PL177096B1 - Nakładka rogówkowa - Google Patents

Abstract

1. Nakladka rogówkowa majaca strefe osi optycznej z charakterystyka optyczna, uformowana z nieulegajacego biodegradacji, niehydrozelowego mate- rialu biologicznie tolerowanego przez oczy, przy czym nakladka ta jest porowata, znamienna tym, ze ma pory o srednicy od 15 nanometrów do 0,5 mikrometra. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest nakładka rogówkowa, stosowana w okulistyce, zwłaszcza do wszczepów rogówkowych.

Rogówka stanowi złożoną strukturę warstwową, zawierającą przednią warstwę komórek nabłonkowych, za tą warstwą nabłonkową - błonę Bowmana, za błoną Bowmana - zrąb, za zrębem - błonę Descemeta, a bezpośrednio za błoną Descemeta - śródbłonek. Szereg chirurgicznych metod leczenia polega na wszczepianiu struktur soczewkowych do jednego lub więcej niż jednego z tych składników rogówki lub na jeden lub więcej niż jeden z tych składników rogówki. W jednej z metod chirurgii oka usuwa się warstwę komórek nabłonkowych i w miejscu, z którego usunięto te komórki, umieszcza się oraz umocowuje korekcyjne struktury soczewkowe. W innej metodzie chirurgii oka usuwa się część warstwy komórek nabłonkowych i usuwa z błony Bowmana oraz z leżącego poniżej zrębu fragment pierścienia w kształcie klina. Następnie wykonuje się nacięcie od tylnego końca otrzymanej bruzdy promieniowo na zewnątrz w strefie pierścienia w celu określenia płata. Następnie umocowuje się korekcyjną strukturę soczewkową przez wprowadzenie skrzydełek struktury soczewkowej pod spód płata rogówki i przyszycie go w tym miejscu. Korekcyjne struktury soczewkowe można również umieszczać całkowicie wewnątrz zrębu. Ten sposób chirurgicznego postępowania obejmuje dokonywanie nacięć w rogówce, aby uzyskać dostęp do zrębu, a także obejmuje rozerwanie zrębu przez umieszczenie w nim struktury soczewkowej.

Wymienione wyżej zabiegi chirurgiczne korygujące rogówkę stosuje się w leczeniu poważnych zaburzeń wzroku, jak np. towarzyszących nadmiernej lub niedostatecznej krzywiźnie rogówki, urazowych uszkodzeń rogówki, u pacjentów nie tolerujących soczewek kontaktowych itp. Takie procedury nazywa się zwykle keratoplastyką.

Wiadomo, że wszczepiane protezy rogówkowe muszą być skutecznie umocowane do tkanki rogówkowej i muszą umożliwiać przenikanie gazów, metabolitów i substancji odżywczych (zwłaszcza glukozy). Oprócz technik chirurgicznych oraz mechanicznego zamocowywania za pomocą szwów itp. w celu przymocowania wszczepu w danym miejscu w znanych rozwiązaniach stosowano czynniki umocowujące, które pokrywały wszczepy (patrz np. opisy patentowe USA nr nr 4 715 858,5171381 oraz 5192 316). W odniesieniu do problemu przenikalności poprzednie rozwiązania polegały na stosowaniu hydrożelów, tworzących polimery o wysokiej zawartości wody, bazując na ich przepuszczalności względem glukozy i charakterystyce wymiany gazowej.

Obecnie stwierdzono, że hydrożele, które są porowate dla glukozy, substancji odżywczych i metabolitów, nie są porowate dla białka. Hydrożele i podobne porowate polimery blokują swobodny ruch białek i innych płynnych składników tkanki o dużej masie cząsteczkowej i w ten sposób są przeszkodą w wymianie pomiędzy tkankami rozdzielonymi przez wszczep rogówkowy. Powoduje to poważne ujemne skutki, co będzie opisane dalej. Hy177 096 drożele pozbawione są również wymaganych własności mechanicznych, niezbędnych dla wszczepów ocznych. Np. hydrożelowe wszczepy oczne ujawnione w australijskim opisie patentowym nr 623137 kurczą się o około 22% (jest to skurczliwość od pierwotnej objętości) po umieszczeniu w roztworze soli fizjologicznej (patrz str. 16, wiersze od 19 do 24 australijskiego opisu patentowego nr 623 137). Oczywiście takie materiały nie byłyby odpowiednie do wszczepiania do oka. Ponadto komórki bardzo słabo przylegają do polimerów hydrożelowych, co utrudnia rekolonizację nabłonka wszczepów hydrożelowych.

W znanych rozwiązaniach proponowano także zaopatrzenie wszczepów rogówkowych w otworki w celu przepuszczenia substancji odżywczych i płynów z głębszych warstw rogówki przez wszczep do wierzchniej warstwy rogówki. Propozycje te mają takie wady, że wykonane otworki są albo zbyt małe, aby umożliwić przenikanie białek, albo mają taką średnicę, że ostrość wzroku zaburza albo bezpośrednia dystorsja światła, przechodzącego przez wszczep, albo wrastanie tkanki do wszczepu, powodujące zaćmienie widzenia.

Stwierdzono nieoczekiwanie, że przepływ płynnych składników tkanki o dużej masie cząsteczkowej takich, jak białka i glikoproteidy (np. czynniki wzrostu, hormony peptydowe i białkowe oraz białka transportujące niezbędne metale) itp., przez wszczep rogówkowy, tj. od komórek nabłonkowych do komórek zrębu, a nawet do warstwy śródbłonkowej i poza nią, jest podstawą długotrwałości zachowania żywotności tkanki otaczającej z przodu i z tyłu wszczep rogówkowy. W kontekście wszczepów wewnątrz nabłonka rogówkowego, z którego usuwa się pewną powierzchnię komórek nabłonkowych i wprowadza wszczep albo do pozostałego nabłonka, albo na błonę podstawną, decydujący jest przepływ płynnych składników tkanki, niezbędny dla pełnego istotnego pokrycia wszczepu przylegającymi do niego komórkami nabłonkowymi. Obejmuje to płynne składniki tkanki, przepływające od tkanki zrębu poniżej wszczepu w kierunku tkanki na przedniej powierzchni (a zwłaszcza tkanki nabłonkowej) podczas procesu początkowego pokrywania tej przedniej powierzchni komórkami nabłonkowymi oraz przepływ składników białkowych z tych komórek nabłonkowych do tkanki zrębu i niżej.

Stwierdzono obecnie, że znane wszczepy rogówkowe uniemożliwiają przenikanie białek i glikoproteidów o dużej masie cząsteczkowej (np. o masie cząsteczkowej sięgającej 10 000 daltonów i wyższej, a nawet sięgającej 200 000 daltonów i wyższej) i ujemnie wpływają na tworzenie warstwy nabłonkowej ponad przednią powierzchnią wszczepów soczewek wprowadzonych do nabłonkowej warstwy rogówki. Podobnie tkanka z tyłu wszczepu rogówkowego doznaje degeneracji zrębu, co - jak się przypuszcza - wynika z niezdolności przenikania składników białkowych z tkanki nabłonkowej do tkanki zrębu.

Niniejszy wynalazek dotyczy zwłaszcza wszczepów umieszczanych poniżej, w obrębie lub na całej powierzchni tkanki nabłonkowej, albo wewnątrz zrębu rogówkowego lub innej warstwy tkankowej rogówki. Dla uproszczenia wszystkie takie wszczepy będą nazywane dalej nakładkami rogówkowymi.

Nakładka rogówkowa, mająca strefę osi optycznej z charakterystyką optyczną, uformowana z nieulegającego biodegradacji, niehydrożelowego materiału biologicznie tolerowanego przez oczy, przy czym nakładka ta jest porowata, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że ma pory o średnicy od 15 nanometrów do 0,5 mikrometra.

Korzystnie, nakładka ma pory o średnicy od 15 nanometrów do 300 nanometrów.

Bardziej korzystnie, nakładka ma pory o średnicy od 20 do 150 nanometrów.

Nakładki rogówkowe według wynalazku, stosowane przy chirurgicznym wszczepianiu do rogówki lub na rogówkę ssaków, posiadające okolicę osi optycznej o takiej charakterystyce optycznej, która zapewnia ostrość widzenia przez nie, są zbudowane ze zgodnego z biologią oka, niehydrożelowego materiału, nieulegającego biodegradacji. Nakładki te wykazują porowatość dostateczną· dla umożliwienia przenikania przez nie płynnych składników tkanki o masie cząsteczkowej większej od 10 000 daltonów, dzięki czemu zapewniają przepływ płynu tkankowego między komórkami, znajdującymi się z przodu wszczepianej nakładki i komórkami, znajdującymi się z jej tyłu. Porowatość okolicy osi optycznej jest taka, że umożliwia przepływ płynnych składników tkanki, chociaż wyklucza wzrastanie tkanki ocznej. Nakładki te są przystosowane do rekolonizacji nabłonka.

177 096

Za pomocą nakładek rogówkowych według wynalazku, opisanych powyżej i stosowanych przy chirurgicznym wszczepianiu do rogówki lub na rogówkę ssaków, dokonuje się korekcji optycznych własności oka lub zmiany jego wyglądu.

T a nakładka rogówkowa może wykazywać taką samą ostrość widzenia w całych swoich wymiarach, podobnie jak konwencjonalne soczewki kontaktowe. Jednakże ostrości widzenia wymaga się jedynie od tej części nakładki, która pokrywa źrenicę, zwanej dalej okolicą osi optycznej, toteż korzystne jest otrzymywanie nakładek rogówkowych z okolicą osi optycznej, wykazującą porowatość dostateczną dla umożliwienia przenikania przez tę okolicę płynnych składników tkanki o masie cząsteczkowej sięgającej lub przekraczającej 10 000 daltonów, ale z wykluczeniem wrastania tkanki ocznej. W tej sytuacji obwód nakładki, otaczający okolicę osi optycznej, może oznaczać obrzeże o porowatości dostatecznej dla umożliwienia wzrastania tkanki ocznej, aby ułatwić zamocowanie nakładki przy rogówce.

