy kezelésére szolgáló új eljárások képezik, különösen humán eredetű sejtek humán immunhiányvírussal (HÍV) történő fertőződésének, valamint az azzal kapcsolatos betegségek, ezen belül a szerzett immunhiány szindróma (AIDS) megelőzősére szolgáló új eljárások képezik.

A találmány kiterjed retrovírusfertőzések kezelésére, különösen emberben HIV-fertőzés kezelésére szolgáló olyan gyógyászati készítményekre, amelyek szerin leukocita proteáz inhibitort (SLPI) vagy annak analógját vagy származékát, valamint egy gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagot tartalmaznak.

A találmány tárgyát képezi továbbá humán sejtben HIV-fertőzés kezelésére szolgáló eljárás, amelyben SLPI vagy analógjának, vagy származékának hatékony mennyiségét adagoljuk.

Az ábrák rövid leírása

1. ábra : Az SLPI monocitákban dózisfüggően blokkolja a HIV-replikációt. Tisztított humán monocitákat tenyésztőlemezre helyeztünk, egy órán át 37 °C-on HÍV +/- SLPI kezelésnek vetettük alá; mostuk, majd 37 °C-on inkubáltuk, miközben minden negyedik napon leszívtuk a felülúszót, és friss tápfolyadékot adtunk a tenyészethez. Ennek a kísérletnek az alapján meghatározott EC₅₀-érték kisebb volt 0,1 mikrogramm/ml (8,5 nanomol/1) értéknél, és teljes gátlás 10 mikrogramm/ml (850 nanomol/1) értéknél jött létre.

2. ábra: Az SLPI gátló hatása hosszú ideig tart. 18 nap elteltével a HIV-vírust még 90%-ban gátolja.

A találmány szerinti megoldás részletes leírása

A találmány tárgyát emlőssejtek, különösen humán eredetű sejtek retrovírussal, különösen HIV-vírussal történő fertőződésének megelőzésére szolgáló eljárások, és azzal kapcsolatos betegségek, ezen belül a szerzett immunhiány szindróma (AIDS) megelőzésére szolgáló eljárások képezik.

HU 218 892 Β

A „gyógyszergyártásban elfogadott hordozóanyag” megjelölés egy, az aktív összetevővel alkalmazott, nem toxikus, általában inért vivőanyagra vonatkozik, amely nem hat hátrányosan az összetevőre, illetve arra a betegre, akinek a készítményt adagoljuk.

A „hatékony mennyiség” megjelölés az SPLI-nek vagy egy analógjának, illetve származékának in vivő HIV-ellen hatékony, előre meghatározott mennyiségére vonatkozik.

A találmány szerint retrovírusos fertőzéseket retrovírusellenes anyagok olyan dózisának adagolásával kezelünk, amely elegendő az ilyen fertőzés hatásainak csökkentésére. Retrovírusfertőzések szerepét számos betegségben feltételezik, például, de nem kizárólag, daganatos megbetegedésekben, autoimmun betegségekben, valamint szerzett immunhiány szindrómában. A találmány elsősorban a humán immunhiányvírus okozta fertőzésre vonatkozik.

A gyakorlatban számos retrovírusellenes anyag ismert. Ezek közül a legtöbb a retrovírus eredetű reverz transzkriptázt gátolja, közéjük tartozik a zidovudine (AZT), amely egy timidinanalóg, a didezoxiinozin (ddl) és a didezoxicitozin (ddC). A zidovudine a HlV-fertőzés kezelésében elsődlegesen alkalmazott vírusellenes gyógyszer. A retrovírusellenes anyagok általában körülbelül 50 mg/nap-1000 mg/nap dózisban hatékonyak, előnyösebben körülbelül 100 mg/nap-500 mg/nap dózisban hatékonyak, és zidovudine esetében körülbelül 300 mg/nap-500 mg/nap dózisban hatékonyak. Ezeket az anyagokat rendszerint szájon át adagolható készítmények formájában adagoljuk.

A találmány szerinti proteáz inhibitorok a gyakorlatban járatos személy számára jól ismert módon állíthatók elő (lásd a WO-86/03519 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentést).

