CZ218996A3 - Comparison analysis of gene transcriptors - Google Patents

Description

Porovnávací analýza genových transkriptů (57) Anotace:

Vynález poskytuje způsob kvantifikace relativní hojnosti genových transkriptů v biologicky vzorcích. Jedno výhodné provedení vynálezu generuje výkonou, sekvenčně specifickou analýzu mnohých mRNA biologického vzorku (např. krve, slin ap.) nebo jejich odpovídajících cDNA, a poskytuje takto zobrazovací analýzu genových produktů. Jiné provedení poskytuje způsob porovnání profilů hojnosti genových transkriptů ve dvou nebo více biologických vzorcích (např. tak, že se určuje poměr zastoupení mnohých jednotlivých genových transkriptů v různých biologických vzorcích, spojených např. s aktivací buněk imunitního systému, s chorobou, stárnutím ap.). Systémem pro provádění porovnávacích analýz je počítač programovaný software, schopným identifikace nové sekvence transkriptů se sekvencemi uloženými v databázích a dalších operací přii porovnání hojností transkriptů v knihovnách biologických sekvencí. Vynález je užitečný v diagnostice, výběru zvířecích modelů, farmakologii, toxikologii, ap., v těchto oborech předčí dosavadní způsoby, poskytuje nové přístupy a ι

Porovnávací analýza genových transkript

Oblast techniky

C X »— 7Ό Tří w 2 o o = O —i <

< ~ «5 σ>

o

C3 'O« cx

Tento vynález je z oblasti molekulární biologie a počítačové vědy; konkrétněji tento vynález popisuje metody analýzy genových transkiptů a diagnóz genové exprese buněk a tkání.

Dosavadní stav techniky

Do zcela nedávného času se historie molekulární biologie psala gen po genu. Vědci pozorovali fyzikální změny buňky, izolované směsi buněk nebo jejich prostředí, čištěné bílkoviny, sekvenované bílkoviny a podle tohoto konstruovali sondy ke zkoumání příslušných genů.

Nedávno byly založeny různé velké národní projekty k sekvenování miliard baží v lidském genomu. Tyto projekty typicky začínají rozdělením genomu na velké úseku chromosomů a následně se stanovují sekvence v těchto částech, které se pak analyzují na identitu se známými bílkovinami nebo jejich částmi, známými jako motivy. Většina genomické DNA ale bohužel nekóduje bílkoviny a i když je postulováno, že má určitý vliv na schopnost buňky vytvářet bílkoviny, její relevance pro lékařské aplikace není dosud poznána.

Třetí metodologie zahrnuje sekvenování pouze transkriptů aktivně zapojených do buněčné mašinérie, která vytváří bílkoviny, jmenovitě mRNA. Výhodné je, že buňka si zrediguje všechny nekódující DNA a že je relativně snadné identifikovat úseky mRNA, kódující bílkovinu. Význam tohoto přístupu nebyl výzkumníkům genomu okamžitě zřejmý. Ve skutečnosti, když se původně sekvenování cDNA navrhovalo, tato metoda byla sumárně odsuzována těmi, kdo se věnovali sekvenaci genomu. Například: Vedoucí amerického projektu lidského genomu znevážil sekvenování cDNA jako bezcenné a odmítl schválení podpory takovýchto projektů.

Zde zveřejňujeme metody analýzy DNA, včetně knihoven cDNA. Na základě našich analýz a výzkumů nahlížíme na každý jednotlivý genový produkt jako na pixel informace, jenž se týká exprese onoho, a jen onoho, genu. Uvádíme zde metody, jimiž se dají jednotlivé pixely informace o genové expresi spojit do obrazu transkripce jediného genu, přičemž se všechny jednotlivé geny dají vizualizovat současně a vztahy mezi těmito genovými pixely se snadno vizualizují a chápou.