Porowatość nakładki rogówkowej w okolicy osi optycznej oka umożliwia przepływ przez nakładkę płynnych składników tkanki, zawierających białko o dużej masie cząsteczkowej, a także substancji odżywczych o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak glukoza i gazy oddechowe. Porowatość tej nakładki umożliwia białkom o masie cząsteczkowej, wynoszącej od kilku tysięcy daltonów aż do kilkuset tysięcy daltonów lub wyższej, swobodne przenikanie przez warstwy rogówki, jak to opisano wcześniej. Jest to przenikanie składników białkowych o dużej masie cząsteczkowej takich, jak czynniki wzrostu, hormony, białka sygnalizacyjne, cząsteczkowe przekaźniki oraz białka transportowe, jak np. transferryna, przenosząca podstawowe jony metali, które zapewniają przetrwanie, integralność i dobry stan tkanek z tyłu i z przodu wszczepianej nakładki rogówkowej. Doświadczenia wykazują, że przenikanie białek i innych składników o masie cząsteczkowej wynoszącej co najmniej 10 000 daltonówjest podstawią zachowania i integralności tkanki. Shwendzając to,uważamy za oczywiste, że przenikanie białkowych i innych składników o masach cząsteczkowych poniżej 10 000 daltonówjest również ważne, a zatem wynalazek obejmuje przenikanie przez nakładkę rogówkową substancji odżywczych, gazów metabolicznych, a zwłaszcza białek, węglowodorów i lipidów o masach cząsteczkowych sięgających 300 000 daltonów lub wyższej, np 500 000 daltonów, lub nawet 1000 000 daltonów.

Opisane tutaj nakładki rogówkowe nadają się do chirurgicznego przyłączania oraz, korzystnie, do umocowywania do żywej rogówki tak, aby zmienićjej własności optyczne (np. defekty prawidłowego widzenia oka), lub zmienić wygląd oka, np. zabarwienie źrenicy.

Porowatość nakładki rogówkowej można zapewnić dzięki właściwościom materiału, z którego wytwarza się tę nakładkę, tj. dzięki swoistej porowatości tego materiału. Alternatywnie pory można wytworzyć w materiale, z którego buduje się nakładkę, różnymi sposobami dobrze znanymi ze stanu techniki, jak np. opisanymi w publikacjach WO 90/07575, WO 91/07687 oraz w opisach patentowych USA nr nr 5 244 799, 5 238 613, 4 799 931 i 5 213 721.

Pory można wytworzyć po wykonaniu kształtki nakładki (jak np. przez odlewanie polimeru) albo w masie materiału przed uformowaniem kształtu nakładki. Taki sposób postępowania może obejmować; zastosowanie iskier lub laserów do wypalania otworków biegnących przez nakładkę lub materiał nakładki, przy czym pory można wytwarzać w konwencjonalny sposób przez zastosowanie laserów ekscymerowych, np. laserów typu impulsowego sterowanych mikroprocesorem, jak to opisano np. w publikacji WO 91/07687; powtarzalne wyciąganie materiału polimerycznego, ujawnione w opisie patentowym USA nr 5 213 721; procesy formowania wielofazowego, a następnie polimeryzację łańcuchową ujawnione w opisie patentowym USA nr 5 238 613.

Alternatywnie porowatość można uzyskać przez sieć wzajemnie przenikających się otworków w całym materiale nakładki, otrzymanym np. przez polimeryzację w obecności nierozpuszczalnej substancji. Późniejsze usunięcie tej nierozpuszczalnej substancji powoduje powstawanie szpar w całym ukształtowanym materiale polimerycznym.

Niezależnie od sposobów wytwarzania wymaganej porowatości nakładek według wynalazku, takie nakładki muszą wykazywać porowatość wystarczającą do przepuszczem 096 nia białek o masie cząsteczkowej sięgającej 10 000 daltonów i wyższej, np. od 10 000 do 1 000 000 daltonów, ale nie wystarczającą do przepuszczenia komórek, a przez to do umożliwienia inwazji tkanki w okolicy osi optycznej nakładki rogówkowej. Jeśli porowatość nakładki zapewniają pory, to okolica osi optycznej zawiera liczne pory, których liczba nie jest w żaden sposób ograniczona w niniejszym wynalazku, ale wystarcza do umożliwienia przepływu składników tkanki z przedniej do tylnej okolicy wszczepionej nakładki. Jedynie przykładowo można podać, że liczba porów otrzymanych w nakładce może wynosić od 200 porów na milimetr kwadratowy do 300 000 porów na milimetr kwadratowy lub więcej.

Pory wytworzone w obrębie okolicy osi optycznej mają średnicę od 15 nanometrów do 0,5 mikrometra. Pory o takich wymiarach, występujące w okolicy osi optycznej, nie powodują załamania światła widzialnego w takim stopniu, który stwarzałby problem korekcji wzroku. Korzystnie, pory w okolicy osi optycznej mają średnicę od 15 do 300 nanometrów, a jeszcze korzystniej - od 20 do 150 nanometrów. Należy rozumieć, że termin pory nie stawia żadnych ograniczeń geometrycznych w odniesieniu do charakterystyki tych porów, które mogą mieć morfologię regularną lub nieregularną. W tym kontekście termin średnia szerokość może być bardziej korzystny od terminu średnica. W zakresie wyżej wymienionych średnic należy uznać, że nie wszystkie pory muszą mieć taką samą średnicę, lecz mogą różnić się nią w podanym zakresie.

Poza okolicą osi optycznej nakładki mogą mieć taką samą porowatość, jak w okolicy osi optycznej, tj. umożliwiającą przenikanie przez nakładkę substancji odżywczych o niskiej masie cząsteczkowej, gazów oddechowych oraz białkowych i innych składników płynu tkankowego, mających masę cząsteczkową sięgającą 10 000 daltonów lub wyższą (np. sięgających 1 000 000 daltonów lub powyżej), jeśli ich porowatość wyraźnie wyklucza wrastanie tkanki. Alternatywnie ta okolica nakładki, otaczająca obwód okolicy osi optycznej, którą można nazwać obrzeżem, może pozwalać na wrastanie komórek rogówki, pomagając w ten sposób w umocowaniu nakładki na oku.

W tym rozwiązaniu obrzeże może zawierać liczne pory o średnicy 20 mikrometrów lub większej, korzystnie od 50 mikrometrów do 1000 mikrometrów, bardziej korzystnie od 50 do 500 mikrometrów, a jeszcze korzystniej od 50 do 300 mikrometrów. Pory można wytwarzać w obrzeżu w. ten sam sposób, jak opisany wyżej dla wytwarzania porów w okolicy osi optycznej nakładki.

Porowatość obrzeża może stanowić naturalna właściwość materiału, z którego wykonuje się to obrzeże. Pod tym względem należy zdawać sobie sprawę, że obrzeże można wykonywać z tego samego materiału, co okolicę osi optycznej i że może ono stanowić integralną całość z tą okolicą. W tym przypadku można wywarzać pory o zróżnicowanej średnicy w okolicy osi optycznej i w obrzeżu. Alternatywnie, obrzeże można wykonywać odrębnym sposobem, odmiennym od sposobu wytwarzania okolicy osi optycznej (np. przez polimeryzację w obecności substancji nierozpuszczalnej, jak np. glukozy, którą następnie usuwa się ze spolimeryzowanej macierzy przez rozpuszczanie, otrzymując silnie porowatą, wzajemnie przenikającą się sieć), dzięki czemu obrzeże to, chociaż wykonane z tego samego materiału, co okolica osi optycznej, wykazuje jednak znacznie większą porowatość, umożliwiając tym samym wrastanie tkanki. W jeszcze innym rozwiązaniu obrzeże można wykonywać z materiału różnego od materiału okolicy osi optycznej, wykazującego większą porowatość niż okolica osi optycznej tak, aby umożliwić wrastanie tkanki. Obrzeże to można wytwarzać w taki sposób, aby otrzymać wysoką porowatość np. przez wytwarzanie spójnej masy włókien ciągnionych przy topieniu o wewnętrznie powiązanej sieci porów, np. włókien wykonanych z materiałów poliolefinowych, które stosuje się do wytwarzania okolicy osi optycznej. Obrzeże to można wykonywać np. z silnie porowatych materiałów ceramicznych, które spaja się z okolicą osi optycznej, np. przez spajanie rozpuszczalnikiem, zgrzewanie lub zastosowanie klejów. Silnie porowate materiały ceramiczne, które ułatwiają wrastanie tkanki, są dobrze znane (patrz np. J. Biomed. Mater. Res. Symp. nr 4, str. 1-23,1973).

Nakładki rogówkowe można wykonywać z dowolnego znanego, naturalnego lub syntetycznego materiału polimerycznego o wymaganych własnościach mechanicznych, jak

ΠΊ ®96 np. z polimerów i kopolimerów z grup powszechnie znanych jako materiały akrylowe, poliolefinowe, fluoropolimeryczne, silikonowe, styrenowe, winylowe, poliestrowe, poliuretanowe, poliwęglanowe, celulozowe lub białkowe, np. materiały bazujące na kolagenie. Wyraźnie wyklucza się hydrożelowe kompozycje polimeryczne z uwagi na ich skłonności do kurczenia się, brak porowatości dla substancji o dużej masie cząsteczkowej oraz słabe zdolności do przyczepiania komórek.

Jeśli do wytwarzania nakładek rogówkowych stosuje się mieszaniny materiałów polimerycznych, to można te materiały kopolimeryzować metodami dobrze znanymi ze stanu techniki, w celu otrzymania sieci polimerycznych. Wspomniano wyżej, że obrzeża można wytwarzać z innych polimerów lub z innych materiałów niż okolica osi optycznej, aby umożliwić wrastanie tkanki, co zależy od zwiększonej porowatości. Okolice obrzeża można wytwarzać z jednego lub więcej niż jednego spośród wyżej wymienionych polimerów, materiałów ceramicznych lub dowolnych innych biologicznie tolerowanych, nie ulegających biodegradacji materiałów, z porami o średnicy większej niż około 20 mikrometrów, aby umożliwiały wrastanie tkanki.