A találmány tisztított formában izolált proteáz inhibitorokra vonatkozik. A találmány szerinti szerin-proteáz inhibitorok előnyösen egyetlen polipeptidszálból álló proteinek, amelyek a humán fultőmirigy váladékából izolált natív szerin-proteáz inhibitorral lényegében homológok, és legelőnyösebben annak biológiai megfelelői. A natív szerin-proteáz inhibitort natív fültőmirigy inhibitornak is nevezzük. A találmány leírásában és a szabadalmi igénypontokban használt „biológiailag ekvivalens” kifejezés arra vonatkozik, hogy a készítmény képes az SLPI által gátolt monocita eredetű proteázt gátolni, de nem szükségszerűen azzal azonos mértékben. A találmány leírásában és a szabadalmi igénypontokban használt „származék” meghatározás a natív fültőmirigy inhibitorral összehasonlított aminosav homológia-fokára vonatkozik, amelynek mértéke előnyösen több mint 40%, előnyösebben több mint 50% és a legelőnyösebb proteincsoport több mint 60% homológiát mutat a natív fultőmirigy inhibitorral. A fenti meghatározás szerinti százalékban megadott homológiát a két összehasonlított szekvencia közül a kisebb szekvenciában található azon összetevők százalékos aránya alapján számítottuk, amelyek megtalálhatók lehetnek a két nagyobbik szekvenciában is; itt „összetevő” alatt négy szomszédos aminosavból álló szekvenciát értünk.

A fenti százalékos homológia kiszámítása az alapján történt, hogy a rövidebb szekvencia elemeinek hány százaléka található meg a hosszabbik szekvenciában, elem alatt négy egymást követő aminosav szekvenciáját értve.

Egy alkalmazható SLPI-származék a CLPI, amely egy, a natív fultőmirigy inhibitornak csupán az utolsó 60 aminosavát tartalmazó csonka SLPI-molekula. Ez a 60 aminosav a következő:

Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Alá.

A fenti aminosavakból álló molekulát a következő nukleotidszekvencia kódolja:

CTG GAT CCT GTT GAC ACC CCA ACA CCA ACA AGG AGG AAG CCT GGG AAG TGC CCA

GTG ACT TAT GGC CAA TGT TTG ATG CCT

AAC CCC CCC AAT TTC TGT GAG ATG GAT

GGC CAG TGC AAG CGT GAC TTG AAG TGT

TGC ATG GGC ATG TGT GGG AAA TCC TGC

GTT TCC CCT GTG AAA GCT.

A CLPI-t úgy állítottuk elő, hogy az SPLI gén szignálszekvenciájának és az érett SLPI-proteinben található első 47 aminosavnak megfelelő nukleotidokat a deletáltuk a WO-86/03519 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt eljárással. Bár a fenti két bejelentésben található 8. példa SLPI előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, ez az eljárás alkalmazható CLPI előállítására is. A CLPI felhasználható az SLPI tisztításánál alkalmazható ellenanyagok termelésére is. Ellenanyagok előállíthatok például E. Harlow és D. Lane eljárásával [Antibodies: A Laboratory Manual; 92-114, Cold Springs Harbor Laboratory (1988)].

A találmány szerinti „analógok” megjelölés alatt bármely olyan vegyületet, például kisméretű szerves vegyületeket értünk, melyek hatása a HIV-fertőzés gátlását tekintve funkcionálisan biológiailag megfelel az SLPI-nek. Ilyen származékok és analógok a gyakorlatban járatos személy számára ismert módszerekkel izolálhatok, például monocitasejtek felhasználásával olyan vegyületek válogathatok ki, amelyek megakadályozzák az SLPI azokhoz való kötődését. Analógok lehetnek fajlagos SLPI-muteinek (mutáns proteinek) is, amelyek a natív proteinnel legalább azonos, egyes esetekben pedig nagyobb aktivitással rendelkeznek. Különösen előnyös SLPI-muteinek az alábbi pozíciókban a következő aminosavhelyettesítéseket tartalmazzák: Gly 20, Gly 72, Val 72, valamint Phe 72.

