DE69232649T2

DE69232649T2 - Verwendung von 5-fluoro-2'-deoxy-3'-thiacytidin zur behandlung von hepatitis b

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Publication number: DE69232649T2
Application number: DE69232649T
Authority: DE
Inventors: Woo-Baeg Choi; Dennis C. Liotta; Raymond F. Schinazi
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1991-03-06
Filing date: 1992-03-05
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2012-03-06
Also published as: SK279542B6; JP3479068B2; CA2105486A1; EP1142891A1; JP2011102308A; ATE361293T1; CA2105486C; JPH06505725A; DE69232649D1; AU1367692A; EP1808434A2; HUT64844A; ES2179040T3; DK0574487T3; ES2286072T3; JP2010013466A; PT100198A; WO1992015308A1; IE920701A1; CZ282747B6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines 1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5-yl)-cytosinderivats und physiologisch funktionellen Derivaten davon zur Behandlung von Hepatitis-B-Virus-Infektionen.
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein virales Pathogen von weltweit großer Bedeutung. HBV ist in asiatischen Ländern und vorwiegend in Afrika, in der Sub-Sahara, sehr verbreitet. Das Virus ist ätiologisch mit primärem hepatozellulärem Karzinom verbunden und es wird angenommen, dass es weltweit 80% des Leberkrebses verursacht. In den Vereinigten Staaten werden mehr als zehntausend Menschen jedes Jahr aufgrund HBV-Krankheit in Krankenhäuser eingeliefert, wobei im Durchschnitt 250 an dieser plötzlich ausbrechenden Krankheit sterben. Die Vereinigten Staaten haben gegenwärtig eine geschätzte Anzahl von 500 000-1 Million infektiösen Trägern. Chronisch aktive Hepatitis wird sich bei über 25% der Träger entwickeln und häufig als Zirrhose verlaufen. Es wird geschätzt, dass in den USA 5000 Menschen jedes Jahr an HBV-bedingter Zirrhose sterben und dass möglicherweise 1000 an HBV-bedingtem Leberkrebs sterben. Auch wenn ein universeller HBV-Impfstoff vorliegt, besteht fortwährender Bedarf für wirksame Anti-HBV-Verbindungen. Ein großes Reservoir von persistent infizierten Trägern, weltweit auf 220 Millionen geschätzt, wird keinen Vorteil von einer Impfung haben und wird bei hohem Risiko für eine HBV-induzierte Lebererkrankung fortbestehen. Diese Trägerpopulation wirkt als Infektionsherd für anfällige Individuen unter Erhaltung der Erkrankung, insbesondere in endemischen Bereichen oder bei mit hohem Risiko behafteten Gruppen, wie i.v.- Drogenabhängigen und Homosexuellen. Somit gibt es einen starken Bedarf für wirksame antivirale Mittel, sowohl zum Bekämpfen der chronischen Infektion als auch, um das Fortschreiten zu hepatozellulären Karzinomen zu vermindern.
Klinische Wirkungen der Infektion mit HBV liegen im Bereich von Kopfschmerz, Fieber, Unwohlsein, Nausea, Erbrechen, Anorexia und abdominalen Schmerzen. Die Replikation des Virus wird gewöhnlich durch die Immunreaktion gesteuert, wobei ein Verlauf der Erholung bei Menschen Wochen oder Monate anhält, jedoch kann die Infektion viel schwerer sein, was, wie vorstehend ausgewiesen, zu einer anhaltend chronischen Lebererkrankung führt. "Viral Infections of Humans" (zweite Ausgabe, Hrsg. Evans, A. S. (1982) Plenum Publishing Corporation, New York), Kapitel 12, beschreibt die Ätiologie von viralen Hepatitis-Infektionen. EP 0 382 526 offenbart eine Gruppe von 1,3-Oxathiolannucleosiden für die Behandlung von Viren und insbesondere HIV. Die Verbindung 2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorcytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan ist in dieser Beschreibung möglicherweise generisch, jedoch nicht im Einzelnen offenbart und wird für die Behandlung von HIV, nicht Hepatitis-B-Virus, generisch offenbart. EP-A-0 206 497 offenbart ein 2,6-Diaminopurin-9-β-D-2',3'-didesoxyribofuranosid für die Behandlung einer viralen Infektion und insbesondere HIV. Gastroenterology, Band 94, Nr. 5, Teil 2, 1988, A552, offenbart die Wirkung von 2',3'-Didesoxycytidin beim Enten-Hepatitis-B-Virus. WO92/14743 beschreibt die Verwendung von 2-Hydroxymethyl-5(5-fluorcytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan und seinen Enantiomeren bei der Behandlung von HIV und HBV.
Wir haben nun überraschenderweise gefunden, dass ein cis-1-(2-(Hydroxymethyl)- 1,3-oxathiolan-5-yl)-cytosinderivat der Formel I
nämlich cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin und physiologisch funktionelle Derivate davon, potentielle Wirkung gegen HBV aufweisen.