Nakładki rogówkowe według niniejszego wynalazku można wytwarzać standardowymi metodami otrzymywania nakładek rogówkowych, które są dobrze znane ze stanu techniki. Oczywiście szczegółowe metody, stosowane przy polimeryzacji polimerów, kopolimerów, ich mieszanin, przy otrzymywaniu materiałów ceramicznych oraz przy łączeniu okolicy osi optycznej z obrzeżem w razie takiej potrzeby, zależą od rodzaju użytych materiałów, przy czym dla poszczególnych materiałów przystosowuje się odpowiednie metodologie według konwencjonalnych sposobów postępowania.

Nakładki rogówkowe można kształtować podczas lub pod koniec procesu produkcji zwykłymi metodami frezowania, polerowania i/lub strugania, które są dobrze znane w dziedzinie produkcji protez rogówkowych. Przykładowo, nakładki rogówkowe, otrzymywane przez polimeryzację, kształtuje się albo przez odlewanie podczas polimeryzacji, albo przez obróbkę tokarską wstępnie uformowanej kształtki. Alternatywnie, można najpierw ukształtować okolicę osi optycznej, np. albo przez odlewanie, albo przez obróbkę toczeniem wstępnie uformowanej kształtki, a następnie przymocować obrzeże do obwodu okolicy osi optycznej wokoło tej okolicy. Inaczej można też przymocować okolicę osi optycznej do zewnętrznego porowatego obrzeża np. przez zamoczenie tego obrzeża w acetonie i sprasowanie obydwu części razem. Jeszcze inaczej można zastosować optycznie tolerowany klej dla połączenia materiałów ze sobą, wykorzystując ogrzewanie, np. wytwarzane przez laser impulsowy. Obrzeże można najpierw ukształtować z pierścieniowymi otworkami, a następnie wewnątrz niego ukształtować oś optyczną albo przez polimeryzację, albo przez umocowanie wstępnie uformowanej kształtki.

Nakładkę lub jej część można zabarwićjednym lub więcej niżjednym pigmentem bądź barwnikiem, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Zabarwienie nakładki, a zwłaszcza barwienie wokół pola nad źrenicą, zmienia barwę oka po wszczepieniu.

Nakładki rogówkowe według wynalazku są przystosowane do rekolonizacji nabłonka. Oznacza to, że substancja polimeryczna, z której kształtuje się nakładkę, nie powstrzymuje przyczepiania się komórek ani ich ruchliwości. Ponadto poszczególne powierzchnie nakładki można modyfikować, jak to opisuje się dalej, w celu ułatwienia przyczepiania się komórek.

Zewnętrzną tylną i przednią powierzchnię nakładki rogówkowej można modyfikować przez zastosowanie polimeru, zawierającego doczepione grupy, które można przekształcić w czynne grupy funkcyjne, zdolne następnie do kowalencyjnego wiązania z powierzchnią nakładki. Przykładowo, kompozycja modyfikująca powierzchnię może zawierać poliaminokwas, jak np. polilizynę, w której np. około 10% molowych doczepionych grup można przekształcić w nitrenowe grupy funkcyjne.

Tak zmodyfikowana powierzchnia może sama z siebie pobudzać przyczepianie się komórek sąsiadujących z wszczepioną nakładką, jak np. komórek nabłonkowych albo komórek zrębu. W innym rozwiązaniu zmodyfikowaną powierzchnię można pokryćjednym lub więcej niż jednym składnikiem, który pobudza wzrost tkanki sąsiadującej z wszczepioną

177 096 nakładką. Takie substancje obejmują np. fibronektynę, lamininę, siarczan chondroityny, kolagen, białka mocujące komórki, czynnik przeciwżelatynowy, globulinę nierozpuszczalną na zimno, chondronektynę, czynnik wzrostu naskórka, białko kleiste, trombospondynę, witronektynę oraz różne proteoglikany i/lub pochodne wyżej wymienionych substancji oraz ich mieszaniny. Fibronektyna, pochodne fibronektyny, czynnik wzrostu naskórka, pochodne czynnika wzrostu naskórka oraz ich mieszaniny są szczególnie korzystne. W jeszcze innym rozwiązaniu samą nakładkę rogówkową, bez modyfikacji jej powierzchni, można bezpośrednio pokrywać jednym lub więcej niż jednym składnikiem, który pobudza wzrost tkanki sąsiadującej z wszczepioną nakładką i/lub przyczepność komórek do tej tkanki. Składnikami tymi mogą być dowolne składniki (jeden lub więcej niż jeden), które zapewniają przyczepność komórek i/lub pobudzają wzrost komórek, jak np. czynniki wzrostu lub czynniki zapewniające przyczepność. Korzystnymi substancjami są te, które wyszczególniono w związku z zastosowaniami w nakładkach rogówkowych o modyfikowanej powierzchni. Pokrywające składniki, które pobudzają wzrost tkanki sąsiadującej z wszczepioną nakładką, korzystnie są związane kowalencyjnie z tą nakładką, nie wpływając na jej optyczne własności. W wyniku modyfikacji powierzchni albo też dzięki swoistym własnościom nakładki, nakładka według wynalazku jest przystosowana do rekolonizacji przez nabłonek.

Opisane nakładki rogówkowe według wynalazku są odmienne od znanych; mają one nad znanymi tę przewagę, że zapewniają skuteczny przepływ płynnych składników tkanki o dużej masie cząsteczkowej do przedniej powierzchni z tkanki poniżej wszczepu, co służy do utrzymywania i pobudzania pokrywania tej przedniej powierzchni wszczepu nabłonkowymi komórkami rogówki dzięki procesom migracji z sąsiedniej tkanki i nawarstwiania, oraz do utrzymywania przy życiu tkanki nabłonkowej, która pokrywa wszczep, albo - co więcej każdej innej tkanki pokrywającej wszczep. Zapewniona jest sygnalizacja przezrogówkowa, np. w początkowym okresie po wszczepieniu, jak np. podczas pokrywania wszczepu nabłonkiem, a ponadto porowatość wszczepu umożliwia podawanie związków leczniczych na przednią powierzchnię wszczepu.

Wszczep rogówkowy według wynalazku można wprowadzać do oka zgodnie ze sposobem postępowania ustalonym dla wycinania rogówki, dobrze znanym w tej dziedzinie.

Przedmiot wynalazku jest dokładnie wyjaśniony w przykładach i w oparciu o rysunki, których omówienie zostało podane poniżej.

Figura 1: przedstawia histogram, który obrazuje procenty (%) zwierząt z owrzodzeniem rogówki dla poszczególnych wymiarów porów w błonie. Kolumna A reprezentuje materiały błony Cuprophan/Gambrane.

Figura 2: przedstawia histogram, który obrazuje procenty (%) zwierząt ze ścieńczeniem nabłonka i przedniego zrębu dla poszczególnych wymiarów porów w błonie. Kolumna A reprezentuje materiały błony Cuprophan/Gambrane.

Figura 3: przedstawia histogram, który pokazuje przyczepność nabłonkowych komórek rogówki wołowej do polistyrenu z hodowlą tkankową (TCPS) we frakcjonowanym płynie surowiczym po dwudziestu czterech godzinach. Oś iksów przedstawia środowisko. Oś igreków przedstawia procenty liczby komórek w stosunku do kontrolnych, gdzie kontrolne = DD/Fn w dniu 6 przyjęto za 100%. DD oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego z dodatkiem 20% objętościowych płynu surowiczego pozbawionego fibronektyny i witronektyny; 100k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych frakcji 1, zawierającej czynniki surowicze o wymiarach od 1000 do 100000 dalton; 30k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych czynników surowiczych o wymiarach od 1000 do 30000 dalton; 10k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych czynników surowiczych o wymiarach od 1000 do 10000 dalton; 100+30+10 k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych czynników surowiczych o wymiarach od 1000 do 100000 dalton; DD oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego + 20% objętościowych płynu surowiczego pozbawionego fibronektyny o witronektyny (nie frakcjonowanego według

177 096 wymiarów); SFM oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego; oraz Fn oznacza, że polistyrenową powierzchnię hodowli tkanki pokrywa się uprzednio fibronektyną.

Figura 4: przedstawia histogram, który pokazuje narastanie nabłonkowych komórek rogówki na polistyrenie z hodowlą tkankową (TCPS) we frakcjonowanym płynie surowiczym po sześciu dniach hodowli. Oś iksów reprezentuje środowisko. Oś igreków reprezentuje procenty liczby komórek 24 godz/5 (kontrola w 6 dniu); narastanie komórek 6 dni/24 godz. (gdzie zakreskowana część kolumny reprezentuje narastanie, a czarne kwadraty oznaczają liczbę komórek). DD oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego + 20% objętościowych płynu surowiczego pozbawionego fibronektyny i witronektyny (nie frakcjonowanego według wymiarów); 100k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych frakcji 1, zawierającej czynniki surowicze o wymiarach od 1000 do 100000 dalton; 30k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych czynników surowiczych o wymiarach od 1000 do 30000 dalton; 10k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych czynników surowiczych o wymiarach od 1000 do 10000 dalton; 100+30+10 k oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego, do którego dodaje się 20% objętościowych czynników surowiczych o wymiarach od 1000 do 100000 dalton; SFM oznacza środowisko hodowli bez płynu surowiczego; oraz Fn oznacza, że polistyrenową powierzchnię hodowli tkanki pokrywa się uprzednio fibronektyną.

Przykład I. Przenikanie makrocząsteczek przez rogówkę jest podstawą zachowania normalnej struktury i integralności rogówki

Błony o różnych wymiarach porów wszczepia się kotom do oczu w celu określenia skutków ułatwienia lub zahamowania przepływu płynnych składników tkanki o dużej masie cząsteczkowej przez rogówkę, zarówno z tyłu, jak i wewnątrz wszczepu rogówkowego.

W pierwszym doświadczeniu do rogówki kotów wszczepia się błony, stosowane w dializie, o wymiarach porów 1,4 nanometra. Błony te pozwalają na przenikanie glukozy, aminokwasów, wody i gazów oddechowych, ale blokują przenikanie składników o masie cząsteczkowej większej od 10000 dalton. Po okresie próby, trwającym cztery tygodnie, zarówno nabłonki, jak i zręby rogówki badanych zwierząt utraciły integralność. Doświadczenie to wykazuje, że składniki tkanki o masie cząsteczkowej większej niż 10000 dalton, a mianowicie białka i glikoproteidy, stanowią podstawę integralności rogówki.