A találmány kiterjed CLPI muteinekre is. A Gly 72, Val 72, valamint Phe 72 SLPI-muteineknek megfelelő CLPI-muteinekre, mint Gly 25, Val 25, illetve Phe 25 utalunk. Néhány már megtervezett CLPI-mutáns az alábbi aminosavszekvenciával rendelkezik:

Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys R₈R₃ R₉ Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu R₄ Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys R₅ Gly R₆ Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys R₇,

HU 218 892 Β ahol R₇ alanin és R₃, R₄, R₅, R₆, valamint R₈ ugyanazok vagy különböző aminosavak, és R₃, R₄, R₅, R₆, valamint R_g közül egy vagy több metionin, valin, alanin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, lizin, glicin vagy arginin. A találmány tárgykörébe tartoznak ezek megfelelői is, például az SLPI vagy CLPI PEGilezett formái, amelyek a natív proteinhez képest jobb terápiás tulajdonságokkal rendelkezhetnek. PEGilezésre alkalmas mutánsok lehetnek az SLPI 13., 23., 52., 58., 68. és/vagy 75. pozícióiban, illetve a CLPI megfelelő 5., 11., 21. és 28. pozícióiban ciszteinnel rendelkező mutánsok. PEGilezésre alkalmas ciszteinmutánsok előállítását ismerteti a WO-92/16221 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés (a közzététel napja: 1992. 03. 13.), melyre szakirodalmi helyként utalunk. A mutein előállításánál alkalmazhatunk egy újrahajtogatási lépést, amelyben ciszteint adunk a proteint tartalmazó oldathoz. A risztéin elősegítheti az újrahajtogatódást és a muteinben a helyettesített szabad risztemhez kötődhet. Monocitákból a gyakorlatban járatos személy számára ismert szokásos biokémiai eljárásokkal izolálható a humán monocita sejt eredetű, SLPI által gátolható protein (SÍP) is, és tisztíthatok SLPI által gátolt proteolitikus aktivitással rendelkező proteinek is. A protein tisztítását követően (és ha szükséges, szekvenálását, génjének klónozását és gazdasejtben való expresszálását, azaz rekombináns eljárással SÍP előállítását követően) a gyakorlatban járatos személy számára ismert eljárásokkal SIP-gátlókat kereshetünk. Más eljárás szerint meghatározhatjuk a szerkezetét, ennek alapján ugyancsak a gyakorlatban járatos személy számára ismert eljárásokkal tervezhetők gátlóanyagok.

SLPI-nek vagy analógjának, illetve származékának emberben HIV-fertőzés elleni küzdelemben való alkalmazása esetén a vegyületet szájon át vagy parenterális úton adagolhatjuk, egy vagy több, a gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagot tartalmazó vivőanyagban, melyek arányát a vegyület oldékonysága, vegyi természete, valamint az adagolás választott módja és a szokásos biológiai gyakorlat alapján határozhatjuk meg. Szájon át történő adagolás céljára az SLPI vagy analógja, vagy származéka adagokban, például kapszulaként vagy tablettaként formulálható, melyek mindegyike egy gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagban az aktív összetevő előre meghatározott mennyiségét tartalmazza, mely mennyiség körülbelül 10-1000 mg, előnyösebben naponta betegenként 10-200 mg, még előnyösebben naponta betegenként 20-200 mg.

Parenterális adagolás céljára az SLPI-t vagy megfelelőjét, vagy származékát intravénásán, bőr alá vagy izomba adott injektálással adagoljuk, a gyógyszergyártásban szokásos vivőanyagokat, illetve hordozóanyagokat tartalmazó készítményekben. Injektálással történő adagolásnál előnyös a vegyületet steril vizes vivőanyagban oldva alkalmazni, amely tartalmazhat egyéb oldott anyagokat is, például puffereket vagy konzerválóanyagokat, valamint elegendő mennyiségű, a gyógyszergyártásban szokásos sót vagy glükózt ahhoz, hogy az oldat izotóniás legyen. A találmány szerint a bőr alá történő injektálás az előnyös adagolási mód. Az adagok lényegében megegyeznek a szájon át történő adagolásnál ismertetettekkel.