Dále uvádíme novou metodu, kterou nazýváme elektronické odčítání. Elektronické odčítání umožní genovému badateli převést jednotlivé obrazy do pohyblivého sledu, který popíše časový průběh a dynamiku genové exprese na úrovni buňky nebo celé tkáně. Je to smysl pro pohyb buněčné mašinérie v měřítku buňky nebo orgánu, jenž je základem tohoto nového vynálezu. Tím je založén nový pohled na pochody fyziologie živé buňky, jenž skýtá vell<é naděje na odhalení a odkrytí nových terapeutických a diagnostických přístupů v medicíně.

Uvádíme další metodu, kterou nazýváme elektronický northern, jež sleduje expresi jediného genu v mnohých typech buněk a tkání.

Nukleové kyseliny (DNA a RNA) nesou ve svých sekvencích dědičnou informaci a jsou proto prvotními molekulami života. Nukleové kyseliny se nacházejí ve všech živých organismech, včetně bakterií, plísní, virů, rostlin a zvířat. Předmětem zájmu je stanovit relativní zastoupení různých konkrétních nukleovýčh kyselin v různých buňkách, tkáních a organismech v průběhu času za různých podmínek, při různých působeních a režimech.

Všechny dělicí se buňky v lidském těle obsahují stejný soubor 23 párů chromosomů. Odhaduje se, že tyto autosomní a pohlavní chromosomy kódují přibližně 100 000 genů. Má se za to, že rozdíly mezi různými typy buněk odrážejí rozdílnou expresi těchto 100 000 genů (nebo podobného počtu). Fundamentální otázky biologie by mohly být zodpovězeny tím, že by se porozumělo tomu, které geny jsou transkribovány v různých buňkách a jaké je u nich relativní zastoupení transkriptů.

Dříve tento obor zajišťoval pouze analýzy několika málo známých genů najednou, a to standardními technikami molekulární biologie jako jsou řetězová polymerizační reakce (PCR), analýža northern přenosem, nebo jiné typy analýz s DNA sondami, jako je hybridizace in šitu. Každá z těchto metod dovoluje jen analýzu transkripce známých genů nebo jenom malého počtu genů najednoú. Nucl. Acids Res. 19, 7097-7104, (1991); Nucl. Acids Res. 18. 4833-42, (1990); Nucl. Acids Res. 18, 2789-92, (1990); EUropean

J. Neuroscience 2, 1063-1073 (1990); Analytical Biochem. 187, 364-73 (1990); Genet Annals Techn. Appl. 7, 64-70 (1990); GATA 8 (4), 129-33; Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 1696-1700 (1988); Nucl. Acids Res. 19./ 1954, (1991); Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1943-1947 (1991); Nucl. Acids Res. 19, 6123-6127, (1991); Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5738-42 (1988); Nucl. Acids Res. 16, 10937, (1988).

metod. Jednou jejich hladin

Studie počtů a typů genů, jejichž transkripce je indukována nebo jinak regulována během buněčných procesů, jako jsou aktivace, diferenciace, stárnutí, virová transformace, morfogenese a mitóza, probíhají již mnoho let a používají řadu z nejstarších metod je izolace bílkovin a analýza v buňce, tkáni, orgánu nebo dokonce organismu jak před, tak po pochodu, o nějž je zájem. Jednou z metod analýzy mnohých bílkovin v jednom vzorku je použití dvojrozměrné gelové elektroforézy, kde bílkoviny mohou být, v principu, identifikovány a kvantifikovány jako jednotlivé pruhy, a nakonec redukovány na oddělený signál. V současnosti rozlišuje dvojrozměrná analýza jen asi 15 % bílkovin. Aby byly pozitivně analyzovány pruhy, jež jsou rozděleny, každý pruh musí být vyříznut z membrány a podroben analýze bílkovinné sekvence s použitím Edmanovy degradace. Bohužel je většina pruhů přítomná v množstvích příliš malých pro získání spolehlivé sekvence a mnohé tyto pruhy obsahují více než jednu bílkovinu. Další potíž je v tom, že mnohé z bílkovin jsou blokované na N-konci, což dále komplikuje sekvenační postup.