Do bardziej szczegółowych badań używa się cztery dorosłe koty.

A. Podstawowe pomiary

Wykonuje się podstawowe badania integralności rogówki, w tym badanie w lampie szczelinowej. Ocenia się szczegółowo przezroczystość rogówki, przekrwienie i penetrację naczyń, charakterystykę powierzchni, zmętnienie itd.

B. Program doświadczalny

W badaniach stosuje się dwa rodzaje błon - Nuclepore Filter (poliwęglanową) oraz błonę do dializy (poliwęglan/PEG) (tabela 1). Przed wszczepieniem błony te trepanuje się do średnicy 12 mm. Błona stosowana u kota nr 2 ma na obwodzie otworki o wymiarach od 20 do 30 mikrometrów, wykonane laserem. Błonę Nuclepore Filters przeciera się przyrządem do czyszczenia soczewek kontaktowych Miraflow, a następnie opłukuje i sterylizuje w sterylizatorze parowym pod ciśnieniem w sterylnym izotonicznym środowisku solankowym.

Błonę do dializy opłukuje się i sterylizuje w sterylizatorze parowym pod ciśnieniem w sterylnym izotonicznym środowisku solankowym po perforowaniu laserowym.

177 096

Tabela 1

Błony i dane chirurgiczne

Kot nr	Wszczepione oko	Rodzaj błony	Wymiar porów błony (jm)	Przeciwstronne oko kontrolne (tak/nie?)
1	Lewe oko	Poliwęglanowa	0,05	Nie
2	Lewe oko	Poliwęglan/PEG	nieperforowana <0,0014 Perforacje: 20-30	Nie
3	Prawe oko	Poliwęglanowa	0,05	Tak
4	Lewe oko	Poliwęglanowa	0,1	Tak

C. Postępowanie chirurgiczne

1. Koty znieczula się do głębokości 3 fazy - poziom 2.

2. Diamentowym nożem wykonuje się 6 mm nacięcia dokładnie wewnątrz górnego rąbka.

3. Prosektorem rogówkowym z kształtowaną krawędzią formuje się blaszkowatą kieszeń o średnicy od 14 mm do 15 mm.

4. Kleszczykami z końcówkami z tworzywa sztucznego wprowadza się do tej kieszeni błonę o średnicy 12 mm.

5. W przypadku kotów nr 1 i nr 2 nacięcie zamyka się mononylonem od 9 do 0. W przypadku kotów nr 3 i nr 4 cięcie zamyka się jedwabiem od 8 do 0.

D. Badania kontrolne

Oczy bada się codziennie aż do wystąpienia objawów klinicznych uzasadniają cych eksterminację (tabela 2).

Tabela 2 Okres katamnezy

Kot nr	Liczba dni przed eksterminaq'ą
1	23
2	28
3	16
4	zachowany

Eutanazji kotów dokonywano przez dożylne przedawkowanie pentobarbitalu sodowego do 140 mg/kg masy ciała.

E. Histologia

Oczy zwierząt usuwa się zaraz po eutanazji. Podczas wyłuszczania do obydwojga oczu zakrapia się środek utrwalający (2,5% aldehyd glutarowy w 0,1 M trójwodzianie kakodylanu sodowego, 2 mM chlorek wapnia, pH doprowadzony do 7,2 z zastosowaniem 1 M HCl, w 25°C) z częstością zapewniającą utrzymanie przedniej powierzchni rogówki w stanie zwilżenia. Natychmiast po uśmierceniu do przedniej komory każdego oka wstrzykuje się 0,3 cm³ środka utrwalającego w celu utrwalenia tylnej powierzchni rogówki.

Rogówki oddziela się od reszty oka i zanurza do środka utrwalającego na sześćdziesiąt godzin w 4°C. Z każdej rogówki wycina się dwa paski o szerokości 1 mm; jeden od obwodu do środka wzdłuż osi góra-dół; drugi od obwodu do środka wzdłuż osi nosowo-skroniowej.

Wyniki

Tabele 3 i 4 przedstawiają skrót programu badań oraz ich wyników.

1. Obserwacće kllmczne.

Kliniczny obraz błon, tj. położenie i rozmiar tych błon, nie zmienia się w okresie obserwacji.

177 096

Odkładanie się złogów, obrzęki i neowaskularyzacja są wyraźniejsze w badanych oczach z implantami w porównaniu z oczami kontrolnymi, do których nie wszczepiono błon. Reakcje te zachodzą z przodu połączenia błona/kieszeń.

W oczach z implantami odkładanie się złogów obserwuje się z przodu błony, zwłaszcza w dolnej okolicy kieszeni, w dwa do trzech dni po zabiegu chirurgicznym.

W przypadku oczu kontrolnych odkładanie się złogów jest głównie zlokalizowane w środkowej okolicy kieszeni i okazuje się być mniej intensywne od obserwowanego w oczach z implantami. Odkładanie się złogów wygląda podobnie jak w oczach z implantami, ale nie rozwija się do takiego samego stopnia.

Neowaskularyzacja rogówki zaczyna się od miejsca nacięcia i sięga w głąb do zrębu otaczającego wszczepioną błonę u wszystkich kotów. Neowaskularyzacja rogówki cofała się jednak w jednym oku w czasie badania (kot nr 4). Obserwowana neowaskularyzacja jest raczej powikłaniem zabiegu chirurgicznego, niż wzrostem naczyń, spowodowanym brakiem substancji odżywczych.

Odkładanie się złogów oraz obrzęki w przedniej części zrębu obserwuje się u kotów nr 1, nr 3 i nr 4 przez cały okres obserwacji.

Odkładanie złogów, obrzęki i neowaskularyzację w przedniej części zrębu obserwuje się w okolicy otaczającej nieperforowaną część wszczepionej błony poliwęglan/PEG. Jednakże obrzęków ani neowaskularyzacji nie obserwuje się w obszarze sąsiadującym z okolicą perforowaną.

W żadnym oku z implantem nie obserwuje się klinicznie wykrywalnych zmian zrębu z tyłu błony lub śródnabłonka.

2. Obserwacje histologiczne

Nabłonek nad wszczepioną błoną ma mniejszą grubość i liczbę warstw komórek, w porównaniu z kontrolną rogówką (nieoperowaną i operowaną) odpowiednio u kotów nr 1 i nr 3.

Komórki nabłonkowe we wszystkich oczach z implantami zmieniają się w pewnym stopniu pod względem morfologicznym, co przejawia się wzrostem ilości barwnika w przestrzeni pozakomórkowej, większą zawartością ziarnistości w jądrach oraz słabiej widoczną cytoplazmą.

U kotów nr 2 i nr 3 zaobserwowano cechy reakcji zapalnej w rogówce przed i za błoną. Przejawia się ona obrzękami keratocytów, okrągłymi i ciemno zabarwionymi komórkami, prawdopodobnie granulocytów obojętnochłonnych, oraz neowaskularyzacją w zrębie za błoną.

Istnieje ścisły związek między zmianami komórkowymi i wszczepioną błoną u kota nr 2. Świadczą o tym następujące zjawiska:

- gęstość keratocytów szybko wrasta przy zbliżaniu się do błony;

- występuje zwiększona liczba małych, okrągłych, ciemno zabarwionych komórek (być może granulocytów obojętnochłonnych) w nabłonku pokrywającym błonę oraz w zrębie z przodu i z tyłu tej błony;

- w obszarach nad nieperforowanymi fragmentami błony obserwuje się rozpad błony Bowmana;

- w sąsiedztwie styku zrąb/błona obserwuje się obecność substancji ziarnistej; u kota nr 2 w przedniej okolicy styku zrąb/błona warstwa substancji ziarnistej jest grubsza niż w tylnej okolicy błony;

- morfologiczne zmiany w składnikach komórek nabłonka są bardziej wyraźne w obszarach nad nieperforowaną okolicą błony, niż nad okolicą perforowaną.

Śródbłonek wygląda na nie uszkodzony i ciągły we wszystkich oczach z implantami.

U kota nr 3 w oku z implantem obserwuje się nacisk komórek keratocytopodobnych między błoną Descemeta i przednią powierzchnią komórek śródbłonkowych. Obserwuje się także niewielką ilość czerwonych krwinek, przylegających do tylnej powierzchni śródbłonka. Zmian tych nie obserwuje się w oku kontrolnym.

177 096

Pokazano wyżej, że wszczepy, które uniemożliwiają przepływ białkowych składników tkanki o dużej masie cząsteczkowej przez rogówkę, powodują degenerację zrębu i rozpad błony Bowmana oraz utratę integralności nabłonka rogówki.

eo σ3

O

X ίβ ca x>

ε

I §

(Λ

Przyczyna eksterminacji		Martwica tkanki, obrzęk, neowaskularyzacja	Neowaskularyzacja, obrzęk					Martwica wewnątrz zrębowa
Liczba dni przed eksterminacją	co CM	co CM			Zachowany	Zachowany	oo CM	OO 04
Rozmiar porów błony dyn)	t	0,05	1 0,05 i...	1	r	°·1 - J		o <1,4 mm w okolicy nieperforowanej o zmienne: 20-30 w okolicy perforowanej
Rodzaj błony	1	Poliwęglan	Poliwęglan	1	1	Poliwęglan		Poliwęglan/PEG
Błona (Tak/Nie)	Nie	Tak	Tak i	Nie	Nie	Tak j	Nie	Tak i
Głębokość kieszeni	1	1/2 zrębu	2/3 zrębu	2/3 zrębu	1/2 zrębu	1/2 zrębu j	1	1/3 zrębu
Kieszeń (Tak/Nie)	Nie	Tak	Tak	Tak	Tak	Tak )	Nie	Tak
Oko (P/L)	Pl.	J	PL,		PL.		PL,
Kot nr	1—4	CO			CM

177 096 <υ χ>

λ

Η ^4 ο

C

Ο

Ό

Ο

Uo <D

S ο

δ| ο

£

Ο ο

(β £

cel α

ο

Ν i

-¾

Ν ί>Ί α

•έ i Ε .2 (,λ Sgo :=ς 0 4?

c B”S £ 8 &

_ο Ο Ο

2on« f§|i * *·Κ2 έχ5 '3 ΛΊ2 -α Η c -g ω . .·> C ΰ'ν'Ε'Ο £ t>,s ε >.

