CZ286070B6 - Rohovkové náhrady - Google Patents

Abstract

Rohovková náhrada, má oblast optické osy s optickými vlastnostmi, sestává z biologicky nedegradovatelného nehydrogelového materiálu, biokompatibilního s okem, a vykazuje pórovitost, přičemž tato pórovitost je v oblasti optické osy zajištěna přítomností množiny pórů, zahrnující póry o průměru od 15 nm do 0,5 .mi.m. Tato pórovitost dostačuje k průchodu složek tkáňové tekutiny o molekulové hmotnosti vyšší než 10 000 k zabezpečení toku tkáňové tekutiny mezi buňkami anteriorními a posteriorními k implantované náhradě, přičemž tato pórovitost oblasti optické osy je taková, že umožňuje tok složek tkáňové tekutiny a současně vylučuje prorůstání oční tkáně.ŕ

Description

Rohovková náhrada

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje k oftalmologii a je zaměřen zejména na rohovkové implantáty.

Dosavadní stav techniky

Rohovka je složitě vrstvenou strukturou, zahrnující vnější vrstvu epiteliálních buněk s bazální Bowmanovou membránou, za ní ležícím stromatem a Descemetovou membránou, a bazální membránou endotelu rohovky. Řada chirurgických postupů zahrnuje mimo jiné implantování čočkovité struktury do anebo na jednu z těchto rohovkových vrstev. V jedné z forem oční chirurgie se vrstva epiteliálních buněk odstraňuje a nahrazuje se strukturou, korigující čočku, se zajištěním v místě, na kterém byly buňky odstraněny. Při jiném postupu v oční chirurgii se odstraňuje část vrstvy epiteliálních buněk a klínovitý prstenec z Bowmanovy membrány a ze stromatu, ležícího pod ní. Poté se provádí naříznutí od zadního okraje vzniklého žlábků radiálně směrem ven od prstencovité zóny pro vytvoření chlopně. Korekční čočkovitá struktura se přiloží, křidélka čočky se umístí pod rohovkový lalok a přišijí. Struktura korigující čočku může být umístěna zcela uvnitř stromatu. Tento chirurgický postup se skládá z naříznutí rohovky za účelem získání přístupu ke stromatu a také narušení stromatu v důsledku umísťování v něm čočkovitého tělíska.

Shora uvedené chirurgické zákroky korigující rohovku se uplatňují v případě těžkých narušení zraku, např. spojených s přílišnou nebo nedostatečnou zakřiveností rohovky, traumatickými poraněními rohovky, u pacientů nesnášejících kontaktní čočky apod. Tyto postupy jsou všeobecně známy jako keratoplastiky.

Již dříve bylo zjištěno, že implantované rohovkové protézy musí být účinně zakotveny v rohovkové tkáni a zabezpečovat propustnost pro plyny, metabolity a živiny (zejména pro glukózu). Kromě chirurgických postupů a mechanické fixace pomocí všívání /sutury/ apod. za účelem fixace implantátů v určené poloze, využívaly dosavadní návrhy lepicích faktorů, pokrývajících povrch implantátu (viz např. US patenty č. 4 715 858; 5 171 381; a 5 192 316). Co se týče otázek propustnosti, pak dosavadní návrhy zahrnovaly používání polymerů, tvořících hydrogely s vysokým obsahem vody na základě jejich propustnosti pro glukózu a způsobilosti k výměně plynů. Zjistili jsme, že hydrogely jsou sice propustné pro glukózu, živiny a metabolity, nejsou však propustné pro glukózu, živiny a metabolity, nejsou však propustné pro bílkoviny. Hydrogely a podobné „porézní“ polymery blokují volný pohyb bílkovin a jiných složek tkáňových tekutin o vysoké molekulové hmotnosti a tím oddělují tkáň před rohovkovým implantátem od tkáně, ležící za ním. To má významné negativní účinky, které budou popsány níže. Hydrogely také ztrácejí potřebné mechanické vlastnosti, nezbytné pro oční implantáty. Například hydrogelové oční implantáty, popsané v australském patentu č. 623137 se srážejí přibližně o 22 % (srážení se vztahuje k původnímu objemu), pokud jsou ponořeny do fyziologického roztoku (viz str. 16, řádky 19 až 24 australského patentu č. 623137). Je jasné, že takového materiály by nemohly být vhodné k implantacím do očí. Navíc, buňky velmi slabě lnou k hydrogelový polymerům, což by mohlo bránit epiteliální rekolonizaci hydrogelových implantátů.

Dříve se též navrhovalo, aby rohovkové implantáty byly opatřeny otvory pro průchod živin a tekutin ze spodních vrstev rohovky přes implantát do horních vrstev rohovky. Tyto návrhy mají tu nevýhodu, že vyrobené otvory jsou příliš malé pro umožnění průtoku bílkovin, anebo zase mají takový průměr, že zraková ostrost je ovlivněna buďto bezprostředním zkreslením světla, procházejícího implantátem, anebo prorůstáním tkáně do implantátu a zhoršujícím vidění.

-1 CZ 286070 B6

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že průtok složek tkáňových tekutin o vysoké molekulové hmotnosti, jako jsou bílkoviny nebo glykoproteiny (například růstové faktory, peptidy a bílkovinné hormony a bílkoviny, spojené s přenosem nezbytných kovů) apod. skrz rohovkový implantát, tj. směrem od epiteliálních buněk ke stromálním buňkám a dokonce k endoteliální vrstvě a za ní, je podstatný pro dlouhodobou výživu tkáně před i za rohovkovým implantátem. Co se týče implantátů uvnitř rohovkového epitelu, ve kterém je plocha epiteliálních buněk zbroušena a implantát je vložen buďto dovnitř zbývajícího epitelu anebo na podkladovou membránu, pak je průtok složek tkáňové tekutiny, potřebných pro velmi důležité obalení implantátu ulpívajícími epiteliálními buňkami, kritickým činitelem. To se týká tkáňové tekutiny, směřující od stromální tkáně pod implantátem k tkáni na předním povrchu (a zejména epiteliální tkáni) v průběhu procesu počátečního pokrývání předního povrchu epiteliálními buňkami, jakož i toku bílkovinných složek od těchto epiteliálních buněk ke stromální tkáni a za ní.

S překvapením bylo zjištěno, že rohovkové implantáty původního typu zabraňují průchodu vysokomolekulámích bílkovin a glykoproteinů (jako jsou ty, které mají molekulovou hmotnost až do anebo převyšující 10 000 a až do a převyšující 200 000 nebo více), a nepříznivě ovlivňují tvorbu epiteliální vrstvy nad předním povrchem čočkovitého implantátu, vloženého dovnitř epiteliální vrstvy rohovky. Obdobně tkáň ležící za rohovkovými implantáty trpí degenerací stromatu, což je považováno za následek nemožnosti průniku bílkovinných složek o vyšší molekulové hmotnosti od epiteliální tkáně k tkáni stromatu.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká zejména implantátů, které mají být umístěny pod, uvnitř anebo napříč rohovkovou epiteliální tkání, anebo dovnitř rohovkového stromatu či jiných tkáňových vrstev rohovky. Pro zjednodušení se budou všechny tyto implantáty nadále nazývat rohovkovými náhradami.

Vynález popisuje rohovkovou náhradu pro využití při chirurgické implantaci dovnitř rohovky anebo na rohovku savce, která má oblast optické osy s optickými vlastnostmi, sestává z biologicky nedegradovatelného nehydrogelového materiálu, biokompatibilního s okem, a vykazuje pórovitost, přičemž tato pórovitost je v oblasti optické osy zajištěna přítomností množiny pórů, zahrnující póry o průměru od 15 nm do 0,5 pm. Tato pórovitost je dostatečná k umožnění průniku složek tkáňových tekutin o molekulové hmotnosti větší než 10 000, čímž se zabezpečuje tok tkáňové tekutiny mezi buňkami před a za implantovanou náhradou s tím, že pórovitost náhrady v oblasti optické osy je taková, že umožňuje tok složek tkáňové tekutiny, avšak vylučuje prorůstání oční tkáně, přičemž zmíněná náhrada je způsobilá k epiteliální rekolonizaci.

Rohovkovou náhradu podle vynálezu lze použít ke způsobu korekce optických vlastností oka či změny jeho vzhledu, zahrnujícími chirurgickou implantaci dovnitř nebo na rohovku rohovkové náhrady pro použití v chirurgické implantaci dovnitř nebo na rohovku savce, kterážto náhrada má v oblasti optické osy takové optické vlastnosti, jež zabezpečují ostrost vidění skrz ní, sestává z biologicky nedegradovatelné nehydrogelové hmoty, biologicky přijatelné pro oko, a vyznačuje se tím, že její pórovitost je dostatečná pru umožnění průniku složek tkáňové tekutiny o molekulové hmotnosti větší než 10 000, čímž se zabezpečuje tok tkáňové tekutiny mezi buňkami před a za implantovanou náhradou, ve které pórovitost oblasti optické osy je taková, že umožňuje tok složek tkáňové tekutiny, zatímco prorůstání oční tkáně vylučuje, a přičemž tato náhrada je způsobilá k epiteliální rekolonizaci.

-2CZ 286070 B6

Rohovková náhrada může zachovávat stejnou zrakovou ostrost napříč jejími rozměry, jako je tomu u konvenčních kontaktních čoček. Avšak, jelikož zraková ostrost je vyžadována pouze v této části náhrady, která pokrývá zornici, jež se bude nadále nazývat oblastí optické osy, je dávána přednost tomu, aby byla zabezpečena rohovková náhrada, která má oblast optické osy s pórovitostí, dostatečnou pro umožnění průniku složek tkáňové tekutiny o molekulové hmotnosti až do 10 000 anebo větší, avšak vylučující prorůstání oční tkáně. V takovémto případě periférie náhrady, obklopující oblast optické osy, může tvořit pásmo s pórovitostí dostatečnou pro umožnění prorůstání oční tkáně, takže se usnadňuje zakotvení náhrady v rohovce.