A fenti készítmények számára megfelelő vivőanyagok, illetve hordozóanyagok megtalálhatók a szokásos gyógyszerészeti szakirodalmi helyeken [lásd például „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, PA, (1980), melyet szakirodalmi helyként mellékelünk].

A vegyület adagja az adagolás módjától és az adott aktív hatóanyagtól függően változik. Ezenkívül változik a kezelés alatt álló adott betegtől vagy gazdaszervezettől függően (amely lehet emlős, ezen belül ember). A kezelést rendszerint kis adagokkal kezdjük, amely lényegesen kisebb a vegyület optimális adagjánál. Ezután az adagot kis lépésekben addig növeljük, míg az adott körülmények között optimális hatást nem érünk el. Általánosságban a vegyületet legelőnyösebben olyan koncentrációban adagoljuk, amely általában vírusellenes hatást eredményez anélkül, hogy bármilyen káros vagy ártalmas mellékhatást okozna. Előnyösen a vegyület vérkoncentrációját olyan szinten tartjuk, amely elegendő a gazdasejt retrovírussal történő fertőzésének megakadályozására. Ez annak a vegyületmennyiségnek az in vitro meghatározásával érhető el, amely hatásos a gazdasejtek retrovírussal történő fertőzésének megelőzésére, azaz a HIV-vírusnak monocitákba való bejutásának megelőzésére, majd szokásos farmakokinetikai eljárásokkal annak a vegyületmennyiségnek a meghatározásával, amely a plazmaszintet ezen a gátló hatású szinten vagy annál 10-100-szor magasabb értéken tartja.

Bár a fenti találmány szerinti készítmények a HIVfertőzés kezelésében hatékonyak és viszonylag biztonságos gyógyászati készítmények, nincs kizárva, hogy ezeknek a készítményeknek az esetleges egyidejű adagolása egyéb vírusellenes gyógyszerekkel vagy anyagokkal jó eredménnyel járhat. Ilyen egyéb vírusellenes gyógyszerek vagy anyagok például az oldékony CD4, a zidovudine, didezoxicitidin, foszfonoformát, ribavarin, a vírusellenes interferonok (például alfa-interferon vagy interleukin-2) vagy pentamidin aeroszol.

A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal szemléltetjük.

1. példa

Egészséges donorokból elutriációs eljárással perifériás vér eredetű monocitákat (PBM) [Lásd például: Zuckerman és munkatársai: Immunology, 38 (2) 401 (1979)] izoláltunk, azokat szövettenyésztő edényekbe helyeztük, és néhány napig inkubáltuk. SLPI-t elegyítettünk HIV-vírusokkal (Bal), és egy órán át 37 °C-on a PBM-tenyészeten állni hagytuk. A sejteket mostuk, és minden harmadik napon a tápfolyadék cseréjével és a felülúszóban a reverz transzkriptáz meghatározása mellett tovább inkubáltuk. Azt találtuk, hogy az SLPI 1 mikrogramm/ml koncentrációban hatékonyan gátolja a HIVreplikációt (lásd 1. ábra). 20 mikrogramm/ml SLPI-koncentrációnál, illetve ennél nagyobb koncentrációnál a

HU 218 892 Β gátló hatás megszűnik. A gátló hatás hosszan tartó, és a 18. napig szignifikáns gátlás mutatható ki (2. ábra).

2. példa

PBM-sejteket oltottunk ki és inkubáltunk az 1. példában leírtak szerint. A sejteket SLPI-vel kezeltük körülbelül 1 órán át, majd a sejteket mostuk, és HIV-vel kezeltük. A tápfoíyadékcserét és a vizsgálatokat az 1. példában leírtak szerint végeztük. Azt találtuk, hogy az SLPI sokkal hatékonyabban blokkolta a HIV-vírust, ha a sejteket SLPI-vel előkezeltük, mint ha a sejteket SLPI és HÍV elegyével kezeltük volna.

3. példa

Lényegében az 1. példában alkalmazott eljárással, azonban a monocitákat T-sejtekkel helyettesítve azt is kimutattuk, hogy az SLPI hatékonyan gátolja a HlV-replikációt a T-sejtekben.