Es sollte angemerkt werden, dass die Verbindung der Formel (I) zwei chirale Zentren enthält und deshalb in Form von zwei Paaren von optischen Isomeren (das heißt Enantiomeren) und Gemischen davon, die racemische Gemische einschließen, vorliegt. Somit kann die Verbindung der Formel (I) entweder als ein cis- oder ein trans- Isomer oder Gemische davon vorliegen. Jedes cis- und trans-Isomer kann als eines von zwei Enantiomeren oder Gemischen davon, einschließlich racemischen Gemischen, vorliegen. Alle solche cis-Isomeren und Gemische davon, einschließlich racemische Gemische, und tautomere Formen der Verbindung der Formel (I) liegen im Umfang der Erfindung.
Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung stellen wir die Verwendung der cis-Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, Amids, Esters oder Salzes eines Esters davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer Hepatitis-B-Virus-Infektion bereit.
Das Arzneimittel kann zur Behandlung oder Prophylaxe einer Hepatitis-B-Virus- Infektion in einem Wirt, beispielsweise einem Säuger, wie einem Menschen, durch Behandeln des Wirts mit einer therapeutisch wirksamen Menge der cis-Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, Amids, Esters oder Salzes eines Esters davon verwendet werden.
Der Begriff "physiologisch funktionelles Derivat" bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Salz, Amid, Ester oder Salz eines Esters der Verbindung der Formel (I).
Bevorzugte Ester gemäß der Erfindung schließen Carbonsäureester, worin die Nicht- Carbonyl-Einheit des Carbonsäureteils der Estergruppierung aus geradem oder verzweigtkettigem Alkyl, beispielsweise n-Propyl, t-Butyl, n-Butyl, Alkoxyalkyl (beispielsweise Methoxymethyl), Arylalkyl (beispielsweise Benzyl), Aryloxyalkyl (beispielsweise Phenoxymethyl) und Aryl (beispielsweise Phenyl) ausgewählt ist; Sulfonatester, wie Alkyl- oder Arylalkylsulfonyl (beispielsweise Methansulfonyl); Aminosäureester (beispielsweise L-Valyl oder L-Isoleucyl); Dicarbonsäureester (beispielsweise Hemisuccinat) und 5'-Mono-, Di- oder Triphosphatester ein. Die Phosphatester können beispielsweise durch einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkohol oder ein reaktives Derivat davon, oder durch ein 2,3-Di(C&sub6;&submin;&sub2;&sub4;)acylglycerin weiter verestert werden. Jede Alkyleinheit, die in solchen Estern vorliegt, enthält vorteilhafterweise 1 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Jede in solchen Estern vorliegende Aryleinheit umfasst vorteilhafterweise eine Phenylgruppe, gegebenenfalls substituiert beispielsweise mit Halogen, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy oder Nitro.
Die vorstehend erwähnten pharmazeutisch verträglichen Amide der cis-Verbindung der Formel (I) schließen jene Derivate ein, worin die Cytosin-Amino-Gruppe in Form eines Amids, beispielsweise -NHCOR, worin R C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl oder Aryl (beispielsweise Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy, Nitro oder Hydroxyl) darstellt, vorliegt.
Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Salze gemäß der Erfindung schließen Basensalze, beispielsweise abgeleitet von einer geeigneten Base, wie Alkalimetall- (beispielsweise Natrium-), Erdalkalimetall- (beispielsweise Magnesium-)-Salzen, Ammonium und NX&sub4;&spplus; (worin X C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl darstellt), ein. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze schließen Salze von organischen Carbonsäuren, wie Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Isethion-, Lactobion- und Bernsteinsäuren, organische Sulfonsäuren, wie Methansulfon-, Ethansulfon-, Benzolsulfon- und p-Toluolsulfonsäure, und anorganische Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Phosphor- und Sulfaminsäuren, ein.
Die Menge der cis-Verbindung der Formel (I) (nachstehend auch als der "Wirkstoff" bezeichnet) oder des pharmazeutisch verträglichen Salzes, Amids, Esters oder Salzes eines Esters davon, die in einer Medikation erforderlich ist, um die gewünschte Wirkung zu erreichen, wird von einer Vielzahl von Faktoren, insbesondere der besonderen Verabreichung, der Natur der verwendeten jeweiligen Verbindung, der Verabreichungsart und dem Zustand des Patienten abhängen. Im Allgemeinen wird eine geeignete Dosis im Bereich von 3,0 bis 120 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Einnehmenden pro Tag, vorzugsweise im Bereich 6 bis 90 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag und besonders bevorzugt im Bereich 15 bis 60 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegen. Die gewünschte Dosis wird vorzugsweise als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Teildosierungen verabreicht, wobei sie in geeigneten Intervallen über den Tag dargereicht werden. Diese Teildosierungen können in Einheitsdosierungsformen, die beispielsweise 10 bis 1500 mg, vorzugsweise 20 bis 1000 mg und besonders bevorzugt 50 bis 700 mg des Wirkstoffs pro Einheitsdosierungsform enthalten, verabreicht werden.