Pórovitost rohovkové náhrady nad oblastí optické osy oka umožňuje protékání či tok složek tkáňové tekutiny, které sestávají z bílkovin o vysoké molekulové hmotnosti, jakož i živin s nízkou molekulovou hmotností, jako je glukóza a respirační plyny. Pórovitost náhrady dovoluje bílkovinným látkám o molekulové hmotnosti od několika tisíc až do několika set tisíc anebo vyšší volně procházet napříč vrstvami rohovky, jako bylo uvedeno výše. Je to právě průchod bílkovinných složek o vysoké molekulové hmotnosti, jako jsou růstové faktory, hormony, signální bílkoviny, molekulární transmittery a transportní bílkoviny, jako je transferrin, přenášející ionty nezbytných kovů, jenž zabezpečuje zachování, soudržnost a zdraví tkání, ležících před a za implantovanou rohovkovou náhradou. Naše experimenty ukázaly, že průchod bílkovin a jiných komponent o molekulové hmotnosti přinejmenším 10 000 je podstatný pro soudržnost tkáně a její výživu. Když se říká toto, je zřejmé, že průchod bílkovinných a jiných komponent o molekulové hmotnosti menší než 10 000 je též důležitý, a tento vynález proto zahrnuje i průchod živin rohovkovou náhradou, jakož i metabolických plynů a zejména bílkovin, glycidů a lipidů o molekulové hmotnosti až do 300 000 nebo větší, jako do 500 000 nebo až do 1 000 000.

Popisovaná rohovková náhrada může být chirurgicky spojena s živoucí rohovkou a ještě lépe být nalepena na ni tak, že to změní optické vlastnosti rohovky (jako je neschopnost oka správně vidět) nebo vzhled oka, jako zabarvení zornice.

Pórovitost rohovkové náhrady může být zabezpečena díky vlastnosti hmoty, ze které se náhrada zhotovuje, tj. díky vzorové pórovitostí hmoty. Póry mohou být popřípadě zavedeny do hmoty, ze které se náhrada formuje, pomocí různých postupů dobře známých v tomto oboru, jako postupů uvedených ve WO 90/07575, WO 91/07687, US patentu čís. 5 244 799; US patentu čís. 5 238 613; US patentu čís. 4 799 931 a US patentu čís. 5 213 721.

Póry mohou být vytvořeny až po zformování rohovkové náhrady do žádoucího tvaru (jako třeba polymemím litím) anebo v surovině před vlastním tvarováním náhrady. Takové postupy mohou zahrnovat:

a) Užívání jisker nebo laserů k vypalování otvorů v náhradě anebo hmotě pro zhotovení náhrady. Póry mohou být s výhodou vytvořeny pomocí použití excimerových laserů, jako je laser pulzního typu s mikroprocesorovým ovládáním, popsaný například v WO 91/07687;

b) Opakované tažení polymemí hmoty, jak je popsáno v US patentu čís. 5 213 721;

c) Vícestupňové formovací postupy s následnou řetězovou polymerací, jak je popsáno v US patentu čís. 5 238 613.

Alternativně je možno pórovitost zabezpečit pomocí vzájemně pronikající sítě otvorů, vytvořených ve hmotě pro výrobu náhrady polymerací v přítomnosti nerozpustné látky. Následné odstranění nerozpustné látky působí vznik spár v celém objemu vytvořené polymemí hmoty.

Nezávisle na metodách vytváření žádoucí pórovitostí náhrady podle vynálezu musí mít náhrada pórovitost, postačující k prostupu bílkovin o molekulové hmotnosti až do a větší než 10 000, jako

-3 CZ 286070 B6 od 10 000 do 1 000 000, ale nedostačující pro postup buněk a tím i pro invazi tkáně do oblasti optické osy rohovkové náhrady. Tam, kde je pórovitost náhrady zabezpečována pomocí pórů, oblast optické osy zahrnuje množství pórů, jejíchž počet není v žádném případě limitujícím pro tento vynález, avšak je postačující pro zabezpečení průtoku tkáňových komponent z oblasti před implantovanou náhradou do oblasti za ní. Pouze jako příklad lze uvést, že počet pórů v náhradě se může pohybovat v rozmezí od 200 pórů na čtvereční milimetr do 300 000 pórů na čtvereční milimetr nebo i více. Póry, vytvářené uvnitř oblasti optické osy rohovkové náhrady podle vynálezu, mají průměr v rozmezí od 15 nanometrů do 0,5 mikrometru, přičemž póry této velikosti uvnitř oblasti optické osy by neměly způsobovat refrakci viditelného světla v rozsahu, který by mohl vyvolat jakýkoliv problém ve vztahu ke korekci vidění. Ještě větší přednost je dávána tomu, aby póry v oblasti optické osy měly průměr od 15 do 300 nanometrů, a je dokonce ještě více žádoucí, aby měly průměr od 20 do 150 nanometrů. Je pochopitelné, že pojem póry neklade žádná geometrická omezení povaze pórů, které z hlediska morfologie mohou být pravidelného nebo nepravidelného tvaru. V tomto kontextu, pojmu „průměrná šířka“ může být dána přednost před pojmem „průměr“. Je třeba poznamenat, že uvnitř shora zmíněných rozmezí preferovaných průměrů všechny póry nemusí být stejného průměru, jenž může kolísat uvnitř daného rozmezí.

Vně oblasti optické osy může mít náhrada stejnou pórovitost jako v oblasti optické osy, to znamená umožňovat živinám s nízkou molekulovou hmotností, respiračním plynům a bílkovinným a jiným složkám tkáňové tekutiny o molekulové hmotnosti až do a věší než 10 000 (například, až do 1 000 000 a více) průchod skrz náhradu, a zároveň to bude pórovitost specificky vylučující prorůstání tkáně. Alternativně může tato oblast náhrady, obklopující periférii oblasti optické osy, jež může být zmiňována jako pásmo, umožňovat prorůstání buněk rohovky a tím napomáhat zakotvení náklady v oku. Při tomto provedení může pásmo obsahovat rozmanité póry o průměru 20 mikrometrů a větším, s výhodou od 50 do 1 000 mikrometrů, výhodněji od 50 do 500 mikrometrů, a ještě výhodněji od 50 do 300 mikrometrů. Póry v pásmu mohou být vytvořeny stejným způsobem, který byl popsán výše pro vytváření pórů v oblasti optické osy náhrady.

Pórovitost v pásmu může být inherentní vlastností hmoty, ze které je pásmo zhotoveno. V tomto ohleduje třeba ocenit, že pásmo může být vytvořeno z téže hmoty jako oblast optické osy a tvořit s ní jeden celek. Za těchto okolností mohou být v oblasti optické osy a v pásmu vytvořeny póry odlišného průměru. Alternativně může být pásmo vytvořeno způsobem odlišným od toho, kterým byla vytvořena oblast optické osy (například pomocí polymerace v přítomnosti nerozpustného činidla jako glukózy, které se posléze vymyje z polymemí matrice, takže vznikne vysoce porézní hmota se vzájemně se prolínající sítí), takže ač pásmo je zhotoveno ze stejné látky jako oblast optické osy, jeho pórovitost je mnohem vyšší a tím i umožňující prorůstání tkáně. Alternativně může být pásmo vytvořeno z odlišné hmoty než je používána k formování oblasti optické osy, kterážto hmota má vyšší pórovitost než oblast optické osy, takže umožňuje prorůstání tkáně. Pásmo může být zpracováno postupem, vytvářejícím vyšší pórovitost, jako třeba pomocí přípravy koherentní masy tavením vytažených vláken s vytvořením vzájemně propojené sítě pórů, jako třeba vláken, zhotovených z polyolefinického materiálu, který je aplikován v oblasti optické osy. Pásmo může být například zhotoveno z vysoce porézní keramické hmoty, která se spojí s oblastí optické osy například rozpouštědlovým svářením, tepelným natavením anebo za použití lepidel. Vysoce porézní keramické hmoty, usnadňující prorůstání tkáně, jsou dobře známy (viz např. J. Biomed. Mater. Rys. Symp, No. 4, str. 1 - 23, 1973).

Rohovková náhrada může být připravena z jakýchkoliv známých přírodních nebo syntetických polymemích materiálů s odpovídajícími mechanickými vlastnostmi, jako jsou polymery a kopolymery z různých obecně známých skupin, jako akrylové polymery, polyolefiny, fluoropolymery, silikony, styreny, polyestery, polyurethany, polykarbonáty, materiály na bázi celulózy anebo bílkoviny, jako kolagen. Hydrogelové polymemí kompozice jsou konkrétně vyloučeny

-4CZ 286070 B6 vzhledem k jejich sklonu smršťovat se, jejich nedostatečné pórovitosti pro látky s vyšší molekulovou hmotností a slabé schopnosti vyvolávat ulpívání buněk.

Tam, kde se ke zhotovení rohovkové náhrady využívá směs polymemích hmot, tyto hmoty mohou být kopolymerovány v souladu s postupy dobře známými v oboru pro účely vytváření výsledné polymemí sítě. Jak již bylo zmíněno, pásmo může být zhotoveno z rozdílných polymemích nebo jiných materiálů než oblast optické osy, takže je umožněno prorůstání tkáně, což je funkcí zvýšené pórovitosti. Oblast pásma může být zhotovena zjednoho nebo více polymerů, o kterých již byla zmínka, keramického anebo jakéhokoliv jiného biokompatibilního biologicky nerozložitelného materiálu, který má póry o průměru větším než kolem 20 mikrometrů, čímž se umožňuje prorůstání tkáně.

