CZ282747B6

CZ282747B6 - Použití 1-/2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiazolan-5-yl/5-fluorocytosinu k výrobě léčiva pro ošetřování hepatitidy B

Info

Publication number: CZ282747B6
Application number: CS931835A
Authority: CZ
Inventors: George Robert Painter Iii; Allen Phillip Furman
Original assignee: Emory University
Priority date: 1991-03-06
Filing date: 1992-03-05
Publication date: 1997-09-17
Also published as: ES2286072T3; EP0574487A1; DK0574487T3; DE69232649T2; PT100198B; JPH06505725A; JP3479068B2; SK95093A3; EP1142891A1; JP2011102308A; HU9302493D0; ATE361293T1; SK279542B6; JP3987335B2; ES2179040T3; IE920701A1; CZ183593A3; WO1992015308A1; NZ264621A; IL101144A0

Abstract

Je popsáno použití sloučeniny obecného vzorce I, tedy 1-/2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiazolan-5-yl/5fluorcytosinu nebo jeho fyziologicky funkčního derivátu k výrobě léčiva pro ošetřování nebo profylaxi infekce způsobené virem hepatitidy B. K tomu se uvedené sloučeniny používají především ve formě farmaceutických prostředků. Sloučenina obecného vzorce I se s výhodou používá ve formě svého cis-isomeru.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nového použití l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiolan-5-yl/-5-fluorcytosinu.

Dosavadní stav techniky

Virus hepatitidy B (HBV) je virový patogen, který má značnou důležitost z celosvětového hlediska. HBV je nejběžnější v asijských zemích a je velmi rozšířen v subsaharské Africe. Virus je etiologicky spojen s primárním hepatocelulámím karcinomem a předpokládá se, že je příčinou 80 % rakoviny jater ve světovém měřítku. Ve Spojených státech amerických více než 10 000 lidí je každým rokem hospitalizováno s chorobami, způsobenými HBV, a průměrně 250 umírá na fulminantní průběh onemocnění. Ve Spojených státech amerických je průběžně odhadovaný počet 500 000 až 1 000 000 infikovaných bacilonosičů. Chronicky aktivní hepatitida se vyvine u více než 25 % bacilonosičů a často směřuje k cirhóze. Odhaduje se, že 5000 lidí umírá na cirhózu, vyvolanou HBV každým rokem v USA, a že snad 1000 úmrtí je způsobeno rakovinou jater, související s HBV. I když je k dispozici univerzální HBV vakcína, trvá potřeba získat účinné sloučeniny, které působí proti HBV. Vysoký počet trvale infikovaných bacilonosičů, odhadovaný na celém světě na 220 milionů, se nepodrobuje výhodné vakcinaci a trvá vysoké riziko choroby jater, vyvolané HBV. Populace těchto bacilonosičů slouží jako zdroj infekce citlivých jedinců, což způsobuje opakující se situaci propuknutí chorob, zvláště v endemických oblastech nebo u vysoce rizikových skupin, jako u jedinců, intravenózně zneužívajících drogy, nebo homosexuálů. Tak trvá vysoká potřeba účinných protivirových přípravků, použitelných jak pro potlačování chronické infekce, tak pro snížení vývoje hepatocelulámího karcinomu.

Klinické účinky infekce, vyvolané HBV, jsou v rozsahu od bolesti hlavy, horečky, pocitu neklidu, nucení ke zvracení, dávení, nechutenství a bolestí břicha. Replikace viru se u člověka obvykle sleduje podle imunitní odezvy v průběhu rekonvalescence, trvající týdny nebo měsíce, ale infekce může být mnohem závažnější a může vést k úporné chronické chorobě jater, jak je naznačeno výše. V Viral Infections of Humans (2. vydání, vyd. A. S. Evans /1982/, Plenům Publishing Corporation, New York) je v kapitole 12 popsána etiologie infekcí, způsobených virem hepatitidy. Evropský patentový spis č. 0 382 526 uvádí určité 1,3-oxathiolanové nukleosidové analogy, které jsou účinnými inhibitory replikace viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV).

Podstata vynálezu

Původci tohoto vynálezu nyní s překvapením zjistili, že l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiolan-5yl)cytosinový derivát vzorce I

- 1 CZ 282747 B6

a jeho fyziologicky funkční deriváty mají silný účinek proti viru hepatitidy B (HBV).

Podstatou vynálezu je proto použití l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosinu vzorce I nebo je ho fyziologicky funkčního derivátu k výrobě farmaceutického prostředku pro ošetřování nebo profylaxi infekce, způsobené virem hepatitidy B.