4. példa

Egy humán T-limfocita sejtvonalat (H-9) szuszpenziós tenyészetként tartottunk fenn 10% borjúszérumot (FCS) és 200 mikrogramm/1 gentamicint tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban. A tápfolyadékhoz 100 mikrogramm/ml végkoncentrációban SLPI-t adtunk. 24 óra elteltével a sejteket mostuk, négy órán keresztül IIIB jelzésű HIV-törzzsel fertőztük, újból mostuk, és 500 000 sejt/ml sejtsűrűségben szuszpendáltuk. A szuszpendálást követően azonnal (T=0), illetve a szuszpendálást követően két nap múlva (T=2) a tápfolyadékot 100 mikrogramm/ml végkoncentrációjú SLPI-vel egészítettük ki, és ezt a szintet fenntartottuk. Kétnaponta összegyűjtöttük a tenyészet felülúszóját, és a tenyészeteket friss tápfolyadékkal fedtük. A fertőzést követő 8. napon összegyűjtött felülúszóban tríciummal jelölt timidinnek egy poli(rA)-oligo(dT) tempáltba történő felvételének mérésével vizsgáltuk a reverz transzkriptázaktivitást.

Amint azt az 1. ábra mutatja, az SLPI-vel előkezelt sejtekben az SLPI közvetlenül a fertőzés után, illetve a fertőzést követően két nappal hozzáadva körülbelül 62%-kal, illetve 54%-kal gátolta a vírusreplikációt.

1. táblázat

SLPI-vel előkezelt sejtek

	Negatív kontroll	Pozitív kontroll	T=0	T=2
RT-aktivitás (átlagbeütés/perc)	955	86,205	32,594	39,554
Standard deviáció	±330	±9,676	±7,220	±8,737

5. példa

A kísérletet a 4. példában ismertetettek szerint végeztük azzal az eltéréssel, hogy az inkubálás előtt 6 órán át 1000-szeresen koncentrált IIIB HIV-törzset inkubáltunk jégen 100 mikrogramm/ml SLPI-vel. A négyórás fertőzést megelőzően ezt a HIV/SLPI elegyet 1000-szeresre hígítottuk.

Amint azt a 2. táblázat mutatja, SLPI-vel előkezelt vírusok és sejtek alkalmazásával az SLPI közvetlenül a fertőzés után, illetve a fertőzést követően két nappal hozzáadva körülbelül 64%-kal, illetve 26%-kal gátolta a vírusreplikációt.

2. táblázat

SLPI-vel előkezelt vírusok és sejtek

	Negatív kontroll	Pozitív kontroll	T=0	T=2
RT-aktivitás (átlagbe- ütés/perc)	2,889	59,004	20,676	43,432
Standard deviáció	±565	±10,988	±4,111	±14,982

6. példa

A kísérletet a 5. példában ismertetettek szerint végeztük azzal az eltéréssel, hogy a sejtek tiszták voltak, azaz a fertőzést megelőzően nem tenyésztettük őket SLPI jelenlétében. „Tiszta” (kezeletlen) sejtek és SLPIvel előkezelt vírusok alkalmazásával az SLPI közvetlenül a fertőzés után, illetve a fertőzést követően két nappal hozzáadva körülbelül 59%-kal, illetve 32%-kal gátolta a vírusreplikációt (3. táblázat).

3. táblázat

SLPI-vel előkezelt vírusok

	Negatív kontroll	Pozitív kontroll	T=0	T=2
RT-aktivitás (átlagbe- ütés/perc)	4,763	70,076	28,383	47,436
Standard deviáció	±1,698	±15,803	±5,520	±11,679

7. példa

A kísérletet a 4-6. példában ismertetettek szerint végeztük azzal az eltéréssel, hogy sem a sejteket, sem a vírusokat nem kezeltük SLPI-vel a fertőzést megelőzően. „Tiszta” (kezeletlen) sejtek és „tiszta” (kezeletlen) vírusok alkalmazásával az SLPI közvetlenül a fertőzés után, illetve a fertőzést követően két nappal hozzáadva körülbelül 50%-kal, illetve 42%-kal gátolta a vírusreplikációt (4. táblázat). Az 5. táblázat a fertőzést követően a 4., 6., illetve 8. napokon a felülúszóban található reverz transzkriptázaktivitást mutatja.

