CZ286794A3

CZ286794A3 - The use of non-immunogenic enzyme preparation

Info

Publication number: CZ286794A3
Application number: CZ942867A
Authority: CZ
Inventors: Ragnvald Lindblom; Faire Johan De
Original assignee: Phairson Medical Ab
Priority date: 1992-05-22
Filing date: 1993-05-21
Publication date: 1995-08-16
Also published as: AU4100093A; RU94046254A; ES2173887T3; SK140594A3; JPH08501068A; CA2136331C; HU9403343D0; KR100290266B1; EP0642351A1; ES2255097T3; NO944448D0; JP2000351734A; ZA933598B; CA2306952A1; NO944448L; ATE311853T1; SE9201628D0; DE69333931D1; AU675942B2; CN1089505A

Description

(57) Řešení se týká nových neimunogenních enzymových prostředků izolovaných z antarktického krilu (Euphausia superba) a vykazujících jak endo-, tak exopeptidázovou aktivitu, s nímž bylo ve velkém počtu klinických zkoušek překvapivě prokázáno, že poskytují léčbu pro různé choroby až zarážejícího rozsahu (popáleniny, záněty, oční a urologická onemocnění, rakovina aj.). Podle vynálezu se usuzuje, že tyto látky fungují způsobem podobným fagocytoze, tj. zdají se schopné rozeznávat, zaměřovat a ničit odlišující se buňky; vynález však není omezen na jakýkoliv hypotetický způsob účinku. Žádné toxické účinky nebyly pozorovány ani u těžkého předávkování, takže prakticky každá (rozumná) dávka je bezpečně použitelná. Prostředky podle vynálezu mohou být používány v lidské a veterinární medicíně ve formě roztoků např. místně (povrchové rány, intaktní kůže); nakapáním (močový trakt, píštěle); jako oční kapky; jako vyplachovací roztok; inhalačně; injekcemi (nitrokloubově, nitrožilně, intraperitoneálně, podkožně, nitrosvalově) a také ve formě gelů, např. místně nebo nakapáním (píštěle, proleženinové rány) nebo v suché práškové formě, např, v kyselinovzdorných kapslích při podávání do zažívacího traktu.

užití prostředků izolovaných z antarktického krilu

Oblast techniky

Vynález se týká nového farmaceutického použití neimunogenních bílkovinných látek a prostředků, jež mají enzymovou aktivitu a s nimiž bylo ve velkém počtu klinických zkoušek překvapivě prokázáno, že poskytují léčbu pro různé choroby až zarážejícího rozsahu. Podle vynálezu se usuzuje, že tyto látky fungují způsobem podobným fagocytóze, t.j. zdají rozlišovat různé částice nebo rozpuštěné látky za normální nebo abnormální v konkrétním nebo, jinak řečeno, zdají se schopné rozeznávat, se schopné považované prostředí zaměřovat a ničit odlišující se buňky. Musí být však zdůrazněno, že vynález není zamýšlen tak, aby byl omezen na jakýkoliv hypotetický způsob účinku vyjádřený v předkládané specifikaci.

Dosavadní stav techniky

Jedním z tradičních způsobů náhledu na proteolytické enzymy v medicínské aplikaci je jejich použití při čištění něhojících se ran pokrytých bílkovinnými strukturami jako alternativa k chirurgickému očišťování, jmenovitě u starších pacientů s vředy způsobovanými poruchami krevního oběhu. Viz např. US-A-4,801,451 a US-A-4,963,491, které uveřejňují směs exoa endopeptidázových enzymů, jež byly izolovány s antarktického krilu (Euphausia superba) a jejich použití pro čistící účely, (US-A-4,801,451), tak nefarmaceutické Jediným uveřejněným farmaceutickým odstraňování bílkovinných substancí, jak farmaceutické čištění čištění (US-A-4,963,491) čištěním je enzymatické

Uveřejněná použití pro pracích látek, renovace enzymatické čištění nekrotickych ran.

nefarmaceutické účely jsou např. jako starých maleb atd. VíO 85/04809 uveřejňuje použití enzymů z antarktického krilu jako podpory trávení. EP-A1-0170115 uveřejňuje použití krilu při rozpouštění trombů.

Enzymy a enzymové směsi odvozené od antarktického krilu byly izolovány a intenzivně studovány co do biologických a biochemických vlastností. Byly rovněž vyvinuty různé postupy k izolaci těchto enzymů. Viz např. Anheller J.-E., Hellgren L., Karlstam B a Vincent J. (1989): Biochemický a biologický profil nových preparátů enzymů z antarktického krilu (E. superba) vhodných k očišťování vředových lézí, Arch. Dermatol. Res. 281, 105-110; Axelsen N. Η., Kroll J. a Weeke B. (1973): Manuál kvantitativních imunoelektroforetických metod: Metody a aplikace, Scan. J. Immunol. 2, Suppl.; Bucht A. a Karlstam B. (1966): Imunologická charakterizace tří vysoce purifikovaných, trypsinu podobných, enzymů z antarktického krilu (Euphausia superba), Biol. Chem. Hopper-Seyler 367, 366 (Suppl.); Bucht A, Johansson B. a Karlstam B. (1986): Separace a identifikace protáz z antarktického krilu (Euphausia superba), 6th Int. Symp. HPLC Proteins, Peptides, and Polynucleotides, Baden-Baden, pp. 34; Chen C. S., Yan T. R. a Chen Η. Y. (1978): Purifikace a vlastnosti trypsinu podobných enzymů a karboxypeptidázy A z Euphausia superba, J. Food Biochem. 2, 349-366; Hellgren L., Karlstam Β., Mohr V. a Vincent J. (1991): Enzymy z krilu - nová koncepce účinného očišťování nekrotických vředů, Int. J.

Karlstam B.: Křížová bílkovin z antarktického krilu serinovým Kusama S.

charakterizace serinových Agric. Biol. Chem. 47,

Dermacol. 30, 102-103;

imunoelektroforetická analýza (Euphausia superba) se zvláštním zřetelem k proteinázám, (podáno k publikaci); Kimoto K. K., a Murakami K. (1983): Purifikace a proteináz A z Euphausia superba,

529-534; Lowry O. Η., Rosebrough N. J., Farr A. L., a Randal R. J. (1951): Měření bílkovin s Folinovým fenolovým činidlem, J. Biol. Chem. 193, 265-275; Moore S a Sfeein W. H. (1963): Chromatografické stanovení aminokyselin s použitím automatického zapisovacího zařízení, Methods Enzymol. 6, 819-931; Osnes K. K. a Mohr V. (1985); O purifikaci a charakterizaci tří anionických peptid-hydroláz serinového typu z antarktického krilu, Euphausia superba”, Comp. Biochem. Physiol. 82B, 607-619; a Osnes K. K. a Mohr V. (1986);

O purifikaci a charakterizaci exopeptidáz z antarktického krilu, Euphausia superba’', Comp. Biochem. Physiol. 83B, 445-458.

Podklady vynálezu: Náš imunitní systém je vždy pohotový a aktivní a jeho hlavními funkcemi jsou obrana a ochrana integrity našeho těla tím, že se postará o cizí útočníky, staré a opotřebované buňky, odlišné buňky a rozpustné látky, jež jsou považovány za abnormální v daném prostředí.

Fagocyty, granulocyty, makrofágy a NK-buňky jsou naše staré imunitní buňky a typem působení v obraně a ochraně je fagocytóza, t.j. pohlcení např. zárodku dovnitř sebe sama a uvolnění lysozymálních enzymů, které zabijí a rozloží zárodek.

Lymfocyty, T-buňky a B-buňky jsou naše nové imunitní buňky a vykazují řadu typů působení při obraně a ochraně. Některé T-buňky uvolňují toxíny na zabíjení mikrobů, jiné doručují zprávy a řídí intenzitu odezvy a B-buňky produkují protilátky. Staré a nové buňky interagují v komplexní provázanosti k optimální ochraně našeho těla.

V případě poškození tkáně se objevují během několika minut na granulocyty a začínají okamžitě napadat cizí útočníky, poškozené buňky atd. Během několika hodin odpovídají makrofágy, NK-buňky a T-buňky na chemotaktické signály činných granulocytů a vstupují do dané oblasti. Začíná komplikované provázání činností ke smetení poškozené tkáně a konečnému zhojení.

Znamení aktivované imunitní obrany může být viditelné jako zánět, jenž je způsobován toxíny unikajícími z různých imunitních buněk a mikrobů a tento zánět je zdravý pokud je udržován na nízké úrovni. Někdy se imunitní obrana stane přeaktivovanou a akutní zánět se ukáže vykazovat více škody než užitku, a když zánět přetrvává, může se stát chronickým, což může být počátkem autoimunního stavu.

Hlavní důvod, proč se zánět dostává mimo normální průběh, jsou ikrobiální infekce a navzdory různorodým činnostem naší imunitní ochrany mají mikroby vyvinuty prostředky své ochrany, které mohou dlouhodobě vést k velice nebezpečným stavům.

Mikroby se mohou skrývat k nerozeznání pro imunitní buňky nebo mohou vnikat dovnitř buněk, dokonce do imunitních buněk, a žít, množit se a měnit paměť svých hostitelských buněk. Některé nádory, AIDS a těžké komplikace oportunistickými příklady takovéhoto mikrobiálního (špatného) infekcemi jsou chování.

Patogeneze imunitní systém choroby je tak závislá na tom, funguje a normálně je tento systém jak dobře v dokonalé rovnováze se svými úkoly. Vedle mikrobiálních zásahů jsou léky hlavním zdrojem dočasného nebo trvalého ochrany a mnoho pozornosti farmaceutického tímno směrem.

potlačení imunitní výzkumu je zaměřeno

Podstata vynálezu působí v souladu

Dokonalým a symbiotickém směrováním na lékem by byl lék, jenž provázání se systémem imunitní obrany a se příčinu a symptomy, bez škodlivých reakcí.

Předkládaný vynález poskytuje nová farmaceutická použití nových farmaceutických prostředků, které se zdají mít řečené vlastnosti. Způsoby, jimiž se tohoto doashuje, zahrnujé použití jednoho nebo více proteolytických enzymů izolovaných z antarktického krilu (Euphausia superba). Jak je zmíněno výše, tyto enzymy jsou známy jako takové, a byly též navrženy pro některá .farmaceutická použití. Výsledky získané při používaní řečených enzymů z krilu pro účely zde uveřejněné nebylo lze očekávat, a získané výsledky jsou skutečně neočekávané. Způsoby jako byly výsledky dosaženy jsou vysvětleny v následujících příkladech a připojených nárocích.

Příklad preparace: Jak je zmíněno výše, mnoho postupů izolace proteolytických enzymů z krilu je již známo takže následující je jen jednou z mnoha možných cest k přípravě enzymových preparátů, jež mohou být použity podle vynálezu.

Hlubokozmražený bílý kril, Euphausia superba, byl rozmražen a zhomogenizován. Byla přidána destilovaná voda v poměru 1': 1 (obj./hmotn.) a 0.02 % azid sodný a ponecháno 6 hod při +4°C.

Sebrala se vodná fáze spolu s centrifugátem od kousků masa a krunýřů, 9000 rpm po 40 minut. Vodná fáze byla odmaštěna ethylacetátem při +4°C přes noc. Spodní vodná vrstva byla sebrána a odpařaována po několik hodin.

Byl přidán nasycený roztok síranu amonného k 60 % sycení. Získaná sraženina byla zcentrifugována při 9000 rpm po 40 minut a pak rozpuštěna v 0,05 M fosfátovém pufru, pH 7,4, 0,05 M chloridu sodném (PBS) a dialyzována proti PBS, surový extrakt.

Surový extrakt byl nanesen na kolonu Sephacryl 200 (Pharmacia, Švédsko) a bílkovinné frakce byly sbíraný při 280 nm absorbci a testovány na proteolytickou aktivitu. Aktivní frakce byly spojeny a lyofilizovány. Spojené aktivní frakce budou v následujícím záměnné nazývány Multi-Protein, Multi-Enzyme, PHIM nebo PHIM 106.

Rozsah molekulových hmotností izolovaných enzymů byl stanoven SDS-PAGE PAA4/30 (Pharmacia, Švédsko). Ukázalo se nejméně 6 pruhů v rozsahu 18 000 - 40 000, konkrétně 24 000 - 34 ooo.

Jedna frakce gelové chromatografie zde výše vykazovala jak endo- tak exopeptidázové aktivity a tato frakce byla použita k další separaci. Bylo ukázáno, že tato frakce může obsahovat jednotlivý enzym s molekulovou hmotností 26 000 - 32 000. v následujícím bude nazývána Single-Protein nebo Single-Enzyme.

Ani surový extrakt, ani Multi-Protein, ani Single-Protein nevykazovaly žádné baktericidní účinky in vitro, snad jen bakteriostatický účinek.

Normální rozsah teplot pro enzymy v žijících krevetkách je -5 až -2°C. Překvapivý je nález, že teplotní optimum pro tyto enzymy je +55°C při neutrálním pH a že některé enzymy jsou stále při 100°C po 1 hodinu.

Různé chrakteristiky PHIM: V obrázku 28 je ukázána teplotní stabilita PHIM připraveného jako výše, t.j. procento relativní aktivity PHIM (aktivita vyjádřena jako digerovaná plocha bovinního kaseinu; BioRad Protease Substráte Tablets; 30°C po hod) jako funkce času při teplotách 10, 20, 30, 40,.50, 60, a

70°C. Při 70°C aktivita poklesla k méně než 25 % po 2 hodinách, zatímco toto trvalo nejméně 12 hodin při 60°C. Při 40°C je pokles aktivity pod 25 % pozorován po 11 dnech, zatímco aktivita PHIM po 11 dnech při 30°C je stále kolem 100 %.

V obrázku 29 je ukázáno teplotní optimum, t.j. celková proteolytická aktivita PHIM (aktivita vyjádřena v kaseinových ekvivalentech v mm² jako digerovaná plocha bovinního kaseinu; BioRad Protease Substráte Tablets; 30°C po 24 hod) jako funkce teploty. Zajímavý je nález, že optimální aktivita se získá při 55°C.