Sloučenina vzorce I obsahuje dva chirální středy, a proto může být ve formě dvou párů optických io isomerů (enantiomerů) nebo jejich směsí, včetně racemické směsi. Sloučenina vzorce I může být tudíž ve formě cis-isomeru nebo trans-isomeru, nebo může být tvořena jejich směsí. Každý cisnebo trans-isomer se může vyskytovat jako jeden ze dvou enantiomerů nebo jako jejich směsi, včetně směsi racemické. Všechny takové isomery a jejich směsi, zahrnující též racemické směsi, a tautomemí formy sloučeniny vzorce I spadají do rozsahu vynálezu. Cis-isomery sloučeniny 15 vzorce I jsou výhodné.

Vynález se tedy týká použití sloučeniny vzorce I, zvláště ve formě cis-isomeru, popřípadě fyziologicky funkčního derivátu, jako ve formě soli nebo esteru, pro výrobu farmaceutického prostředku pro ošetřování nebo profylaxi infekcí, způsobených virem hepatitidy B. Takový 20 farmaceutický prostředek je vhodný pro ošetřování nebo pro profylaxi infekcí, způsobených virem hepatitidy B u hostitele, například savce, jako je člověk, přičemž se podává vždy účinné množství sloučeniny vzorce 1 nebo jejího fyziologicky funkčního derivátu.

Výrazem fyziologicky funkční derivát se rozumí farmaceuticky přijatelná sůl, amid, ester nebo 25 sůl esteru sloučeniny vzorce I, nebo jakákoli jiná sloučenina, která po podání příjemci (pacientovi) je schopna poskytnout (přímo nebo nepřímo) tuto sloučeninu vzorce I nebo její aktivní metabolit nebo zbytek, odvozený od této sloučeniny.

Mezi výhodné estery podle tohoto vynálezu se zahrnují estery karboxylových kyselin, ve kterých 30 nekarbonylový zbytek části karboxylové kyseliny, který tvoří esterové seskupení, je zvolen z přímých nebo rozvětvených alkylových řetězců, například n-propylu, terc.-butylu nebo nbutylu, alkoxyalkylové skupiny (například methoxymethylu), aralkylové skupiny (například benzylu), aryloxyalkylové skupiny (například fenoxymethylu) a arylové skupiny (například fenylu), sulfonátových esterů, jako alkylsulfonylu nebo aralkylsulfonylu (například methan35 sulfonylu), esterů aminokyselin (například L-valylu nebo L-isoleucylu), esterů dikarboxylových kyselin (například hemisukcinátu) a 5'-, mono-, di- nebo trifosfátových esterů. Fosfátové estery mohou být dále esterifikovány, například alkoholem s 1 až 20 atomy uhlíku nebo jeho reaktivní derivátem, nebo 2,3-diacylglycerolem s 6 až 24 atomy uhlíku v acylové části. Libovolná alkylová část, přítomná v takových esterech, výhodně obsahuje 1 až 18 atomů uhlíku, zvláště 1 až 4 atomy 40 uhlíku. Jakákoli arylová část, přítomná v takových esterech, výhodně obsahuje fenylovou skupinu, která je popřípadě substituována, například atomem halogenu, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo nitroskupinou.

Svrchu uvedené farmaceuticky přijatelné amidy sloučeniny vzorce I zahrnují deriváty, ve kterých aminoskupina cytosinu je přítomna ve formě amidu, například jako skupina vzorce -NHCOR, kde R představuje alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo arylovou skupinu (například fenylovou skupinu, která je popřípadě substituována atomem halogenu, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, nitroskupinou nebo hydroxyskupinou).

Příklady farmaceuticky přijatelných solí podle tohoto vynálezu zahrnují bázické soli, například odvozené od příslušné báze, jako soli alkalických kovů (například sodné), kovů alkalických zemin (například hořečnaté), soli amonné nebo obsahující NX/ (kde X znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku). Farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami zahrnují soli organických karboxylových kyselin, jako je kyselina octová, kyselina mléčná, kyselina vinná, kyselina jablečná, kyselina isethionová, kyselina laktobionová a kyselina jantarová, organických sulfonových kyselin, jako je kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, kyselina benzensulfonová a kyselina p-toluensulfonová, a anorganických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná a kyselina sulfamová.