Idealerweise sollte der Wirkstoff zum Erreichen von Plasmaspitzenkonzentrationen des Wirkstoffs von etwa 1 bis etwa 75 uM, vorzugsweise etwa 2 bis 50 uM, besonders bevorzugt etwa 3 bis etwa 30 uM, verabreicht werden. Dies kann beispielsweise durch die intravenöse Injektion einer 0,1- bis 5%igen Lösung des Wirkstoffs, gegebenenfalls in Salzlösung, oder oral verabreicht als Bolus, der etwa 1 bis etwa 100 mg/kg Wirkstoff enthält, erreicht werden. Wünschenswerte Blutspiegel können durch eine kontinuierliche Infusion unter Bereitstellung von etwa 0,01 bis etwa 5,0 mg/kg/Stunde oder durch unterbrochene Infusionen, die etwa 0,4 bis etwa 15 mg/kg Wirkstoff enthalten, gehalten werden.
Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels, nachstehend als eine "Formulierung" bezeichnet, wird die cis-Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz, Amid, Ester oder Salz eines Esters davon, hierin als "Wirkstoff" bezeichnet, typischerweise unter anderem mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Träger(n) oder Exzipienten und gegebenenfalls anderen therapeutischen Mitteln angemischt.
Die Formulierungen schließen jene, die zur oralen, rektalen, nasalen, örtlichen (einschließlich transdermalen, buccalen und sublingualen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intramuskulären, intravenösen und intradermalen) Verabreichung geeignet sind, ein. Die Formulierungen können geeigneterweise in Einheitsdosierungsform dargereicht werden oder können durch beliebige Verfahren, die auf dem pharmazeutischen Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Solche Verfahren schließen den Schritt des In-Verbindung-Bringens des Wirkstoffs mit dem Träger, der einen oder mehrere Hilfsbestandteile enthält, ein. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichförmiges und inniges In-Verbindung-Bringen des Wirkstoffs mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern, oder Beides, und dann, falls erforderlich, Formen des Produkts, hergestellt.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Oblatenkapseln oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs enthalten, als ein Pulver oder Granulat, als eine Lösung oder Suspension in einer wässerigen oder nichtwässerigen Flüssigkeit, oder als eine flüssige Öl-in-Wasser-Emulsion oder eine flüssige Wasser-in-Öl-Emulsion dargereicht werden. Der Wirkstoff kann auch als Bolus, Latwerge oder Paste dargereicht werden.
Eine Tablette kann durch Verdichtung oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen, hergestellt werden. Verdichtete Tabletten können durch Verdichten des Wirkstoffs in einer geeigneten Maschine in einer freifließenden Form, wie einem Pulver oder Granulat, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel (beispielsweise Povidon, Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose), Gleitmittel, inertem Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Sprengmittel (beispielsweise Natriumstärkeglycollat, vernetztes Povidon, vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktives oder dispergierendes Mittel, hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen eines Gemisches der gepulverten Verbindung, angefeuchtet mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Die Tabletten können gegebenenfalls beschichtet oder gekerbt sein und können so formuliert werden, dass langsame oder gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs darin bereitgestellt wird, wobei beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen zur Bereitstellung des gewünschten Freisetzungsprofils eingesetzt wird. Tabletten können gegebenenfalls mit einer enterischen Beschichtung versehen sein, um Freisetzung in Teilen des Darms, und nicht im Magen, bereitzustellen.
Zur oralen, wie vorstehend beschriebenen Verwendung geeignete Formulierungen können auch Puffermittel, aufgebaut, um die Magensäure zu neutralisieren, einschließen. Solche Puffer können aus einer Vielzahl von organischen oder anorganischen Mitteln, wie schwachen Säuren oder Basen, angemischt mit ihren konjugierten Salzen, ausgewählt werden.