Rohovková náhrada podle tohoto vynálezu může být zhotovena standardními postupy, využívanými pro zhotovování rohovkových náhrad, dobře známými v tomto oboru. Konkrétní techniky, používané pro přípravu polymerů, kopolymerů, jejich směsí, keramických výrobků a pro spojování oblasti optické osy a pásma tam, kde je to nutné, budou pochopitelně záviset na původu použitých materiálů a metodách vhodně upravených pro použité materiály v souladu s konvenčními postupy.

Rohovkové náhrady mohou být tvarovány v průběhu anebo v závěru procesu jejich zhotovování pomocí standardního frézování, leštění a/nebo tvarovacích postupů, dobře známých v oboru výroby rohovkových protéz. Jako příklad se uvádí náhrada rohovky, zhotovená polymerací a zformovaná do tvaru buďto pomocí tváření v průběhu polymerace anebo pomocí soudružení přeformovaného knoflíku. Alternativně může být oblast optické osy nejdříve zformována do žádoucího tvaru, například frézováním nebo soustružením přeformovaného knoflíku, načež se pásmo připojí k periférii oblasti optické osy pomocí polymerace. Alternativně může být oblast optické osy připojena k poréznímu vnějšímu pásmu například namočením pásma v acetonu a slisováním obou komponent. Alternativně mohu být použity opticky přijatelné adhezivní materiály, které se napojují za pomoci tepla, jaké produkuje třeba pulzní laser. Pásmo může být nejdříve vytvarováno tak, aby mělo prstencový otvor, uvnitř kterého se vytvoří optická osa pomocí buď polymerace nebo fixace přeformovaného knoflíku.

Náhrada nebo její část může být vybarvena jedním nebo několika pigmenty anebo barvami, dobře známými v tomto oboru. Vybarvení náhrady a zejména zbarvení zóny v okolí pupily má za následek změnu zbarvení oka po implantaci.

Náhrada rohovky v souladu s tímto vynálezem je způsobilá pro epiteliální rekolonizaci. Tím se míní, že polymerní substance, ze které je náhrada zhotovena, nebrání v ulpívání buněk nebo jejich pohybu. Navíc, odpovídající plochy náhrady mohou být modifikovány, jak se uvádí dále, pro usnadnění ulpívání buněk.

Vnější přední i zadní plocha rohovkové náhrady mohou být modifikovány pomocí aplikace takového polymeru, který obsahuje volné skupiny, schopné konverze v reaktivní funkční skupiny, jež jsou schopny následně se kovalentně vázat k povrchu náhrady. Například směs, jež modifikuje povrch, může sestávat z polyaminokyseliny, jako je polylysin, kde například zhruba 10 molámích procent volných skupin je schopno konverze v nitrenové funkční skupiny. Modifikovaný povrch může sám o sobě stimulovat adhezi buněk v blízkosti implantované náhrady, jako epiteliálních buněk anebo buněk stromatu. Alternativně může být modifikovaný povrch obalen jednou nebo několika složkami, které podporují růst tkáně v blízkosti implantované náhrady. Mezi tyto materiály patří například fíbronektin, laminin, chondroitensulfát, kolagen, bílkoviny spojující buňky, antiželatinový faktor, za studená nerozpustný globulin, chondrenektin, epidermální růstový faktor, adhezivní proteiny mušle, trombospondin, vitronektin a rozmanité proteoglykany a/nebo deriváty zmíněných látek a jejich směsi. Fíbronektin, deriváty fibronektinu, epidermální růstový faktor, deriváty epidermálního růstového

-5CZ 286070 B6 faktoru a jejich směsi jsou zvlášť užitečné. Alternativně může být náhrada rohovky sama o sobě, bez modifikace povrchu, bezprostředně obalena jednou nebo několika složkami, které podporují růst tkáně v blízkosti implantované náhrady a/nebo adhezi buněk k náhradě. Těmito komponentami mohou být libovolná sloučenina nebo sloučeniny, které zabezpečují adhezi buněk a/nebo podporují růst buněk, jako jsou růstové faktory a adhezní faktory. Výhodné jsou materiály, detailně popsané v souvislosti s aplikací na povrchově modifikovanou náhradu. Je žádoucí, aby povlak ze sloučenin, podporujících růst tkáně v blízkosti implantované náhrady, byl kovalentně vázán na náhradu, aniž by ovlivňoval její optické vlastnosti. Ať už v důsledku modifikací povrchu nebo díky kvalitě inherentních vlastností náhrady, je náhrada podle tohoto vynálezu způsobilá pro epiteliální rekolonizaci.

Popisovaná náhrada rohovky podle vynálezu se liší a překonává dřívější návrhy v tomto boru vtom smyslu, že zabezpečuje účinný průtok složek tkáňové tekutiny o vysoké molekulové hmotnosti k zevnímu povrchu od tkáně pod implantátem, což slouží k podpoře a stimulaci pokrývání vnějšího povrchu implantátu rohovkovými epiteliálními buňkami díky migračním pochodům od přilehlé tkáně a stratifikaci a k podpoře výživy epiteliální tkáně, pokrývající implantát, nebo i jakékoliv jiné tkáně, jež pokrývá implantát. Transkomeální signalizace je zabezpečena, například během počátečního období po provedení implantace, jako během povlékání se náhrady epitelem, a dále s stará o pórovitost náhrady, zaměřenou na terapeutické přípravky, aplikované na vnější povrch implantátu.

Náhrada rohovky v souladu s vynálezem může být zavedena do oka v souladu s ustálenými keratoktomickými postupy, dobře známými v oboru.

Tento vynález bude nyní popsán s odkazem na následující obrázky a příklady, které jeho rozsah v žádném směru neomezují.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje histogram, znázorňující v procentech (%) výskyt zvířat s vředy na rohovce v relaci k velikosti pórů specifických membrán. Sloupec A představuje membránové materiály Cuprophan/Gambrane.

Obr. 2 představuje histogram, znázorňující výskyt v procentech (%) zvířat s řídnutím epitelu a stromatu v relaci k velikosti pórů specifických membrán. Sloupec A představuje membránové materiály Cuprophan/Gambrane.

Obr. 3 představuje histogram, který znázorňuje ulpívání epiteliálních buněk hovězí rohovky na polystyrenu pro kultivaci tkáně (TCPS) ve frakcionovaném séru po 24 hodinách. Osa X představuje médium. Osa Y reprezentuje koncentraci buněk v procentech kontroly, kde kontrola =DD/Fn v 6. Den aje brána jako 100%. „DD“ představuje kultivační médium, neobsahující sérum, s obsahem 20% (objem/objem) séra, ochuzeného o fibronektin a viktonektin; „lOOk“ představuje kultivační médium bez obsahu séra, ke kterému bylo přidáno 20 % (objem/objem) frakce 1 s velikostí molekulové hmotnosti sérových faktorů od 1 000 do 100 000; „30k“ představuje kultivační médium, neobsahující sérum, ke kterému bylo přidáno 20 % (objem/objem) sérových faktorů o velikosti molekulové hmotnosti od 1 000 do 30 000 „lOk“ představuje kultivační médium, neobsahující sérum, ke kterému bylo přidáno 20 objemových procent sérových faktorů o molekulové hmotnosti od 1 000 do 10 000; „100+30+10k“ představuje kultivační médium neobsahující sérum, ke kterému bylo přidáno 20 % (objem/objem) sérových faktorů o molekulové hmotnosti od 1 000 do 100 000; „DD“ je kultivační médium, neobsahující sérum, + 20 % (objem/objem) séra ochuzeného o fibronektin a vitronektin (nefrakcionovaného podle velikosti); SFM je kultivační médium, neobsahující sérum; a Fn značí, že polystyrénový povrch tkáňové kultury byl předem obalen fíbronektinem.

-6CZ 286070 B6

Obr. 4 představuje histogram, znázorňující rozrůstání rohovkových epiteliálních buněk na polystyrenu pro kultivaci tkáně (TCPS) ve frakcionovaném séru po 6 dnech kultivace. Osa X představuje médium. Osa Y představuje v procentech počet buněk po 24 hod/5 (kontrola 6. dne); rozrůstání buněk 6 dnů/24 hod (kde šrafovaná plocha sloupce představuje rozrůstání a černé čtverečky znamenají počet buněk). „DD“ je kultivační médium, neobsahující sérum, +20 % (objem/objem) séra, ochuzeného o fibronektin a vitronektin (nefrakcionovaného podle velikosti); „lOOk“ představuje kultivační médium, neobsahující sérum, do kterého bylo přidáno 20% (objem/objem) procent frakce 1, která obsahuje sérové faktory o molekulové hmotnosti 1 000 až 100 000; „30k“ reprezentuje kultivační médium, neobsahující sérum, ke kterému bylo přidáno 20% (objem/objem) sérových faktorů o molekulové hmotnosti 1 000 až 30 000; „lOk“ značí kultivační médium, neobsahující sérum, do kterého bylo přidáno 20 % (objem/objem) sérových faktorů o molekulové hmotnosti 1 000 až 10 000; „100+30+10k“ reprezentuje kultivační médium, neosahující sérum, do kterého bylo přidáno 20 % (objem/objem) sérových faktorů o molekulové hmotnosti 1 000 až 100 000; SFM je kultivační médium, neobsahující sérum; a Fn značí, že polystyrénový povrch tkáňové kultury byl obalen fibronektinem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Prostup makromolekul napříč rohovkou je nezbytný pro zachování normální struktury/ soudržnosti rohovky

Membrány s rozdílnou velikostí pórů byly implantovány do očí koček za účelem stanovení usnadňujících nebo blokujících účinků na tok složek tkáňové kultury o vysoké molekulové hmotnosti přes rohovku, a to jak za implantát, tak dovnitř implantátu.