Množství sloučeniny vzorce I (zde dále také označované jako účinná složka) nebo jejího fyziologicky funkčního derivátu, které je potřebné ve farmaceutickém prostředku pro dosažení požadovaného účinku, bude záviset na řadě okolností, zvláště na specifickém použití, povaze použité zvláštní sloučeniny, cestě podání a stavu pacienta. Obecná vhodná dávka bude v rozmezí od 3 do 120 mg na kilogram tělesné hmotnosti příjemce za den, výhodně v rozmezí od 6 do 90 mg na kilogram tělesné hmotnosti příjemce za den, zvláště výhodně v rozmezí od 15 do 60 mg na kilogram tělesné hmotnosti příjemce za den. Požadovaná dávka se výhodně předkládá jako dvě, tři, čtyři, pět nebo šest dílčích dávek, podávaných ve vhodných intervalech během dne. Tyto dílčí dávky se mohou podávat ve formě dávkové jednotky, například obsahující od 10 do 1500 mg, výhodně od 20 do 1000 mg a nejvýhodněji od 50 do 700 mg účinné složky na formu dávkové jednotky.

V ideálním případě by se účinná složka měla podávat tak, aby se dosáhlo vrcholných koncentrací účinné složky v plazmě od přibližně 1 do zhruba 75 μΜ, výhodně od přibližně 2 do 50 μΜ a zvláště výhodně od přibližně 3 do zhruba 30 μΜ. Toho se může dosáhnout například intravenózními injekcemi 0,1 až 5 % roztoku účinné látky, popřípadě ve fyziologickém roztoku, nebo perorálním podáním ve formě sousta, které obsahuje od přibližně 1 do zhruba 100 mg/kg účinné složky. Požadované úrovně v krvi se mohou udržovat nepřetržitou infuzí, která poskytuje od přibližně 0,01 do zhruba 5,0 mg/kg účinné složky za hodinu, nebo přerušovanou infuzí, obsahující od přibližně 0,4 do zhruba 15 mg/kg účinné složky.

Při výrobě farmaceutického prostředku podle tohoto vynálezu, dále také označovaného jako prostředek, se sloučenina vzorce I nebo její fyziologicky funkční derivát jako účinná složka obvykle smíchá mimo jiné s jednou nebo větším počtem fyziologicky přijatelných nosných nebo pomocných látek a popřípadě s jinými terapeuticky účinnými přípravky.

Prostředky zahrnují takové prostředky, které jsou vhodné pro perorální, rektální, nasální, lokální (včetně transdermálního, bukálního a sublinguálního), vaginální nebo parenterální (včetně subkutánního, intramuskulámího, intravenózního a intradermálního) podání. Prostředky mohou být obvykle přítomny ve formě jednotkové dávky a mohou se vyrábět libovolnými způsoby, které jsou dobře známé v oboru farmacie. Takové způsoby zahrnují stupeň uvedení do styku účinné látky s nosnými látkami, které sestávají z jednoho nebo většího počtu vedlejších složek. Z obecného hlediska se prostředky mohou vyrábět rovnoměrným a důkladným uvedením do styku účinné látky s kapalnými nosnými látkami nebo jemně rozmělněnými pevnými nosnými látkami, případně s oběma těmito typy nosných látek a potom, jestliže je zapotřebí, tvarováním produktu.

-3 CZ 282747 B6

Prostředky podle tohoto vynálezu, vhodné pro perorální podání, mohou být přítomny jako oddělené jednotky, jako například kapsle, kasety nebo tablety, z nichž každá obsahuje předem stanovené množství účinných látek, jako prášky nebo granule, jako roztoky nebo suspenze ve vodné nebo nevodné kapalině, nebo jako kapalné emulze typu olej ve vodě nebo voda v oleji. Účinná složka může být také přítomna ve formě sousta, lektvaru nebo pasty.

Tablety se mohou zhotovovat lisováním nebo odléváním, popřípadě s jednou nebo větším počtem vedlejších složek. Lisované tablety se mohou vyrábět ve vhodném přístroji lisováním účinné látky ve volně tekoucí formě, jako prášku nebo granulí, která je popřípadě smíchána s pojivém (například povidonem, želatinou nebo hydroxypropylmethylcelulózou), kluznou látkou, inertním ředidlem, konzervační látkou, látkou napomáhající rozpadu (například natriumglykolátem škrobu, zesítěným povidonem nebo zesítěnou natriumkarboxymethylcelulózou), povrchově aktivní látkou nebo činidlem, napomáhajícím dispergování. Odlévané tablety se mohou vyrábět na vhodném stroji ze směsi práškových účinných látek, zvlhčených inertním kapalným ředidlem. Tablety se mohou popřípadě povlékat nebo opatřit zářezem a mohou se připravovat tak, aby se dosáhlo pomalého nebo řízeného uvolňování účinné látky při jejich použití, například zavedením hydroxypropylmethylcelulózy v měnících se poměrech k získání požadovaného profilu uvolňování. Tablety se mohou popřípadě opatřit enterickým povlakem, aby se dosáhlo uvolňování v části vnitřností, která je jiná než žaludek.