Zur örtlichen Verabreichung im Mund geeignete Formulierungen schließen Pastillen (lozenges), umfassend den Wirkstoff auf einer mit Geschmack versehenen Basis, gewöhnlich Saccharose und Acacia oder Tragacanth, Pastillen, umfassend den Wirkstoff in einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Acacia, und Mundwaschungen, umfassend den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger, ein.
Formulierungen zur rektalen Verabreichung können als ein Suppositorium mit einer geeigneten Base, umfassend beispielsweise Kakaobutter oder ein Salicylat, dargereicht werden.
Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprühformulierungen, die zusätzlich zu dem Wirkstoff solche Träger enthalten, die auf dem Fachgebiet als geeignet bekannt sind, dargereicht werden.
Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wässerige und nichtwässerige, isotonische, sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung mit dem Blut des vorgesehenen Rezipienten isotonisch machen; und wässerige und nichtwässerige, sterile Suspensionen, die suspendierende Mittel und Verdickungsmittel, wie Liposomen oder andere mikroteilchenförmige Systeme, die aufgebaut sind, um Verbindungen für Blutkomponenten auf ein Organ oder mehrere Organe zu lenken, einschließen können, ein. Die Formulierungen können in verschlossenen Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behältern, beispielsweise Ampullen und Fläschchen, dargereicht werden und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand, der nur die Zugabe des sterilen, flüssigen Trägers, beispielsweise Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erfordert, gelagert werden. Extemporäre Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der vorstehend beschriebenen Art hergestellt werden.
Bevorzugte Einheitsdosierungsformulierungen sind jene, die eine tägliche Dosis oder Einheit, tägliche Teildosis, wie vorstehend hierin angeführt, oder einen geeigneten Teil davon als Wirkstoff enthalten.
Es sollte selbstverständlich sein, dass zusätzlich zu den vorstehend besonders erwähnten Bestandteilen der Formulierungen diese Erfindung auch andere Mittel, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bezüglich der Art der infrage kommenden Formulierung, einschließen kann, beispielsweise können jene, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, weitere Mittel, wie Süßungsmittel, Verdickungsmittel und Geschmacksmittel, einschließen.
Die Verbindung der Formel I kann beispielsweise hergestellt werden durch: a) Umsetzen einer gegebenenfalls geschützten 5-F-Cytosinverbindung mit einem 1,3-Oxathiolan der Formel IIA
worin R&sub1; Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe darstellt und L eine Abgangsgruppe darstellt; oder b) Umsetzen einer Verbindung der Formel IIB
(worin R&sub1; wie vorstehend definiert ist und R&sub1;a eine Aminoschutzgruppe darstellt) mit einem Fluorierungsmittel, das dazu dient, ein Fluoratom in der 5-Stellung des Cytosinrings einzuführen; oder c) Umsetzen einer Verbindung der Formel IIC
(worin R&sub1; wie vorstehend definiert ist) mit einem Mittel, das dazu dient, die Oxogruppe in der 4-Stellung des Uracilrings in eine Aminogruppe umzuwandeln, wobei die verbleibenden Schutzgruppen beispielsweise durch Säure- oder Basehydrolyse unter Erzeugung des gewünschten Produkts entfernt werden.
Bezüglich Verfahren a) schließt die Hydroxyschutzgruppe Schutzgruppen, wie Acyl (beispielsweise Acetyl), Arylacyl (beispielsweise Benzoyl oder substituiertes Benzoyl), Trityl oder Monomethoxytrityl, Benzyl oder substituiertes Benzyl, Trialkylsilyl (beispielsweise Dimethyl-t-butylsilyl) oder Diphenylmethylsilyl, ein. Die 5-R-Cytosinverbindung kann gegebenenfalls mit Silyl, beispielsweise Trimethylsilylgruppen, geschützt sein. Solche Gruppen können in herkömmlicher Weise entfernt werden. Die Abgangsgruppe L ist eine Abgangsgruppe, die für jene typisch ist, die auf dem Fachgebiet der Nucleosidchemie bekannt sind, beispielsweise Halogen, wie Chlor oder Brom, Alkoxy, wie Methoxy oder Ethoxy, oder Acyl, wie Acetyl oder Benzoyl.
Die Reaktion in Verfahren a) kann in einem organischen Lösungsmittel (beispielsweise 1,2-Dichlorethan oder Acetonitril) in Gegenwart einer Lewis-Säure, beispielsweise Zinn(II)chlorid oder Trimethylsilyltriflat bewirkt werden.