V obrázku 30 je ukázána pH stabilita PHIM, t.j. procento relativní aktivity PHIM (aktivita vyjádřena jako digerovaná plocha bovinního kaseinu; BioRad Protease Substráte Tablets; 30°C po 20 hod) jako funkce času při různých hodnotách pH. Rekonstituovaný PHIM byl ponechán při pokojové teplotě od 2 do 18 hodin. Při pH 3,5 a pH 11 nastane rychlý pokles aktivity už po několika hodinách, zatímco mezi pH 7.0 a pH 9.5 je aktivita po 18 hodinách stále nad asi 70 %.

V obrázku 31 je ukázáno pH optimum PHIM, t.j. celková proteolytická aktivita PHIM (vyjádřena v kaseinových ekvivalentech v mm² jako digerovaná plocha bovinního kaseinu; BioRad Protease Substráte Tablets; 30°C po 16 hod) jako funkce pH. Zjištuje se, že optimum proteolytické aktivity je při pH asi 8.

V obrázku 32 je ukázána křivka dávka/aktivita PHIM, t.j. celková proteolytická aktivita PHIM (vyjádřena v kaseinových ekvivalentech v mm² jako digerovaná plocha bovinního kaseinu; BioRad Protease Substráte Tablets; pH 7,0; 30°C po 24 hod). Koncentrace bílkoviny byla měřena podle Bradford, Μ., Anal. Biochem. 72, 248, 1976. Aktivita prudce roste se zvyšující se dávkou PHIM a dosahuje maxima při asi 1,5 mg PHIM, když aktivita má stále stejnou hodnotu při 15 mg PHIM.

Klinické příklady: Pro osvětlení terapeutických účinků získaných podle vynálezu, možných omezení a potíží v klinické praxi, byly enzymy a směsi enzymů podle vynálezu klinicky testovány mezi jinými pro tyto následující indikace:

- Infekce

- Záněty

- Mrtvé a odlišné buňky

- Opurtunistické infekce

- Oční choroby

- Bolesti

- Rakovina.

Všechny studie byly navrženy jako orientační studie na malém počtu pacientů pro příslušnou indikaci. K výzkumným cílům studie byly vybírána většinou taková místní poranění a zasažená místa, která umožňovala provádění vizuálních prohlídek klinických parametrů.

Ve většině případů byl klíčovým prvkem pro výběr pacienta jinak zdravý pacient, t.j. zaměření bylo na situaci primárních klinických problémů a vyloučeny byly podmiňující systémové faktory tak, aby bylo možno dobře interpretovat výsledky. Určitá variabilita obecných podmínek a systémových faktorů je přirozeně zahrnuta v tomto pacientském materiálu, protože participovali pacienti od 20 do 85 let věku a zahrnuty byly indikace od lehkých ambulantních zánětů po nemocničně lůžkové léčené potíže. Každá testovaná skupina tvořila relativně homogenní skupinu qo do obecných podmínek a podmiňujících systémových faktorů.

Stručný popis obrázků

Obrázky 1 - 4 jsou diagramy ukazující průměry exudačních poměrů, průměry nálezů zarudnutí, průměry nálezů otoků/edémů, a průměry bolestivosti pro léčení pooperačních chirurgických rán pomocí Single-Enzyme a Multi-Enzyme podle vynálezu.

Obrázky 5 a 6 jsou diagramy ukazující průměry odstraňování bolesti a nálezů zánětů pro 7-denní léčení bolestivých gumózních infekcí pomocí Multi-Enzyme podle vynálezu.

Obrázky 7 a . 8 jsou diagramy ukazující nálezy zarudnutí/otoků a bolestivých pocitů pro devítidenní léčení virových infekcí horních cest dýchacích pomocí Multi-Enzyme podle vynálezu.

Obrázky 9 a 10 jsou diagramy ukazující průměry intervalů mezi močením respektive nálezů odstraňování bolesti pro čtyřdenní léčení urologických zánětů močového měchýře a močové trubice pomocí Multi-Enzyme podle vynálezu.

Obrázek 11 je diagram ukazující průměry odstraňování bolesti při sedmidenním léčení akutní arthritidy dostihových koní pomocí Multi-Enzyme podle vynálezu.

Obrázek 12 je diagram ukazující rozkladnou účinnost Single-Enzyme na nekrotických pooperačních ránách.

Obrázek 13 ukazuje křivku dávka/odezva Multi-Enzyme (PHIM) při indikaci popáleniny.

Obrázek 14 ukazuje intervaly dávka/odezva Multi-Enzyme (PHIM) při různých indikacích.

maximální tělesné nahromaděné množství váhy k dosažení léčby

Obrázek 15 ukazuje Multi-Enzyme (PHIM) na kg u různých indikací.

Obrázek 16 ukazuje Multi-Enzyme (PHIM) na kg u různých indikací.

Obrázek 17 je sloupcový nádorů pomocí jediné injekce (IT, v porovnání s kontrolní skupinou.

Obrázek 18 je podobný Obr. 17, ale opakovaných subkutánních injekcí PHIM 106.

Obrázek 19 je sloupcový diagram ilustrující objemy nádorů pro podávání PHIM 106 a porovnání ke kontrole.

Obrázky 20 a 21 ukazují histopatologické řezy kontrolních potkanů ve dvou různých stupních zvětšení.

Obrázky 22 a 23 ukazují řezy odpovídající Obr. 20 a 21, ale pro potkany léčené podle vynálezu.

Obrázky 24 a 25 jsou fotografie ukazující nádory neléčených kontrolních potkanů, a

Obrázky 26 a 27 ukazují odpovídající fotografie potkanů léčených jedinou subkutánní injekcí podle vynálezu.

minimální tělesné nahromaděné množství váhy k dosažení léčby diagram ukazující účinek při léčbě IP nebo SC) PHIM 106 ukazuje výsledky

Obrázek 28 ukazuje teplotní stabilitu PHIM, t.j. procento relativní aktivity PHIM versus čas při různých teplotách.

Obrázek 29 ukazuje teplotní optimum PHIM, t.j. celkovou proteolytickou aktivitu jako funkci teploty.

Obrázek 30 ukazuje pH stabilitu PHIM, t.j. procento relativní aktivity PHIM versus čas při různých hodnotách pH.

Obrázek 31 ukazuje pH optimum PHIM, t.j. celkovou proteolytickou aktivitu jako funkci pH.

Obrázek 32 ukazuje křivku dávka/odezva PHIM, t.j. celkovou proteolytickou aktivitu jako funkci dávky PHIM.

Příklady provedení vynálezu

Klinické příklady 1 až 10 - infekce

Infekce a záněty se nejčastěji vyskytují společně a vykazují podobné klinické znaky, t.j. zarudnutí, otok, zápal, edém, exudaci, hnisání, bolest, nekrotické tkáně a někdy zápach. Tyto klinické znaky byly sledovány a zaznamenávány pro hodnocení průběhu léčby a účinnosti přípravků Single-Protein a Multi-Protein podle vynálezu, jak je popsáno výše.

Příklad 1

Pooperační chirurgické rány.

Celkově 40 pacientů bylo zahrnuto do této studie a bylo rozděleno do dvou skupin po dvaceti pacientech, reprezentujících 41 postoperačních břišních (34) a hrudních (7) ran. Preparáty jedn./ml resp. Multi-Enzyme, byly testovány na každé skupině, bez konzervačních látek nebo rekonstituci v 5 ml solného

Single-Enzyme, 3 kaseinové kaseinových jedn./ml z krilu Lyofilizovaný bílý prášek antimikrobiálních přídavků. K roztoku.

Pacienti měli průměrný věk 52 + 16 let, a zahrnovali mužů a 12 žen. Protimikrobiální působení preparátů bylo velmi dobré až výborné co do klinických výsledků a účinnosti. Během dnů všechny infekce přešly do subklinické úrovně a veškeré jasné znaky klinické infekce vymizely. Nebylo možné vidět žádný rozdíl mezi zmíněnými dvěma přípravky. Nebyly pozorovány áádné zřejmé nebo suspektní nežádoucí reakce.

Výsledky jsou shrnuty v Obrázcích 1-4.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 100, s výhodou 1 až 25 mg na 100 cm².

Příklad 2

Popáleniny malé velikosti

Do této studie bylo zahrnuto 11 pacientů s menšími hlubokými popáleninami infikovanými S. aureus a P. aeruginosa neodpovídajícími a antibiotika a selverdiazinovou mast. 5 pacientů bylo léčeno pomocí hydrokoloidní masti Single-Enzyme, 3 kaseinové jednotky/ml a 6 pacientů pomocí roztoku Multi-Enzyme, 5 kaseinových jednotek/ml. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Přípravek Multi-Enzyme: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml solného roztoku na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml roztoku. Přípravek Single-Enzyme: 1 ampule ke smíchání s 5 ml hydrokoloidního gelu roztoku na konečnou koncentraci 3 kaseinových jednotek/ml gelu.

Všechny rány byly úplně prosté veškerých známek infekce do 5 dnů léčby, což bylo potvrzeno MO kultivacemi. Nekrotické tkáně, hnis a fibrinová vlákna v granulační tkáni byly účinně rozloženy oběma přípravky a nebyl vidět rozdíl v účinnosti přípravků. Nebyly zaznamenány žádné nežádoucí reakce na přípravky.

Výsledky testu jsou shrnuty v Tabulce 1.

Tabulka 1

Kompilace dat o popáleninách malé velikosti

Rána č. pl.oir	kmen	HO-stav před(10³)	Vizuální procento Nek./Hn./Fib./Gran./Epit.	Přípravek	Den ukonč.	HO-stav po(10³)	Vizuální procento Nek./Hn./Fib./Gran./Epit.	Zhoj.d. po léč.
I 1.5	P. aerig.	16	20	60	20			roztok	3.5	1		30	70	3
II 4.0	P. aerig.	18	50	10	40			gel	5.0	1	10	60	30	11
III 3.6	S. aureus	22	10	90				gel	3.0	1	10	40	50	6
IV 2.4	P. aerig.	14	40	10	50			gel	3.0	1		50	50	. · ·
.. V 2.8	S. aureus	17		100				roztok	4.0	1		30	70	7
VI 1.9	S. aureus	16		100				roztok	2.5	1		20	80	4
VII 1.5	S. aureus	15	10	80	10			gel	5.0	1	10	60	30	15
VIII 3.2	P. aerig.	. 12	40	40	20			roztok	3.0	1		60	40	6
IX 1.8	S. aureus	16	10	90				roztok	2.5	1		20	80	• ·«
X 2.3	P. aerig.	17	30	30	40			gel	3.5	1		40	60	8
XI 3.1	P. aerig.	20	30	30	40			roztok	5.0	1	10	80	10	18

Příklad 3

Bolestivé gumózní infekce

Do této studie bylo zahrnuto 22 pacientů s akutními a chronickými gomózními infekcemi/záněty. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Přípravek Multi-Enzyme: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml solného roztoku na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml roztoku.

Třikrát denně, ráno v poledne a večer, jedna ampule byla rekonstituována v 5 ml vodovodní vody a ústní dutina byla vystavena působení 5 minut. Jídlo a pití nebyly povoleny 2 hodiny po použití. Léčba probíhala 7 dní nezávisle na výsledcích.

Zmírnění bolest bylo zaznamenáno po 20 minutách až 12 hodinách léčby. Infekce a záněty zmizely do 4 dnů a nenavrátily se během následujících 3 týdnů. Nebyly zaznamenány nežádoucí reakce.

Výsledky jsou shrnuty v Obrázcích 1-4.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 100, s výhodou 1 až 35 mg na léčebný výkon.

Příklad 4

Virové infekce horních cest dýchacích

Do této studie bylo zahrnuto 11 pacientů s infekcemi chřipkovým virem a sekundárními bakteriálními infekcemi v horních cestách dýchacích (např. sinusitídou).

Virové infekce v dýchacích cestách poškozují cílie a zánětlivá reakce začíná zarudnutím, otokem a zvýšenou mukozální sekrecí. Poškozené cílie nemohou nadále odstraňovat inhalované bakterie a bakteriální infekce bývají častými komplikacemi virových infekcí.

Dalšími typickými symptomy virových infekcí jsou celkový chorobný stav, silný pocit únavy, horečka a celkové bolesti.

Viry jsou závislé na hostitelských buňkách co do svého přežití a množení a úkol zabít virus bez poškození nebo zabití hostitelské buňky je těžký.

Přípravek Multi-Enzyme: Byl použit lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Jedna ampule k rekonstituci v 5 ml solného roztoku na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml.

Přibližně 0,25 ml testovaného roztoku bylo aplikováno jako sprej do každé nosní dírky a asi 4,5 ml působilo na ústní dutinu po 5 minut. Postup se opakoval třikrát denně a klinické parametry zarudnutí, otoku, mukozní sekrece, bolesti a nežádoucích reakcí se zaznamenávaly jednou za den.

Léčba byla ukončena když vymizely veškeré známky infekce ale ne později jak po 10 dnech.

pacientů bylo bez symptomů po šestidenní léčbě a ostatní tři pacienti po devítidenní.

Zmírnění bolesti nastalo u všech pacientů a došlo k němu během 2 hodin až dvou dnů. Sputum se vyjasnilo během tří dnů u pacientů s uvolňováním hnisu. Zarudnutí a otoky zmizely během 4 dnů.

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Výsledky jsou shrnuty v Obrázcích 7 a 8.

Příklad 5

Infekce herpes simplex v ústní dutině pacientů s opakovaně vzniklými pupínky herpes simplex v ústní dutině bylo léčeno dvakrát denně přípravkem ústní vody. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Přípravek Multi-Enzyme: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml solného roztoku na konečnou koncentraci kaseinových jednotek/ml roztoku.

Ampule byla připravována před každým léčebným výkonem a ústní dutina byla vystavena testovanému roztoku po 5 minut. Jídlo a pití nebyly povoleny 2 hodiny po každém léčebném použití. Postup se opakoval dvakrát denně a klinické parametry zarudnutí, otoku, bolesti a nežádoucích reakcí se zaznamenávaly jednou za den.