Prostředky, vhodné k perorálnímu použití, popsané výše, mohou také obsahovat pufr, určený k neutralizaci kyselosti žaludku. Takové pufry mohou být zvoleny z různých organických nebo anorganických činidel, jako jsou slabé kyseliny nebo báze, ve směsi se svými konjugovanými solemi.

Prostředky, vhodné k lokálnímu podání do úst, zahrnují pokroutky, obsahující účinnou složku ve vhodné bázi, obvykle v sacharóze aakacii nebo tragantu, pastilky, které obsahují účinnou látku a inertní bázi, jako je želatina nebo glycerin, nebo sacharóza a akacie, a ústní vody, které obsahují účinnou látku ve vhodné kapalné nosné látce.

Prostředky k rektálnímu podávání mohou být přítomny jako čípky, které například obsahují kakaové máslo nebo salicylát.

Prostředky, vhodné k vaginálnímu podání, mohou být přítomny jako pesary, tampony, krémy, želé, pasty, pěny nebo sprejové formulace, které obsahují kromě účinné látky látky nosné, o kterých je v oboru známo, že jsou vhodné k tomuto účelu.

Prostředky, vhodné k parenterálnímu podávání, zahrnují vodné a nevodné isotonické sterilní injekční roztoky, které mohou například obsahovat antioxidační činidla, pufiy, bakteriostatické přípravky a rozpuštěné látky, pomocí kterých se dosahuje isotonického stavu s krví zamýšleného příjemce, a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat například suspendační činidla a zahušťovadla, a liposomy nebo jiné makropartikulámí systémy, které jsou navrženy k dosažení toho, že se sloučenina stane složkou krve, nebo se dostane k jednomu nebo většímu počtu orgánů. Prostředky mohou být přítomny v zásobnících pro jedinou dávku nebo pro větší počet dávek, například v uzavřených ampulích nebo lahvičkách, a mohou se skladovat za lyofilních podmínek (dosažených vymražováním), vyžadujících toliko přídavek sterilní kapalné nosné látky, například vody pro injekce, bezprostředně před použitím. Extemporální injekční roztoky a suspenze se mohou vyrábět ze sterilních prášků, granulí a tablet druhů, které jsou popsány výše.

Výhodné prostředky, tvořené dávkovou jednotkou, jsou prostředky, které obsahují denní dávku nebo denní dílčí dávku, jak je popsána výše, účinné složky, nebo její příslušný díl.

-4CZ 282747 B6

Je třeba rozumět, že kromě složek, zvláště uvedených výše, prostředky podle tohoto vynálezu mohou zahrnovat také jiné látky, obvyklé v oboru s ohledem na typ příslušného prostředku. Například prostředky, vhodné k perorálnímu podání, mohou zahrnovat další látky, jako jsou sladidla, zahušťovadla a příchuti.

Sloučenina vzorce I se může vyrobit například tím, že

a) popřípadě chráněná 5-fluorcytosinová sloučenina se nechá reagovat s 1,3-oxathiolanem obecného vzorce IIA

ve kterém

Ri znamená atom vodíku nebo skupinu, chránící hydroxyskupinu, a L představuje odštěpitelnou skupinu, nebo

b) sloučenina obecného vzorce IIB

ve kterém

Ri má význam uvedený výše a

Ri^a představuje skupinu chránící aminoskupinu, se nechá reagovat s fluoračním činidlem, sloužícím k zavedení atomu fluoru do polohy 5 cytosinového kruhu, nebo

c) sloučenina obecného vzorce IIC

- 5 CZ 282747 B6 (HC),

O

ve kterém

R_t má význam uvedený výše, se nechá reagovat s činidlem, sloužícím k převedení oxoskupiny v poloze 4 uracilového kruhu na aminoskupinu a io libovolné chránící skupiny se odstraní například hydrolýzou za kyselých nebo bázických podmínek, za vzniku požadované sloučeniny.

S ohledem na způsob a), skupina, chránící hydroxyskupinu, zahrnuje chránící skupiny, jako je acyl (například acetyl), arylacyl (například benzoyl nebo substituovaný benzoyl), trityl nebo 15 monomethoxytrityl, benzyl nebo substituovaný benzyl, trialkylsilyl (například dimethyl-terc.butylsilyl) nebo difenylmethylsilyl. 5-R-cytosinová sloučenina může být popřípadě chráněna silylem, například trimethylsilylovými skupinami. Takové skupiny se mohou odstranit obvyklým způsobem. Odštěpitelná skupina L je odštěpující se skupina typu, známého v oboru chemie nukleosidů, například halogen, jako atom chloru nebo atom fluoru, alkoxyskupina, jako 20 methoxyskupina nebo ethoxyskupina, nebo acyl, jako je acetyl nebo benzoyl.