V prvním pokusu byly do rohovky koček implantovány dialyzační membrány o velikosti pórů 1,4 nanometrů. Tyto membrány, ačkoliv umožňovaly průchod glukózy, aminokyselin, vody a respiračních plynů, blokovaly průchod komponent o molekulové hmotnosti vyšší než 10 000. Jak epitel rohovky, tak i stroma u testovaných zvířat ztratily soudržnost během pokusného období v trvání čtyř týdnů. Tento experiment ukazuje, že tkáňové složky o molekulové hmotnosti nad 10 000, jmenovitě bílkoviny a glykoproteiny, jsou nezbytné pro zachování soudržnosti rohovky.

Čtyři dospělé kočky byly poté použity k podrobnějšímu studiu.

A. Základní měření

Byla provedena základní měření soudržnosti rohovky včetně hodnocení štěrbinovou lampou. Byly zjišťovány parametiy průhlednosti rohovky, náplň cév a jejich prorůstání do rohovky, charakteristiky povrchu, opacity atd.

B. Uspořádání experimentu

V této studii (viz tabulka 1) byly použity dva typy membrán: Nuclepore Filter (polykarbonát) a dialyzační membrána (polykarbonát/PEG). Před implantací byly membrány trepanovány na průměr 12 mm. V membráně, použité u kočky 2, byly na periferii vytvořeny otvory o velikosti od 20 do 30 mikrometrů, vytvořené pomocí laseru. Membrány, zhotovené z Nuclepore Filter, byly vyčištěny přípravkem na čištění kontaktních čoček zn. Miraflow, poté opláchnuty a autoklávovány ve sterilním izotonickém fyziologickém roztoku.

-7CZ 286070 B6

Dialyzační membrána byla opláchnuta a autoklávována ve sterilním izotonickém fyziologickém roztoku po laserové perforaci.

Tabulka 1: Membrána a podrobnosti chirurgických zákroků

Kočka číslo	Implantované oko	Typ membrány	Velikost pórů membrány (pm)	Kontralaterální oko - implantát (Ano/Ne)
1	Levé oko	Polykarbonát	0,05	Ne
2	Levé oko	Polykarbonát/PEG	Neperforované; 0,0014; Perforace: 20-30	Ne
3	Pravé oko	Polykarbonát	0,05	Ano
4	Levé oko	Polykarbonát	0,1	Ano

C. Chirurgický postup

1. Kočky byly anestetizovány do stupně 3 - rovina 2.

2. K provedení 6 mm incise přesně v horním limbu byl použit diamantový nůž.

3. Pro vytvoření lamelámí kapsy o průměru od 14 do 15 mm byl použit rohovkový disektor.

4. Membrána o průměru 12 mm byla vložena dovnitř vytvořené kapsy s použitím pinzet s plastovým značením.

5. U kočky 1 a kočky 2 byla incize uzavřena monofilním nylonem 9 - 0. U kočky 3 a kočky 4 byla incize uzavřena hedvábím 8-0.

D. Následné hodnocení

Oči byly vyhodnocovány denně od ukončení pokusu, limitovaného klinickými příznaky (tabulka 2).

Tabulka 2: Doba pozorování

Číslo kočky	Počet dnů do ukončení pokusu
1	23
2	28
3	16
4	pokus pokračuje

Eutanazie koček byla provedena intravenózně pomocí předávkování pentobarbitonem sodným v množství 140 mg/kg tělesné hmotnosti.

E. Histologie

Oči zvířat byly vyjmuty ihned po eutanazii. V průběhu enukleace byl do obou očí kapán fíxativ (2,5% roztok glutaraldehydu v 0,1 M natriumkakodylát-trihydrátu, 2 mM chloridu vápenatého, pH upraveno na 7,2 pomocí 1 M HC1, 25 °C), rychlostí dostačující ktomu, aby vnější povrch rohovky zůstával vlhký. Ihned po usmrcení bylo injektováno do přední komory každého oka 0,3 ml fixativu za účelem fixace zadního povrchu rohovky.

-8CZ 286070 B6

Rohovky byly odseparovány od zbytku oka a ponořeny do fixativu o teplotě 4 °C na šedesát hodin. Z každé rohovky bylo vyříznuto po dvou proužcích o šířce 1 mm; jeden od periferie do centra podél svislé osy; druhý od periferie do centra podél horizontální osy.

Výsledky

Tabulka 3 a 4 poskytují souhrn uspořádání pokusu a výsledků.

I. Klinická pozorování

- Klinický vzhled membrán, tj. poloha a rozměr membrán, se během sledovaného období nezměnil.

- Depozita, otok a neovaskularizace nebyly výraznější v pokusných očích s implantáty ve srovnání s kontrolníma očima, do kterých membrány nebyly implantovány. Tyto reakce se zdály být lokalizovány před rozhraním membrána/kapsa.

- V implantovaných očích, byla pozorována „depozita“ před membránou, zejména v dolních partiích kapsy po dvou nebo třech dnech po provedení chirurgického zákroku.

- V kontrolních očích byla „depozita“ lokalizována především do centrální oblasti kapsy a jevila se méně hutnými ve srovnání s nálezem v implantovaných očích. „Depozita“ měla podobný vzhled jako depozita v implantovaných očích, avšak nevykazovala progresi ve stejném rozsahu.

- Neovaskularizace rohovky začala v místě incize a pokračovala penetrací do stromatu s překrytím membrány u všech koček. Avšak v průběhu studia došlo k regresi neovaskularizace rohovky u jednoho oka (kočka 4). Pozorovaná neovaskularizace byla spíše komplikací chirurgického zákroku, než aby byl růst cév podmíněn nedostatkem živin.

- Přední stromální „depozita“ a edém byly pozorovány u kočky 1, kočky 3 a kočky 4 v celém průběhu sledovaného období.

- Přední stromální depozita, edém a neovaskularizace byly pozorovány v implantované zóně, překrývající neperforovanou oblast polykarbonát/PEG membrány. Avšak edém a neovaskularizace nebyly pozorovány v zóně, překrývající perforovanou oblast.

- Nebyly pozorovány žádné klinicky zjistitelné změny stromatu za membránou nebo na endotelu v žádném z implantovaných očí.

II. Histologické nálezy

- Epitel nad implantovanou membránou se zmenšil jak co do tloušťky, tak i do počtu buněčných vrstev ve srovnání s hodnotami, nalezenými v kontrolní rohovce (operované i neoperované) u kočky 1, respektive kočky 3.

- Epiteliální buňky všech implantovaných očí se morfologicky do určité míry změnily, jak bylo prokázáno vzestupem počtu extracelulámích pigmentací, větším počtem granulámích jader a méně definovanou cytoplazmou.

- Byla pozorována zánětlivá reakce v rohovce před i za membránou u kočky 2 a kočky 3. Projevilo se to otokem keratocytů, kulatých a tmavě se barvících buněk, pravděpodobně neutrofilů, a neovaskularizací v zadním stromatu.

-9CZ 286070 B6

- Byla zjištěna těsná souvislost mezi celulámími změnami a implantovanou membránou u kočky

2. To se projevilo tím, že:

-- dramaticky vzrostla hustota keratocytů, dosahujících membrány;

-- vzrostl počet malých, kulatých, tmavě se barvících buněk (možná neutrofilů) v epitelu, překrývajícím membránu a ve stromatu před a za membránou;

-- v zónách nad neperforovanou oblastí membrány se Bowmanova membrána jevila jako poškozená;

- byl pozorován granulámí materiál v blízkosti rozhraní stroma/membrána; přední rozhraní stroma/membrána akumulovalo silnější vrstvu granulámího materiálu, než bylo pozorováno na zadním rozhraní u kočky 2;

-- morfologické změny celulámích komponent epitelu se objevovaly obvykleji v zóně, překrývající neperforovanou oblast membrány, než nad perforovanou oblastí.

- Endolel se jevil jako intaktní a souvislý ve všech implantovaných očích.

- U kočky 3 masa buněk, podobajících se keratocytům, penetrovala mezi Descemetovu membránu a přední povrch endoteliálních buněk v implantovaném oku. Několik červených krevních buněk bylo nalezeno přilepených k zadní straně endotelu. Tyto jevy nebyly pozorovány v kontrolním oku.

Jak bylo ukázáno výše, implantáty, které bránily toku tkáňových bílkovinných složek o vysoké molekulové hmotnosti skrz rohovku, měly za následek degeneraci stromatu a poškození Bowmanovy vrstvy, jakož i ztrátu soudržnosti epitelu rohovky.