Zmírnění bolesti nastalo během 2 hodin po prvním léčebném výkonu a u některých pacientů se bolest navracela mezi léčebnými výkony během prvních dvou dnů ale nikdy už potom.

Všichni pacienti byli bez symptomů po 5 dnech a všechny pupínky byly zhojeny. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Z Příkladů 1 až 5 zde výše se zdá, že zlepšení bakteriálních, virových a plísnových infekcí sleduje velice podobný průběh a všechny známky infekcí a zápalů vymizí během

3-6 dní. Dokonce bakteriální kmeny rezistentní k lékům, jako

S. aureus a P. aeruginosa v popáleninách, a intracelulární virus, jako herpes simplex, sledují stejný obraz. Gumózní infekce a virové infekce horních cest dýchacích jsou rovněž účinně léčeny pouhým působením v ústní dutině celkově 15 minut denně po 5 - 7 dní. Krátký čas účinného nasazení a potenciální vymývací efekt slin podporují hypotézu, že bílkoviny z testovaných přípravků mají schopnost adheze k buňkám a schopnost působit mnohem déle než je skutečné ošetřování. Podobná pozorování byla získána u pacientů s extrémní sekrecí slz při očních infekcích. Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 100, s výhodou 1 až 35 mg na léčebný výkon.

Příklad 6

Infikované proleženinové vředy starších pacientů s celkem 18 proleženinami na patách a spodních zádech bylo zahrnuto do této studie. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Přípravek Multi-Enzyme: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml solného roztoku na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml roztoku.

Vředy byly důkladné omyty solným roztokem a vyprázdněny jak jen bylo možno před nakapáním 5 ml roztoku Multi-Enzyme do vředu a zakryty polopřilnavým obvazem. Postup byl opakován-dvakrát denně po 7 dní a vředy byly prohlíženy co do zánětu, zarudnutí, zvýšené teploty, otoku, nekrotické tkáně, hnisu, bolesti a možných nežádoucích reakcí.

Infekce odešly během čtyřdenní léčby. 6 ran se zhojilo úplně během 7 dní a celkem jedenáct během 14 dní. 7 ran se nezhojilo z důvodů celkového stavu pacientů, ale rány vykazovaly určité zlepšení. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 100, s výhodou 1 až 25 mg na 100 cm².

Příklad 7

Píštělové infekce

Účelem této studie bylo zkoumat protimikrobiální a rozkladné účinnosti a užitečnost přípravků Single-Enzyme a Multi-Enzyme z krilu na řitní píštéle. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Single-Protein s endo- a exopeptidázovými aktivitami: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml hydrokoloidního gelu na konečnou koncentraci 3 kaseinové jednotky/ml. Multi-Protein se směsí endo- a exopeptidázových aktivit: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml hydrokoloidního gelu na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml roztoku.

Píštéle byly důkladně omyty solným roztokem a vyprázdněny jak jen bylo možno před nakapáním gelu Single-Protein řesp. Multi-Protein. Postup byl opakován jedenkrát denně a pacienti byli prohlíženi co do zarudnutí, zvýšené teploty, otoku, hnisu, bolesti a nežádoucích reakcí.

Léčba byla ukončena když vymizely veškeré známky infekce a zánětu ale ne později jak po 10 dnech.

+ 2 pacienti s řitní pištěli bez spojení k rektu byli zahrnuti do této studie a léčeni přípravky gelu Single-Protein resp. Multi-Protein.

Úplné zbavení bolesti bylo zaznamenáno během 48 hodin známky infekce a zánětu vymizely během 4 dnů.

Všechny píštěle se zhojily od žestého do devátého dne a žádná rekurence nebyla hlášena během následného šestiměsíčního sledování. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Z výšeuvedených příkladů plyne, že komplikované infekce, jež jsou ze zkušenosti považovány za těžko léčitelné, jako řitní píštěle a proleženinové vředy, byly úspěšně léčeny a finálně zhojeny ve většině případů časového rámce příslušné studie.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikací je 0,01 až 100, s výhodou 1 až 25 mg na 100 cm².

Příklad 8

Oční infekce pacientů s hnisavými opčními injekcemi bylo léčeno dvakrát denně očními kapkami přípravku Multi-Enzyme z krilu. (Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. 1 ampule Multi-Enzyme k rekonstituci v 25 ml vody pro injekce na konečnou koncentraci 1 kaseinová jednotka/ml. Do infikovaného oka bylo nakapáno ráno a večer po dvou kapkách, přibl. 0,4 ml, testovaného roztoku. Při každé aplikaci bylo oko prohlíženo co do zarudnutí, otoku, hnisu, sekrece slz a možných nežádoucích reakcí.

Všichni pacienti byly bez infekce během třídenní léčby.

Zarudnutí a zanícení kolem očí odezněly během 2 dní a nadbytečné slzení zmizelo během 2 dní také. Okamžitě po první aplikaci všichni pacienti pociťovali vyhlazení v infikovaném oku a dráždění a citlivost kolem oka zmizely během několika minut. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Z výšeuvedeného příkladu plyne, že oční infekce odpovídaly nejrychleji na léčbu i když byla použita velmi nízká koncentrace, 0,4 kaseinových jednotek na ošetření.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 50, s výhodou 0,1 až 5 mg na léčebný výkon.

Příklad 9

Profylaktické ošetření pooperačních ran

Přípravky Single-Enzyme a Multi-Enzyme z krilu byly testovány proti kontrolnímu sterilnímu 0,9 %-nímu roztoku NaCl jako profylaktický antimikrobiální omývací roztok na pooperačních ranách, celkem u 60 pacientů, 20 v každé skupině.

Nekrvácející pooperační rány, první ošetření 6 - 12 hodin po operaci, byly převazovány dvakrát denně s příslušným roztokem. Rány byly důkladně myty příslušným roztokem a pokryty sterilní gázou pod polopřilnavým obvazem. Při každém převazu byly rány prohlíženy co do infekce, zánětu, zarudnutí, otoku, zvýšené teploty, nekrotických tkání, fibrínu, hnisu, krvácení, bolesti a možných nežádoucích reakcí.

Ošetřování bylo skončeno když se rány zhojily, > 90 % epitelizace, nebo když testované nebo kontrolní ošetřování selhalo.

Žádné pooperační klinické infekce nanastaly ve skupinách ošetřovaných roztoky Single-Enzyme nebo Multi-Enzyme, a ani akutní záněty nebo zarudnutí nebyly pozorovány u žádného pacienta v těchto dvou skupinách. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

V kontrolní skupině se u 4 pacientů vyvinuly těžké invazivní infekce a další dva pacienti měli akutní záněty. Zarudnutí, otok a bolest byly často pozorovány v této skupině. 14 ran se zhojilo během destidenního ošetřování.

Příklad 10

Urinární infekce močového měchýře a močové trubice pacientů, pouze žen, s bolestivými urinárními infekcemi bylo zahrnuto v této studii. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Přípravek Multi-Enzyme: 6 ampulí k rekonstituci v 50 ml solného roztoku na konečnou koncentraci 3 kaseinové jednotky/ml roztoku.

První vypuzená moč byla u všech pacientů kalná, druhá čistá až slabě kalná.

Zmírnění bolesti bylo okamžité a zlepšená schopnost udržovat moč byla zřetelná po dvoudenní léčbě. MO-vzorky neprokázaly žádné bakterie po čtyřdeníí léčbě a všechna léčení byla ukončena po 4 dnech. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Výsledky jsou shrnuty v Obrázcích 9 a 10. Průměrné hodnoty MO-stavu jsou uvedeny v Tabulce 2.

Tabulka 2

Průměrný MO-stav při čtyřech dnech léčení přípravkem Multi-Enzyme z krilu

MO-stav před léčením	MO-stav den 2	MO-stav den 4
1,4 χ 10⁴	4,3 χ 10³	< 1,0 χ 10²
100 %	31 %	< 1 %

Z Příkladu zde nahoře plyne, že urinární infekce močového měchýře a močové trubice odpovídaly velmi dobře na ošetření zakapáním, dvakrát denně. Po dvoudenním léčení akutní známky infekce a zánětu vymizely a po čtyřdenním léčení byli všichni pacienti bez symptomů.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 200, s výhodou 1 až 50 mg na léčebný výkon.

Klinické příklady - záněty

Záněty jsou společným znakem většiny studií a zmírnění zánětu je podobné u všech indikací. Během 3 až 4 dní byly záněty zmírněny na úroveň přijatelnou pro správný uzdravovací proces. V profylaktické studii pooperačních ran (Příklad 9) nenastal v testované skupině žádný zánět. Porovnej rovněž Příklad 3 (akutní a chronické gomózní infekce/záněty).

Příklad 11

Zanícené klouby koní kulhajících klusákú se zanícenými koleny předních nohou bylo zahrnuto do této studie. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Přípravek Multi-Enzyme: 1 ampule k rekonstituci v 10 ml vody pro injekce na konečnou koncentraci 2,5 kaseinové jednotky/ml roztoku.

ml testovaného roztoku bylo injikováno do bolestivého kloubu ve dnech 1,2,4a 7. Po injekci byly koně prohlíženy co do okamžité nežádoucí reakce nebo zhoršení celkového stavu. Klinické parametry byly sledovány jednou denně.

případů odpovídalo rychlím zmírněním bolesti, 30 minut až dvě hodiny po prvním ošetření, 4 další případy během 6 hodin, 2 další případy během 2 hodin po druhé injekci. 1 řípad vykázal zmírnění bolesti po třetí injekci a tento případ měl extrémní otok kolem kolena.

Teplota o otok byly rychle sníženy a žádné známky zánětu nebylo možno pozorovat po dvou dnech u 15 ze zařazených případů.

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Výsledky jsou shrnuty v Obrázku 11.

Z Příkladu zde nahoře plyne, že akutní artritida u dostihových koní může být léčena vnitrokloubovými injekcemi v postupné léčbě 4 injekcí během 7 dní. Klinické známky zánětu byly rychle redukovány a teplota a otok odezněly během 2 dní. Po týdnu rekonvalescence byly koně zpět v lehkém tréningu.

Klinické příklady - mrtvé a odlišné buňky

Porovnej rovněž Příklady 3, 4, 5 a 10.

Příklad 12

Nekrotické pooperační rány pacientů s nekrotickými ranami bylo léčeno přípravkem Single-Enzyme z krilu. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. K rekonstituci v 5 ml solného roztoku. Přípravek Single-Enzyme: 3 kaseinové jednotky/ml.

Normální mytí a hygiéna rány se prováděly před aplikací Single-Enzyme. Dvakrát denně byla ampule naředěna v 5 ml solného roztoku a nanesena na gázový obvaz úplně pokrývající ránu. Odtečená gáza byla na ráně připevněna samolepícím polopřilnavým obvazem. Při každé změně obvazu byla rána vizuálně prohlížena co do zarudnutí, edému, krvácení, otoku, zvýšené teploty, mokvání, hnisu, nekrotických tkání, bolesti, zápachu, možných nežádoucích reakcí a celkového stavu pacienta. Léčba byla ukončena když byly rozloženy veškeré nekrózy, fibrín, hnis a krevní sraženiny, ale ne později jak po 7 dnech.

Tento pacientský materiál byl heterogenní co do etiologie ran, t.j. plánovaných operací, traumat, popálenin, postřelení a diabetických pacientů. Všichni pacienti byli léčeni na polyklinice dvakrát denně. Nebyly pozorovány žádné nežádopcí reakce na testovaný přípravek.

Výsledky jsou shrnuty v Obrázku 12.

Jak je zřejmé ze zhorauvedeného, nekrózy, fibrin, hnis, krevní sraženiny a povlaky mohou být účinně rozloženy během tádne a některé rány se během týdne zhojí. Popáleniny, postřelení a pooperační rány vykazovaly ze účinnost, ale při konci studie, 7 dnech, uvolněny z podkladu a co zůstalo byl jenom horní povrch nekróz, jako víčko, a rány byly zčásti zhojeny během týdne.

začátku velmi malou nekrózy byly úplně

Příklad 13

Rozklad tvořených jizev a keloidů

Účelem této studie bylo zkoumat rozkladnou účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein z krilu jako alternativy k chirurgické konzervačních Multi-Protein revizi. Lyofilizovaný bílý prášek bez látek nebo antimikrobiálních přídavků, s endo- a exopeptidázovými aktivitami: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml vody pro injekce na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml.·

Na každý cm jizvy/keloidu bylo injikováno 0,2 ml roztoku Multi-Protein na maximální obkem 1 ml na lézi a den. Postup byl opakován jednou denně a jizva/keloid byla prohlížena co do zarudnutí, otoku, zvýšené teploty, krvácení, nekróz a nežádoucích reakcí.

Léčba byla ukončena při 80 % rozkladu jizvy/keloidu ale ne později jak po 7 dnech.

Přípravek Multi-Protein byl injikován jednou denně do obličejových jizvovových útvarů a 3 keloidních útvarů na rukou a předloktích.

Fibrinózní jizvy se zmenšily na přibl. 25 % svého původního objemu a kolagenózní keloidy na přibl. 70 % po sedmidenní léčbě.

Během této zkoušky nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Jak je ze výšeuvedeného vidět, intradermální a sukutánní jizvové útvary a keloidy byly rozkládány ze 75 resp. 30 % po sedmidenní léčbě nitrotkáňovými injekcemi. Při kosmetických korekcích jizev a keloidů nesmí být rozklad příliš rychlý a zřídka více nž 60 - 80 % jizev/keloidů má být odstraněno pro ideální výsledek. Kůže a podkladová tkáň se mají adaptovat pomalu na novou situaci, když nemá dojít k jiným vadám, jako jsou vrásky.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 50, s výhodou 1 až 10 mg na léčebný výkon.