Η

E?

ε jjN

Ο *

. ο &*·£ ϊ/3 Ό § ε

X ο

Ofe ¹ α ο ce- ο

W §>3-0 g fr-~ -S-gcS

Ο β) 4> ΰ C ο ο-2 ο ^-eoa ^“1

C ce α

£·§ 8-ε £

ce ο

Ζ εό . - ο «ή §* ^s 8 « >> C •S-&2 §ξ

8--³ £·«>>:

ο ΰ «3 CU Ź Ο Ν >» «Λ

Β ’μι.

¹ 2 ,^,ο

1+ >>

c

CO - ce ‘Sb j? c o o α> « « N ^N- « 23 - ω.2 « gJ2

Jo 8 &° &> N £-5

a «§£ g

JO t> CQ O O

O’2E33 _ci S? 73

-o ?->

* as gS feg

S¹ °

- e?

e § .23 ? >, o & o. g ·-, °4? _V <s će* x>'S a‘.H ί> c o.

4)

J2 .2

1-3 % ce

J ε

.5-S

AON >> I ou e? « o &,¹ ce.2 ϊξ3 2 -S § .2 -° ¢3 cJ N μ c<J g ·

g. „o <x c ^VO fi N £

C o H 2 2 2 o

Śłi

X>-i4·.

O αί’Ξ E? <P υ r a g>₅

5t .3*·* a-c-f o

-2 N 75 u

C

O

O £ & o

-*K

N X>

CM

177 096

Przykład II: Porowatość nakładki niezbędna do zachowania dobrego stanu nabłonka i zrębu

W przykładzie tym chirurgicznie wprowadza się do oczu dorosłych kotów (n=50) nakładki o różnej porowatości. Żaden z kotów nie ma schorzeń ocznych ani układowych. Szczegóły i charakterystykę błon stosowanych w tych badaniach przedstawia tabela 5.

Tabela 5

Materiały i charakterystyka błon

Nazwa	Materiały	Wymiar porów (nm)	Porowatość (przybliżona w %)	Średnica (mm)
Cuprophan	Regenerowana celuloza	<15		10
Gambrane	Poliwęglan/P	1,4		12 i 8
Poretics	Poliwęglan	25	1,50	8
Nucleopore	Poliwęglan	100	2,36	12 i 8
50 .	1,20	12 i 8
15	0,10	8

Przed wszczepianiem błony trepanuje się do średnicy 12 mm, 10 mm lub 8 mm. Postępowanie chirurgiczne oraz badania kontrolne prowadzi się według przykładu 1.

Liczby zwierząt, u których dokonuje się wszczepów poszczególnych błon, przedstawia tabela 6.

Tabela 6

Podsumowanie stanu zwierząt dla błony każdego rodzaju

Liczba	Cuprophan	Gambrane	Porectics 25 nm	Nucleopore
				100 nm	50 nm	50 nm
Ogółem z wszczepami	2	3	8	15	16	6

W zebranych licznych obserwacjach klinicznych oraz danych histologicznych najlepszymi danymi dla oceny stanu nabłonka i zrębu w następstwie wprowadzenia błony nakładkowej są: owrzodzenie rogówki oraz ścieńczenie nabłonka i zrębu nad wszczepem.

Figura 1 pokazuje histogram, który przedstawia procenty zwierząt z wrzodami rogówki w każdej grupie z implantami. Czterdzieści trzy procent zwierząt z wszczepioną błoną o porowatości 25 nm wykazuje owrzodzenie rogówki. Osiemdziesiąt procent zwierząt z wszczepioną błoną o wymiarach porów 15 nm przejawia owrzodzenie rogówki. W rzeczywistości takie same wyniki obserwuje się w przypadku błon z cuprophanu i gambranu o wymiarach porów mniejszych niż 1,5 nm. Owrzodzeń nie obserwuje się u zwierząt z wszczepionymi błonami o wymiarach porów 50 nm i 100 nm.

Figura 2 pokazuje histogram, który przedstawia procent zwierząt ze ścieńczeniem nabłonka i zrębu nad wszczepem w następstwie wszczepiania do oczu błon o różnych wymiarach porów. Figura 2 wyraźnie wskazuje, że ze zmniejszeniem wymiarów porów wszczepianych błon wzrasta liczba zwierząt ze ścieńczeniem nabłonka i zrębu nad wszczepem. Wszystkie zwierzęta z wszczepionymi błonami o wymiarach porów wynoszących 15 nm lub mniej wykazują ścieńczenie nabłonka zrębu nad wszczepem. Błony o wymiarach porów 25 nm dają ,75% zwierząt, przejawiających ścieńczenie nabłonka i zrębu nad wszczepem. Liczba ta maleje odpowiednio do 31% i 27% w przypadku membran o wymiarach porów 50 nm i 100 nm.

Figura 1 i figura 2 wyraźnie wskazują, że wymiary porów nakładek rogówkowych przeznaczonych do wprowadzania do oczu zwierząt powinny być większe niż około 15 nm.

177 096

Przykład III. Nabłonkowa tkanka rogówki wymaga czynników troficznych o masie cząsteczkowej większej niż 10000 dalton dla przyczepiania komórek, migracji i rozrostu nabłonka.

W tym doświadczeniu określa się wymagania w odniesieniu do dostępu do tkanki płynnych czynników, np. płynu surowiczego, w celu umożliwienia optymalnych reakcji rozrostu i migracji nabłonkowych komórek rogówki. Nabłonkowe komórki rogówki przetrzymuje się w pożywce hodowlanej (nie zawierającej płynu surowiczego), która zaspokaja zapotrzebowanie tych komórek na glukozę, substancje odżywcze, metabolity i małe cząsteczki fizjologiczne. Celem tego doświadczenia jest określenie zapotrzebowania tych komórek na troficzne czynniki tkanki, umożliwiającego określone funkcje komórek, które zapewniają kolonizację wszczepu rogówkowego przez nabłonek rogówki oraz utrzymanie tej tkanki nabłonkowej. Wykazuje się to przez badania wpływu dodawania do pożywki hodowlanej płynu surowiczego, np. takich płynów tkankowych, na migracyjne i rozrostowe czynności nabłonkowych komórek rogówki.

Celem doświadczeń jest określenie zapotrzebowania nabłonkowych komórek rogówki na czynniki o działaniu troficznym, toteż doświadczenia te programuje się w sposób wykluczający możliwość jakiegokolwiek działania pobudzającego czynników płynu surowiczego, które mogłyby wynikać wyłącznie z bezpośredniego pobudzania przyczepności komórek w następstwie adsorpcji tych czynników płynu surowiczego na powierzchni polimeru. Dwa czynniki tkanki i płynu surowiczego, fibronektyna i witronektyna, mogą występować w postaci rozpuszczalnej oraz mogą też adsorbować się na powierzchniach i w tej nierozpuszczalnej postaci mogą sprzyjać przyczepianiu się komórek. W celu rozróżnienia dostarczania substancji odżywczych lub troficznych z czynników płynu surowiczego, w odróżnieniu od pobudzania przyczepności komórek do powierzchni hodowli w wyniku adsorpcji fibronektyny i/lub witronektyny z płynu surowiczego na tej powierzchni, płyn surowiczy stosowany w tych doświadczeniach przed jego użyciem w próbach z komórkami dokładnie pozbawia się przyczepnych białek: fibronektyny i witronektyny.

Układ prób z hodowlą komórek, stosowany do określania wpływu troficznych czynników tkanki, wybiera się w celu przedstawienia możliwości materiału nakładek rogówkowych dotychczasowego typu do podtrzymywania procesów początkowego przyczepiania się komórek. Nabłonkowe komórki rogówki hoduje się na powierzchni syntetycznego polimeru, zwanej polistyrenem do hodowli tkanki, która stanowi powierzchnię utlenionego polistyrenu, optymalizowaną dla podtrzymywania przyczepności komórek. Wykazując chemię powierzchni, która podtrzymuje przyczepność nabłonkowych komórek rogówki, polimer ten ma powierzchnię podobną, jeśli chodzi o przyczepność komórek, do przykładowej powierzchni nakładki rogówkowej wcześniej opisanej.

Poprzednio stwierdzono, że składniki macierzy pozakomórkowej, jak np. fibronektyna, laminina lub kolageny, mogą aktywować przyczepianie się komórek nabłonkowych rogówki. We wstępnych doświadczeniach porównuje się różne składniki macierzy pozakomórkowej pod względem ich zdolności do podtrzymywania początkowego przyczepiania się oraz rozrostu nabłonkowych komórek rogówki, gdzie czynniki te adsorbuje się na powierzchni hodowli w celu określenia rodzaju powierzchni optymalnego dla pobudzania migracyjnych funkcji nabłonkowych komórek rogówki. W tych wstępnych doświadczeniach stosuje się pożywkę hodowlaną pozbawioną płynu surowiczego, zawierającą 20% objętościowych płodowej surowicy cielęcej pozbawionej fibronektyny i witronektyny, aby można było określić skuteczność różnych składników macierzy pozakomórkowej bez udziału witronektyny lub fibronektyny, zaadsorbowanej ze składników płynu surowiczego pożywki hodowlanej.