Tabulka 3: Souhrn uspořádání experimentu a zjištěné výsledky

Číslo kočky	Oko (P/L)	Kapsa (Ano/Ne)	Hloubka kapsy	Membrána (Ano/Ne)	Typ Membrány	Velikost pórů (pm)	Počet dní před ukončením	Důvod ukončení
1	P	Ne		Ne			23
	L	Ano	1/2 stromatu	Ano	Polykarbonát	0,05	23	Nekróza tkáně, edém, neovaskularizace
3	P	Ano	2/3 stromatu	Ano	Polykarbonát	0,05	16	Neovaskularizace; edém
	L	Ano	2/3 stromatu	Ne		-	16
4	P	Ano	1/2 stromatu	Ne	-	-	pokus pokračuje
	L	Ano	1/2 stromatu	Ano	Polykarbonát	0,1	pokus pokračuje
2	P	Ne	-	Ne	-	-	28
	L	Ano	1/3 stromatu	Ano	Polykarbonát/PEG	* 1,4 pm v neperforované zóně	28	Intrastromální nekróza

♦proměnlivá: 20-30 v perforované zóně

- 10CZ 286070 B6

Poznámka: P = pravé oko

L = levé oko

Tabulka 4: Další souhrn zjištěných výsledků

Číslo kočky	Oko (P/L)	Jiná kliň, pozorování	HISTOLOGICKÁ POZOROVÁNÍ
Epitel	Stroma	Membránové rozhraní	Endotel
1	P	Anterior. Stromální jizva	Normální	Normální	Normální	Normální
	L	Proužky ve	Zeslabené:	Přední:	Anteriomí:	Normální
		stromatu	celulámí	normální,	prolíná se s
		„Depozita“	změny	Zadní:	granulámí
		před membránou		norální	materiálem, Posteriomí: Červené kr. b., debris prolíná se s epi buňkami
3	P	Neovaskularizace;	Zeslabené;	Anteriomě:	Anteriomě:	Keratocytům
		edém a disperze,	celulámí	Jizvení“ tkáně,	prolíná se s	podobné
		„Depozita“ před	změny	RBC a zánět-	granulámím	buňky mezi
		membránou		livé buňky	materiálem;	Descementovou
				v horním	Posteriomě:	membránou a
				kvadrantu,	prolíná se s epi	endotelem
				Posteriomě:	buňkami a
				aktivované	granulámím
				keratocyty	materiálem
3	L	Zánět: „Depozita“ v rovině neovaskularizace kapsy	Normální	Normální	Normální	Normální
4	P	Edém, Zarudnutí Zesílení fíbroblasty na úrovni endotelu, jasný endotel	*	*	*	*
	L	Membrána, ztrácející průhlednost	*	*	*	*
2	P	-	Normální	Normální	Normální	Normální
	L	Neovaskularizace;	Normální	Normální,	Aktivované	Normální
		Edém zašednutí a	tloušťka	s výjimkou	keratocyty
		opar anteriomě	Celulámí	oblasti neovas-	uloženy
		k membráně,	změny a prů-	kularizace	anteriomě a
		Depozita	lom Bowma-		posteriomě
		posteriomě	novy vrstvy,		k povrchu a
		k centrální	překrývající		zaplňují
		membráně	intaktní membránu		perforaci

Poznámky: P = pravé oko

L = levé oko

-11 CZ 286070 B6

Příklad 2

Pórovitost náhrady, požadovaná pro udržení epitelu a stromatu ve zdravém stavu

V tomto příkladu byly do očí dospělých koček (n=50) chirurgicky vpraveny náhrady s odlišnou pórovitostí. Žádná kočka netrpěla oční či systemickou chorobou. Detaily a charakteristiky membrán, užitých v této studii, jsou uvedeny v následující tabulce 5.

Tabulka 5: Materiály membrán a jejich specifikace

Název	Materiály	Velikost pórů (nm)	Pórovitost (cca %)	Průměr (mm)
Cuprophan	Regenerovaná celulóza	<15		10
Gambrane	Polykarbonát/P	1,4		12 a 8
Poretics	Polykarbonát	25	1,50	8
		100	2,36	12a8
Nucleopore	Polykarbonát	50	1,20	12a8
		15	0,10	8

Před implantací byly membrány trapenovány do průměrů 12 mm, 10 mm nebo 8 mm.

Chirurgický postup a následné hodnocení bylo prováděno stejně jako v příkladu 1. Počet zvířat, kterým byly implantovány jednotlivé membrány, je uveden v následující tabulce 6.

Tabulka 6: Souhrn počtů zvířat podle typů membrán

Počet	Cuprophan	Gambrane	Poretics 25 nm	100 nm	Nucleopore 50 nm	50 nm
Celkem	2	3	8	15	16	6
implantováno

Z velkého množství klinických pozorování a shromážděných histologických dat patří mezi údaje, které mají nejtěsnější vztah k hodnocení zdravotního stavu epitelu a stromatu po zavedení membránové náhrady, rohovkový vřed a ztenčování epitelu a předního stromatu.

Obrázek 1 ukazuje histogram, který udává v procentuálním vyjádření počet zvířat s rohovkovými vředy v každé skupině implantátů. Rohovkový vřed vykazuje 43 % zvířat s implantovanou membránou s velikostí pórů 25 nm. Rohovkový vřed vykazuje 80 % zvířat s implantovanou membránou s velikostí pórů 15 nm. Co do úspěšnosti byl stejný výsledek pozorován pro cuprophanovou a gambranovou membránu, které měly póry o velikosti menší než 1,5 nm. Žádné vředy nebyly pozorovány u zvířat, kterým byly implantovány membrány s velikostí pórů 50 nm a 100 nm.

Obrázek 2 ukazuje histogram, který udává v procentním vyjádření počet zvířat se ztenčením epitelu a předního stromatu, následujícími po implantaci membrán s rozdílnou velikostí pórů do očí. Obrázek 2 zřetelně dokládá, že jakmile velikost pórů implantované membrány se zmenšuje, stoupá počet zvířat se ztenčením epitelu a předního stromatu. Všechna zvířata s implantovanou

-12CZ 286070 B6 membránou s velikostí pórů 15 nm nebo méně vykazovala ztenčení epitelu a předního stromatu. Tento údaj klesá na 31 %, respektive 27 % pro membrány s velikostí pórů 50 nm a 100 nm.

Obrázky 1 a 2 zřetelně ukazují, že velikost pórů v rohovkových náhradách, zaváděných do očí zvířat, by měla být větší než alespoň 15 nm.

Příklad 3

Rohovková epiteliální tkáň vyžaduje trofické faktory s molekulární hmotností větší než 10 000 pro ulpívání buněk, migraci a nárůst epitelu

V tomto pokusu byl zjišťován požadavek na určení faktorů tkáňové tekutiny, jako například séra, které by umožňovaly optimální proliferativní a migrační odpověď rohovkových epiteliálních buněk. Rohovkové epiteliální buňky byly vyživovány kultivačním médiem (neobsahujícím sérum), které vyhovovalo požadavkům buněk na glukózu, živiny, metabolity a malé fyziologické molekuly. Účel experimentu spočíval ve stanovení požadavků těchto buněk na faktory, trofizující tkáň, s umožněním určitých buněčných funkcí, které by měly umožňovat kolonizaci rohovkového implantátu rohovkovým epitelem a výživu této epiteliální tkáně. Toto bylo demonstrováno pomocí zkoumání účinku přídavku séra do kultivačního média, jako příkladu takové tkáňové tekutiny, na migrační a růstové aktivity rohovkových epiteliálních buněk.

Jelikož cílem experimentu bylo stanovit požadavky rohovkových epiteliálních buněk na trofizující složky, byly experimenty uspořádány takovým způsobem, aby byla vyloučena možnost, že by jakýkoliv stimulační účinek sérových faktorů mohl vzniknout jen díky přímé stimulaci ulpívání buněk po adsorpci sérových faktorů na povrch polymeru. Dva tkáňové a sérové faktory, fibronektin a vitronektin, se mohou nalézat v rozpustné formě a také se adsorbovat na povrchy, a v takovéto nerozpustné formě mohou sloužit k podpoře ulpívání buněk. Za účelem rozlišení mezi vyživovacím nebo trofizujícím účinkem sérových faktorů, jakožto odlišných od stimulace buněčné adheze k povrchu kultury v důsledku adsorpce sérového fibronektinu a/nebo vitronektinu na tento povrch, bylo sérum, používané v tomto experimentu, před pokusem s buňkami dokonale zbaveno adhezivních bílkovin fibronektinu a vitronektinu.

Systém testování buněčné kultury, používaný ke stanovení účinku faktorů trofizujících tkáň, byl zvolen s cílem představit materiál ke zhotovení rohovkové náhrady prvního druhu, tj. takový, který podporuje procesy počátečního ulpívání buněk. Rohovkové epiteliální buňky byly kultivovány na povrchu syntetického polymeru, nazývaného polystyrenem, pro kultivaci tkáně, což je okysličený polystyrénový povrch, který byl optimalizován pro podporu ulpívání buněk. Jelikož chemická povaha povrchu je taková, že podporuje ulpívání rohovkových epiteliálních buněk, podobá se tento polymemí povrch, pokud jde o buněčnou adhezi, příkladu rohovkové náhrady, popsanému v dosavadním stavu techniky.

Již dříve se předpokládalo, že složky extracelulámí matrice, jako fibronektin, laminin nebo kolageny, mohou stimulovat buněčnou ulpívací aktivitu rohovkových epiteliálních buněk.

V předcházejících experimentech byly porovnávány komponenty různých extracelulámích matric co do schopnosti podporovat procesy počátečního ulpívání a dalšího rozrůstání epiteliálních buněk, pokud na kultivovaném povrchu jsou adsorbovány faktory, za účelem určení povrchu optimálního pro stimulaci migrační aktivity rohovkových epiteliálních buněk. V těchto předcházejících experimentech bylo jako kultivační médium zvoleno médium, neobsahující sérum s přídavkem 20 % (objem/objem) zárodečného hovězího séra, zbaveného jak fibronektinu, tak i vitronektinu s tím, že může být stanovena účinnost různých komponent extracelulámí matrice bez jakéhokoliv přispění vitronektinu nebo fibronektinu, adsorbovaného ze sérové komponenty kultivačního media.