Příklad 14

Lupénka a suché ekzémy

Lupénkové povlaky a povlaky suchých ekzémů jsou extrémně lehce rozkládány pomocí hydrogelového zkušebního přípravku (Single-Enzyme) pod polopřilnavým obvazem. Během 24 hodin jsou povlaky úplně odstraněny a citlivá kůže, zvláště u pacientů s lupénkou, nevykazuje žádný další zánět, podráždění nebo bolest. Naopak, zasažená kůže vykazovala po léčbě méně zánětu, ale hlavně dostupnost k steroidní masti byla zlepšena, když byl povlak odstraněn a u těchto přípravků bylo možno pozorovat mnohem lepší účinky.

Příklad 15

Zubní povlak u psů

Účelem této studie bylo zkoumat rozkladnou účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein z krilu na modelu zubního povlaku u psů. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Multi-Protein s endo23 a exopeptidázovými aktivitami: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml solného roztoku na konečnou koncentraci 5 kaseinových j ednotek/ml.

Obsah čerstvě připravené ampule byl pečlivě natřen na zuby a dásně. Jazyk byl fixován na nejméně 2 minuty a strava a nápoje nebyly povoleny 2 hodiny po ošetření. Ošetření bylo opakováno dvakrát denně dokud povlak nebyl úplně rozložen. Psi byly prohlíženi jednou denně co do stavu povlaku, slinění a nežádoucích reakcí.

bíglů s abnormální tvorbou povlaku zapříčiněnou speciálním krmením a umístěním bylo zahrnuto do této studie. Po čtyřech dnech všechny známky povlaku odešly a studie byla ukončena. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Vhodný	dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 100,
s výhodou 1	až 35 mg na léčebný výkon.
Příklad 16
Lidský	zubní povlak
Účelem	této studie bylo zkoumat rozkladnou účinnost

a užitečnost přípravku Multi-Protein z krilu na zubní povlak. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálnxch přídavků. Multi-Protein s endoa exopeptidázovými aktivitami: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml solného roztoku na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml.

Ampule roztoku Multi-Protein byla připravena před kařdým použitím a ústní dutina proplachována po 5 minut. Strava a nápoje nebyly povoleny 2 hodiny po ošetření. Ošetření bylo opakováno dvakrát denně a pacienti byli prohlíženi jednou denně co do povlaku, slinění, suchosti a nežádoucích reakcí. Pacientům nebylo během probíhající studie dovoleno čistit si zuby.

Léčba byla ukončena když zmizely veškeré známky povlaku, ale ne později jak po 7 dnech.

hodiny po prvním ošetření zažívali všichni pacienti měkký a hladký pocit na zubech a všichni pacienti věřili, že povlak byl úplně rozložen. Vizuální prohlídka ukázala zbytky povlaku. 2 hodiny po třetím ošetření odešly veškeré známky povlaku a léčba byla ukončena. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 100, s výhodou 1 až 35 mg na ošetření.

Příklad 17

Oportunistické infekce

Tyto typy infekci se vyvíjejí u pacientů s úplně potlačeným imunitním systémem, způsobeným imunosupresivními léky, ozářením atd. kmeny a normálně nepatogenní kmeny, patogenní, způsobují těžké infekce, rakovinou, AIDS,

Patogenní mikrobiální jež se mohou změnit na které finálně vedou k celkové sepsi, jež je vlastní příčinou smrti pacientů trpících tímto stavem.

Tři pacienti, 2 pacienti s rakovinou dělohy v stádiu IV a 1 pacient s radiačním poraněním, s oportunistickými infekcemi v něhojících se pooperačních ránách byli léčeni dvakrát denně smočeným obvazem. Po 12, 14 a 17 dench byly rány zhojeny.

Klinické příklady 18-19 - oční onemocnění

Příklad 18

Šedý zákal u psů

Účelem této studie bylo zkoumat účinnost a užitečnost přípravků Single-Protěin a Multi-Protein z krilu na na šedý zákal u psů. Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků. Single-Protein s endoa exopeptidázovými aktivitami: l ampule k rekonstituci v 5 ml vody pro injekce na konečnou koncentraci 3 kaseinové jednotky/ml. Multi-Protein se směsí endo- a exopeptidázových aktivit: 1 ampule k rekonstituci v 5 ml vody pro injekce na konečnou koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml.

Pravé oko bylo léčeno pomocí dvou kapkek, přibl. 0,4 ml, roztoku Multi protein. Postup byl opakován jednou denně a pes prohlížen co do změn opacity a nežádoucích reakcí.

Léčba byla ukončena když oko vypadalo čisté při vizuální prohlídce. Levé oko bylo léčeno roztokem SIngle-Protein postupem stejným jako u roztoku Multi-Protein.

Léčba byla ukončena když oko vypadalo čisté při vizuální prohlídce.

Po 5 dnech bylo možno zaznamenat jasné snižování opacity v pravém oku a po 10 dnech oko vypadalo velmi čisté a léčba byla ukončena.

Stejná pozorování byla učiněna a léčba byla po 10 dnech ukončena též u levého oka. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 50, s výhodou 0,1 až 5 mg na ošetření.

Příklad 19

Oční zákal

Účelem této studie bylo zkoumat účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein z krilu na na šedý zákal.

Multi-Protein se směsí endo- a exopeptidázových aktivit,

2,5 kaseinových jednotek/ml byl nakapán do pravého oka každé tři dny.

Starší paní v osmdesátce s viděním den/noc v jednom oku, zpříčiněným šedým zákalem byla éčen každé tři dny pomocí 0,4 ml, 1 kaseinové jednotky, přípravku Multi-Protein. Po 5 ošetřeních musela být studie ukončena z jiných medicínských důvodů, ale jasné snížení opacity bylo pozorováno a paní hlásila zlepšené vidění v postiženém oku. Žádné dráždění, bolest nebo jiný diskomfort nebyly pozorovány během léčby a 1 měsíce po ní.

Klinické příklady - bolest

Bolest je původně zapříčiňována mechanickým narušením tkání a akutní pocit bolesti odeznívá krátce po traumatu. Určitá citlivost zůstává počas brzkých fází hojícícho procesu. Infekce a akutní záněty mohou způsobovat silnou bolest otékáním tkání, chemickými reakcemi, biochemickými aktivitami, tvorbou nekrotických tkání, přilnavostí a tvorbou jizev. Bolest může po dlouhý čas přetrvávat konečné zhojení nabo být trvalá.

Bolest je velmi subjektivní parametr a je ji velmi těžké klinicky přerušit. Z definice je bolestí všechno od lehkého svědění po těžkou zničující bolest. Pacienti trpící silnou bolestí mají tendenci rostoucího přivykání k bolesti a jejich úroveň přijatelnosti je spojitě zvyšována.

Nastálé zmírnění bolesti je nejrychlejším a nej zřejmějším účinkem přípravků podle vynálezu. Zmírnění bolesti je zaznamenáváno 20 minut až dvě hodiny po první aplikaci a ve většině případů je bolest po dvou dnech snížena na mírnou hladinu až na pouhou citlivost. Nezávisle na indikaci, akutní nebo chronickou bolest, hlásili pacienti stejný obraz zmírnění bolesti. Cítění a pocit doteku z ošetřených oblastí nemizely.

Pacienti, kteří neměli žádnou bolest před léčbu, hlásili pocity vyhlazení a uvolnění po prvním ošetření, zvláště u ošetřování oka a ústní dutiny. (Porovnej Příklady výše, bolest je parametrem ve většině těchto studií.)

U infekcí močového měchýře a gumózních infekcí vedl pocit bolesti k tělesně-sociálním poruchám pacientů. S rychle nastálým zmírněním bolesti testovnými přípravky se pacientům navracela schopnost koncentrace a byli během dvou dní schopni činností jako normální lidé. (Porovnej Příklady 3 a 10.)

Nejobjektivnější hodnocení pocitu bolesti bylo provedeno u zanícených kloubů koní, kde pocit bolesti byl vztažen k času opírání se o postiženou nohu. Tyto výsledky jsou porovnatelné s obecnými výsledky na lidech (porovnej Příklad 11).

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 200, s výhodou 1 až 25 mg na ošetření.

Klinické příklady 20-40 - různé indikace

Příklad 20

Žaludeční vřed

Muž ve čtyřítcitce s opakujícími se potížemi charakteristickými pro mírnou formu žaludečního vředu byl léčen kyselinovzdornými želatínovými kapslemi obsahujícími 5 mg PHIM na kapsli. Polykal 1 kapsli denně se sklenicí vody po dva týdny. Po asi 4 dnech žaludeční potíže vymizely a žaludek pracoval skoro dokonale, s přirozenou stolicí, bez bolesti atd.

let starý muž s potížemi žaludečního vředu trvale se vracejícími po 20 let byl léčen se stejným dávkováním jako výše. Už po několikadenní léčbě potíže vymizely a žaludek pracoval normálně.

Žaludeční vřed je zánětlivý proces pravděpodobně začínající z bakteriálního napadení. Napřed je střevní sliznice infikována mikroby a pak se stav mění na zánět, jenž brzy přechází na vřed. Znamená to, že je zde situace, kdy buňky střevní sliznice začínají být odlišné. Situace je dosti podobná kožním infekcím a ránám; rozdílem mezi kůží a střevní sliznicí je přítomnost jednoho buněčného systému v střevní sliznici, nazývaného Peyerúv buněčný systém a sestávajícího z vysoce aktivních B-buněk, T-buněk atd. Tento systém se považuje za bránu k autoimunním onemocněním. Díky skutečnosti, že PHIM pracuje na tomto buněčném systému a má schopnost odstraňovat odlišné buňky z citlivé slizniční vrstvy, měl by, celkem logicky, být aktivní i vůči autoimunním onemocněním jako jsou Crohnova choroba, ulcerativní kolika, reumatoidní artritida, atd.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,5 až 300, s výhodou 1 až 50 mg na léčebný výkon.

Příklad 21

Léčení vrásčité kůže

Vrásčitá kůže je z větší části zapříčiněna volnými radikály provazujícími kolagén. Tvorba volných radikálů je způsobována opotřebovanými a mrtvými buňkami, jež se obratem po tvorbě volných radikálů stávají výbornou živnou půdou pro rozběh bakterií. Ponecháním PHIM aby žral mrtvé buňky a bakterie je příčina vráskavění odstraněna.

33-letá žena byla ošetřována každou noc po 60 dní gázovým zábalem zvlhčeným roztokem PHIM 106. Celkové množství PHIM 106 použitého každou noc bylo kolem 0,15 mg. Zábal byl ponechán v těsném kontaktu s kůží po 30 minut.

Při ošetřování oblasti jen pod jedním okem byla druhá strana použita jako kontrola. Už po patnáctidenním ošetřování bylo možno pozorovat rozdíl v pružnosti kůže a po celkem šedesátidenním ošetřování byl vizuálně znatelný rozdíl pokud jde o vrásky. Ošetřovaná oblast kůže byla velmi měkká a pružná a hloubka vrásek se významné snížila ve srovnání s neošetřovanou oblastí.

Příklad 22

Polypy

Léčen byl muž věku 62 let s análním polypem. Muž trpěl polypem 3 roky a byl lékařsky léčen. Léčen byl léky různého druhu, ale nebylo pozorováno zlepšení.

Byl ošetřován gázovým obkladem obsahujícím asi 5 mg PHIM rozpuštěného v 5 ml solného roztoku. Ošetřování bylo opakováno celkem pětkrát. Všechny potíže zmizely a u následující návštěvy lékaře se ukázalo, že polyp zmizel. 8 měsíců po léčbě byl tento muž stále bez potíží.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,5 až 250, s výhodou 1 až 50 mg na léčebný výkon.

Příklad 23

Bradavice

Muž věku 35 let s bradavicí na krku byl léčen jeden týden náplastí (Hansaplast) obsahující roztok PHIM 106, kolem 0,1 mg na jednu náplast. Ošetření bylo opakováno každý den během týdne. Po týdenním léčení bradavice úplně zmizela.

Příklad 24

Běžná rýma pacientů ve věku od 30 do 63 led bylo léčeno PHIM už od několika hodin po projevení se prvních symptomů rýmy. Léčba se prováděla nosními spreji každé 4 hodiny a ústní vodou každých 6 hodin. Dávka používaná u nosního spreje byla pokaždé kolem 0,1 mg na každou nosní dírku a dávka u promývání úst kolem

1,5 mg na promytí. Při mytí úst byl roztok držen v ústech po asi 2 - 4 minuty a počemž byl roztok spolknut. Po 12 hodinách symptomy rýmy zmizely a pacienti byly bez potíží.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 100, s výhodou 1 až 25 mg na léčebný výkon.

Příklad 25

Haemophilus influenza

Žena věku 34 let měla opakující se sinusitidu z infekce Haemophilus influenza. Od několika hodin po objevení se symptomů tlaku a bolesti v nosní dutině byla ústa promývána po 3 minuty roztokem 2 mg PHIM 106 každé dvě hodiny celkem čtyřikrát a kolem 0,1 mg PHIM 106 bylo ve formě spreje podáno do každé nosní dírky. Ošetření sprejem bylo opakováno každé 3 hodiny po celkově 3 dny. Tlak způsobovaný infekcí nosní dutiny zmizel už za několik hodin po prvním ošetření a nosní sekrece sekrece se silně zvýšila. Po celkově třídenní léčbě byla žena bez potíží.

Příklad 26

Pásový opar

Muž starý 70 let s velmi bolestivou infekcí herpes zoster v obličeji z před 10 měsíců byl léčen místně gázovým obvazem obsahujícím 1 - 2 mg PHIM, každé tři dny.

Už po prvním ošetření se snížilo svědění a také bolest, jež zmizela úplně po 12 dnech. Z důvodu infekce měl tento muž dříve potíže se žvýkání pro bolest v patře, ale po 12 dnech mohl žvýkat jídlo bez problémů.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 100, s výhodou l až 25 mg na 100 cm².

Příklad 27

Herpes genitalis

Léčen byl muž věku 62 let s herpes genitalis z před deseti let. Měl potíže vracející se pravidelně každé 4 měsíce a během období akutních potíží abstenoval od pohlavního styku.