W celu badania reakcji migracji nabłonkowych komórek rogówki wołowej na różne składniki macierzy pozakomórkowej skutecznejest określanie prędkości rozrostu komórek z wysepki komórkowej. Osiąga się to przez posiew komórek w określonej środkowej okolicy powierzchni hodowli (polistyrenu do hodowli tkanki) o znanej średnicy ze z góry określonym stężeniem tych komórek, wystarczającym do utworzenia zlewającej się monowarstwy komórek nabłonkowych na początku okresu hodowli. Ograniczenie powierzchni ustala się

177 096 stosując pierścienie ze stali nierdzewnej (s/s), które u podstawy mają silikonowe pierścienie w kształcie litery O z profilem V, skutecznie uszczelniające komorę, w której umieszcza się komórki. Po posiewie i hodowaniu przez okres wystarczający dla przyczepienia się komórek (hodowla trwająca cztery godziny) pierścienie te usuwa się i podaje świeżą pożywkę hodowlaną. Komórki na wysepce nabłonkowej mają wówczas nieograniczoną możliwość rozrostu na powierzchni z prędkością, którą mogą częściowo warunkować składniki macierzy pozakomórkowej wcześniej zaadsorbowane na powierzchni polimeru. W próbie tej możliwe są dwa różne warianty. Komórki można posiewać albo w okolicy środka komory, skutecznie tworząc w ten sposób okrągłą wysepkę komórek, albo alternatywnie na zewnątrz komory, pozostawiając w ten sposób środkową okolicę powierzchni wolną od komórek. Stosując te warianty prób porównuje się składniki macierzy pozakomórkowej pod względem ich wpływu na rozrost komórek nabłonkowych.

Część doświadczalna

Przygotowanie powierzchni ze składnikami macierzy pozakomórkowej: Bada się pięć różnych określonych macierzy pod względem ich zdolności do podtrzymywania przyczepności nabłonkowych komórek rogówki przez uprzednią adsorpcję następujących białek na polistyrenie do hodowli tkanki, a następnie zablokowanie wszystkich pozostałych miejsc wiążących białko 1% (wagowo/objętościowo) roztworem albuminy z surowicy wołu:

1. Witronektyna z surowicy wołu w stężeniu 5 ^g/cm³ (wydzielona jak opisano uprzednio);

2. Fibronektyna z surowicy wołu w stężeniu 10 μ g/cm³;

3. Laminina mysia w stężeniu 50 /zg/cm3 (wyizolowana z mięsaka EHS);

4. Kolagen mysi typ IV w stężeniu 40 3ig/cm³ (wyizolowany z mięsaka EHS);

5. Kolagen wołowy typ I w stężeniu 1,5 mg/cm3 (wyizolowany ze skóry cielęcej, Cellagen).

Te stężenia do wstępnego powlekania wybrano, aby zapewnić poziomy, które wywołują maksymalne pobudzanie przyczepności komórek. Dodaje się 80 μ l roztworu macierzystego o określonych z góry stężeniach do replikowanych wgłębień w polistyrenie do hodowli tkanki (tace hodowlane o 96 wgłębieniach) i inkubuje przez godzinę w 37°C. Następnie usuwa się kolejno roztwory macierzyste i blokuje powierzchnie 1% (wagowo/objętościowo) roztworem albuminy z surowicy wołu w pożywce hodowlanej pozbawionej płynu surowiczego i inkubuje przez godzinę w 37°C. Ten etap 'blokowania zapewnia, że wszystkie miejsca wiązania komórek nie mające dostępu do macierzy są skutecznie zneutralizowane przed posiewem komórek. Zablokowaną powierzchnię polistyrenu do hodowli tkanki włącza się również do każdej próby i w wyniku potraktowania jej albuminą służy ona jako skuteczna powierzchnia kontrolna o reakcji ujemnej.

Próba przyczepności komórek: Do każdego wgłębienia dodaje się porcje po 100 μ l roztworu, zawierającego 0,7-1,0 · 10⁵ komórek w 1 cm³ w przypadku komórek hodowanych lub 3,0-5,0 · 105 komórek w 1 cm.3 w przypadku komórek pierwotnych w 1% (wagowo/objętościowo) roztworze albuminy z surowicy wołu w pożywce hodowlanej pozbawionej płynu surowiczego i inkubuje przez dziewięćdziesiąt minut w 37°C. Przyczepność komórek określa się przez barwienie błękitem metylenowym i odczyt ekstynkcji przy 650 nm na płytowym urządzeniu do odczytywania wskazań. Jako podłoże odniesienia dla komórek o pochodzeniu każdego rodzaju stosuje się kolagen typ I i przyjmuje się tu przyczepność komórek za równą 100%, zaś dla celów sprawozdawczych przyczepność komórek do wszystkich innych macierzy wyraża się w procentach przyczepności uzyskanej w tym samym doświadczeniu na kolagenie typu I.

Próba rozrostu komórek: W środkach przegródek migracyjnych ze stali nierdzewnej posiewa się 100 μΐ porcje hodowanych nabłonkowych komórek rogówki wołu (przejścia nr nr od 5 do 7) pochodzenia brzeżnego o stężeniu 5 · 105 komórek w 1 cm3, albo 0,45 cm3 porcje zawiesiny komórek o stężeniu 1 · 10⁶ komórek w 1 cm3 posiewa się wokoło na zewnątrz tych przegródek. Stężenia te są wystarczające dla uzyskania jednolitej monowarstwy przyczepionych komórek po czterech godzinach inkubacji. Komórki inkubuje się przez cztery godziny w 37°C przed usunięciem przegródek. Stosowana pożywka hodowlana

177 096 zawiera 20% (objętościowo) płodowej surowicy wołowej, pozbawionej fibronektyny i witronektyny, 40% (objętościowo) minimalnej pożywki podstawionej Dublecco i 40% (objętościowo) pożywki Ham F12.

Każdą próbę przeprowadza się w trzech równoległych doświadczeniach, stosując następujące powlekania powierzchni:

a) Fibronektyna - fibronektyna, pokrywanie w stężeniu 10 μ g/cm³;

b) Ln - laminina, pokrywanie w stężeniu 25 μ g/cm3;

c) Cl - kolagen typ I, pokrywanie w stężeniu 187,5 μ g/cm3.

Te pierwotne powłoki inkubuje się przez godzinę w 37°C przed ich użyciem. Podczas okresu hodowli co trzy dni zmienia się pożywkę hodowlaną.

Wskaźnik rozrostu oblicza się następująco:

powierzchnia rozrostu komórek po pięciu (lub siedmiu) dniach ,_r powierzchnia początkowa komórek po czterech godzinach

Wyniki

1. Reakcja komórek hodowanych - Początkowa przyczepność komórek. W przypadku komórek hodowanych przez krótki okres czasu (przejścia nr nr 2-3) każda z cząsteczek macierzy pozakomórkowej, tj. fibronektyny, witronektyny, kolagenu I, kolagenu IV i lamininy, pobudza początkową przyczepność komórek. W przypadku komórek świeżo przygotowanych z tkanki, tj. zawiesin komórek pierwotnych, wyniki są podobne, ale reaktywność tych komórek na witronektynę jest stosunkowo słaba. W trzech doświadczeniach porównuje się pod względem przyczepności oczyszczone składniki macierzy pozakomórkowej w czasie pierwszych dziewięćdziesięciu minut hodowli nabłonkowych komórek rogówki wołowej, które stosuje się niezwłocznie po wydzieleniu z rogówki. Kolagen I, laminina i kolagen IV pobudzają przyczepność nabłonkowych komórek rogówki. W serii ośmiu doświadczeń fibronektyną również pobudza przyczepność komórek z każdej okolicy, ale w przypadku każdego pochodzenia komórek reakcja tych pierwotnych izolatów na fibronektynę zmienia się od jednego doświadczenia do drugiego (średnia reakcja zmienia się w granicach od 2,3 do 2,8 razy). Chociaż witronektyna jest stymulatorem, to jednak w sposób powtarzalny jest znacznie mniej skuteczna niż lamininaa, kolageny lub fibronektyną w pobudzaniu przyczepności wszystkich komórek z pierwotnych izolatów. Jest to nieoczekiwane odkrycie, jeśli chodzi o witronektynę.

2. Wpływ składników macierzy pozakomórkowej na migrację hodowanych komórek rogówki.

1) Rozrost komórek z centralnie posianej powierzchni. Tabela 7 przedstawia porównanie oddziaływania różnych macierzy pozakomórkowych na rozrost komórek od wysepek komórek nabłonkowych podczas pięciodniowego do siedmiodniowego okresu hodowli. Biorąc pod uwagę słabe oddziaływanie witronektyny na pobudzanie przyczepności pierwotnych komórek nabłonkowych rogówki wobec witronektyny, czynnika tego nie włącza się do porównań. Widoczne są niektóre interesujące różnice między działaniami rozmaitych macierzy pozakomórkowych. W obecności płynu surowiczego pozbawionego fibronektyny i witronektyny powierzchnie pokryte albo fibronektyną albo kolagenem typu I dobrze oddziaływują w przypadku powierzchni pokrytej komórkami przesuwającymi się od centralnej wysepki. Powierzchnie powleczone lamininą działają jednak słabo w porównaniu z innymi powierzchniami.

177 096

Tabela 7

Wpływ składników macierzy pozakomórkowej na migrację hodowanych komórek rogówki - rozrost komórek od centralnie posianej wysepki

	Powierzchnia	Wskaźnik (średnia ± SD)
Okres hodowli pięć dni	TCPS/NS	3,4±0,0
	Fn/DD	3,2±0,0
	Ln/DD	1,6 ± 0,8
	Col I/DD	2,2±0,3
Okres hodowli siedem dni	TCPS/NS	5,4±0,5
	Fn/DD	4,7±0,3
	Ln/DD	2,7+0,3
	Coll/DD	4,2±0,4

W tabeli 7 używa się następujących skrótów:
TCPS	- polistyren dla hodowli tkanki,
Ns	- ptodowa surowica cielęca (nó^f^ozi^i^w^c^ina fibionekymy i witronektyny),
Fn	- fibronekiyna,
Ln	- laminina,
Col I	- kolagen I,
DD	- płodowa surowica cielęca, pozbawiona fibronektyny i witronektyny,
SD	- odchylenie standardowe.

2) Rozrosty komórek do wewnątrz od obwodowo posianego pierścienia. Monitoruje się komórki nabłonkowe rogówki, posiane wokoło na zewnątrz przegródek, aż w jednej z równoległych prób każdego badania nastąpi całkowite pokrycie środkowej powierzchni wgłębienia. Skuteczność w każdym badaniu oblicza się i wyraża w procentach środkowej powierzchni, pokrytej pod koniec okresu doświadczenia. Tabela 8 przedstawia porównanie oddziaływania różnych macierzy pozakomórkowych na rozrost komórek od wysepek komórek nabłonkowych w okresie siedmiodniowej hodowli. Ten wariant daje podobne wyniki do uzyskanych metodą centralnego posiewu. Laminina tu również okazuje się słabą powierzchnią do pobudzania czynności migracyjnych, lecz fibronektyna i kolagen I są skuteczne w pobudzaniu migracji komórek.