Die Verbindungen der Formel IIA können aus einem geeignet geschützten 2- Hydroxyacetaldehyd der Formel III
R&sub1;OCH&sub2;CHO (III),
worin R&sub1; wie vorstehend definiert ist, wie beschrieben in Can. J. Research, 8, 129 (1933) und der europäischen Patentbeschreibung 0 382 526, erhalten werden. Die Reaktion von Verbindungen der Formel III mit einem Mercaptoacetal HSCH&sub2;CH(OR)&sub2;, worin R C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy darstellt, wie HSCH&sub2;CH(OC&sub2;H&sub5;)&sub2;, die auf dem Fachgebiet (Chem. Ber. 85: 924-932, 1952) bekannt ist, ergibt Verbindungen der Formel IIA, worin L OR (Alkoxy), beispielsweise Methoxy oder Ethoxy, darstellt. Alternativ können Verbindungen der Formel IIA, worin L Alkoxy darstellt, zu Verbindungen der Formel IIA, worin L Halogen oder Acyl darstellt, durch auf dem Fachgebiet der Kohlenhydratchemie bekannte Verfahren umgewandelt werden.
Die Verbindungen der Formel III können aus 1,2-O-Isopropylidenglycerin durch Einführung von R&sub1; (beispielsweise trisubstituiertes Silyl, Benzyl oder Trityl) und Entfernen der Isopropylidengruppe mit einer schwachen Säure (beispielsweise wässerige Ameisen- oder Essigsäure) oder Zinkbromid in Acetonitril, gefolgt von Oxidation der Alkoholgruppe mit wässerigem Perjodat, hergestellt werden.
Bezogen auf Verfahren b), kann der 5-Fluorsubstituent durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren (M.J. Robins, et al., in Nucleic Acid Chemistry, Teil 2, L.B. Townsend and R.S. Tipson, Herausgeber, J. Wiley and Sons, New York, 895-900 (1978) und Literaturstellen hierin; R. Duschinsky in Nucleic Acid Chemistry, Teil 1, L.B. Townsend and R.S. Tipson, Herausgeber, J. Wiley and Sons, New York, 43-46 (1978) und Literaturstellen hierin) eingeführt werden. Das Fluorierungsmittel kann beispielsweise Trimethylhypofluorit in Fluortrichlormethan sein.
Bezogen auf Verfahren c), wird die Verbindung der Formel IIC vorteilhafterweise mit 1,2,4-Triazol, vorteilhafterweise zusammen mit 4-Chlorphenyldichlorphosphat, unter Bildung der entsprechenden 4-(1,2,4-Triazolyl)verbindung, die dann zu der gewünschten 4-Amino(cytidin)verbindung umgewandelt wird, durch Reaktion mit beispielsweise Methanol behandelt.
Die Ausgangsmaterialien der Formel IIB und IIC können beispielsweise durch Umsetzung einer geeigneten (gegebenenfalls geschützten) Base mit einer Verbindung der Formel IIA in einer analogen Weise zu jener, beschrieben in Verfahren a), hergestellt werden. 5-Fluoruracil und 5-Fluorcytosin sind kommerziell von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, USA, erhältlich.
Die Abtrennung der (±)-cis- und (±)-trans-Isomere, beispielsweise in einer geschützten Form, kann durch Chromatographie an Kieselgel mit Gemischen von organischen Lösungsmitteln, wie Essigsäureethylester/Methanol, Essigsäureethylester/Hexan oder Dichlormethan/Methanol, ausgeführt werden. Eine beliebige Schutzgruppe kann dann unter Verwendung des geeigneten Reagenz für jede Gruppe entfernt werden.
Die Verbindung der Formel (I) kann durch Reaktion mit einem geeigneten Acylierungsmittel, beispielsweise einem Säurehalogenid oder -anhydrid, das dazu dient, die 5'-OH- und 4-NH&sub2;-Gruppen zu acylieren, in pharmazeutisch verträgliche Ester und Amide umgewandelt werden. Die Acylgruppe kann dann selektiv von einer oder der anderen der 5'-OH- und 4-NH&sub2;-Gruppen entfernt werden. Beispielsweise entfernt die Behandlung der diacylierten Verbindung unter sauren Bedingungen, beispielsweise einer Lewis-Säure, wie Zinkbromid in Methanol, die 4 N-Acylgruppe, unter Erzeugen des entsprechenden 5'-OH-Esters, wenn Behandlung der diacylierten Verbindung unter alkalischen Bedingungen, beispielsweise mit Natriummethoxid, die 5'- OH-Acylgruppe entfernt, unter Gewinnung des entsprechenden 4 N-Amids. Die Acylgruppen können auch selektiv durch Behandlung mit kommerziell erhältlichen Esterase- oder Lipaseenzymen, beispielsweise Schweineleberesterase oder Pankreaslipase, oder durch Behandlung gemäß in US-Patentbeschreibung Nr. 5071983 beschriebenen Verfahrens, entfernt werden. Die Verbindung der Formel (I) kann in herkömmlicher Weise, beispielsweise durch Behandlung mit einer geeigneten Base, in ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon umgewandelt werden. Ein Ester oder Salz einer Verbindung der Formel (I) kann in die Stammverbindung, beispielsweise durch Hydrolyse, umgewandelt werden.
Für ein besseres Verständnis der Erfindung werden die nachstehenden Beispiele zur Erläuterung angegeben.