Reakce při způsobu a) se může provádět v organickém rozpouštědle (například 1,2-dichlorethanu nebo acetonitrilu) v přítomnosti Lewisovy kyseliny, jako je chlorid cíničitý nebo trimethylsilyltriflát.

Sloučeniny obecného vzorce IIA se mohou získat z vhodně chráněného 2-hydroxyacetaldehydu obecného vzorce III

R,OCH₂CHO (III), ve kterém

Ri má význam uvedený výše, jak je popsáno v Can. J. Research, 8, 129 /1933/ a evropském patentovém spise č. 0 382 526. Reakce sloučenin obecného vzorce III s merkaptoacetalem obecného vzorce

HSCH₂CH(OR)₂, ve kterém

R znamená alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jako se sloučeninou vzorce

-6CZ 282747 B6

HSCH₂CH(OC₂H5)₂, známá v oboru (Chem. Ber. 85, 924-932 /1952/), poskytne sloučeniny obecného vzorce IIA, ve kterém L představuje skupinu vzorce OR (alkoxyskupinu), například methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu. Podle jiného provedení se sloučeniny obecného vzorce IIA, ve kterém L znamená alkoxyskupinu, mohou převést na sloučeniny obecného vzorce ILA, ve kterém L znamená atom halogenu nebo acylovou skupinu, způsoby známými v oboru chemie cukrů.

Sloučeniny obecného vzorce III se mohou vyrobit z 1,2-O-isopropylidenglycerolu zavedením substituentu Ri (například trisubstituovaného silylu, benzylu nebo tritylu) a odstraněním isopropylidenové skupiny působením mírné kyseliny (například vodné kyseliny mravenčí nebo kyseliny octové) nebo bromidu zinečnaného v acetonitrilu a poté oxidací alkoholového zbytku vodným roztokem jodistanu.

Podle způsobu b) se fluor jako substituent polohy 5 může zavést způsoby, známými v oboru (M. J. Robin a kol. v Nucleic Acid Chemistry, část 2, L. B. Townsend a R. S. Tipson, vyd. J. Wiley and Sons, New York, str. 895 až 900/1978/ a odkazy tam uvedené, R. Duschinsky v Nucleic Acid Chemistry, část 1, L. B. Townsend a R. S. Tipson, vyd. J. Wiley and Sons, New York, str. 43 až 46 /1978/ a odkazy tam uvedené). Fluoračním činidlem může být například trimethylhypofluorit ve fluortrichlormethanu.

S ohledem na způsob c) se uvádí, že se sloučenina obecného vzorce IIC výhodně zpracuje s 1,2,4-triazolem, účelně dohromady s 4-chlorfenyldichlorfosfátem, za vzniku odpovídající 4(1,2,4-triazolylové) sloučeniny, která se potom převede na požadovanou 4-amino(cytidinovou) sloučeninu reakcí například s methanolem.

Výchozí sloučeniny obecného vzorce IIB a IIC se mohou vyrobit například reakcí vhodné (popřípadě chráněné) báze se sloučeninou obecného vzorce IIA analogickým způsobem, jako je popsán pod způsobem a). 5-Fluoruracil a 5-fluorcytosin jsou obchodně dostupné sloučeniny od firmy Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin 53233, USA.

Oddělení (±)-cis-isomeru a (±)-trans-isomeru například v chráněné formě, se může provádět chromatograficky na silikagelu za použití směsi organických rozpouštědel, jako směsi ethylacetátu a methanolu, ethylacetátu a hexanu nebo dichlormethanu a methanolu. Jakákoli chránící skupina se může potom odstranit za použití příslušného reakčního činidla pro každou skupinu.

Sloučenina vzorce I se může převést na své farmaceuticky přijatelné estery nebo amidy reakcí s příslušným acylačním činidlem, například halogenidem nebo anhydridem kyseliny, sloužícím k acylaci hydroxyskupiny v poloze 5' a aminoskupiny v poloze 4. Acylová skupina se může potom selektivně odstranit z hydroxyskupiny v poloze 5' nebo aminoskupiny v poloze 4, nebo z obou těchto skupin. Například zpracováním diacylované sloučeniny za kyselých podmínek, například působením Lewisovy kyseliny, jako bromidu zinečnatého v methanolu, se odstraní 4Nacylová skupina za vzniku odpovídajícího 5'-OH esteru, zatímco zpracováním diacylované sloučeniny za alkalických podmínek, například působením methoxidu sodného, se odstraní 5'OH acylová skupina, za vzniku odpovídajícího 4N-amidu. Acylové skupiny se také mohou odstranit selektivně zpracováním s komerčně dostupnými esterázovými nebo lipázovými enzymy, například esterázou z prasečích jater nebo lipázou ze slinivky břišní, nebo zpracováním podle způsobů, které jsou popsány v US patentovém spisu č. 5 071 983. Sloučenina vzorce I se může převést na svou farmaceuticky přijatelnou sůl obvyklým způsobem, například zpracováním s vhodnou bází. Ester nebo sůl sloučeniny vzorce I se může převést na základní sloučeninu například hydrolýzou.