Analýzy diferenciace na úrovni transkripce genů překonaly mnohé z těchto nevýhod a potíží, protože síla technologie rekombinantní DNA dovoluje amplifikaci signálů obsahujících velmi malá množství materiálu. V nejběžnější metodě, zvané hybridizačni odčítání je zahrnuta izolace mRNA z biologického vzorku před (B) a po (A) vývojovém ději, o nějž je zájem, transkripci jedné sady mRNA na cDNA, odečtení vzorku B od vzorku A (mRNA od cDNA) hybridižací a konstrukci knihovny cDNA z nehybridizující frakce mRNA. Tuto strategii použily úspěšně mnohé skupiny a řada postupů byla publikována a vylepšena na základě téhož základního schématu. Nucl. Acids Res. 19, 7097-7104, (1991); Nucl. Acids Res. 18, 4833-42, (1990); Nucl.

Acids Res. 18, 2789-92, (1990); European J. Neuroscience 2,

1063-1073 (1990); Analytical Biochem. 187, 364-73 (1990); Genet Annals Techn. Appl. 7, 64-70 (1990); GATA 8 (4), 129-33; Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 1696-1700 (1988); Nucl. Acids Res. 19^, 1954, (1991); Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1943-1947 (1991); Nucl. Acids Res. 19, 6123-6127, (1991); Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5738-42 (1988); Nucl. Acids Res. 16, 10937, (1988).

I když každá z těchto technik má svou zvláštní sílu i slabší stránky, pořád existují určitá omezení a nežádoucí aspekty těchto metod: Za prvé, čas a úsilí potřebné ke konstrukci takovýchto knihoven jsou dosti značné. Typicky může cvičený molekulární biolog očekávat, že si konstrukce a charakterizace takovéto knihovny vyžádá 3 až 6 měsíců, v závislosti na úrovni schopností, zkušenosti a štěstí. Z druhé, výsledné odečtené knihovny jsou typicky horší než knihovny konstruované standardní metodologií. Typická konvenční cDNA knihovna má klonovací komplexitu přinejmenším 10⁶ klonů, a průměrnou velikost insertu 1 - 3 kB. Naproti tomu odečtené knihovny mohou mít komplexity 10² nebo IQ³ a průměrnou velikost insertu 0,2 kB. Takovéto knihovny proto může doprovázet významná ztráta klonovacích a sekvenčních informací. Za třetí, tento přístup umožňuje badateli zachytit pouze geijy indukované ve vzorku A vzhledem k vzorku B, ale ne naopak, a také neumožňuje jednoduché srovnání s třetím vzorkem, jenž je předmětem zájmu (C). Za čtvrté, tento přístup vyžaduje velmi velká množství (stovky mikrogramů) hnací mRNA (vzorek B), což významně omezuje možné počty a typy odčítání, protože mnohé tkáně a buňky se získávají ve velkých množstvích velice obtížně.

Za páté: Rozlišení odčítání je závislé na vlastnostech hybridizací DNA:DNA a RNA:DNA. Schopnost dané sekvence nalézt hybridizační protějšek závisí na unikátní hodnotě CoT. Hodnota CoT je funkcí počtu kopií (koncentrace) konkrétní sekvence, násobené dobou hybridizace. Z toho vyplývá, že pro sekvence, které se vyskytují bohatě, proběhnou hybridizační události velmi rychle (nízká hodnota CoT), zatím co vzácné sekvence budou dvořit duplexy s velmi vysokými hodnotami CoT. Hodnoty CoT, jež by umožnily takovýmto vzácným sekvencím tvořit duplexy a tedy být účinně selektovány, je těžké dosáhnout v konvenčním časovém rozsahu, Hybridizační odčítání tedy jednoduše není užitečnou technikou, s níž by se měly studovat relativní hladiny vzácných druhů mRNA. Za šesté: Tento problém se dále komplikuje skutečností, že tvorba duplexů je závislá také na složení nukleotidových baží v dané sekvenci. Sekvence bohaté na G + C tvoří pevnější duplexy než sekvence s vysokým obsahem A + T. Prvně jmenované sekvence budou tedy mít tendenci k selektivnímu odstranění hybridizačním odčítáním. Za sedmé: Je možné, že nastane hybridizace mezi nepřesnými protějšky. Když k tomu dojde, exprese homologního genu může maskovat expresi genu, o nějž je zájem, a uměle deformovat výsledky pro tento konkrétní gen.