Léčen byl obvazem nasáklým roztokem PHIM 106, kolem 3 mg na obvaz. Ošetření bylo opakováno dvakrát denně po dva dny. Potíže zmizely už po druhém ošetření. Od dovršení léčby neměl muž žádné potíže v posledních 10 měsících.

Příklad 28

Hemoroidy

Dvě osoby byly léčeny na hemoroidy, muž 55 let věku a žena 30 let věku. Žena měla potíže po asi 3 roky, s bolestmi a menším krvácením. Byla léčena suchým pudrem PHIM 106 vetřeným do gázového obvazu a aplikovaným na předmětná místa. Každá dávka byla kolem 5 mg. Celkem pět ošetření bylo potřebných před zmizením potíží. Teď je úplně bez potíží po jeden rok.

U muže během posledních let potíže přicházely a odcházely. Výsledkem toho se před 6 měsíci potíže staly akutními, s krvácením a velmi silnou bolestí obkladem nasáklým asi 4 mg PHIM 106, minut a po tomto jediném ošetření všechny potíže zmizely a od té doby se nevrátily.

Muž byl ošetřen jednou Bolest zmizela během 20

Příklad 29

Turistický průjem

U muže starého 41 let se akutně vyvinula otrava jídlem (pravděpodobně stafylokoková) s průjmem a zvracením. Hodinu po ulehnutí s nemocí byl léčen 5 mg PHIM 106 drženým v ústech po asi 3 minuty a pak pomalu polknutým. Postup byl opakován třikrát, každou druhou hodinu. Po čtvrtém ošetření bolesti žaludku ustaly a zvracení a prudký průjem úplně skončily.

Příklad 30

Prořídlost vlasů

Byly léčeni dva muži, 55 resp. 62 let staří. Oba trpěli řídnutím vlasů po 10 posledních let. Ošetřování se provádělo zvlhčením celé vlasové části hlavy roztokem PHIM 106, celkem asi mg PHIM na ošetření. Aby se udržela vlhkost ve vlasové části, byla na 30 minut pokryta sprchovou čepičkou. Ošetření se opakovalo jednou týdně po asi 3 měsíce. Po tomto čase léčby začínaly vyrůstat nové vlasy.

Důvodem dobrého výsledku se zdá být to, že PHIM 106 účinně rozkládá všechny mrtvé a odlišné buňky, které jsou dobrou živnou půdou pro bakterie. Řečené bakterie produkují toxíny, které místně spouštějí v buňkách kožní vrstvy tvorbu, mezi jinými, TNF (faktoru nekrózy nádorů), jenž pak, když je přítomen ve větších množstvích, negativně ovlivňuje růst vlasů. Odstraněním řečených mrtvých a odlišných buněk včetně bakterií je také mikrocirkulace ovlivněna ve prospěch obnovy vlasů.

Vhodný dávkový.rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 100, s výhodou 1 až 25 mg na 100 cm².

Příklad 31

Akné ženy, věk 29 a 30 let, byly léčeny na akné v obličeji. Žena věku 29 let měla vážné potíže zatímco žena stará 30 let měla mírné potíže, hlavně na čele.

Byly léčeny pomocí 0,1 mg PHIM 106 několikrát denně po 4 6 dnů. Účinek by dosti značný už po prvním ošetření a po několika dnech samotná infekce zmizela a vyléčení bylo skoro úplné. Jeden týden po léčení byly znatelné jen pigmentové stopy.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 50, s výhodou 1 až 10 mg na léčebný výkon.

Příklad 32

Zánět průdušek let starý muž měl poměrně těžké bronchitické potíže. Potíže se manifestovaly jako dýchací potíže, těžkosti projít bez přestávky vzdálenost delší než 100 metrů a těžká únava jakož i obtížný úporný kašel.

Za příčinu zánětu průdušek považoval lékař infekci mykoplasmatem, k níž došlo před 3 let a která se navzdory léčbě antibiotiky stala rezistentní. Infekce vedla též k tvorbě vody v pohrudnici, což bylo ověřeno rentgenovým vyšetřením.

Pacient byl léčen ústní vodou, pokaždé kolem 4 mg PHIM 106. Roztok byl držen v ústech po asi 4 minuty a pak pomalu polknut. Postup byl opakován během prvních dvou týdnů každý druhý den. Během tohot období bylo též malé množství PHIM 106 inhalováno.

Během prvních dvou týdnů nebylo pozorováno žádné zlepšení, ale po dvoutýdenní léčbě otekla lymfatická uzlina na levé straně krku s následnou bolestí. Během tohoto období léčba pokračovala asi třikrát. Po asi 1,5 týdne všechny problémy s lymfatickou uzlinou zmizely a bronchitické potíže začaly ustupovat. Po dalších třítýdenním léčení ústní vodou každý čtvrtý den bronchitické potíže úplně zmizely.

Po této léčbě trvající celkově přes 6,5 týdne se pacient úplně zotavil a po krátkém čase mohl projí 5 kilometrů bez jakýchkoli potíží.

Příklad 33

Zánět prostaty

Muž věku 52 let trpěl prostatickými potížemi každou zimu od svých dvaceti let. Během posledních čtyř let se staly potíže akutnějšími a vedly k extrémně silným bolestem břicha. V každé akutní fázi byl léčen různými druhy antibiotik, ale jakmile bylo léčení antibiotiky ukončeno, potíže se během několka týdnů vrátily. Při takto se navrátivších prostatických problémech mírného typu byly tomuto muži podány kyselinovzdorné kapsle obsahující PHIM 106; kolem 5 mg na kapsli. Bral 2 kapsle denně, celkově jeden týden. Všechny symptomy zmizely a tento muž neměl ani jednu rekurenci během posledních 12 měsíců.

Příklad 34

Rezistentní kmeny mykoplasmatické infekce

Léčen by muž starý 55 let s resistentím kmenem mykoplasmatu. Muž akutně onemocněl před třemi lety a byl léčen různými druhy antibiotik, ale pro nedostatečné dávky se vyvinula rezistentní forma. Několik týdnů po infekci dostal muž vysokou horečku a velmi těžký kašel jako následky infekce a rentgenové vyšetření ukázalo vodu v pohrudnici.

Potíže se projevovaly formou dýchacích potíží, těžkosti projít bez přestávky vzdálenost delší než 100 metrů a těžké únavy, jakož i obtížného úporného kašle.

Pacient byl léčen ústní vodou, pokaždé kolem 4 mg

PHIM 106. Roztok PHIM byl držen v ústech po asi 4 minuty a pak pomalu polknut. Postup byl opakován během prvních dvou týdnů každý druhý den. Během tohot období bylo též malé množství PHIM

106 inhalováno.

Po této léčbě trvající celkově přes 6,5 týdne se pacient úplně zotavil a po krátkém čase mohl projít 5 kilometrů bez jakýchkoli problémů.

Příklad 35

Mastitida u lidí

Žena, 28 let stará, dostala těžké galaktostazické potíže už 3 dny po porodu, jež se projevovaly mléčnou žlázou tvrdou jak kámen a intenzivní bolestí. Tyto potíže nastaly už půl hodiny po kojení. Byla léčena v Akademické nemocnici v Uppsale, Švédsko, různými dostupnými metodami, ale nic nepomohlo.

Roztok asi 0,1 mg PHIM 106 byl kápnut na bradavku této ženy když nastávala intenzivní bolest. Veškerá bolest zmizela během 15 minut a po asi 45 minutách tvrdá mléčná žláza změkla.

Toto ošetření bylo opakováno po každém kojení po více než 3 měsíce. Aby se vyzkoušelo, zda je ošetření pokaždé potřebné, žena občas upustila od ošetření přímo po kojení před nástupem bolesti. Při každém případě, kdy byla tato zkouška provedena nastala znovu intenzivní bolest a tvrdá mléčná žláza.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 25, s výhodou 0,1 až 5 mg na léčebný výkon.

Příklad 36

Alergické svědění

Žena věku 29 let měla alergické problémy ve formě intenzivního svědění s žahavou vyrážkou nad jedním z kolen a také na bradě a pod ní. Vyrážka vypadala jako bílé poděkud roztroušené vyvýšeniny na koloně zatímco brada byla plná skvrn malé vyrážky barvy stejné jako kůže.

Gázový obvaz byl zvlhčen roztokem PHIM 106, kolem 2 mg. Gáza byla připevněna přes vyrážku v oblasti nad kolenem. Po 10 minutách byl gázový obvaz odstraněn. 45 minut později svědění začalo odeznívat a úplně zmizelo po 1,5 hodiny. Bílé vyvýšeniny rovněž zmizely a žahavá·' vyrážka zeslábla.

24 hodin později byla léčena oblast na bradě a pod ní. Tato oblast ted svědila intenzivně a byla více podrážděna v důsledku ženina škrábání.

Přímo za aplikace gázového obvazu s roztokem PHIM svědění zesílilo a gázový obvaz byl odstraněn po 7 minutách pro velmi intenzivní svědění. Během období 1,5 hodiny svědění upadalo a úplné zmizelo o 1,45 hodiny později.

Vůbec žádné problémy nebyly pozorovány ani v oblasti u kolena ani na obličeji po 48 resp. 24 hodinách.

Příklad 37

Antiadheze šlachy k pouzdru

Účelem této studie bylo zkoumat antiadhezívní vlastnosti přípravku Multi-Protein z krilu při hojení přetržené Achilovy šlachy u králíků. Levé Achilovy šlachy dvou králíků byly přetrženy a okamžitě sešity pomocí techniky překrytí přetržení umožňující ponechat neimobilizovanou poperační levou nohu.

Pátý den po operaci byla patrná adheze mezi šlachou a pouzdrem a 1 mg (0,25 ml) Multi-Protein bylo injikováno intersticiálné pátého dne po operaci a opakováno sedmého a devátého dne. 24 hodin po prvé injekci nebyla patrná adheze mezi šlachou a pouzdrem a šlacha znovu v pozdře volně klouzala. Šest týdnů po operaci se adheze se nenavrátila.

Osm měsíců po operaci byla zvířata utracena a šlachy makroskopicky prohlédnuty na adhezi, nadbytek fibrínu a kolagen. Šlachy a pozdra se zhojily odděleně a žádné známky adheze nebylo možno pozorovat. Pevnost v pnutí šlachy operované levé nohy byla porovnána se šlachou neoperované pravé nohy a nebyl zjištěn žádný rozdíl v pevnostech v pnutí.

Multi-Protein specificky rozkládá nadbytek fibrínu bez toho, že by ovlivňoval potřebu fibrínu pro správné hojení šlachy resp. pouzdra.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 100, s výhodou 1 až 10 mg na léčebný výkon.

Příklad 38

Uvolnění strnulého zápěstí

Účelem této studie bylo zkoumat účinnost přípravku Multi-Protein při rozkladu fibrinózní tkáně v zápěstí s omezenou pohyblivostí.

Žena ve čtyřicítce trpěla strnulým zápěstím v důsledku dlouhého znehybnění kloubu pevným sádrovým obvazem po komplikované zlomenině paže, 25 % normální pohyblivosti.

Navzdory cvičebnímu programu se pohyblivost postiženého kloubu zlepšila málo a diagnózou bylo znehybnění v důsledku fibrínového potažení uvnitř kloubu.

Multi-Protein byl injikován, 2 mg (0,5 ml), intraartikulárně celkem čtyřikrát, v odstupech 3 dnů. Pohyblivost se zlepčovala postupné během 14 dnů na 50-60 % pohyblivosti. Této ženě se navrátila pohyblivost na 70 - 80 % po 4 měsících cvičení.

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Příklad 39

Antitrombolytické/antiembolické vlastnosti Single-Protein

Účelem této studie bylo zkoumat účinnost přípravku Single-Protein z krilu při léčení trombů a embólií.

Tromby byly způsobeny umělou zástavou hlavní ušní žíly do utvoření řádného trombů. Single-Protein byl injikován, 0,5 mg (0,2 ml), do žíly ve směru k trombů, 2 cm od ischemické oblasti. Během 30 minut se trombus úplně rozpustil a krev měla volný vytvořily v této oblasti ale byly průchod. Malé nekrózy se resorbovány během 7 dnů.

U kontrolních zvířat nekrotickou během 4-5 dnů. Vhodný dávkový rozsah přešla ischemická oblst na plně pro tuto indikaci je 0,1 až 200, s výhodou 1 až 10 mg na léčebný výkon.

Příklad 40

Léčení glaukómu

Účelem této studie bylo zkoumat účinnost přípravku Multi-Protein při léčení zvšeného očního tlaku.

Muž věku 74 let pociťoval slabší bolest/diskomfort v pravém oku a bylo nalezeno, že trpí zvýšeným očním tlakem. Prohlídkami bylo stanoveno, že zvýšení tlaku je trvalé a není způsobeno akutními příčinami.

Každý čtvrtý den byl Multiprotein nakapán do postiženého oka, celkem třikrát. Dva týdny po léčbě byl oční tlak normální a už 4 měsíce po léčbě je tlak normální.

Muž pocítil okamžité zmírnění bolesti, během 20 minut, při prvním ošetření.

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Příklad 41

Protivirový účinek na HlV-kontaminované buněčné linie, in vitro

Tato studie byla provedena ve Švédské národní bakteriologické laboratoři (SBL). Multi-Protein byl porovnán s AZT a Foscarnet. Všech přípravky byly testovány ve zředěních od nezředěného do 10^-5 (nejvyšší koncentrace pro Multi-Protein byla 5 mg/ml). Přípravky byly přidávány k buněčným liniím, HIV-1 infikovaným z 40 - 60 %, za stejných a standardizovaných podmínek.

Při nízkých ředěních AZT a Foscarnet byly všechny buňky v kultuře napadeny a zabity. V těchto kulturách byly detegováný jen mrtvé a zborcené buňky.

Multi-Protein, při nízkých ředěních, vykazuje inhibiční účinek k viru. V kulturách bylo napadeno 40 - 60 % buněk, identicky s počátečními hodnotami příslušných kultur, a tyto byly uvolněny z povrchu. Tyto napadené buňky vykazovaly morfologické změny a virus byl neschopný proliferace. Neinfikované buňky v Multi-Protein skupině nebyly zasaženy, ani Multi-Proteinem, ani virem uvolněným uvolněným z napadených buněk; držely se povrchu a nevykazovaly žádné morfologické změny.