- 13 CZ 286070 B6

K. výzkumu migrační odpovědi epiteliálních buněk hovězí rohovky na různé složky extracelulámí matrice bylo vhodné stanovit rychlost rozrůstání buněk z celulámího ostrůvku. Toho bylo dosaženo tím, že buňky byly rozesety do definované centrální oblasti kultivovaného povrchu (polystyren pro kultivaci tkáně) o známém průměru při předem stanovené koncentraci buněk, dostatečné pro vytvoření souvislé monovrstvy epiteliálních buněk na počtu kultivačního období. Vymezení plochy bylo dosaženo použitím kroužků z nerezavějící oceli (dále uváděné jako „s/s“), které měly v základně silikonový O-kroužek s V-profilem, který účinně zabezpečoval těsnění vzniklé komůrky, do níž byly vysety buňky. Po výsevu a kultivaci po dobu dostatečně dlouhou pro ulpění buněk (čtyři hodiny kultivace) byly kroužky odstraněny a bylo aplikováno čerstvé kultivační médium. Buňky na epiteliálním ostrůvku se potom mohly volně rozrůstat nad povrchem rychlostí, která mohla být zčásti determinována tou složkou extracelulámí matrice, která se předem adsorbovala na povrch polymeru. V tomto pokusu byla možná dvě různá uspořádání. Buňky se mohly vysévat buďto dovnitř oblasti centrální komůrky a tím účinně vytvářet kruhový buněčný ostrůvek, nebo alternativně mimo komůrku a tak nechávat centrální oblast povrchu bez buněk. S použitím těchto dvou forem pokusu byly porovnávány složky extracelulámí matric vzhledem k jejich vlivu na rozrůstání epiteliálních buněk.

Experimentální část

Příprava povrchů složek extracelulámích matric: Bylo otestováno pět rozdílně definovaných matric s ohledem na jejich schopnost podporovat ulpívání rohovkových epiteliálních buněk pomocí předběžné adsorpce níže uvedených bílkovin na povrch polystyrenu pro kultivaci tkáně a následné blokády všech zbývajících míst, schopných vázat bílkoviny, pomocí 1% (hmotnost/ objem) roztoku albuminu hovězího séra:

1. Vitronektin hovězího séra v koncentraci 5 pg/ml (izolován výše uvedeným způsobem);

2. Fibronektin hovězího séra v koncentraci 10 pg/ml (firma Sigma);

3. Myší laminin v koncentraci 50 pg/ml (purifikován z EHS sarkomu; Collaborative Biomedical);

4. Myší kolagen typu IV v koncentraci 40 pg/ml (purifikován z EHS sarkomu; Collaborative Biomedical);

5. Hovězí kolagen typu I v koncentraci 1,5 mg/ml (purifikován z telecí kůže; „Cellagen“ od fy ICN).

Tyto koncentrace látek, vytvářejících předběžný obal, byly zvoleny na hladině, která by měla nabídnout maximální stimulaci adheze buněk. Bylo přidáno 80 μΐ matricového roztoku s předem stanovenou koncentrací, dostatečnou k počátečnímu pokrytí vnitřních stěn jamek v polystyrenu pro kultivaci tkáně (kultivační deska s 96 jamkami), načež se provedla jednohodinová inkubace při teplotě 37 °C. Matricové roztoky byly posléze odstraněny a povrchy „blokovány“ pomocí 1% (hmotnost/objem) roztoku albuminu v kultivačním médiu, neobsahujícím sérum, a provedla se jednohodinová inkubace při teplotě 37 °C. Tento „blokační“ krok zabezpečoval, že všechna vazebná místa, jež nebyla saturována matricí, byla účinně neutralizována před výsevem buněk. Do každého experimentu byl taktéž zahrnut blokový povrch polystyrenu pro kultivaci tkáně, který sloužil jako efektivní negativní kontrola.

Experimentální měření ulpívání buněk: Do každé jamky bylo vneseno 100 μΐ roztoku o koncentraci 0,7 - 1,0 x 10⁵ buněk/ml pro kultivované buňky nebo 3,0 - 5,0 x 10⁵ buněk/ml pro primární buňky v 1% (hmotnost/objem) roztoku albuminu hovězího séra a inkubovalo se po dobu 90 minut při teplotě 37 °C. Adheze buněk byla stanovována pomocí barvení methylenovou modří a odečítáním absorbance při 650 nm na zařízení pro odečítání z kultivačních desek. Jako referenční substrát pro buňky každého původu byl použit kolagen typu I a ulpívání jeho buněk stanoveno na 100%. Adheze buněk ke všem ostatním matricím byla pak pro účely porovnání výsledků vyjádřena v procentech, vztažených ke kolagenu typu I v tomtéž experimentu.

-14CZ 286070 B6

Experimentální měření rozrůstání buněk: 100 μΐ vzorků kultivovaných buněk hovězího rohovkového epitelu (pasáže č. 5 až 7) limbálního (tj. z periferie rohovky) původu bylo vyseto v koncentraci 5 x 10⁵ buněk/ml do centra kroužků, zabraňujících migraci, zhotovených z nerezavějící oceli, nebo 0,45 ml buněčné suspenze v koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml mimo tyto kroužky. Zmíněné koncentrace byly postačujícími pro vytvoření uniformní monovrstvy ulpělých buněk v průběhu čtyřhodinové inkubace. Buňky byly inkubovány po dobu čtyř hodin při teplotě 37 °C před odstraněním kroužků. Použité kultivační médium sestávalo z 20 % (objem/objem) zárodečného hovězího séra, zbaveného fibronektinu a vitronektinu, 40 % (objem/objem) média, známého pod obchodním názvem Minimal Essential Medium (Dulbecco) a 40 % (objem/objem) média, známého pod obchodním názvem F12 (Ham).

Každé očkování bylo provedeno triplicitně s použitím následujících povrchových povlaků:

a) Fibronektin - fibronektin, předem povlečený při koncentraci 10 pg/ml;

b) Ln - laminin, předem povlečený při koncentraci 25 pg/ml;

c) Cl - kolagen typu I, předem povlečený při koncentraci 187, 5 pg/ml.

Předběžné povlaky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při 37 °C před použitím. V průběhu kultivačního období se kultivační médium vyměňovalo každý třetí den.

Index rozrůstání se vypočítal podle vzorce:

plocha zaplněná narostlými buňkami po 5 (nebo 7) dnech x 10

Index rozrůstání = -------------------------------------plocha zaplněná buňkami po prvních 4 hodinách

Výsledky

1. Odpověď kultivačních buněk - počáteční ulpívání buněk. Pro buňky, které se kultivovaly krátkou dobu (pasáže č. 2 až č. 3), byly stimulujícími pro počáteční ulpívání buněk molekuly každé z extracelulámích matric, tj. fibronektinu, vitronektinu, kolegenu I, kolagenu IV a lamininu. Výsledky s buňkami, čerstvě vypreparovanými z tkání před vytvořením buněčné suspenze, byly obdobné, avšak schopnost těchto buněk k odpovědi na vitronektin byla relativně slabá. Rafinované složky extracelulámích matric byly vzájemně porovnávány ve třech pokusech ve vztahu k ulpívání epiteliálních buněk hovězí rohovky, jež byly použity ihned po izolaci z rohovky, během prvních devadesáti minut kultivace. Kolagen I, laminin a kolagen IV shodně stimulovaly ulpívání rohovkových epiteliálních buněk. Vzato souhrnně ze série osmi experimentů, fibronektin byl též stimulujícím pro ulpívání buněk z každé oblasti, avšak pro buňky odlišného původu odezva těchto primárních izolátů na fibronektin se měnila od experimentu k experimentu (střední odezva se pohybovala v rozmezí od 2,3- do 2,8-násobku). Vitronektin, ač stimulující, byl soustavně méně účinný ve srovnání s lamininem, kolageny či fibronektinem v podpoře ulpívání buněk každého z těchto primárních buněčných izolátů. Toto zjištění, pokud se týká vitronektinu, je překvapivé.

2. Účinek komponent extracelulámích matric na migraci kultivovaných rohovkových buněk

i) Rozrůstání buněk z centrálně očkované oblasti. Tabulka 7 srovnává působení rozdílných extracelulámích matric na rozrůstání buněk z ostrůvků epiteliálních buněk po kultivační dobu od pěti do sedmi dnů. Vzhledem ke slabé účinnosti vitronektinu při stimulaci ulpívání primárních rohovkových epiteliálních buněk na vitronektinu nebyl tento faktor zahrnut do srovnání. Některé

- 15 CZ 286070 B6 zajímavé rozdíly v působení různých extracelulámích matric jsou zjevné. V přítomnosti séra, zbaveného jak fibronektinu, tak vitronektinu, fungovaly povrchy obalené buďto fibronektinem nebo kolagenem typu I dobře ve smyslu velikosti plochy, pokrývané buňkami, pohybujícími se směrem ven od centrálního ostrůvku. Povrchy, obalené lamininem, naopak fungovaly slabě a relaci k ostatním povrchům.

Tabulka 7: Účinky komponent extracelulámích matric na migraci kultivovaných rohovkových buněk - rozrůstání buněk z centrálně očkovaného ostrůvku

	Povrchové médium	Index (střed ± SD)
Kultivační doba pět dnů:	TCPS/NS	3,4 ± 0,0
	Fn/DD	3,2 ± 0,0
	Ln/DD	1,6 ±0,8
	Col I/DD	2,2 ± 0,3
Kultivační doba sedm dnů:	TCPS/NS	5,4 ± 0,5
	Fn/DD	4,7 ± 0,3
	Ln/DD	2,3 ± 0,3
	Col I/DD	4,2 ± 0,4

V tabulce 7 byly použity tyto zkratky:

TCPS = polystyren pro kultivaci tkáně,

NS = zárodečné telecí sérum (nezbavené fibronektinu nebo vitronektinu),

Fn = fibronektin,

Ln = laminin,

Col I = kolagen I,

DD = zárodečné telecí sérum, zbavené jak fibronektinu, tak vitronektinu,

SD = standardní odchylka.

ii) Rozrůstání buněk z periferně očkovaného kroužku. Rohovkové epiteliální buňky, naočkované kolem vnějšího okraje kroužků, byly monitorovány, dokud v jednom ze stanovení v libovolném testu zcela nevyplnily centrální plochu jamky. Účinnost každého testu byla vypočítána a vyjádřena v procentech, vztažených na centrální plochu, zaplněnou na konci experimentálního období. Tabulka 8 srovnává působení různých extracelulámích matric na rozrůstání buněk z ostrůvků epiteliálních buněk po sedmidenním kultivačním období. Toto uspořádání experimentu poskytlo výsledky obdobné těm, které byly zjištěny metodou centrálního očkování. Laminim se opět ukázal být špatným povrchem pro podporování migrační aktivity, avšak fibronektin a kolagen I byly účinnými stimulátory buněčné migrace.