Beispiel 1: cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin

Verfahren A: (±)-cis- und (±)-trans-2-Benzoyloxymethyl-5-(N&sub4;-acetylcytosin-1-yl)-1,3- oxathiolan werden hergestellt und in die (±)-cis- und (±)-trans-Isomeren, wie in der europäischen Patent-(EP)-Beschreibung 0 382 526 beschrieben, getrennt. Das (±)- cis-Isomer wird mit Trifluormethylhypofluorit in Fluortrichlormethan (CCl&sub3;F) und Chloroform bei -78ºC gemäß dem Verfahren von Robins et al. fluoriert. Nucleic Acid Chemistry, Teil 2, 895-900, 1978. Die N&sub4;-Acetyl- und 2-Benzoylgruppen werden mit Dimethylamin in Ethanol entfernt und das Produkt, (±)-cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin, wird isoliert.
Verfahren B: (±)-cis- und (±)-trans-2-Benzoyloxymethyl-5-(uracil-1-yl)-1,3-oxathiolan werden, wie in EP 0 382 526 beschrieben, hergestellt. Nach Entfernung der Schutzgruppen der 2-Hydroxylgruppe mit gesättigtem methanolischem Ammoniak werden die Isomeren auf Kieselgel, unter Verwendung von EtOAc/MeOH als Elutionsmittel (EP 0 382 526), getrennt. Das (±)-cis-Isomer wird mit Essigsäureanhydrid in Pyridin bei Raumtemperatur umgesetzt, unter Gewinnung des 2-Acetats. Das Lösungsmittel wird im Vakuum bei < 30ºC entfernt. Das 2-Acetat wird dann in CHCl&sub3; gelöst und mit wässerigem Natriumbicarbonat gewaschen. Die getrennte organische Schicht wird getrocknet und CHCl&sub3; wird im Vakuum verdampft. (±)-cis-2-Acetyloxymethyl-5- (uracil-1-yl)-1,3-oxathiolan wird wie vorstehend beschrieben (Verfahren A) durch das Verfahren von Robins et al. fluoriert. Die Umwandlung der 5-F-Uracilbase zu der 5-F- Cytosinbase wird durch die Herstellung des 4-(1,2,4-Triazol-1-yl)derivats gemäß den Verfahren von C.B. Reese, J. Chem. Soc., Perkins I, 1171, 1984, und W.L. Sung, Nucleic Acids Res. 9: 6139, 1981, unter Verwendung von 1,2,4-Triazol und 2 Äquivalenten 4-Chlorphenyldichlorphosphat in trockenem Pyridin bei Umgebungstemperatur, ausgeführt. Dieser Umwandlung folgt die Reaktion mit Methanol, das vorher mit Ammoniak bei 0ºC gesättigt wurde und das 2-Acetat wird zur Gewinnung von (±)- cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin hydrolysiert.

Pharmazeutische Formulierungen

In den nachstehenden Formulierungsbeispielen ist der "Wirkstoff" cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin.

Beispiel 2

Tablettenformulierungen

Die nachstehenden Formulierungen A, B und C werden durch Nassgranulierung der Bestandteile mit einer Lösung von Povidon, gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verdichtung, hergestellt. Formulierung A Formulierung B

Formulierung C

mg/Tablette

Wirkstoff 100
Lactose 200
Stärke 50
Povidon 5
Magnesiumstearat 4
359
Die nachstehenden Formulierungen D und E werden durch direkte Verdichtung der angemischten Bestandteile hergestellt. Die Lactose in Formulierung E ist vom direkten Verdichtungstyp (Dairy Crest - "Zeparox").

Formulierung D

mg/Tablette

Wirkstoff 250
Vorgelierte Stärke NF15 150
400

Formulierung E

mg/Tablette

Wirkstoff 250
Lactose 150
Avicel 100
500

Formulierung F (Formulierung zur gesteuerten Freisetzung)

Die Formulierung wird durch Nassgranulierung der Bestandteile (nachstehend) mit einer Lösung von Povidon, gefolgt von der Zugabe von Magnesiumstearat und Verdichtung, hergestellt.

mg/Tablette

(a) Wirkstoff 500
(b) Hydroxypropylmethylcellulose (Methocel K4M Premium) 112
(c) Lactose B.P. 53
(d) Povidon B.P. 28
(e) Magnesiumstearat 7
700
Die Arzneistoffabgabe findet innerhalb eines Zeitraums von etwa 6-8 Stunden statt und ist nach 12 Stunden abgeschlossen.