Je tedy ukázáno, že Multi-Protein z krilu může rozeznávat buňky zdravé a pozměněné, jako jsou buňky hostící virus, a může specificky rozpoznávat, zachycovat a ničit pouze odlišné částice bez toho, že by škodil zdravým buňkám.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 1 až 500, s výhodou 10 až 300 mg na jedno působení.

Viabilita buněk (tox.)

Inhibiční účinnost - Pokus 1

Virus (IC50) (HVI-1, kmen HTLV IIIB moi 0,4)

Multi-Protein	200
AZT	100
Foscarnet	200

100 (deformované buňky) 100 100

Kontrola: 50% infikované buňky. Buněčná toxicita a procento infikovaných buněk měřeny pomocí imunoflurescence.

Inhibiční účinnost - Pokus 2

Virus (IC50) Viabilita buněk (tox.) (HVI-1, kmen HTLV IIIB moi 0,2)

Multi-Protein 200-400 100-200 (deformované buňky)

AZT 100 100

Foscarnet 100 100

Příklad 42

Epidermofytóza nohou

Účelem této studie bylo zkoumat účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein při epidermofytóze nohou.

pacientů s plísňovými infekcemi bylo zrazeno do této studie, léčeno jednou denně koupelí nohou s Multi-Protein,

k.j./ml po 3 dny a hydrogelem, 5 k.j./ml, přes noc, po nejvýše dní.

Zmírnění bolesti nastalo okamžitě u mnoha pacientů a úplné odeznění během 2 dnů u jiných. Skvrny na otevřeném povrchu, v prasklinách a pod nechty byly lehce odstraněny a všechny známky skrvn, zápachu a infekce odešly během tří dnů.

Příklad 43

Ekzémové infekce

Účelem této studie bylo zkoumat účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein při mokvavých a lupénkových infekcích.

Čtyřicet pacientů bylo léčeno jednou nebo dvakrát denně pomocí hydrogelu Multi-Protein, 2,5 k.j./ml.

Pacienti se suchými ekzémy/skvrnami nevykazovaly žádné známky zánětu nebo infekce po 2-4 ošetřeních, l - 2 dnech. Mastný typ mokvavých skvrn zmizel po 6-9 dnech, i když zánět/ infekce zmizely během prvních 2-4 dnů.

Pacienti s lupénkovými skvrnami zaznamenali zlepšenou účinnost svých normálních steroidních mastí, pravděpodobně z důvodu účinného odstranění skvrn Multi-Proteinem, s výsledkem lepšího přístupu steroidů do kůže.

Příklad 44

Infekce předkožky

Účelem této studie bylo studovat účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein při infekcích předkožky u novorozeňat.

Dvě novorozeňata, stará 4 resp. 6 týdnů, byla léčena dvakrát denně roztokem Multi-Protein, 1 k.j./ml. Přibl. 10 ml roztoku bylo proudem aplikováno pod předkožku ráno a večer, s použitím standartní stříkačky a měkkého katetru. Po třech dnech byla obě novorozeňata bez příznaků a infekce se nevrátila během dvouměsíčního sledování.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,01 až 100, s výhodou 1 až 25 mg na léčebný výkon.

Příklad 45

Infekce předkožky u psů

Účelem této studie bylo studovat účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein při infekcích předkožky u psů.

Pět psů bylo proudem prostříkáváno pod předkožkou jednou denně roztokem Multi-Protein, 1 k.j./ml. 10 ml roztoku bylo nasáto do standartní jednorázové stříkačky. Měkký silikonový katetr byl připevněn ke stříkačce a vložen pod předkožku, a oblast byla pomalým proudem prostříknuta. Přibl. 1 ml roztoku byl držen pod předkožkou po nejméně 2 minuty a psům bylo zabráněno lízat si tuto oblast po 30 minut.

Hnisavý exudát ustal během 2 dnů ve všech případech a všechny známky infekce a zánětu zmizely během 4 dnů.

Příklad 46

Oční kapky na běžné používání

Účelem bylo studovat účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein při únavě a podráždění očí, avšak bez veškerých známek klinického zánětu nebo infekce.

Dvanáct pacientů bez záznamu o očních chorobách, alergických reakcích ke znečištěnému vzduchu nebo o očních infekcích/zánětech bylo ad hoc ošetřováno na unavené a podrážděné oči. 2 kapky roztoku Multi-Protein, 0,1 k.j./ml, byly nakapány do očí kdykoli bylo potřeba.

Všichni pacienti pociťovali okamžité uvolnění napětí/slabé bolesti během 30 minut. Žádný nehlásil žádnou změnu v citlivosti k světlu, zaostřování ani žádné roztažení zornic. Někdy byla pociťována přechodná suchost.

Nebylo pozorováno žádné podráždění, zvýšené slzení nebo jiné nežádoucí reakce.

Příklad 47

Abcesy u telat

Účelem bylo studovat účinnost a užitečnost přípravku Multi-Protein při abcesech u telat, s užitím roztoku Muti-Protein, 5 k.j./ml,

Dvě telata s abcesy, přibl. velikosti 25 a 40 ml, na krku, vytvořenými po injekci kalciového roztoku, byla ošetřována jednou denně. 10 ml roztoku Multi-Protein bylo nakapáno skrz drénovou trubku a drženo na místě po nejméně 4 hodiny. Pak byla trubka otevřena a ponechána tak do dalšího ošetření.

Po třetím ošetření byla drénová kapalina čirá a po šestém ošetření byly trubky odstraněny. Kapsy se zhojily úplně po 9 resp. 12 dnech.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 200, s výhodou 1 až 20 mg na léčebný výkon.

Příklad 48

Pupínky u psů

Účelem bylo studovat účinnost a užitečnost přípravku

Multi-Protein při infikovaných pupíncích na tlapkách u psů.

Tři boxeři s bolestivými, infikovanými a mokvajícími/ krvácejícími pupínky mezi prsty byly léčeni dvakrát denně roztokem Muti-Protein, 5 k.j./ml,

Gáza byla smočena 2 ml roztoku a pak aplikována na pupínky. Noha byla obvázána k připevnění gázy a gumová botička byla použita k ochraně.

Jasné zmírnění bolesti bylo možno pozorovat po 1 dni a hnisavé mokvání/krvácení se zastavilo během 2 dnů. po 5-ti až 7-mi denní léčbě bylo možno pozorovat jen slabé známky zánětu a po 11-15 dnech všechny známky pupínků odešly a psi mohli volně pobíhat.

Dávky pro různé indikace

Obrázek 13 ukazuje křivku dávka/odezva pro jednu konkrétní indikaci, jmenovitě popáleniny, a ukazuje procento účinnosti, vyjádřené jako antmikrobiální aktivita jako funkce množství PHIM v mg na 100 cm² poraněné oblasti. Skoro 100 %-ní účinnost je dosažena při dávce kolem 2 mg na 100 cm² poraněné oblasti. Ukázaná křivka dávka/odezva může být reprezentativní též pro jiné aplikace.

Obrázek 14 ukazuje intervaly dávka/odezva pro PHIM, t.j. dávky pro dosažení 100 %-ní účinnosti, definované jako vyléčení pacienti, pro různé indikace. Účinnost je vynesena proti zasažené oblasti. Přibližné množství PHIM v mg na 100 cm*

dávkové rozsahy jsou (mg	PHIM/100	cm²
-	oční infekce	0,5 -	0
-	záněty	0,1 -	15
-	virové infekce	0,5 -	1
-	plísňové infekce	1	15
-	bakteriální infekce	0,5 -	25
-	zmírnění bolesti	o,i -	25

Obrázek 15 ukazuje PHIM na kg tělesné váhy maximální nahromaděné množství k dosažení léčby, t.j. klinického ukončení, u různých indikací. Přibližná maximální nahromaděná množství u různých indikací jsou (mg PHIM/kg tělesné váhy):

oční infekce 1 infekce místních poranění 5 infekce močové trubice 9 plísňové infekce 5 infekce herpes simplex 5 mastné kožní skvrny 18 hluboké popáleniny 20 oportunistické infekce 28

Obrázek 16 ukazuje minimální nahromaděné množství PHIM na kg tělesné váhy k dosažení léčby u různých indikací. Přibližná minimální nahromaděná množství u různých indikací jsou

(mg PHIM/kg tělesné váhy):
-	oční infekce	< 1
-	infekce místních poranění	3
-	infekce močové trubice	7
-	plísňové infekce	3
-	infekce herpes simplex	4
-	mastné kožní skvrny	13
-	hluboké popáleniny	13
-	oportunistické infekce	15

Závěry z klinických Příkladů 1 až 51

Přípravky Single-Protein a Multi-Protein podle vynálezu představují úplný rozsah působení, jež se zdají připomínat typ působení fagocytujicích buňek.

Žádná klinická omezení nebo zábrany nebylo možné určit u zkoumaných indikací. Naopak, přípravky vykazují dobrou účinnost v klinických situacích, kde přirozená imunitní ochrana neodpovídala, např. u ran při krevních zástavách a tam, kde byla imunitní ochrana úplné potlačena, např. u oportunistických infekcí.

Nežádoucí reakce resp nebo

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce u žádného z mnoha pacientů, zařazených do studií vyložených výše. Pacienti trpící polyalergiemi, alergií na pokrmy z mořských produktů, citlivou kůží, suchostí v očích a pacienti, u nichž byl znám potlačený hyperaktivní imunitní systém byli též zařazováni do studií testováni zvlášť, aniž by se projevily jakékoli známky nežádoucích reakcí.

Bylo ukázáno, že nárokované přípravky Multi-Protein a Single-Protein jsou netoxické.

Na základě těchto úplných a předběžných klinických výzkumů lze rozumně dojít k závěru, že tyto vynálezecké látky být účinné jako lék na velký počet jiných kde imunitní systém odpovídá, jako jsou glaukómy, trachómy, rakovina, AIDS/HIV; autoimunních onemocnění jako jsou reumatická artritida, Crohnova nemoc, skleróza multiplex, ulcerativní kolika; chorob jako jsou cholera, lepra, malárie, tyfoidní horečka, sepse; techniky transplantace orgánů a štěpů (profylaxie); kosmetika.

a prostředky by měly onemocnění a stavů, klinický Příklad 49

Rakovina

Základy

Nádorová onemocnění jsou velmi komplexní a sestávají z mnoha různých chorob. Komplexita se zvyšuje když nádory rostou a primární nádor rozšiřuje metastázy do jiných orgánů jakož i do lymfatických uzlin. Dodatkem k rostoucí zátěži nádory jsou oportunistické infekce, jež nastávají zčásti v důsledku potlečené imunitní obrany, způsobené nádorem samotným, ale též v důsledku konvenční chemoterapeutické léčby, jež je nejběžnější léčbou používanou dnes k léčení rakoviny.

- 47 K používání tradiční chemoterapie se váže mnoho různých problémů. Hlavním problémem je, že léky proti rakovině nemají schopnost rozlišovat mezi buňkami zdravé tkáně versus rakovinnými buňkami. Toto je nejvážnější problém, protože bílé krevní buňky, jež jsou potřebné pro imunitní obranu, jsou ničeny chemoterapeutickou léčbou. V důsledku toho není možno léčit pacienty s rakovinou optimálním způsobem.

Potlačený imunitní systém má za následek rostoucí zátěž nádorem jakož i nekontrolovatelné oportunistické infekce. Souběh omezených možností pro optimální léčbu a opurtunistických infekcí zhoršuje podmínky života pacientů, kteří trpí nádorovým onemocněním. Exisuje velmi málo dobře kontrolovaných studií na lidech a obecně je účinnost normálně kolem 20 - 25 %, v závislosti na typu rakoviny.

V dobře kontrolované studii fáze II provedené v Japonsku na pacientech trpících primární a sekundární rakovinou jater byla odezva (response rate, CR a PR) 9,5 % u adriamycinu a 20 % u mitomycinu C. Viz T. Taguchi et al., Regional Cancer Treatment (1992) 4: 161-165.

U studií na zvířatech bývá účinnost normálně vyšší, v závislosti na skutečnosti, že se podávají vyšší dávky protinádorových léků v porovnání k léčbě lidských pacientů, protože nežádoucí reakce se na zvířecích modelech studuji. velmi těžko, s výjimkou objektivních parametrů. Je též velmi těžké srovnávat historické údaje.

Byl však použit Cisplatin na potkanech s implantovaným Yoshidovým sarkomem a nádorové buňky bylo vyňaty a kultivovány s cílem studovat přežívající buňky, s výsledkem, že 53 % buněk není zabito působením Cisplatin. Viz K. R. Harp et al., Toxic and Biochemical Properties of Cisplatin.

Podobné pokusy byly provedeny s mitomycinem C v dávkách až do 0,5 mg/kg. V tomto případě účinnost na nerezistentní buňky Yoshidova sarkomu byla skoro 100 %, počítáno jako 30 dní přežití těchto potkanů. Dávku 0,5 mg/kg použitou u potkanů je nemožné použít u lidí pro těžké nežádoucí reakce jako jsou úbytek kostní dřeně, jež je pro pacienty letální. Yoshidův sarkom se snadno stává rezistentním k mitomycinu C a v takovémto případě nelze pozorovat žádné účinky navzdory vysoké dávce 0,5 mg/kg nebo i vyšším dávkám.

Profil vedlejších účinků u zmíněné dávkové hladiny jakož i nižších dávek zahrnuje úbytek tělesné váhy, ztrátu vlasů, snížení [počtu] leukocytů a chronický průjem. Viz Mitomycin C, Kyowo Hakko Ltd., Tokyo, Japonsko. Protinádorová činidla jako adriamycin, Cisplatin, mitomycin C atd. jsou velmi toxická a mohou být používána pouze pro nitrožilní a nitrotepenné podávání.

Navíc se u nádorových buněk velmi často vytvoří rezistence k protinádorovému činidlu podobně jako u bakterií k antibiotikům. Vytvoření rezistence je těžkou překážkou léčitelnosti.