Tabulka 8: Účinky komponent extracelulámích matric na migraci kultivovaných rohovkových buněk - prorůstání buněk z kroužků, naočkovaných buňkami

Plocha/Médium	5 % prorůstání *) (Průměr ± SD)
TCPS/NS Fn/DD Ln/DD Col I/DD	94.4 ± 5,7 95,6 ± 5,7 52,9 ± 7,9 95.4 ± 4,8

V tabulce 8 byly použity tyto zkratky:

-16CZ 286070 B6

TCPS = polystyren pro kultivaci tkáně,

NS = zárodečné telecí sérum (nezbavené fibronektinu nebo vitronektinu),

Fn = fibronektin,

Ln = laminin,

Col I = kolagen I,

DD = zárodečné telecí sérum, zbavené jak fibronektinu, tak vitronektinu,

SD = standardní odchylka.

*) fprůměrná plocha nepokrytá^ - (plocha nepokrytá^ x 10

Ipo 4 počátečních hodinách J Ipo 7 dnech ) průměrná plocha nepokrytá po 4 počátečních hodinách

Tyto předběžné experimenty ukázaly, že jak fibronektin, tak i kolagen I, jsou stimulujícími jak pro počáteční buněčné přilnutí rohovkových epiteliálních buněk k polymemím povrchům, tak i rozrůstání a migraci buněk z buněčných ostrůvků. Do experimentů, ve kterých měl byl stanoven účinek sérových trofických faktorů, byl zahrnut i polymemí povrch, obalený fibronektinem, jakožto reprezentant povrchů, obsahujících biologicky adhezivní faktor.

Stanovení molekulové hmotnosti sérového trofického faktoru (sérových trofických faktorů), který· podporuje migraci a rozrůstání se rohovkových epiteliálních buněk

Experimentální část

Frakcionace séra

Zárodečné hovězí sérum bylo zbaveno molekul vitronektrinu a fibronektinu, adhezivních k buňkám pomocí shora uvedených metod. Toto sérum, zbavené fibronektinu a vitrinektinu, pak bylo zfiltrováno přes sérii ultrafiltračních membrán za účelem separace sérových komponent na frakce s definovanými rozsahy molekulových hmotností. Byly použit tři rozdílné neiontové ultrafíltrační membrány fy Amicon:

1. Membrána Amicon PM10, vymezující molekulovou hmotnost 10 000;

2. Amicon PM30, vymezující molekulovou hmotnost 30 000;

3. Amicon XM100, vymezující molekulovou hmotnost od 100 000.

Membrány byly před použitím vyčištěny podle doporučení výrobce. Každá membrána byla předběžně upravena 1% (hmotnost/objem) roztokem albuminu hovězího séra v PBS s následným promytím ve sterilním PBS za účelem snížení nespecifické vazby bílkovin na membránový povrch a následné ztráty sérových složek v průběhu následujícího filtračního kroku.

Sérum nebo jeho frakce, zbavené fibronektinu a vitronektinu, se promíchají magnetickým míchadlem a za tlaku 400 kPa se zfiltrují přes individuální membrány, popsané výše, za použití ultrafiltračního zařízení (Amicon).

Frakcionace séra se provádí následujícím postupem:

Sérum, zbavené fibronektinu a vitronektinu, se zředí dvěma objemy sterilního solného roztoku, pufrovaného fosfátem (PBS), a podrobí se řadě postupných filtrací. Všechny vzorky zředěného séra, zbaveného fibronektinu a vitronektinu, se nejprve zfiltrují přes membránu XM100 o průměru 43 mm a filtrát se shromáždí. Usazenina na membráně se odloží. Z filtrátu po filtraci membránou XM100 se odeberou dva vzorky, které se zfiltrují jednak přes membránu PM10,

- 17CZ 286070 B6 a jednak přes membránu PM30 o průměru 25 mm. Filtráty, získané za použití těchto dvou membrán, se separátně shromáždí a usazeniny na membránách se odloží. Z frakcí filtrátu se odstraní komponenty o nízké molekulové hmotnosti a zbývající komponenty frakcí se zahustí na objem, který podle výpočtu odpovídá objemu v případě, že by výchozí vzorky nebyly zředěny (a za předpokladu teoretického výtěžku), za použití membrány Amicon UM2 o průměru 43 mm, vymezující molekulovou hmotnost 1000. Získají se následující frakce, jak je rovněž znázorněno v následujícím schématu 1:

Frakce 1: Filtrát po průchodu membránou XM100, který byl následně zadržen na membráně UM2 - tento preparát by měl obsahovat komponenty o molekulové hmotnosti v rozmezí od 1 000 do 100 000.

Frakce 2: Filtrát po průchodu membránou XM100, který rovněž prošel membránou PM30, ale následně byl zadržen na membráně UM2 - tento preparát by měl obsahovat komponenty o molekulové hmotnosti v rozmezí od 1 000 do 30 000.

Frakce 3: Filtrát po průchodu membránou XM100, který rovněž prošel membránou PM10, ale následně byl zadržen na membráně UM2 - tento preparát by měl obsahovat komponenty o molekulové hmotnosti v rozmezí od 1 000 do 10 000.

Schéma 1

Postup frakcionace séra

Zárodečné hovězí sérum (zbavené Fn a Vn)

Naředěné 1:3 PBS

Filtr vymezující molekulové hmotnosti

100 000(100 kD)

Filtrát 100 KD filtr vymezující kD filtrát 100 kD filtr vymezující 10 kD ’'▼ filtrát 30 kD filtrát 10kD ll

Filtráty byly zahuštěny na původní objemy pomocí zadržování nad filtrem, vymezujícím 1 kD molekulové hmotnosti

Každá z těchto frakcí byla po zpracováni sterilizována pomocí filtrace přes „Acrodisc“™ 0,22 pm. Pro ověření účinnosti filtračních postupů, byly frakce séra zfiltrovány přes 12,5% polyakrylamidový mini-gel (BioRad Protean II) za nereduktivních podmínek, a v každé frakci byla standardním postupem stanovena koncentrace bílkovin.

- 18CZ 286070 B6

Zkouška účinku séra a sérových frakcí na růst a migraci epiteliálních buněk rohovky

Sérum, ochuzené o fibronektin a vitronektin, a frakce tohoto ochuzeného séra, připravené výše uvedenými postupy, byly přidávány ke kultivačnímu médiu (modifikované Essential Medium (Dulbecco) / kultivační médium, neobsahující sérum F12 (Ham) v poměru 1:1) v koncentraci 20 % (objem/objem) za účelem zkoumání účinků různých frakcí na ulpívání a růst hovězích rohovkových epiteliálních buněk. Experimentální kultivace trvala šest dní.

Kultivační jamky byly osazeny sterilními „hradbami“ z nerezavějící oceli, rozmístěnými a vycentrovanými uvnitř jamek. Vzorky (100 μΐ) buněčné suspenze rohovkových epiteliálních buněk (připravené z hovězí rohovkové tkáně) s hustotou 5 x 10⁵ buněk/ml byly naočkovány do každého z „ohrazení“ z nerezavějící oceli. Tato dávka buněk byla dostatečná pro vytvoření souvislé jednoduché vrstvy po uplynutí čtyřiadvaceti hodin od očkování buňkami kultury do centra kultivační plochy, definované světlostí „hradeb“ v kultivačním médium, jež obsahovalo intaktní sérum. Hradby v těchto experimentech byly z kultivačních jamek odstraněny po čtyřiadvaceti hodinách kultivace, pak byl objem kultivačního média adjustován a v kultivace se pokračovalo.

Každý zkušební vzorek frakce séra, ochuzeného o fibronektin a vitronektin, byl zkoumán ve trojici jamek, z nichž jedna sloužila ke kvantifikaci plochy kultury, obsahující buňky po čtyřiadvacetihodinové kultivaci, a dvě byly použity pro měření plochy po sedmi dnech kultivace. V příslušné době byly buňky fixovány směsi formolu a solného roztoku a byly skladovány v sterilním PBS při 4 °C do doby použití. Hustota buněk byla stanovována pomocí barvení methylenovou modří podle Olivera a kol., a množství navázaného pigmentu se měřilo kolorimetricky při 655 nm pomocí zařízení na odečítání z kultivačního plata. Methylenová modř byla použita ke stanovení jak ploch s narostlými buňkami (snímkovací analýzou detekovaných buněk, které se intenzivněji zbarvily v důsledku akceptování barvicího modrého pigmentu, s využitím snímkovacího analyzátoru Quantimet 570), tak i k měření rozsahu proliferace buněk (kolorimetrické stanovení při 655 nm, na odečítacím zařízením pro imunodifuzní plata).

Kombinace kultivačních médií byly následující:

a) médium, neobsahující sérum, s přídavkem 20% (objem/objem) frakce 3, obsahující sérové složky o molekulové hmotnosti od 1 000 do 10 000;

b) médium, neobsahující sérum, s přídavkem 20% (objem/objem) frakce 2, obsahující sérové složky o molekulové hmotnosti od 1 000 do 30 000;

c) médium, neobsahující sérum, s přídavkem 20% (objem/objem) frakce 1, obsahující sérové složky o molekulové hmotnosti od 1 000 do 100 000;

d) médium, neobsahující sérum, s přídavkem 20% (objem/objem) kombinace frakcí 1, 2 a 3, obsahujících sérové faktory molekulové hmotnosti od 1 000 do 100 000;

e) médium, neobsahující sérum, s přídavkem 20 % (objem/objem) séra, ochuzeného o fibronektin a vitronektin (nefrakcinovaného podle velikosti);

f) samotné médium, neobsahující sérum.