-7CZ 282747 B6

Příklady provedení vynálezu

Pro lepší porozumění vynálezu jsou dále uvedené příklady, které jsou určeny pouze k ilustraci.

Příklad 1

Způsob výroby cis-l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosinu

Způsob A

Vyrobí se směs (±)-cis- a (±)-trans-2-benzoyloxymethyl-5-(N4-acetylcytosin-l-yl)-l,3-oxathiolanu a rozdělí se na (±)-cis- a (±)-trans-isomer, jak je popsáno v evropském patentovém spise č. 0 382 526. (±)-cis-Isomer se fluoruje působením trifluormethylhypofluoritu v fluortrichlormethanu a chloroformu za teploty -78 °C podle způsobu, který popsal Robins a kol. v Nucleic Acid Chemistry, část 2, str. 895 až 900 /1978/. N₄-Acetylová a 2-benzoylová skupina se odstraní působením dimethylaminu vethanolu a izoluje se výsledná sloučenina, (±)-cis-l-/2-(hydroxymethy 1)-1,3 -oxath iazolan- 5 -y l/-5-fluorcytos in.

Způsob B

Směs (±)-cis- a (±)-trans-2-benzoyloxymethyl-5-(uracil-l-yl)-l,3-oxathiolanu se vyrobí, jak je popsáno v evropském patentovém spise č. 0 382 526. Po odstranění 2-hydroxyskupiny nasyceným methanolickým roztokem amoniaku se isomery oddělí na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a methanolu jako elučního činidla (evropský patentový spis č. 0 382 526). (±)-cis-Isomer se nechá reagovat s anhydridem kyseliny octové v pyridinu za teploty místnosti na 2-acetát. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku při teplotě nižší než 30 °C. 2-Acetát se potom rozpustí v chloroformu a promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Oddělená organická vrstva se vysuší a chloroform se odpaří za sníženého tlaku. (±)-cis-2-Acetyloxymethyl5-(uracil-l-yl)-l,3-oxathiolan se fluoruje, jak je popsáno výše (způsob A) způsobem, který popsal Robins a kol. Konverze 5-fluoruracilové báze na 5-fluorcytosinovou bázi se provede tím, že se vyrobí 4-(l,2,4-triazol-l-ylový) derivát podle způsobů, které uvedl C. B. Reese v J. Chem. Soc., Perkins I, 1171 /1984/ a W. L. Sung v Nucleic Acids Res., 9, 6139 /1981/, za použití 1,2,4triazolu a 2 ekvivalentů 4-chlorfenyldichlorfosfátu v suchém pyridinu při teplotě místnosti. Po této konverzi se provede reakce s methanolem, předem nasyceným amoniakem, za teploty 0 °C a 2-acetát se hydrolýzuje, čímž se dojde k (±)-cis-l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5yl/-5-fluorcytosinu.

Farmaceutické prostředky

V dále uvedených prostředcích účinná složka označuje cis-1-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosin.

Příklad 2

Prostředky ve formě tablet

Dále uvedené prostředky A, B aC se vyrábějí granulací složek za vlhka s roztokem povidonu, poté přidáním stearátu hořečnatého a slisováním.

-8CZ 282747 B6

Prostředek A mg/tableta mg/tableta

a) účinná složka

b) laktóza B. P.

c) povidon B. P.

d) natriumglykolát škrobu

e) stearát hořečnatý celkem

250	250
210	26
15	9
20	12
5	3
500	300

Prostředek B mg/tableta mg/tableta

a) účinná složka	250	250
b) laktóza	150	-
c) Avicel PH 101	60	26
d) povidon B. P.	15	9
e) natriumglykolát škrobu	20	12
f) stearát hořečnatý	5	3
celkem	500	300

Prostředek C účinná složka laktóza škrob povidon stearát hořečnatý celkem mg/tableta

100

200

359

Dále uvedené prostředky D a E se vyrábějí přímým slisováním promíchaných složek. Laktóza v prostředku E je typu, určeného pro přímé slisování (Zeparox - Dairy Crest)

Prostředek D mg/tableta účinná složka

250 předželatinovaný škrob NF15 celkem

150

400

-9CZ 282747 B6

Prostředek E účinná složka laktóza

Avicel celkem mg/tableta

250

150

100

500

Prostředek F (Prostředek s řízeným uvolňováním)

Prostředek se vyrobí granulací složek za vlhka s roztokem povidonu, poté přídavkem stearátu hořečnatého a slisováním.

mg/tableta

a) účinná složka	500
b) hydroxypropylmethylcelulóza
(Methocel K4M Prémium)	112
c) laktóza B. P.	53
d) povidon B. P.	28
e) stearát hořečnatý	7
celkem	700

Uvolňování účinné látky nastává během období 6 až 8 hodin a je ukončeno po 12 hodinách.