Souhrn testovacích postupů a výsledků

Účelem studie bylo zkoumat účinnost a užitečnost přípravku PHIM 106 při léčbě Yoshidova sarkomu u potkanů.

PHIM 106 byl injikován třemi různými cestami, intraperitoneálně (i.p.), intratumorálně (i.t.) a podkožně (s.c.) bílým potkanům Wistar s implantovaným Yoshidovým sarkomem. PHIM 106 byl použit jako jediná injekce 5 mg/kg i.p.,

i.t. a s.c. a jako opakované dávky 1,25 mg/kg s.c. dvakrát denně po 7 dní, 5 mg/kg s.c. každý druhý den s celkem 4 injekcemi a 12,5 mg/kg s.c. každý druhý den s celkem 4 injekcemi.

Léčba začala když velikost implantovaného nádoru byla 10 mm x 10 mm.

Potkani byli utraceni 7 dnů po poslední injekci. Velikost nádorů byla změřena a porovnána s neléčenými konrolními potkany.

Zmenšení velikosti nádoru bylo 46 % u potkanů léčených i.t.

jedinou dávkou, 56 % u potkanů léčených s.c. jedinou dávkou a

49% u potkanů léčených i.p.

Ve skupině s opakovanými dávkami 1,25 mg/kg s.c. dvakrát denně po 7 dní s.c. byla účinnost 72 %.

Ve skupinách dostávajících 5 mg/kg a 12,5 mg/kg s.c. každý druhý den, celkem po 4 injekcích, byly odezvy na nádorech 53 resp. 69 %.

Jeden potkan ve skupině dostávajíc 12,5 mg/kg měl negativní růst nádoru. Stupeň metastázování v léčených skupinách byl velmi malý ve srovnání s kontrolními potkany.

Léčení potkani vykazovali normální chování pokud jde o jídlo a pití, na rozdíl od kontrolních potkanů. Během této studie nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce.

Popis PHIM 106

Jak je vysvětleno výše, PHIM 106 je zkratka pro bílkoviny s enzymatickými vlastnostmi a pocházejícími z mořských zdrojů, v testech níže z anarktického krilu. Podle vynálezu byly u těchto bílkovin shledány zásadní nové vlastnosti. Hypotézou je, že bílkoviny napřed rozpoznají nemocné a odlišující se buňky jakož i mikroby a pak cílové buňky zničí svými enzymatickými vlastnostmi. Nic se nestane buňkám zdravých tkání.

Mechanizmus zakládající ostrou selektivitu je ve výzkumu, ale pracovní hypotézou je, že bílkoviny jsou schopny reagovat na stejné signály jako náš vlastní imunitní obranný systém, a napadat všechny cizí útočníky jakož i odlišující se buňky.

Rakovinné buňky jsou odlišné v tom smyslu, že exprimují fragmenty nádorových bílkovin na svém povrchu a že jsou rozeznávány imunitním obranným systémem jako odlišující se v porovnání s buňkami zdravé tkáně.

PHIM 106 byl použit v otevřených studiích na lidech u více než 400 pacientů bez vedlejších účinků jakéhokoli druhu.

Protože PHIM se skládá z bílkovin velikosti 24-34 000 daltonů a pochází z mořský zdrojů, byla by očekávána tvorba protilátek, ale žádnou tvorbu protilátek nebylo možno najít u imunizovaných králíků a morčat.

Materiály a metody

Cíl studie

Zkoumat v malých porovnávacích studiích způsoby podávání, uspořádání injekcí a křivky dávkové odpovědi a celkovou užitečnost PHIM 106 s použitím bílých potkanů Wistar s implantovaným Yoshidovým sarkomem.

Druhým cílem bylo též studovat cílení vlastností PHIM 106 pomocí použití k léčbě nádoru z žil jakož i z lymfatických uzlin.

Rozvržení studie

Porovnávací studie s injekcemi PHIM 106 jako jedinými injekcemi i.p., i.t. a s.c., opakovanými dávkami každý den a celkem 4 injekcemi s.c. Kontrolní skupiny byly neléčeny. Léčba potkanů začala když buňky implantovaného nádoru měly velikost 10 mm x 10 mm.

Potkani byli utraceni 7 dnů po ukončení léčby a velikost nádorů byla změřena. Byla provedena histopatologické prohlídka.

Přípravek PHIM 106

Lyofilizovaný bílý prášek bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních přídavků.

Tento bílý prášek byl rekonstituován v solném roztoku pro injekce na konečnou koncentraci 5 mg/ml.

Postup x 10⁴ buněk Yoshidova sarkomu bylo podkožně implantováno do zad bílých potkanů Wistar. Léčba začala když velikost nádorů byla 10 mm x 10 mm.

PHIM 106 byl injikován třemi různými cestami, intraperitoneálně (i.p.), intratumorálně (i.t.) a podkožně (s.c.), asi 3 - 5 cm od nádoru do zdravé části kůže.

Zvířata byla rozdělena do následujících 7 skupin.

Skupina 1: Kontrolní skupina 11 potkanů bez léčby.

Skupina 2: 5 potkanů léčených jedinou injekcí 5 mg PHIM 106/kg přímo do středu nádoru (i.t.).

Skupina 3: Léčena jedinou injekcí 5 mg PHIM 106/kg subkutánně (s.e.).

Skupina 4: 1 potkan léčen intraperitoneálně (i.p.) jedinou injekcí 5 mg PHIM 106/kg subkutánně (s.e.).

Skupina 5: 3 potkani léčeni subkutánně (s.e.) pomocí 1,25 mg

PHIM 106/kg dvakrát denně po 7 dní.

Skupina 6: 5 potkanů léčeno subkutánně (s.e.) pomocí 5 mg

PHIM 106/kg každý druhý den celkem 4 injekcemi Skupina 7: 5 potkanů léčeno subkutánně (s.e.) pomocí 12,5 mg

PHIM 106/kg každý druhý den celkem 4 injekcemi.

Sedm dnů po ukončení léčby byli potkani utraceni a objem nádorů byl změřena. Potkani kontrolní skupiny byli utraceni stejný den jako u léčených skupin.

Histopatologie byla také provedena na nádorech ve všech skupinách.

Byla vzata krev a uschována na pozdější vyšetření.

Výsledky

Ve skupině 2, léčené jedinou injekcí i.t. 5 mg PHIM 106/kg, bylo zmenšení nádoru v porovnání s kontrolou 46 %.

Ve skupině 3, také léčené jedinou injekcí s.e. 5 mg PHIM 106/kg, bylo zmenšení nádoru 56 %, a ve skupině 4, léčené jako 2 a 3, ale i.p., bylo zmenšení nádoru 49 %.

Ve skupinách 6 a 7, léčených s.e. opakovanými dávkami 5 mg PHIM 106/kg a 12,5 mg PHIM 106/kg bylo zmenšení nádorů 53 % a 69 %.

Nej lepší účinnost byla pozorována ve skupině 5 léčené opakovanými dávkami během sedmi dní. Zmenšení velikosti v porovnání ke kontrole bylo 72 %. Viz Obr. 17, 18 a 19.

Ve všech skupinách, kde byla poskytnuta léčba, bylo víc než 50 % velikosti nádorů velmi nekrotických v porovnání k nádorům kontrolní skupiny. Viz Snímky 1 a 2.

Během 24 hodin po injekci PHIM 106 se nádory zdají být nekrotické.

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce během léčby nebo po ní.

Během 24 hodin po injekci PHIM 106 se nádory zdají být nekrotické. Velikost nekrotické části nádorů se zvětšovala a nádory byly menší a odlišnější v porovnání s konrolními potkany. Viz Snímky 3 a 4.

Je možno zaznamenat rozdíly v tělesné váze mezi kontrolní skupinou a skupinami, kde byla poskytnuta léčba. Potkani kontrolní skupiny zvýšili [svou váhu] víc než potkani z léčených skupin.

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce během léčby nebo po ní.

Vhodný dávkový rozsah pro tuto indikaci je 0,1 až 500, s výhodou 1 až 300 mg na jedno působení.

Diskuse

Počet potkanů byl omezený se nedal provést statistický výpočet. Cílem studie však bylo zkoumat účinnost vůči nádorům vztaženou na počet dávek, množství PHIM 106 počítané na kg tělesné váhy a získat informaci, zda PHIM 106 napadá nádor když se používá různými cestami podávání.

Celkový pocit užitečnosti byl přirozeně též velmi důležitým záměrem u této studie.

Nádorové buňky jsou z imunologických hledisek odlišné a PHIM 106 by proto měl, podle zhora uvedené hypotézy o rozeznávaných a cílovacích znacích odlišujících se buněk, napadat a ničit nádorové buňky bez ohledu na způsob podávání. Výsledky ukazují, že účinnost proti nádorům je vysoká a že stupeň účinnosti je podobný, když je [PHIM 106] injikován i.p.,

i.t. nebo s.c.

Opakované dávky PHIM 106 jsou lepší než jednotlivá dávka, protože Yoshidův sarkom je velmi rychle což lze očekávat, rostoucí.

Zmenšení nádorů 12,5 mg PHIM 106/kg PHIM 106/kg.

Na druhé straně, je větší ve skupinách, které dostávaly než ve skupinách, které dostávaly 5 mg u potkanů, kteří byly léčeni po 7 dní celkovým množstvím 17,5 mg PHIM 106/kg byla účinnost o málo lepší než u potkanů, kteří byli léčeni každý druhý den celkem 4 injekcemi a celkem 50 mg PHIM 106/kg.

Yoshidův sarkom je velmi maligní a rychle rostoucí. Proto by se dalo očekávat, že léčba každý den by měla dávat lepší výsledky. Všichni potkani v léčených skupinách byly v dobrém stavu a měli vesměs přírůstek v tělesné váze kolem 10 gr v porovnání s potkany v kontrolní skupině, kteří zvýšili svou tělesnou váhu o asi 24 gr. Pro toto je jediné vysvětlení ve velké zátěži nádorem. Nádory v léčených skupinách byly velmi distinktní a solidní v porovnání s nádory v kontrolní skupině, jež byly rozšířeny do žaludku atd. Znamená to též, že u kontrolní skupiny byly problémy se změžením úplné velikosti nádoru, protože nádory pokrývaly velký povrch. Je zajímavé všimnout si, že u jednoho potkana ve skupině léčené 12,5 mg PHIM 106/kg nenastal vůbec žádný růst nádoru. Nádor se zmenšil o asi 15 % ve srovnání s velikostí v den nástupu léčby.

Histopatologické vyšetření nádorů v kontrolní skupině a v testovacích skupinách jasně ukazuje, že potkani léčení PHIM 106 byly nekrotizovanější než neléčení potkani.

Skutečnost, že PHIM 106 byl aktivní při podávání třemi rozdílnými cestami ukazuje, že PHIM 106 cílí k nádoru jak z žíly tak z tepny. Podkožní injekce je zvlášt zajímavá, protože PHIM 106 musel být zachycen lymfatickým řečištěm a musel zčásti dosáhnout nádor lymfatickou cestou. Lymfatický záchyt PHIM 106 je také velice důležitý pro ničení metastáz, jež se zčásti šíří touto cestou. Důkaz pro pokles metastázování je viditelný porovnání s kontrolní skupinou, znatelné velké množství metastáz u léčených V kontrolní skupin při skupině je v plících střevu a játrech. I vélečených skupinách bylo víc než % potkanů prostých detekovatelných metastáz. Zbývajících 5 % mělo pouze něco malých metastáz v oblasti střeva.

I když počet zvířat v různých skupinách byl dosti malý musí být zdůrazněno, že každý potkan odpovídal na léčbu. Možnost použití léku na léčení rakoviny bez jakéhokoli omezení metody podávání, spolu s nepřítomností pozorovatelných vedlejších účinků, zařazuje PHIM 106 do nové třídy protinádorových léků, pravděpodobně na základě jeho přirozených cílících vlastností.

Antimikrobiální účinek PHIM 106 pozorovaný v otevřených ověřovacích studiích bude mít další význam pro léčení pacientů s rakovinou [a] trpících oportunistickými infekcemi. Yoshidův sarkom je mnohem malignější než známé lidské nádory.

Příklad 50

Ošetřování pupku dny starý chlapec byl ošetřován PHIM pro odstranění nekrotické tkáně a zabránění následné infekci.

K ošetření byla použita gáza nasycená roztokem PHIM 106, kolem 2 mg na kousek gázy. Gáza byla obvázána kolem samotné poeční šňůry tak, že pokrývala jak zdravou pupeční šňůru tak poněkud infikovanou jakož i nekrotickou část pupeční šňůry. Obvaz by vyměněn 4 krát za 12 hodin. Po asi 12 hodinách PHIM 106 odstranil nekrotickou a infikovanou část, kdežto zdravá část pupeční šňůry byla úplně nedotčena. Nebylo lze pozorovat žádný rozklad zdravé kůže na pupeční šňůře, ani žádná infekce nebo nějaké podráždění či zánět. Zdravý pupek byl ostřen ještě 4 krát.

Šestý den po narození bylo dítě prohlédnuto v nemocnici a shledáno, že má pupek úplně v pořádku, bez jakékoli infekce, k velkému překvapení lékaře a v protikladu k většině dětí, jež byly prohlédnuty při stejné příležitosti.

Příklad 51

Infikované rány měsíce starý chlapec, který měl operaci tříselné kýly vykazoval 10 dní po operaci vážnou infekci v chirurgické ráně, ve formě tvorby hnisu, čžsti chirurgické rány hrozily roztržením po odstranění stehů.

Chlapec byl šetřován 3 dny obvazy, které byly nasáklé PHIM 106, 4 mg na ošetření. Po 3 dnech ošetřování celá infekce odešla a rána byla zhojen.

Celá operační rána měla délku asi 15 cm.