Matsubara a Okubo navrhli použití částečných cDNA sekvencí ke stanovení profilů exprese genů, jež mohou být použity ve funkčních analýzách lidského genomu. Matsubara a Okubo varují před používáním náhodného startování, protože vytváří více unikátních fragmentů z jednotlivých rnRNA a může tedy deformovat analýzu řady konkrétních genů knihovny. Matsubara a Okubo sekvenovali náhodně vybrané členy z 3'-směrované cDNA knihovny a stanovili četnost, s níž se objevují různé EST. Pro klasifikaci genů navrhli srovnávací seznam EST z řady buněčných typů. Geny exprimované v mnohých různých buňkách byly označeny jako udržovací [housekeepers] a geny exprimované selektivně v určitých buňkách byly označeny jako buněčně specifické geny, dokonce i při chybějící úplné sekvenci nebo při neznámé biologické aktivitě genového produktu.

Předkládaný vynález se odstraňuje nedostatky předchozích způsobů tím, že poskytuje způsob kvantifikace relativního výskytu mnohých genových transkriptů v daném biologickém vzorku za použití vysoce výkonné, sekvenčně specifické analýzy jednotlivých RNA nebo odpovídajících cDNA.

Tento vynález poskytuje několik výhod vzhledem k současným způsobům určování bílkovin, při nichž je snahou izolovat jednotlivé bílkoviny na základě jejich

Způsob podle vynálezu poskytuje podrobné buněčných profilů a odhaluje mnohé změny transkriptů.

Tento vynález poskytuje několik výhod vzhledem k současným odčítacím metodám, včetně analýzy komplexnějších knihoven (10 až 10⁷ klonů v porovnání s 10³ klonů), což dovoluje identifikaci genetických zpráv, jejichž zastoupení roste nebo klesá. Tyto velké knihovny jsou zcela rutinní co do přípravy, na rozdíl od biologických účinků, diagnostické srovnání v expresi jednotlivých knihoven podle předchozích metod. Navíc: Homology lze způsobem podle vynálezu snadno rozeznat.

Tento způsob je velice příjemný, protože organizuje velké množství dat do stručného a záživného formátu. Nejvýznamnější rozdíly jsou zvýrazňovány elektronickým odčítáním. Hloubkové analýzy se stávají příjemnějšími.

Tento vynález poskytuje několik výhod vzhledem k dřívějším způsobům elektronické analýzy cDNA. Tento způsob má obzvláštní sílu při analýzách více než 100, a s výhodou více než 1 000, genových transkriptů. V tomto případě jsou objevovány nové transkripty o nízké četnosti a vytypovávány tkáně.

Analýzu genové exprese o vysokém rozlišní lze použít bučí přímo jako diagnostický profil, nebo k určení genů specifických pro danou chorobu za účelem vývoje klasičtějších diagnostických přístupů.

Tento postup je definován jako frekvenční analýza genových transkriptů. Výsledná kvantitativní analýza genových transkriptů je definována jako srovnávací analýza transkriptů.

Podstata vynálezu

Tento vynález představuje způsob analýzy vzorku obsahujícího genové transkripty, jenž zahrnuje kroky a) vytvoření knihovny biologických sekvencí, b) transkriptů, kde každá sekvence indikativní pro jednu různou generování souboru sekvencí transkriptů v řečeném souboru je biologickou sekvenci knihovny,

c) zpracování sekvencí transkriptů v programovaném počítači referenčních sekvencí transkriptů sekvence) ke generování hodnoty každou ze sekvencí transkriptů, sekvence j e [match] me?i (v němž je uložena databáze indikativní pro referenční identifikované sekvence pro přičemž každá řečená hodnota identifikované indikativní pro anotaci sekvence a stupeň shody jednou z biologických sekvencí knihovny a přinejmenším jednbu z referenčních sekvencí a d) zpracování každé řečené hodnoty identifikované sekvence za generování konečných hodnot dat indikativních pro počet, v kterém je každá hodnota identifikované sekvence přítomná v knihovně.