Jak bylo výše uvedeno, byly používány dva kultivační povrchy: za prvé polystyren pro kultivaci tkáně a za druhé polystyren pro kultivaci tkáně, předem obalený fibronektinem hovězího séra v koncentraci 10 ug/ml a inkubovaný po dobu jedné hodiny při 37 °C před očkováním buňkami.

-19CZ 286070 B6

Výsledky

Pomocí rozdělení séra, zbaveného filtronektinu a vitronektinu, na frakce, obsahující látky o známé molekulové hmotnosti, bylo možné odhadnout vliv sérových složek se specifickým rozpětím molekulových hmotností na ulpívání, migraci a rozrůstání epiteliálních buněk rohovky.

Obrázek 3 znázorňuje účinky různých frakcí, připravených ze séra, zbaveného fibronektinu a vitronektinu, na ulpívání epiteliálních buněk rohovky v průběhu prvních čtyřiadvaceti hodin kultivace. Při postupu, jakým se tento experiment prováděl, byl poet buněk, přítomných na površích s rozdílnou úpravou, pro všechny úpravy po čtyřiadvaceti hodinách kultivace téměř shodný. Rozdílné úpravy mohly být tudíž pozorovány ve smyslu srovnání rychlosti nárůstu buněk a zvyšování počtu buněk po uplynutí prvních čtyřiadvaceti hodin, vzhledem k faktu, že v tomto momentu, tedy po čtyřiadvaceti hodinách, obě disponovaly obdobnou populací buněk.

Obrázek 4 znázorňuje účinky těchto rozdílných frakcí na plochu kultivačního povrchu, obalenou buňkami v průběhu šestidenního kultivačního období, vyjádřené jako index nárůstu buněk (vypočítaný jak uvedeno výše). Obrázek 4 také porovnává tyto výsledky tím způsobem, že vztahuje zvětšení plochy kultivovaných buněk po šestidenním kultivačním období (vyjádřený jako poměr k témuž po čtyřiadvaceti hodinách) k údajům o ulpívání buněk (po čtyřiadvaceti hodinách).

Migrace buněk a rozrůstání ostrůvků byly evidentní ve všech případech kombinací médium/povrch, avšak v nápadně odlišné míře. V průměru, v modifikacích, které obsahovaly zárodečné hovězí sérum, zbavené fibronektinu a vitronektinu, (pozitivní kontrola) či v modifikaci, obsahující 20 % (objem/objem) sérové frakce 1, obsahující sérové složky o molekulové hmotnosti od 1 000 do 100 000, buňky migrovaly tak, že pokrývaly plochu asi desetkrát větší, než plochy pokryté buňkami v případech modifikací s přídavkem frakcí 2 nebo 3. Navíc, rohovkové epiteliální buňky, kultivované v modifikaci s obsahem rekombinovaných frakcí 1, 2 a 3, migrovaly tak, že pokryly kolem 33 % plochy pozitivní kontroly jak v kombinaci s polystyrenem pro kultivaci tkáně, tak i s polystyrenem pro kultivaci tkáně, obaleným fibronektinem.

Obrázek 4 nabízí zajímavé srovnání mezi různými frakcemi séra. Bylo pozorováno, že hladiny ulpívání buněk po čtyřiadvacetihodinové inkubaci v modifikacích, obsahujících buďto samotné médium, neobsahující sérum, anebo médium, neobsahující sérum, s přídavkem 20% (objem/objem) frakce 3 (obsahující sérové složky o molekulové hmotnosti od 1 000 do 10 000 anebo 20 % (objem/objem) frakce 2 (obsahující sérové složky o molekulové hmotnosti do 1 000 do 30 000), anebo 20 % (objem/objem) frakce 1 (obsahující sérové složky o molekulové hmotnosti od 1 000 do 100 000), anebo rekombinace frakcí 1, 2 a 3 jsou shodné. Bez ohledu na to, že počáteční ulpívání buněk bylo shodné ve všech těchto rozdílných modifikacích, ve zvětšení buněčné plochy se projevily nápadné rozdíly. Pouze případy modifikace s přídavkem 20 % (objem/objem) frakce 1 (sérové složky o molekulové hmotnosti od 1 000 do 100 000) a modifikace s přídavkem rekombinace frakcí 1, 2 a 3 zabezpečily zvětšení buněčné plochy na polystyrenu pro kultivaci tkáně po šestidenní kultivaci. Stejný výsledek se projevil pro tytéž modifikace při použití povrchu polystyrenu, obaleného fibronektinem, pro kultivaci tkáně.

S použitím těchto dvou příkladů kultivačních substrátů, stejně jako s použitím kultivačního média, které uspokojuje požadavky buněk na složky s malou molekulovou hmotností, experimentální uspořádání, použití v těchto pokusech, je typické pro výše uvedené rohovkové náhrady, jež zajišťují jak přístup buněk k živinám a jiným malým molekulám, tak i úpravu chemické povahy povrchu, která podporuje ulpívání epiteliálních buněk rohovky. Vzato dohromady, tyto výsledky ukazují, že existuje/existují trofické faktory, jak bylo doloženo na příkladu sérového(-ých) faktoru(-ů), které jsou nutné pro optimální pokrytí povrchu syntetického polymeru, jako je povrch polystyrenu, pro kultivaci tkáně epiteliálními buňkami. Tyto faktor(-y)

-20CZ 286070 B6 jsou rozměrově větší než 1 000 daltonů a jsou též zadržovány na filtrech, které nepropouští molekuly od 10 000 a větší. Tyto výsledky naznačují, že aktivita nebo její část může být identifikována jako pokles uvnitř rozpětí molekulových hmotností do 10 000 do 75 000 (vymezených tím, že byly zadrženy membránovým filtrem Amicon PM10, ale propuštěny membránovým filtrem Amicon XM100). Těmito sérovými faktory nejsou adhezivní činitelé fibronektin a vitronektin.

Tyto výsledky naznačují, že existuje požadavek rohovkových epiteliálních buněk na faktory, trofizující tkáň na aktivity, podmiňující rozrůstání buněk a jejich migraci na povrch. Tkáňové faktory, jako je sérum, stimulují rozrůstání epiteliálních buněk z epiteliálních ostrůvků a tento účinek není závislý na sérových adhezivních bílkovinách fibronektinu a vitronektinu. Pomocí frakcionace séra podle molekulové hmotnosti bylo doloženo, že tyto aktivity jsou rozměrově větší než 10 000 daltonů. Rohovkové náhrady podle vynálezu mají tedy pórovitost dostatečnou pro umožnění průchodu složek tkáňových tekutin o molekulové hmotnosti větší než 10 000.

Příklad 4

Zhotovení rohovkové náhrady

Rohovkové náhrady mohou být zhotoveny z polymeru, sestávajícího z křížově zesítěných makrocyklů, vytvořených z jednotek následujícího vzorce

-(-CR¹⁼CR²-A-)kde A je alkylen nebo alkenylen, obsahující vždy od 3 do 10 uhlíkových atomů, popřípadě substituovaný jedním nebo více zbytky R³; každý ze symbolů R¹ a R², nezávisle na druhém, je vodík nebo nižší alkyl, a R³ je nižší alkyl, fluorovaný nižší alkyl nebo siloxanový zbytek. Takovéto polymery jsou popsány v EP-A-501,917.

Při prvním postupu se k poly(l-okten-l,8-diylu) (obchodní název Vestenamer*) v běžném komerčním hnětači za sníženého tlaku při teplotě 35 °C přidá 5 % terc.butylper-2ethylhexanoátu a zesíťovací činidlo. Rohovkové náhrady se pak z výsledné hmoty za použití vhodných barviv lisují 5 minut při teplotě 160 °C za tlaku 0,5 až 2,0 MPa. Takto získané rohovkové náhrady mají permeabilitu pro kyslík (Dk) 106 a strukturní pevnost 2,7 MPa. Póry se v rohovkových náhradách vytvoří za použití mikroprocesorem řízeného pulzního laseru. V oblasti optické osy každé náhrady se vytvoří množina pórů o průměru zhruba 200 nm. Mimo oblast optické osy každé náhrady se vytvoří množina pórů o průměru zhruba 200 pm.

Při druhém pokusu se rohovkové náhrady připravují z kopolymerů obecného vzorce I, popsaných v EP-A-538,188. Konkrétně se postupuje tak, že se 100 mmol tricyklo-[l,l,l,0^1,3]pentanu a 150 mmol ethylakrylátu dva dny kopolymeruje v diethyletheru při teplotě místnosti za vyloučení přístupu kyslíku. Získá se plošný útvar, vykazující teplotu skelného přechodu 100 °C. Z tohoto plošného útvaru se vylisují rohovkové náhrady, v nichž se shora popsaným postupem vytvoří póry.

Všechny varianty tohoto vynálezu, které jsou pro odborníky běžné, se nikterak nevymykají z rámce vynálezu a spadají do jeho rozsahu.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rohovková náhrada, která má oblast optické osy s optickými vlastnostmi, sestává z biologicky nedegradovatelného nehydrogelového materiálu, biokompatibilního s okem a vykazuje pórovitost, vyznačující se tím, že tato pórovitost je v oblasti optické osy zajištěna přítomností množiny pórů, zahrnující póry o průměru od 15 nm do 0,5 pm.
2. 2. Rohovková náhrada podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená množina pórů zahrnuje póry o průměru od 15 nm do 300 nm.
3. 3. Rohovková náhrada podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená množina pórů zahrnuje póry o průměru od 20 nm do 150 nm.