Příklad 3

Prostředek ve formě kapslí

Prostředek A

Prostředek ve formě kapslí se vyrobí smícháním složek z prostředku D, uvedeného v příkladu 2 výše, a naplněním směsi do dvoudílných tvrdých želatinových kapslí. Prostředek B (popsaný dále) se vyrobí podobným způsobem.

Prostředek B mg/kapsle

a) účinná složka	250
b) laktóza B. P.	143
c) natriumglykolát škrobu	25
d) stearát hořečnatý	2
celkem	420

- 10CZ 282747 B6

Prostředek C účinná složka Macrogel 4000 B. P. celkem mg/kapsle

250

350

600

Prostředek D mg/kapsle účinná složka250 lecithin100 arašídový olej 100 celkem450

Kapsle z prostředku D se vyrobí dispergováním účinné složky v lecithinu a arašídovém oleji a plněním disperze do měkkých elastických želatinových kapslí.

Prostředek E (Kapsle s řízeným uvolňováním)

Dále uvedený prostředek, tvořený kapslí s řízeným uvolňováním, se vyrobí vytlačováním složek 15 a), b) a c) za použití extrudéru, poté sféronizací extrudátu a vysušením. Vysušené pelety se poté povléknou membránou d), řídící uvolňování, a plní do dvoudílných tvrdých želatinových kapslí mg/kapsle

a) účinná složka250

b) mikrokrystalická celulóza125

c) laktóza B. P.125

d) ethylcelulóza 13 celkem513

Příklad 4

Prostředek pro zavádění injekcí

Prostředek A účinná složka 0,200 g

0,1 M roztok kyseliny chlorovodíkové nebo

0,1 M roztok hydroxidu sodného, podle potřeby k úpravě hodnoty pH na 4,0 až 7,0 sterilní voda podle potřeby do 10 ml

Účinná látka se rozpustí jak nejvíce je možné ve vodě (o teplotě 35 až 40 ⁰ C) a hodnota pH se upraví na 4,0 až 7,0 podle potřeby přidáním kyseliny chlorovodíkové nebo hydroxidu sodného. 35 Násada se potom doplní na potřebný objem vodou, filtruje přes sterilní mikroporézní filtr do

- 11 CZ 282747 B6 sterilních skleněných lahviček jantarového zabarvení o objemu 10 ml (typu 1), uzavře sterilním uzávěrem a opatří záklapkou na láhve.

Prostředek B účinná látka sterilní fosfátový pufr, neobsahující pyrogenní látky, o hodnotě pH 7

0,125 g podle potřeby do 25 ml

Příklad 5

Intramuskulámí injekce účinná látka benzylalkohol

Glycofurol 75 voda pro injekce

0,20 g

0,10 g

1,45 g podle potřeby do 3,00 ml

Účinná složka se rozpustí v glukofurolu. Poté se přidá benzylalkohol a rozpustí a nato se přidá voda do 3 ml. Směs se poté filtruje přes sterilní mikroporézní filtr a uzavře do sterilních skleněných lahviček jantarového zbarvení o objemu 3 ml (typu 1).

Příklad 6

Sirup účinná látka roztok sorbitolu glycerol benzoát sodný příchuť, Peach 17.42.316 9 čištěná voda

0,25 g

1,50 g

2,00 g

0,005 g

0.0125 ml podle potřeby do 5,00 ml

Účinná složka se rozpustí ve směsi glycerolu a větší části čištěné vody. Poté se k roztoku přidá vodný roztok benzoátu sodného, nato roztok sorbitolu a nakonec příchuť. Objem se upraví čištěnou vodou a vše se dobře promíchá.

Příklad 7

Čípek účinná látka tvrdý tuk, B. P. (Witepsol H15 - Dynamit

Nobel) celkem mg/čípek

250

1770

2020

- 12 CZ 282747 B6

Jedna pětina Witepsolu H15 se roztaví v pánvi, opatřené parním pláštěm, za maximální teploty 45 °C. Účinná složka se prošije sítem s velikostí ok 200 μτη a přidá k roztavené bázi za míchání při použití Silversonova míchadla, opatřeného řeznou hlavou, přičemž míchání pokračuje, dokud se nedosáhne hladké disperze. Směs se udržuje za teploty 45 °C, k suspenzi se přidá zbývající Witepsol H15 a vše se míchá, aby se zajistila homogenní směs. Veškerá suspenze se vede přes síto z nerezavějící oceli s velikostí ok 250 pm a za nepřetržitého míchání se nechá ochladit na teplotu 40 °C. Za teploty 38 °C až 40 °C se 2,02 g směsi plní do vhodných forem o objemu 2 ml z plastické hmoty. Čípky se nechají vychladnout na teplotu místnosti.