Tabela 8

Wpływ składników macierzy pozakomórkowej na migrację hodowanych komórek rogówki - rozrost komórek do wnętrza od posianego pierścienia komórek

Powierzchnia/Pożywka	5% rozrost do wnętrza * (średnia + SD)
TCPS/NS	94,4±5,7
Fn/DD	95,6±5,7
Ln/DD	52,9±7,9
Col I/DD	95,4±4,8

W tabeli 8 używa się następujących skrótów:
TCPS	- polistyren dla hodowli tkanp^,
Ns	- curocπi(a cep^ca (niepozbawionafibiΌdekfyny t witronekty- ny),
Fn	- fibronektyna,
Ln	- laminina,
Col I	- kolagen I,
DD	- płodowa surowca cS^il^^^, p(^^l^^''nc^l^^ fibronektyny i -ntronekiyny,
SD	- odchylenie standardowe,

177 096 *średnia czterogodzinna niepokryta powierzchnia początkowa siedmiodniowa niepokryta powierzchnia x 10_ średnia czterogodzinna niepokipta powierzchnia oozzątkowa

Te wstępne doświadczenia wykazują, że fbeonektpnn i kolagen I są stymulatorami zarówno początkowej przyczepności komórek nabłonkowych rogówki do powierzchni polimeru, jaki rozrostu oraz migracji komórek z wysepek komórkowych. Do doświadczeń, w których mają być określone wpływy troficznych czynników płynu surowiczego, włącza się powierzchnię polimeru pokrytego fibrocektyną, która reprezentuje powierzchnię, zawierającą przyczepny czynnik biologiczny.

Oznaczanie masy cząsteczkowej czynnika (czynników) troficznych płynu surowiczego, który podtrzymuje migrację i rozrost nabłonkowych komórek rogówki.

Część doświadczalna

Frakcjonowanie płynu surowiczego

Płodową surowicę wołową pozbawia się cząsteczek witeonektycp (νή^^^ώ) i fibrznektpny (Fibronectin), przyczepnych do komórek, metodami uprzednio przez nas opisanymi. Tę surowicę pozbawioną fbronektpcy i witrocektpcy przepuszcza się następnie przez szereg membran ultrafiltracyjnych w celu rozdzielenia składników tej surowicy na frakcje, zawierające składniki o określonym zakresie mas cząsteczkowych. Stosuje się trzy różne niejonowe membrany ultrafiltracyjne Amicon:

1. Membranę Amicon PM10, oddzielającą substancję o masie cząsteczkowej do 10000 dalton;

2. Amicon PM30, oddzielającą substancje o masie cząsteczkowej do 30000 dalton;

3. Amicon XM100, oddzielającą substancje o masie cząsteczkowej do 100000 dalton.

Membrany te przed użyciem czyści się według zaleceń producenta. Każdą z tych membran wstępnie traktuje się 1% (wagowo/objętościowo) roztworem albuminy z surowicy wołu w PBS, a następnie przemywa się sterylnym PBS w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania białek na powierzchni membrany i w konsekwencji strat składników płynu surowiczego w dalszym etapie filtracji. Urządzenie do ultrafiltracji (Amicon) zawiera różne membrany, a płyn surowiczy pozbawiony fibronektpcp i witronektpcy lub jego frakcje miesza się mieszadłem magnetycznym i filtruje pod ciśnieniem 400 kPa.

Frakcjonowanie płynu surowiczego wykonuje się następującą metodą: Płyn surowiczy pozbawiony fbronektpcy i witronektpcp rozcieńcza się dwiema objętościami sterylnego roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) i przepuszcza przez szereg kolejnych filtracji. Cały pozbawiony fibeonektycp i witronektpnp oraz rozcieńczony płyn surowiczy najpierw przepuszcza się przez membranę XM100 o średnicy 43 mm i zbiera przesącz. Substancje zatrzymane na tej membranie (retentat) odrzuca się. Pobiera się dwie porcje przesączu z membrany XM100 i przepuszcza przez membranę albo PM10 albo PM30 o średnicy 25 mm. Przesącze z tych dwóch membran zbiera się oddzielnie, a retentaty z tych membran odrzuca się. Składniki o niskiej masie cząsteczkowej usuwa się z tych frakcji przesączy, przepuszczającje przez membranę Amicon UM2 o średnicy 43 mm z odcięciem 1000 daltonów, a pozostałe składniki w tych frakcjach zagęszcza się z powrotem do objętości, którą oblicza sięjako równą objętości, którą zajmowałyby, gdyby nie były rozcieńczone (oraz przymując ich całkowity odzysk). Występują więc następujące frakqe, jak to przedstawia również załączony schemat 1:

Frakcja 1: Przesącz z membrany XM100, który następnie częściowo zatrzymuje się na membranie UM2 - taka obróbka daje zawartość składników w zakresie 1(000 -10000 dalton.

Frakcja 2: Przesącz z membrany XM100, któryjest również przesączem z membrany PM30, zatrzymany następnie częściowo na membranie UM2 - taka obróbka daje zawartość składników w zakresie 1000-30000 dalton.

Frakcja 3: Przesącz z membrany XM100, któryjest również przesączem z membrany PM10, zatrzymany następnie częściowo na membranie UM2 - taka obróbka daje zawartość składników w zakresie 1000-10000 dalton.

177 096

SCHEMAT 1

Strategia frakcjonowania płynu surowiczego

Płodowa surowica wołowa (pozbawiona Fn i Vn) Rozcieńczona 1:3 PBS

Filtr odcinający substancje o masie cząsteczkowej (MW) 100 kilodalton· (ED)

ή-	Przesącz	100 KD	—*1
1	7$tr odcina-		-„ Filtr odcina-
jący 30 KD		jący 10 KD
V	1	•	’ r
Przesącz 100 KD	Przesącz	30KD	Przesącz 10 KD

i r r

Zatężony do pierwotnej objętości po zatrzymaniu na filtrze odcinającym 100 KD

Każdą z tych frakcji po ich otrzymaniu sterylizuje się przez przepuszczenie przez filtr Gelmana Acrodisc™ 0,22 μ φ. Te frakcje płynu surowiczego przepuszcza się przez mini-żel z 12,5% poliakiylamidu (BioRad Protean II) w warunkach nieredukujących w celu potwierdzenia skuteczności postępowania przy filtracji, a stężenie białek w każdej frakcji oznacza się według standardowego sposobu postępowania.

Badanie wpływu płynu surowiczego oraz frakcji płynu surowiczego na wzrost i migrację nabłonkowych komórek rogówki.

Płyn surowiczy pozbawiony fibronektyny i witronektyny oraz frakcje pozbawionego ich płynu surowiczego, otrzymane jak opisano wyżej, dodaje się do pożywki hodowlanej (1:1 modyfikowana pożywka podstawowa Dulbecco/pożywka bez surowicy Ham’s F12) w stężeniu 20% (objętościowych) w celu zbadania wpływu różnych frakcji na przyczepność oraz wzrost nabłonkowych komórek rogówki wołowej i prowadzi się próby przez okres hodowli wynoszący sześć dni.

Wgłębienia hodowlane zaopatruje się w sterylne przegródki ze stali nierdzewnej, umieszczane wewnątrz tych wgłębień i usytuowane w nich centralnie. Do wnętrza każdej przegródki ze stali nierdzewnej posiewa się porcje (100 μ 1) zawiesiny nabłonkowych komórek rogówki (otrzymanej z wołowej tkanki rogówkowej) o gęstości 5 · 10⁵ komórek na 1 cm³. Taka porcja komórek wystarcza do utworzenia zlewającej się monowarstwy w dwadzieścia cztery godziny po posianiu tych komórek na powierzchnię hodowli, ograniczoną światłem przegródki, w pożywkę hodowlaną zawierającą nienaruszony płyn surowiczy. W doświadczeniach tych po dwudziestu czterech godzinach hodowli usuwa się przegródki

177 096 z zagłębień hodowlanych, a następnie dostosowuje objętość pożywki hodowlanej i kontynuuje hodowlę.

Każdą testowaną próbkę frakcji płynu surowiczego, pozbawionego fibronektyny i witronektyny, bada się w trzech równoległych zagłębieniach, przy czym jedno zagłębienie jest przeznaczone do oznaczania wielkości powierzchni hodowli zawierającej' komórki po dwudziestu czterech godzinach okresu hodowli, a dwa zagłębienia wykorzystuje się do pomiarów tej powierzchni po siedmiu dniach hodowli. W odpowiednim momencie komórki utrwala się roztworem soli z formolem i przechowuje w sterylnym BS w 4°C, dopóki są potrzebne. Gęstość komórek oznacza się przez barwienie błękitem metylenowym według Olivera i in., a ilość związanego barwnika mierzy się kolometrycznie przy 655 nm na płytowym urządzeniu do odczytywania wskazań. Barwienie błękitem metylenowym stosuje się w celu oznaczenia zarówno powierzchni rozrostu komórek (przez analizę obrazu z użyciem analizatora obrazu Quantimet 570, wykrywając komórki na podstawie wzrostu zabarwienia w następstwie wychwytu niebieskiego barwnika), jak i do pomiaru stopnia rozrostu komórek (oznaczanego kolorymetrycznie przy 655 nm na płytowym urządzeniu do odczytywania wskazań przy testach immunologicznych).