Beispiel 3

Kapselformulierungen

Formulierung A

Eine Kapselformulierung wird durch Anmischen der Bestandteile von Formulierung D in vorstehendem Beispiel 2 und Füllen in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel hergestellt. Formulierung B (nachstehend) wird in einem ähnlichen Verfahren hergestellt.

Formulierung B

mg/Kapsel

(a) Wirkstoff 250
(b) Lactose B.P. 143
(c) Natriumstärkeglycollat 25
(d) Magnesiumstearat 2
420

Formulierung C

mg/Kapsel

(a) Wirkstoff 250
(b) Macrogol 4000 B.P. 350
600

Formulierung D

mg/Kapsel

Wirkstoff 250
Lecithin 100
Erdnussöl 100
450
Die Kapseln für Formulierung D werden durch Dispergieren des Wirkstoffs in Lecithin und Erdnussöl und Füllen der Dispersion in weiche, elastische Gelatinekapseln hergestellt.

Formulierung E (Kapsel zur gesteuerten Freigabe)

Die nachstehende Formulierung der Kapsel zur gesteuerten Freigabe wird durch Extrudieren von Bestandteilen a, b und c unter Anwendung eines Extruders, gefolgt von Sphäronisierung des Extrudats und Trocknen, hergestellt. Die getrockneten Pellets werden dann mit der Membran (d) zur gesteuerten Freisetzung beschichtet und in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel gefüllt.

mg/Kapsel

(a) Wirkstoff 250
(b) Mikrokristalline Cellulose 125
(c) Lactose B.P. 125
(d) Ethylcellulose 13
513

Beispiel 4

Injizierbare Formulierung

Formulierung A

Wirkstoff 0,200 g
Salzsäurelösung, 0,1 M oder
Natriumhydroxidlösung, 0,1 M q.s. auf pH 4,0 bis 7,0
Steriles Wasser q.s. auf 10 ml
Der Wirkstoff wird in dem Meisten des Wassers (35ºC-40ºC) gelöst und der pH- Wert, falls geeignet, mit Salzsäure oder Natriumhydroxid zwischen 4,0 und 7,0 eingestellt. Die Charge wird dann auf ein Volumen mit Wasser aufgefüllt und durch ein steriles Mikroporen-Filter in ein steriles bernsteinfarbenes 10-ml-Glasfläschchen (Typ 1) filtriert und mit sterilem Deckel und Überzug verschlossen.

Formulierung B

Wirkstoff 0,125 g
Steriler, Pyrogen-freier, pH 7
Phosphatpuffer q.s. auf 25 ml

Beispiel 5

Intramuskuläre Injektion

Wirkstoff 0,20 g
Benzylalkohol 0,10 g
Glycofurol 75 1,45 g
Benzylalkohol q.s. auf 3,00 ml
Der Wirkstoff wird in Glycofurol gelöst. Der Benzylalkohol wird dann zugegeben und gelöst und Wasser wird auf 3 ml zugegeben. Das Gemisch wird dann durch ein steriles Microporen-Filter filtriert und in sterile bernsteinfarbenes 3-ml-Glasfläschchen (Typ 1) gefüllt und diese verschlossen.

Beispiel 6

Sirup

Wirkstoff 0,25 g
Sorbitlösung 1,50 g
Glycerin 2,00 g
Natriumbenzoat 0,005 g
Geschmack, Pfirsich 17.42.316 9 0,0125 ml
Gereinigtes Wasser q.s. auf 5,00 ml
Der Wirkstoff wird in einem Gemisch von Glycerin und dem Meisten des gereinigten Wassers gelöst. Eine wässerige Lösung des Natriumbenzoats wird dann zu der Lösung gegeben, gefolgt von der Zugabe der Sorbitlösung und schließlich des Geschmacks. Das Volumen wird mit gereinigtem Wasser aufgefüllt und gut vermischt.

Beispiel 7

Suppositorium

mq/Suppositorium

Wirkstoff 250
Hartfett, B.P. (Witepsol H15 - Dynamit Nobel) 1770
2020
Ein Fünftel des Witepsol H15 wird in einer dampfummantelten Pfanne bei maximal 45ºC geschmolzen. Der Wirkstoff wird durch ein 200 M Sieb bewegt und zu der geschmolzenen Base unter Mischen, unter Anwendung eines Silverson, ausgestattet mit einem Schneidkopf, gegeben, bis eine glatte Dispersion erreicht wird. Unter Halten des Gemisches bei 45ºC wird das verbleibende Witepsol H15 zu der Suspension gegeben und gerührt, um ein homogenes Mischen zu sichern. Die gesamte Suspension wird durch ein 250-M-Edelstahlsieb geleitet und unter kontinuierlichem Rühren auf 40ºC abkühlen lassen. Bei einer Temperatur von 38ºC bis 40ºC werden 2,02 g des Gemisches in geeignete 2-ml-Kunststoffformen gefüllt. Die Suppositorien werden auf Raumtemperatur abkühlen lassen.