4. táblázat

Kezeletlen sejtek és vírusok

	Negatív kontroll	Pozitív kontroll	T=0	T=2
RT-aktivitás (átlag beütés/perc)	531	79,356	38,969	46,004
Standard deviáció	±186	±17,497	±7,700	±8,492

HU 218 892 Β

5. táblázat

Kezeletlen sejtek és vírusok

	Negatív kontroll	Pozitív kontroll	T=0	T=2
4. nap (átlagbeütés/perc)	435	1,556	797	1,287
Standard deviáció	±85	±300	±222	±204
6. nap (átlagbeütés/perc)	952	72,085	15,846	41,240
Standard deviáció	±715	±12,219	±5,644	±14,542
8. nap (átlagbeütés/perc)	1,519	13,853	7,617	11,946
Standard deviáció	±475	±3,458	±3,031	±2,889

8. példa

Vizsgáltuk a különböző SLPI-mutánsok vírusrep- 15 likációra kifejtett hatását is. Kezeletlen H-9 sejteket inkubáltunk 4 órán keresztül kezeletlen vírusokkal a 7. példában leírtak szerint. Mosást követően a sejteket

500 000 sejt/ml sűrűségben, 30 mikrogramm/ml SLPI-t, illetve a 6. táblázatban felsorolt SLPI-mutánsokat tartalmazó tápfolyadékban szuszpendáltuk. 8 nappal később a tenyészet felülúszójában meghatároztuk a reverz transzkriptázaktivitást (6. táblázat).

6. táblázat

	Negatív kontroll	Pozitív kontroll	Vad típus	Gly 20	Gly 72	Val 72	Lys 72	Phe 72
RT-aktivitás (átlagbeütés/perc)	4,815	55,126	39,323	39,387	40,549	36,077	52,239	8,384
Standard deviáció	12,849	±6,637	±10,933	±11,143	±33,537	±7,859	±5,863	±1,924

9. példa

A kísérletet a 8. példában ismertetettek szerint vé- 30 geztük azzal az eltéréssel, hogy a fertőzést követően a sejteket 100 mikrogramm/ml SLPI-t, illetve Phe72 mutánst tartalmazó tápfolyadékban szuszpendáltuk. A fertőzést követően a 2., 4., 6., 8., illetve 10. napokon maghatároztuk a felülúszóban található reverz transzkriptázaktivitást (7. táblázat). A 6. és 7. táblázat azt mutatja, hogy a Phe72 mutáns hatása különösen kifejezett volt.

7. táblázat

	Negatív	Pozitív	SLPI	Phe 72
2. nap (átlagbeütés/perc)		1,386	995	897
Standard deviáció		±914	±246	±472
4. nap (átlagbeütés/perc)		1,356	1,087	1,380
Standard deviáció		±370	±414	±442
6. nap (átlagbeütés/perc)	1,142	2,103	1,526	748
Standard deviáció	±389	±498	±508	±243
8. nap (átlagbeütés/perc)		77,931	25,241	3,491
Standard deviáció		±9,779	±8,399	±1,086
10. nap (átlagbeütés/perc)		21,431	12,499	2,239
Standard deviáció		±1,890	±3,495	±444

10. példa

Az SLPI önmagában való hatásának maghatározása céljából a H-9 sejtek proliferációját timidinbeépüléses eljárással vizsgáltuk oly módon, hogy 200 000 H-9 sejtet 100 mikrogramm/ml SLPI jelenlétében, illetve anél- 60 kül tenyésztettünk. A tenyészeteket a 0., 1., és a 2. napon 2,5 mikrocurie triciált timidinnel kezeltük, a beépült radioaktivitásnak megfelelő beütésszámot az 1., 2., és 3. napon mértük. Amint azt a 8. táblázat mutatja, az SLPI nem toxikus ezekre a sejtekre.