Kombinacje pożywek hodowlanych są następujące:

1) pożywka hodowlana pozbawiona płynu surowiczego, do której dodaje się 20% (objętościowo) frakcji 3, zawierającej czynniki płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 10000 dalton;

2) pożywka hodowlana pozbawiona płynu surowiczego, do której dodaje się 20% (objętościowo) frakcji 2, zawierającej czynniki płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 30000 dalton;

3) pożywka hodowlana pozbawiona płynu surowiczego, do której dodaje się 20% (objętościowo) frakcji 1, zawierającej czynniki płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 100000 dalton;

4) pożywka hodowlana pozbawiona płynu surowiczego, do której dodaje się 20% (objętościowo) kombinacji 1, 2 i 3, zawierającej czynniki płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 100000 dalton;

5) pożywka hodowlana pozbawiona płynu surowiczego + 20% (objętościowo) płynu surowiczego pozbawionego fibronektyny i witronektyny (nie frakcjonowana według wymiarów);

6) sama pożywka pozbawiona płynu surowiczego.

Zgodnie z tym, co napisano wyżej, stosuje się dwie powierzchnie hodowlane: po pierwsze - polistyren do hodowli tkanki i po drugie - polistyren do hodowli tkanki, który uprzednio pokrywa się fibronektyną z surowicy wołu w stężeniu 10 μ g/cm³ i inkubuje przez godzinę w 37°C przed wprowadzeniem komórek.

Wyniki.

Dzięki rozdzieleniu płynu surowiczego, pozbawionego fibronektyny i witronektyny, na frakcje o znanych zakresach mas cząsteczkowych można ocenić wpływ składników płynu surowiczego, w ramach poszczególnych zakresów mas cząsteczkowych, na przyczepność nabłonkowych komórek rogówki, ich migrację i rozrost.

Figura 3 przedstawia wpływ różnych frakcji, otrzymanych z płynu surowiczego pozbawionego fibronektyny i witronektyny, na przyczepność nabłonkowych komórek rogówki w czasie pierwszych dwudziestu czterech godzin hodowli. Dzięki sposobowi, w jaki prowadzi się to doświadczenie, liczba komórek znajdujących się na powierzchniach w różnych próbach jest zbliżona lub taka sama dla każdej próby po dwudziestu czterech godzinach hodowli. Różne próby można więc porównywać pod względem szybkości rozrostu komórek oraz wzrostu liczby komórek po pierwszych dwudziestu czterech godzinach okresu hodowli, mając podobne populacje komórek w próbie w punkcie czasowym, wynoszącym dwadzieścia cztery godziny.

Figura 4 przedstawia wpływ tych różnych frakcji na wielkość powierzchni hodowli, pokrytej komórkami w czasie sześciodniowego okresu hodowli, wyrażony wskaźnikiem rozrostu komórek (obliczanym w sposób opisany wyżej). Figura 4 również porównuje

177 096 te wyniki w taki sposób, że odnosi wzrost powierzchni hodowli komórek w czasie sześciodniowego okresu hodowli (wyrażony stosunkiem do tego wzrostu po dwudziestu czterech godzinach) do danych o przyczepności (po dwudziestu czterech godzinach).

Migracja komórek i rozrost wysepek są wyraźne dla wszystkich kombinacji pożywka/powierzchnia, ale w znacznie zróżnicowanym stopniu. Średnio w próbach, zawierających płodową surowicę cielęcą pozbawioną fibronektyny i witronektyny (kontrolna próba dodatnia), albo w próbie, zawierającej 20% (objętościowo) frakcji 1 płynu surowiczego z czynnikami płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 100000 dalton, komórki migrują pokrywając powierzchnię mniej więcej dziesięciokrotnie większą od powierzchni pokrywanych przez komórki w próbach zawierających frakcję 2 lub 3. Ponadto nabłonkowe komórki rogówki, hodowane w próbie zawierającej kombinację frakcji 12 i 3, migrują pokrywając około 33% powierzchni - w odniesieniu do kontrolnej próby dodatniej - zarówno polistyrenu do hodowli tkanki, jak i polistyrenu do hodowli tkanki pokrytego fibronektyną.

Figura 4 daje ciekawe porównanie między różnymi frakcjami płynu surowiczego. Podobne poziomy przyczepności komórek widać po dwudziestu czterech godzinach hodowli w próbach, zawierających albo samą potywkę pozbawioną płynu surowiczego, albo pożywkę pozbawioną płynu surowiczego, zawierającą 20% (objętościowo) frakcji 3 (zawierającej czynniki płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 10000 dalton), lub 20% (objętościowo) frakcji 2 (zawierającej czynniki płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 30000 dalton), bądź 20% (objętościowo) frakcji 1 (zawierającej czynniki płynu surowiczego o wymiarach od 1000 do 100000 dalton), bądź też kombinację frakcji 12 i 3. Pomimo tego, że początkowa przyczepność komórekjestjednakowa w tych różnych próbach, to występuje znaczna różnica we wzroście powierzchni zajętej przez komórki. Tylko próba, zawierająca 20% (objętościowych) frakcji 1 (wymiary czynników płynu surowiczego od 1000 do 100000 dalton), oraz próba, zawierająca kombinacje frakcji 12 i 3, zapewniają wzrost powierzchni komórek w ciągu sześciodniowej hodowli na polistyrenie do hodowli tkanki. Takie same wyniki obserwuje się w tych próbach z użyciem powierzchni polistyrenu do hodowli tkanki pokrytej fibronektyną.

Stosując te dwa przykładowe podłoża hodowli oraz stosując pożywkę hodowlaną, która zaspokaja zapotrzebowanie komórek na substancje o małej masie cząsteczkowej, ten wariant doświadczenia, stosowany w tych próbach, stanowi wzorzec uprzednio opisanych nakładek rogówkowych, zapewniając zarówno dostęp komórek do środków odżywczych i innych małych cząsteczek, jak i zapewniając taką chemię powierzchni, która podtrzymuje przyczepność nabłonkowych komórek rogówki. W sumie wyniki te wskazują, że istnieją takie troficzne czynniki tkanki (lub czynnik), jak np. czynniki (czynnik) płynu surowiczego, które są potrzebne dla optymalnego pokrywania komórkami nabłonkowymi powierzchni syntetycznego polimeru, jak np. powierzchni polistyrenu do hodowli tkanki. Te czynniki (czynnik) mają wymiary większe niż 1000 daltonów i również pozostają na filtrach, które oddzielają cząsteczki o wymiarach 10 000 daltonów i większe. Wyniki te wskazują, że ich aktywność lub część tej aktywności można identyfikować jako przypadającą w zakresie mas cząsteczkowych od 10 000 do 75 000 daltonów (oznaczonych z oddzielonych na filtrze membranowym Amicon PM10 i przepuszczonych przez filtr membranowy Amicon XM100). Te czynniki płynu surowiczego nie są czynnikami przyczepności fibronektyny i witronektyny.

Wyniki te wskazują na istnienie zapotrzebowania nabłonkowych komórek rogówki na czynniki troficzne pochodzące z tkanki dla rozrostu i migracji komórek na powierzchni. Czynniki tkanki, jak np. płyn surowiczy, pobudzają rozrost komórek nabłonkowych z wysepek nabłonkowych i wpływ ten nie zależy od przyczepnych białek płynu surowiczego fibronektyny i witronektyny. Na podstawie frakcjonowania płynu surowiczego według mas cząsteczkowych wykazano, że aktywność ta przypada na substancje o wymiarach większych niż 10 000 daltonów. Dlatego też nakładki rogówkowe według wynalazku wykazują porowatość wystarczającą dla umożliwienia przenikania przez nie składników płynu tkankowego o masie cząsteczkowej większej niż 10 0(^0 daltonów.

Przykład IV: Otrzymywanie nakładek rogówkowych

Nakładki rogówkowe można otrzymywać z polimeru, zawierającego poprzecznie sieciowane makrocykle, zbudowane z jednostek o następującym wzorze: -(-CR=CR²-A)-, w którym A oznacza alkilen lub alkenylen, każdy zawierający od 3 do 10 atomów węgla, i z któiych każdy może być podstawiony jednym lub więcej niż jednym rodnikiem R3, każdy R¹ i R² niezależnie od siebie oznacza wodór lub niższy alkil, a R3 oznacza niższy alkil, fluorowany niższy alkil lub rodnik siloksanowy. Takie polimery opisano w EP-A-501 917.

W pierwszym doświadczeniu dodaje się 5% tert-butyloper-2-etylokapronian do poli(1-okteno-1,8-dwu-ylu) (nazwa handlowa Vestenamer®) i ten środek sieciujący wprowadza się do zwykłego przemysłowego gniotownika pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 35°C. Z otrzymanej masy wyprasowuje się nakładki rogówkowe w 160°C pod ciśnieniem od 0,5 do 2 MPa przez okres pięciu minut, stosując odpowiednie barwniki. Otrzymane w ten sposób nakładki rogówkowe wykazują zdolność przepuszczania tlenu (Dk) wynoszącą 106 oraz wytrzymałość na rozdzieranie równą 2,7 MPa. W nakładkach tych wytwarza się pory z zastosowaniem lasera impulsowego sterowanego mikroprocesorem. W okolicy osi optycznej każdej nakładki wytwarza się liczne pory o średnicy około 200 nm. Na zewnątrz okolicy osi optycznej każdej nakładki wytwarza się liczne pory o średnicy około 20 mikrometrów.

W drugim doświadczeniu nakładki otrzymuje się z kopolimerów o wzorze 1, opisanych w EP-A-538 188. W szczególności kopolimeryzuje się 100 mmol trójcyklo[1.1.1.013]pentanu i 150 mmol akrylanu etylu przez dwa dni, w eterze dwuetylowym, w pokojowej temperaturze, bez dostępu tlenu. Otrzymuje się arkusz o temperaturze zeszklenia 100°C. Z arkusza wyprasowuje się nakładki rogówkowe. Pory wytwarza się w nakładkach tak, jak to opisano wyżej.

177 096 fi

177 096

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nakładka rogówkowa mająca strefę osi optycznej z charakterystyką optyczną, uformowana z nieulegającego biodegradacji, niehydrożelowego materiału biologicznie tolerowanego przez oczy, przy czym nakładka ta jest porowata, znamienna tym, że ma pory o średnicy od 15 nanometrów do 0,5 mikrometra.
2. 2. Nakładka według zastrz. 1, znamienna iym, że pory mają średnice od 15 nanometrów do 300 nanometrów.
3. 3. Nakładka według zastrz. 1, znamienna tym, że pory mają średnice od 20 do 150 nanometrów.