Toxicita na myších

Toxicitu PHIM na lidech nebo zvířatech nebylo možno prokázat navzdory podávání s krajním předávkováním, až do 100 násobku odpovídající účinné dávky. Toxicita PHIM byla testována též na myších s s.c. implantovanou P388 myší leukemí (chemicky indukovaná rakovina) a porovnána s s doxorubicinem, dobře známým protinádorovým lékem, zkratka DOX. Výsledky jsou shrnuty v následujcící Tabulce. Je vidět, že žádná myš z PHIM skupiny nebo kontrolní skupiny nezemřela nebo nestratila váhu, zatímco všechny myši z dexorubicinové skupiny, s výjimkou nejnižší dávky, stratily váhu a zemřely. Stojí za zmínku, že nejvyšší dávka PHIM (20 mg/kg) daleko převyšuje všechny léčebné dávky použité v kterémkoli z klinických příkladů jež byly zmiňovíny dříve v tomto popise.

Toxicita PHIM a DOX podávaných i.p. denně v průběhu 9 po sobě následujících dní myším s P388 myší leukémií

Lék	Dávka (mg/kg)	Toxické úmrtí	Změna tělesné váhy (g)
Kontrola	0	0/6	+ 2,3
PHIM	20	0/6	+ 3,3
	10	0/6	+ 3,3
	5	0/6	+ 3,3
DOX	5	6/6	- 2,3
	2,5	6/6	- 0,6
	1,25	0/6	+ 0,5

Dávkování - obecně

Jak bylo zmíněno v souvislosti se zhora popsanými testy toxicity, žádné toxické účinky nebyly pozorovány navzdory těžkému předávkování. Toto platí nejen v případě myší leukemie, ale i u všech klinických příkladů. U žádného z klinických příkladů nebylo pozorováno též žádné snížení terapeutických účinku z důvodů předávkování. Jinými slovy, horní hranice dávkování je mnohem vyšší než účinné dávky, každá (rozumná) dávka je bezpečně použitelná.

Nejmenší účinné dávky se poněkud liší stavu, jež má být léčen, a v současnosti dávkování pro různé indikace je jak následuje.

takže prakticky v závislosti na upřednostňované

Cesty a prostředky pro podávání

Látky podle vynálezu mohou být bezpečné používány v lidské a veterinární medicíně pro svou zanedbatelnou toxicitu.

Terapeutický režim pro různé klinické indikace musí být přizpůsobem typu patologie s tím, že se bere do úvahy, jak je běžné, také cesta podávání, forma, v níž je sloučenina podávána, a věk, stav a podmínky subjektu, jehož se to týká.

Látky podle vynálezu mohou být podávány ve formě roztoků. Roztoky mohou být podávány např. místné (povrchové rány, intaktní kůže); nakapáním (močový trakt, píštěle); ve formě očních kapek; jako vyplachovací roztok; inhalačně; injekcemi (nitrokloubově, nitrožilně, intraperitoneálně, podkožně, nitrosvalově); a nosem.

Látky podle vynálezu mohou být také podávány ve formě gelů, např. místně nebo nakapáním (píštěle, proleženinové rány).

Když jsou v suché přáškové formě mohou být látky podávány např. místně, do trávícího traktu v kyselinovzdorných kapslích a inhalačně.

Suchý prášek látek podle vynálezu je obsažen v ampulích, každá obsahuje buď 15 k.j. Single-Protein nebo 25 k.j. Multi-Protein. Pro přípravu roztoků k přímému použití je obsah jedné ampule rekonstituován steriliním roztokem chloridu sodného nebo sterilní vodou k vytvoření roztoku obsahujícího 0,10 až 25 k.j. Multi-Protein/Single-Protein.

Když se látky podle vynálezu používají ve formě gelu, Multi-Protein nebo Single-Protein je ex temporere formulován s hydrogelem na žádanou koncentraci za tvorby hydrogelu k přímému použití. Hydrogel jako takový sestává z nízkomolekulárního hydrolyzovaného škrobu obsahujícího > 90 % vody.

Z našich studií byl vyvozen závěr, že při používání výšeuvedených cest podávání najdou látky podle vynálezu svoji cestu prostřednictvým krevního systému, tepenného a žilného, a prostřednictvím lymfatického systému. U místního podávání je přímý kontakt mezi enzymem a jeho substrátem.

FARMACEUTICKÉ PROSTŘEDKY

Ampule s práškem

k.j. Single-Protein nebo 25 k.j. Multi-Protein se plní do konvenčních ampulí s použitím známých technik

Roztoky k přímému použití

Obsah jedné ampule je rekonstituován steriliním roztokem chloridu sodného (fyziologickým solným roztokem) nebo sterilní vodou na koncentraci Multi- nebo Single-Protein od 0,10 do 25 k.j./ml.

Hydrogel

Hydrogel sestávající z nízkomolekulárního hydrolyzovaného škrobu obsahujícího > 90 % vody je připravován způsobem známým samým o sobě. Po přípravě je gel balen v porcích a tato balení jsou sterilizována (autoklávována).

Hydrogelu k přímému použití

Multi-Protein nebo Single-Protein je ex temporere formulován s hydrogelem (srovn. výše) na žádanou koncentraci, např. 2,5 nebo 5 k.j./ml.

Další vysvětlení obrázků

Obrázek 1: Průměrný exudační poměr za pětidenní léčby přípravky Sigle-enzyme (plné čtverce, plná čára) a Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Single-enzyme: 20 pacientů bylo zahrnuto po Den 2. 18 pacientů, 19 , ran, ode Dne 2,5 do 3,5 a 9 pacientů ode Dne

3,5 do konce studie.

Multi-enzyme: 20 pacientů, 21 ran od začátku po Den 2,5. 18 pacientů, 19 ran, ode Dne 2,5 do 4 a 12 pacientů, 12 ran, ode Dne 4 do konce studie.

U všech pacientů bylo konečné kritérium žádné známky infekce dosaženo nejpozději při Dni 5.

Obrázek 2: Průměrné hodnocené zarudnutí za pětidenní léčby přípravky Sigle-enzyme (plné čtverce, plná čára) a Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Zesílená rudost zarudnutí je pravděpodobně důsledkem sníženého otoku a edému obklopující tkáně.

Obrázek 3: Průměrný hodnocený otok/edém za pětidenní léčby přípravky Sigle-enzyme (plné čtverce, plná čára) a Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Obrázek 4: Průměrná hodnocená bolest za pětidenní léčby přípravky Sigle-enzyme (plné čtverce, plná čára) a Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu. Pocity bolesti byly hlášeny samotnými pacienty v analogické stupnici od 0 po 5, žádná blest - nesnesitelná bolest.

Obrázek 5: Průměrné hodnocené zmírnění bolesti za sedmidenní léčby přípravkem Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Obrázek 6: Průměrný hodnocený zánět za sedmidenní léčby přípravkem Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Obrázek 7: Otok/edém jako funkce infekce hodnocená za devítidenní léčby přípravkem Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Obrázek 8: Zmírnění bolesti hodnocené za sedmidenní léčby přípravkem Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Obrázek 9: Průměrný čas mezi močeními hodnocený za čtyřdenní léčby přípravkem Multi-enzyme (prázdné čtverce, tečkovaná čára) z krilu.

Obrázek 10: Průměrné čtyřdenní léčby přípravkem tečkovaná čára) z krilu.

Obrázek 11: Průměrné sedmidenní léčby přípravkem tečkovaná čára) z krilu.

Definice: Krutá bolest: Kůň se nepodpírá bolestivou nohou. Mírná bolest: Kůň se z času na čas podpírá bolestivou nohou, pokaždé déle než 30 vteřin. Jemná bolest: Kůň se trvale podpírá bolestivou nohou, pokaždé déle než 2 minuty.

Obrázek 12: Rozkladná účinnost přípravku Single-Enzyme z krilu na nekrózách, fibrinu, hnisu a krevních sraženinách za sedmidenní léčby.

hodnocené zmírnění bolesti za Multi-enzyme (prázdné čtverce, hodnocené zmírnění bolesti za Multi-enzyme (prázdné čtverce, — B — : Černá nekrotická tkáň; - - Y - - : Žlutá fibrinózní a hnisavá tkáň; .... R .... : Červená granulózní tkáň a epitel.

Obrázek 13: Křivka dávka/odezva - Účinnost vyjádřena jako antimikrobiální aktivita PHIM u popálenin.

Obrázek 14: Intervaly dávka/rozsah pro PHIM -používané dávky na dosažení 100 % úřinnosti, t.j. definované jako vyléčení pacientů. A = oční infekce; B = záněty; C = virové infekce; D = plísňové infekce; E = bakteriální infekce; a F = zmírnění bolesti.

Obrázek 15: Akumulované dávky PHIM aplikovaného pacientům - maximální množství PHIM na kg tělesné váhy na dosažení vyléčení.

A = oční infekce; G = infekce místních poranění; H = infekce močové trubice; I = plísňové infekce; J = infekce herpes simplex; K = mastné kožní skvrny; L = hluboké popáleniny; a

M = oportunistické infekce.

Obrázek 16: Akumulované dávky PHIM aplikovaného pacientům - minimální množství PHIM na kg tělesné váhy na dosažení vyléčení.

A = oční infekce; G = infekce místních poranění; H = infekce močové trubice; I = plísňové infekce; J = infekce herpes simplex; K = mastné kožní skvrny; L = hluboké popáleniny; a M = oportunistické infekce.

Obrázek 17: účinek proti nádorům u jediné injekce PHIM 106 versus kontrola.

Obrázek 18: Účinek proti nádorům u opakovaných injekcí PHIM 106 versus kontrola.

Sloupec (n = 4): S.C. 1,25 mg dvakrát denně/ kg. Q1D 1-7;

Sloupec (n = 5): S.C. 5 mg/kg. Q4D. D 1, 3 (n = 5): S.C. 12,5 mg/kg. Q4D. Dl, 3, 5, 7.

Obrázek 19: Objemy nádorů v kontrolní skupinách.

Obrázkek 20: Kontrola (nízké rozlišení). Obrázek 21: Kontrola (velké zvětšení). Obrázkek 22: Subkutánní (nízké rozlišení). Obrázek 23: Subkutánní (velké zvětšení). Kontrola, bez léčby.

Kontrola, bez léčby. Subkutánní jediná injekce. Subkutánní jediná injekce. Teplotní stabilita PHIM.

5, 7; Sloupec versus léčených

30°C po

Obrázkek 24 Obrázek 25 Obrázkek 26 Obrázek 27 Obrázek 20 hod.

Obrázek

28:

pH 7,0:

29:

Teplotní optimum PHIM. Celková proteolytická aktivita vyjádřena jako digerovaná plocha bovinního kaseinu (Bio Rad Protease Substráte Tablets) pH 7,0; 30°C po 24 hod.

Obrázek 30: pH stabilita PHIM. udržován při pokojové teplotě po proteolytická aktivita vyjádřena bovinního kaseinu (Bio Rad Protease Substráte Tablets), 30°C po 20 hod.

Rekonstituovaný PHIM byl 2 až 18 hodin. Celková jako digerovaná plocha

Obrázek 31: pH optimum PHIM. Celková proteolytická aktivita vyjádřena jako digerovaná plocha bovinního kaseinu (Bio Rad Protease Substráte Tablets), 30°C po 16 hod. pH 5,0; 6,9; 7,0; 8,0; 9,0 a 9,5.

Obrázek 32: Křivka dávka/aktivita PHIM. Koncentrace bílkovin podle Bradfordové (Bradford, M. Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Celková proteolytická aktivita vyjádřena jako digerovaná plocha bovinního kaseinu (Bio Rad Protease Substráte Tablets) pH 7,0; 30°C po 24 hod. Dávky: 0,1; 0,3; 0,5; 0,9; 1,5; 2,5; 5,0 a 15 mg.

Claims

PATENTOVÉ NAROK Yj_ 7t o

1. Použití neimunogenního enzymového prostředku izolovaného z antarktického krilu a vykazujícího jak endo- tak exopeptidázovou aktivitu na přípravu medikamentu k léčení infekcí.

2. Použití neimunogenního enzymového prostředku izolovaného z antarktického krilu a vykazujícího jak endo- tak exopeptidázovou aktivitu na přípravu medikamentu k léčení zánětů

3. Použití neimunogenního enzymového prostředku izolovaného z antarktického krilu a vykazujícího jak endo- tak exopeptidázovou aktivitu na přípravu medikamentu k léčení rakoviny.

4. Použití neimunogenního enzymového prostředku izolovaného z antarktického krilu a vykazujícího jak endo- tak exopeptidázovou aktivitu na přípravu medikamentu k léčení HIV/AIDS.

5. Použití neimunogenního enzymového prostředku izolovaného z antarktického krilu · a vykazujícího jak endo- tak exopeptidázovou aktivitu na přípravu medikamentu k léčbě bolesti.

6. Použití neimunogenního enzymového prostředku izolovaného z antarktického krilu a vykazujícího jak endo- tak exopeptidázovou aktivitu na přípravu medikamentu k léčbě polypů, hemeroidů, povlaku, vrásek, řídnutí vlasů, alergického svědění, adheze.

7. Použití neimunogenního enzymového prostředku izolovaného z antarktického krilu a vykazujícího jak endo- tak exopeptidázovou aktivitu na přípravu medikamentu k léčení očních chorob jako zákalu, glaukómu atd.

8. Použití podle nároku 1 vyznačující se tím, že infekce je vybrána ze skupiny sestávající z virových, bakteriálních, plísňových a mykoplasmatových infekcí.

9. Použití podle nároku 2 vyznačuj ící se ti že zánět je vybrán ze skupiny sestávající z akutních chronických zánětů.

10. Použití podle nároku 9 vyznačující se tím, že zánět je vybrán ze skupiny sestávající z gumózního zánětu v ústech, artritidy, mastitídy, zánětu nosohltanu, zánětu průdušek a žaludečního vředu.

11. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků vyznačující se tím, že řečený neimunogenní enzymový prostředek obsahuje jednotlivý enzym mající jak endotak exopeptidázovou aktivitu a molekulovou hmotnost od asi 26 000 do asi 32 000.

12. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že řečený neimunogenní enzymový prostředek obsahuje směs enzymů majících endopeptidázovou aktivitu s enzymy majícími exopeptidázovou aktivitu.