Vynález zahrnuje také způsob srovnání dvou biologických vzorků obsahujících genové transkripty. První vzorek je zpracován jak je popsáno shora. Druhý vzorek je použit k vytvoření druhé knihovny biologických sekvencí, která je použita ke generování druhého souboru sekvencí transkriptů, kde každá ze sekvencí transkriptů v druhém souboru je indikativní pro jednu druhé knihovny. Pak je druhý soubor zpracován sekvencí transkriptů ke generování druhého souboru z biologických sekvencí sekvencí transkriptů v programovaném počítači hodnot identifikovaných sekvencí, jmenovitě dalších hodnot identifikovaných sekvencí, z nichž každá je indikativní pro anotaci sekvence a zahrnuje stupeň shody mezi jednou z biologických sekvencí druhé knihovny a přinejmenším jednou z referenčních sekvencí. Další identifikované hodnoty sekvencí jsou zpracovány za generování dalších konečných hodnot dat indikativních pro počet, v kterém je každá další hodnota identifikované sekvence přítomná v druhé knihovně. Konečné hodnoty dat z prvního vzorku a další hodnoty identifikovaných sekvencí z druhého vzorku jsou zpracovány ke generování podílů pro sekvence transkriptů, které ukáží rozdíly v počtu genových transkriptů mezi dvěma vzorky.

V dalším provedení způsob zahrnuje kvantifikaci relativního výskytu mRNA v biologickém vzorku pomocí a) izolace populace mRNA transkriptů z biologického vzorku, b) identifikace genů, z nichž byla mRNA transkribována pomocí sekvenčně specifické metody,

c) stanovení počtů mRNA transkriptů, odpovídajících každému genu a d) použití počtů mRNA transkriptů ke stanovení relativního výskytu mRNA transkriptů v populaci mRNA transkriptů.

Zveřejňován je rovněž způsob vytvoření obrazové analýzy genového transkriptů tím, že se předně získá směs mRNA, ze které se udělají cDNA kopie. cDNA je vložena do vhodného vektoru, jenž se použije k transfekci vhodného hostitelského kmene, který se nanese na plotny a umožní růst do klonů, z nichž každý reprezentuje jedinečnou mRNA. Izoluje se reprezentativní populace klonů transfekováných cDNA. Každý klon v populaci se identifikuje pomocí sekvenčně specifické metody, která identifikuje gen, z něhož byla jedinečná mRNA transkribována. Ke zhodnocení výskytu genového transkriptů se určí počet, kolik krát je každý gen identifikován s klonem. Geny a jejich zastoupení jsou dány do seznamu v pořadí výskytu za vytvoření obrazu genovýčh transkriptů.

V dalším provedení se porovnává relativní výskyt genových transkriptů v jednom typu buněk nebo tkání s výskytem relativního počtu genových transkriptů v druhém typu buněk nebo tkání, k identifikaci rozdílů a podobností.

V dalším provedení způsob zahrnuje systém pro analýzu knihovny biologických sekvencí, v němž jsou zahrnuty prostředky k získání souboru sekvencí transkriptů, kde každá sekvence transkriptů je indikativní pro jednu různou biologickou sekvenci knihovny, a prostředky ke zpracování sekvencí transkriptů v počítačovém systému, v němž je uložena databáze referenčních sekvencí transkriptů indikativní pro referenční sekvence, přičemž počítač je programován se software pro generování hodnoty identifikované sekvence pro každou ze sekvencí transkriptů, kde každá řečená hodnota identifikované sekvence je indikativní pro anotaci sekvence a stupeň shody mezi jednou různou biologickou sekvencí knihovny a přinejmenším jednou referenční sekvencí, a pro zpracování každé řečené hodnoty identifikované sekvence za generování konečných hodnot dat indikativních pro počet, ve kterém je každá hodnota identifikované sekvence přítomhá v knihovně.