HU 218 892 Β

8. táblázat

HMimidin-beépüléssel mért H-9 sejt proliferáció (átlagos beütésszám)

	1. nap	2. nap	3. nap
Kontroll (- SLPI)	20,860	67,401	53,326
Standard deviáció	±581	±2,529	±3,783
+ SLPI 100 pg/ml	20,437	61,892	54,592
Standard deviáció	±1,503	±216	±2,781

11. példa

Az U1 promonocita-sejtvonal felhasználásával megvizsgáltuk krónikusan fertőzött sejtekről a vírustermelődés gátlását is. Az U1 sejtek szuszpenziós tenyészetét 10% FCS-sel és 200 mikrogramm/1 gentamicinnel kiegészített RPMI tápfolyadékban tartottuk fenn. A sejteket összegyűjtöttük, mostuk, és 2,5 millió sejt/ml sű5 rűségben szuszpendáltuk. A szuszpendált sejteket 100, illetve 200 mikrogramm/ml SLPl-t tartalmazó tápfolyadékban, illetve csak tápfolyadékban tenyésztettük egy éjszakán keresztül. A vírusokat 1 mikromol/1 végkoncentrációig 13-phorbol-12-mirisztát-acetát (PMA) hoz10 záadásával indukáltuk. 48 óra elteltével a sejttenyészet felülúszójában a 4-9. példákban ismertetettek szerint meghatároztuk a reverz transzkriptázaktivitást. Amint a 9. táblázat mutatja, az SLPI jelentősen gátolta ezekből a krónikusan fertőzött sejtekből való vírusfelszaba15 dulást.

9. táblázat

	- PMA SLPI	- PMA + SLPI (200 pg/ml)	+ PMA - SLPI	+PMA +SLPI (200 pg/ml)	+PMA + SLPI (100 pg/ml)
RT-aktivitás (átlagbeütés/perc)	1,052	994	5,052	2,864	2,648
Standard deviáció	±352	±447	±2,053	±403	±374

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Szerin leukocita proteáz inhibitor, funkcionális mutánsa, analógja vagy származéka alkalmazása retrovírusfertőzés gátlására szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati alkalmazás humán immunhiány-betegség vírusa (HÍV) által okozott fertőzés gátlására szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.
3. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati alkalmazás, ahol a szerin leukocita proteáz inhibitor mutánsa SLPI Phe 72 mutein, SLPI Gly 20 mutein, SLPI Gly 72 mutein, SLPI Val 72 mutein, CLPI Phe 25 mutein, CLPI Gly 25 mutein vagy CLPI Val 25 mutein.
4. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati alkalmazás egy gazdasejt, amely egy monocita vagy egy monocita prekurzorsejtje, retrovírus általi fertőződéséhez szükséges enzimfunkciójának blokkolására képes gyógyászati készítmény előállítására.
5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás gazdasejtként monocita-gazdasejt enzimfunkciójának blokkolására képes gyógyászati készítmény előállítására.
6. A 4. igénypont szerinti alkalmazás gazdasejtként promonocita-gazdasejt enzimfunkciójának blokkolására képes gyógyászati készítmény előállítására.
7. Eljárás hatóanyagként szerin leukocita proteáz inhibitorát tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított szerin leukocita proteáz inhibitort vagy funkcionális mutánsát, analógját vagy származékát és a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó- és/vagy hígítóanyagot összekeverve retrovírusfertőzés gátlására szolgáló gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán immunhiánybetegség-vírus (HÍV) által okozott fertőzés gátlására szolgáló gyógyászati készítményt állítunk elő.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutáns szerin leukocita proteáz inhibitorként SLPI Phe 72 muteint, SLPI Gly 20 muteint, SLPI Gly 72 muteint, SLPI Val 72 muteint, CLPI Phe 25 muteint, CLPI Gly 25 muteint vagy CLPI Val 25 muteint alkalmazunk.
10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy retrovírusfertőzés gátlására szolgáló gyógyászati készítményként egy gazdasejt, amely monocita vagy egy monocita prekurzorsejtje, retrovírus általi fertőződéséhez szükséges enzimfunkcióját blokkoló gyógyászati készítményt állítunk elő.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy monocita-gazdasejt enzimfunkcióját blokkoló gyógyászati készítményt állítunk elő.
12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy promonocita-gazdasejt enzimfunkcióját blokkoló gyógyászati készítményt állítunk elő.