Příklad 8

Pesar mg/pesar účinná látka250 anhydrát dextrózy380 bramborový škrob363 stearát hořečnatý 7 celkem1000

Výše popsané složky se přímo smíchají a pesary se připraví přímým slisováním výsledné směsi.

Příklad 9

Protivirový účinek proti viru hepatitidy B (HBV)

Sloučenina l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosin se testuje, jak je popsáno dále.

Producent lidského HBV buněčné linie HepG₂, 2.2.15, který popsal a charakterizoval Selíš a kol. v PNAS 84, 1005 /1987/ a v J. Virol. 62, 2836 /1988/, projevuje podíl na řadě charakteristických znaků hepatocytu, chronicky infikovaného virem hepatitidy B, který je infekční, jak je doloženo jeho schopností způsobit onemocnění u šimpanzů. Tato buněčná linie se použije in vitro ke zjištění proti-HBV účinku sloučenin.

K testovaní sloučeniny na protivirový účinek se monovrstva kultury uvádí do styku s 50 až 200 μΜ sloučeniny po dobu 10 dnů. Supematant prostředí, obsahující extracelulámí virion DNA (částice Dane), se zachycuje ve dnech 3,6 a 10, zpracuje sl mg/ml proteinázy Kal % dodecylsulfátem sodným a inkubuje za teploty 50 °C po dobu jedné hodiny. DNA se extrahuje stejným objemem fenolu a potom chloroformu a nato vysráží octanem amonným a propanolem. Vysrážená DNA se rozpustí a zachycuje na nitrocelulóze způsobem, který popsal Schlicher a Schull (S & S, 10 Optical Ave., Keene, NH 03431, publikace 4, 700 /1987/), a dále zpracuje, jak popsal Southem v J. Mol. Biol. 98, 503 /1975/). Buňky se zachytí a intracelulámí DNA se dostane po lýze buněk působením guanidinisothiokyanátu. Intracelulární buňky DNA se zpracují stejným způsobem, jako extracelulámí DNA. Po vysrážení octanem amonným a propanolem se sraženina intracelulámích DNA rozpustí, provede řez restrikční endonukleázou, Hind III, aplikovanou na agarózovém gelu a potom se zpracuje, jak popsal Southem, ke stanovené množství replikační intermediátové formy. Protivirový účinek sloučeniny se stanovuje měřením při alespoň stonásobném snížení množství částic Dane, extrudovaných do kultivačního prostředí, a podobném poklesu v intracelulámích replikačních intermediátech.

- 13 CZ 282747 B6

Výsledky se uvádějí v tabulce dále.

Tabulka

Účinek cis-l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosinu na HBV produkci v buněčných kulturách 2.2.15

Intracelulámí HBV DNA*

Testovaná sloučenina (μΜ)	Celkově	Monomer	Replikační intermediát	HBV DNA v kultivačním prostředí (pg/ml)⁺⁺
den 0	den 3	den 6	den 10
A. neošetřené	1,1	2,0	81	58	67	93	77
buňky	0,9	2,3	77	89	110	100	88
100	1,9	0,8	2	64	11	3	0
	1,5	1,9	1	34	19	2	0
B. neošetřené	1,5	1,9	110	65	44	86	71
buňky	1,0	2,3	67	90	120	80	82
100	1,6	0,8	1	90	16	0	0
	1,0	0,7	1	74	10	0	0

Analýza intracelulámí HBV DNA (částice Dane) se provádí za 24 hodiny po 10 dnech zpracování

Číslo nula (0) je ukazatelem neidentifikovatelné úrovně HBV DNA, hraniční citlivost činí 0,1 pg/ml

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použití l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosinu vzorce I nebo jeho fyziologicky funkčního derivátu k výrobě farmaceutického prostředku pro ošetřování nebo profylaxi infekce, způsobené virem hepatitidy B.

2. Použití podle nároku 1 l-/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosinu vzorce I nebo jeho fyziologicky funkčního derivátu ve formě cis-isomeru.

- 14CZ 282747 B6

3. Použití podle nároku 1, přičemž fyziologicky funkčním derivátem je farmaceuticky přijatelná sůl nebo ester l/2-(hydroxymethyl)-l,3-oxathiazolan-5-yl/-5-fluorcytosinu vzorce I.