V podstatě je vynález způsobem a systémem pro kvantifikaci relativní hojnosti genových transkriptů v biologickém vzorku. Vynález poskytuje způsob porovnání obrazu genových transkriptů ze dvou nebo více různých biologických vzorků pro rozlišení meži dvěma vzorky a pro identifikaci jednoho nebo více genů, jež jsou rozdílně exprimovány u těchto dvou vzorků. Tento obraz genových transkriptů a jeho srovnání tedy může být použít jako diagnostika. Jedno provedení tohoto způsobu generuje vysoce výkonnou, sekvenčně specifickou analýzu vícerých RNA a jim odpovídajících cDNA: obrazu genových transkriptů. Jiné provedepí tohoto způsobu vytváří obrazovou analýzu genových transkriptů s použitím vysoce výkonné sekvenční analýzy cDNA. Navíc mohou být srovnávány dva nebo více obrazů genových transkriptů a mohou být použity k detekci nebo diagnóze konkrétního biologického stavu, choroby, nebo podmínek, které korelují s relativní hojností genových transkriptů v dané buňce nebo buněčné populaci.

Popis tabulek a obrázků

Tabulky

Tabulka 1 poskytuje podrobné vysvětlení písmenkových kódů používaných v Tabulkách 2-5.

Tabulka 2 uvádí seznam jednoho sta nejběžnějších genových transkriptů. Je částečným seznamem izolátů z HUVEC cDNA knihovny připravené a sekvenované jak je popsáno níže. Levý sloupec v této tabulce uvádí pořadí hojnosti sekvence. Další sloupec označený číslo je číslo klonu z odkazu první HUVEC sekvenční identifikace, jež odpovídá číslu ve sloupci vstup. Izoláty, které nebyly sekvenovány v Tabulce 2 nejsou. Další sloupec, označený N, ukazuje celkový počet cDNA, jež mají stejný stupeň shody se sekvencí referenčního transkriptů ve sloupci vstup «

Sloupec označený vstup uvádí jméno lokusu NIH GENBANK, které odpovídá číslu sekvence v knihovně. Sloupec s ukazuje v několika málo případech druh referenční sekvence. Kód pro sloupec s se uvádí v Tabulce 1. Sloupec označený popiska poskytuje v běžné angličtině vysvětlení identity sekvence, jež odpovídá jménu lokusu NIH GENBANK ve sloupci vstup.

Tabulka 3 je porovnání prvních patnácti nejhojnějších genových transkriptů v buňkách normálních monocytů a aktivovaných makrofágů.

Tabulka 4 je podrobné shrnutí odčítací (substrakční) analýzy knihoven, porovnávající cDNA sekvence THP-1 a lidských makrofágů.

V Tabulce 4 se používá tentýž kód jako v Tabulce 2. Další sloupce jsou pro bgref (počet výskytu v odčítané knihovně), rfend (cílový počet výskytu v cílové knihovně) a poměr (cílový počet výskytu dělený odčítaným počtem výskytu). Jak je zřejmé ze studia tabulky, když je počet výskytu v odčítané knihovně 0, pak je cílový počet výskytu dělen 0,05. Toto je cesta pro získání výsledku (nemožná při dělení nulou) a pro rozlišení výsledku od poměrů odčínaných počtů 1.

Tabulka 5 je počítačový program napsaný ve výchozím kódu pro generaci profilů odečtení genových transkriptů.

Tabulka 6 je částečný seznam databázových vstupů používaných v elektronické northern analýze podle vynálezu.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 shrnuje shromážděná a uložená data týkající se úseku konstrukce knihovny při přípravě sekvencí a jejich analýze.

Obrázek 2 je diagram představující pořadí operaqí prováděných software pro uspořádání výskytů ve třídě výhodných provedení způsobu podle vynálezu.

Obrázek 3 je blokový diagram výhodných provedení systémů podle vynálezu.