Beispiel 8

Pessare

mg/Pessar

Wirkstoff 250
Wasserfreie Dextrose 380
Kartoffelstärke 363
Magnesiumstearat 7
1000
Die vorstehenden Bestandteile werden direkt vermischt und Pessare durch direktes Verdichten des erhaltenen Gemisches hergestellt.

Beispiel 9

Antivirale Wirkung gegen Hepatitis-B-Virus (HBV)

Die Verbindung, cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin, wurde wie nachstehend beschrieben getestet.
Es hat sich erwiesen, dass die Human-HBV-Producer-Zelllinie von HepG&sub2;, 2.2.15, beschrieben und charakterisiert von Seils et al., PNAS 84: 1005, 1987, und J. Virol. 62: 2836, 1988, viele Eigenschaften der HBV-chronologisch infizierten Hepatozyten teilt. Sie ist infektiös, wie durch die Fähigkeit gezeigt wurde, diese Erkrankung bei Schimpansen zu verursachen. Diese Zelllinie wurde in vitro angewendet, um Verbindungen mit anti-HBV-Aktivität zu identifizieren.
Zu Testverbindungen für antivirale Aktivität wurden Monoschichtkulturen zehn Tage mit der Verbindung, 50-200 uM, behandelt. Überstandsmedien, die extrazelluläres Virion DNA (Dane Teilchen) enthalten, wurden an Tagen drei, sechs und zehn geerntet, mit Proteinase K (1 mg/ml) und Natriumdodecylsulfat (1%) behandelt und eine Stunde bei 50ºC inkubiert. DNA wurde mit gleichen Volumina Phenol, gefolgt von Chloroform, extrahiert und dann durch Ammoniumacetat und Propanol ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wurde gelöst und auf Nitrocellulose unter Verwendung des Verfahrens von Schleicher und Schuell (S & S, 10 Optical Ave., Keene, NH 03431, Veröffentlichungs-Nr. 700, 1987) gesammelt und wie von Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975, beschrieben, behandelt. Die Zellen wurden geerntet und die intrazelluläre DNA wurde nach Zelllyse mit Guanidinisothiocyanat behandelt. Die intrazelluläre DNA wurde in der gleichen Weise wie die extrazelluläre DNA gehandhabt. Nach Ausfällung durch Ammoniumacetat und Propanol wurde der intrazelluläre DNA- Niederschlag gelöst, durch Restriktionsendonuclease, Hind III, geschnitten, auf Agarosegel aufgetragen und dann, wie von Southern beschrieben, um die Menge an replikativen Zwischenproduktformen zu bestimmen, behandelt. Die antivirale Wirkung der Verbindung wurde durch Messen von mindestens einer 100-fachen Verminderung der Menge von Dane-Teilchen, extrudiert in das Kulturmedium, und einer ähnlichen Abnahme bei den intrazellulären Repükatzwischenprodukten bestimmt.
Die Ergebnisse werden nachstehend angegeben: Wirkung von cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin auf HBV- Erzeugung in 2.2.15 Zellkulturen Intrazelluläre HBV DNA*
* Analyse auf intrazelluläre HBV DNA (Dane Teilchen) erfolgte 24 Stunden nach dem 10. Tag der Behandlung.
++ Eine "Null" weist einen nichtnachweisbaren Anteil von HBV DNA, Empfindlichkeitsschwellenwert war 0,1 pg/ml, aus.

Claims

1. Verwendung von cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, Amids, Esters oder Salzes eines Esters davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer Hepatitis-B-Virus-Infektion.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin oder pharmazeutisch verträgliche Salz, Amid, Ester oder Salz eines Esters davon das (-)-Enantiomer ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin oder pharmazeutisch verträgliche Salz, Amid, Ester oder Salz eines Esters davon das isolierte (-)-Enantiomer ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin oder pharmazeutisch verträgliche Salz, Amid, Ester oder Salz eines Esters davon das (+)-Enantiomer ist.

5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Arzneimittel in Form einer Dosierungseinheit vorliegt.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Dosierungseinheit 10 bis 1500 mg cis-1-(2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl)-5-fluorcytosin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz, Amid, Ester oder Salz eines Esters davon enthält.

7. Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei die Dosierungseinheit eine Tablette oder Kapsel ist.