Obrázek 4 je podrobnější blokový diagram bioinformatického postupu od nové sekvence (která je již stanovena, ale ne identifikována) k výtisku zobrazovací analýzy transkriptů a k přípravě zapsání do databáze.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález poskytuje způsob porovnání relativní hojnosti genových transkriptů v různých biologických vzorcích pomocí vysoce výkonné, sekvenčně specifické analýzy jednotlivých RNA nebo jim odpovídajících cDNA (nebo, alternativně, dat reprezentujících jiné biologické sekvence). Tento postup je zde označován jako zobrazování genových transkriptů. Kvantitativní analýza relativních hojností pro soubor genových transkriptů je zde označována jako zobrazovací analýza genových transkriptů nebo frekvenční analýza genových transkriptů. Tento vynález dovoluje získání profilu genové transkripce v jakékoli dané populaci buněk nebo v tkáni z jakéhokoli typu organismu. Vynález lze použít k profilu vzorku sestávajícího z jednotlivé buňky (nebo klonů jednotlivé buňky), nebo mnohých buněk, nebo tkáně složitější než jednotlivé buňky a obsahující více typů buněk, jako je tkáň jater.

Vynález má významné výhody v oblastech diagnostiky, pokud uvedeme jen některé. Vysoce test lze provádět u nemocného pacienta, jemuž nebyla stanovena diagnóza. Získá se biologický vzorek sestávající z pacientových tekutin nebo tkání, a genové transkripty se izolují a expandují v rozsahu potřebném k určení toxikologie a farmagologie, sofistikovaný diagnostický jejich identity. Genové transkripty mohou být případně konvertovány na cDNA. Vzorek genových transkriptů se podrobí sekvenčně specifické analýze a kvantifikuje. Hojnost těchto genových transkriptů se porovnají proti referenční databázi hojnosti sekvencí, zahrnující normální soubory dat pro nemocné a zdravé pacienty. Pacient má chorobu(y), s kterou soubor pacientových dat nejtěsněji koreluje.

Například: Frekvenční analýza genových transkriptů se může použít pro rozlišení normálních buněk nebo tkání od chorobných buněk nebo tkání právě tak, jak je její pomocí zvýrazněn rozdíl mezi normálními monocyty a aktivovanými makrofágy v Tabulce 3.

V toxikologii je fundamentální otázkou které testy jsou nej účinnější pro předpovědí a detekci toxického účinku. Zobrazování genových transkriptů poskytuje velice podrobné informace o prostředí buněk a tkání, z nichž některé by nebyly zřejmé u konvenčních, méně podrobných způsobů hodnocení. Obraz genových produktů je silnější způsob k předpovědi toxicity a účinnosti léčiva. Podobné výhody se hromadí u použití tohoto nástroje ve farmakologii. Obraz genových produktů může být použit pro selektivní nahlédnutí do kategorií bílkovin, u nichž se očekává, že budou ovlivněny, například enzymů, které detoxikují toxiny.

V alternativním provedení se používá srovnávací frekvenční analýza genových transkriptů k rozlišení mezi nádorovými buňkami, které odpovídají na protinádorová činidla a těmi, které neodpovídají. Příklady protinádorových činidel jsou tamoxifen, vincristin, vinblastin, podofylotoxiny, etoposid, tenisposid, cisplatin, raodifikátory biologické odezvy, jako je interferon, 11-2, GM-CSF, enzymy, hormony a podobně. Tato metoda rovněž poskytuje prostředky pro uspořádání genových transkriptů podle funkčních kategorií. V případě nádorových buněk jsou transkripční faktory a jiné základní regulační molekuly velmi důležité kategorie pro analýzu, zahrnující různé knihovny.

V ještě jiném provedení se používá srovnávací frekvenční analýza genových transkriptů k rozlišení mezi mozkovou tkání pacientů léčených a neléčených lithiem.

V dalším provedení se používá srovnávací frekvenční analýza genových transkriptů k rozlišení mezi buňkami, na které se působilo cyklosporinem nebo FK506, a normálními buňkami.

V dalším provedení se používá srovnávací frekvenční analýza genových transkriptů k rozlišení mezi lidskými buňkami infikovanými virem (včetně infekce HIV) a neinfikovanými lidskými buňkami. Porovnání hojnosti transkriptů bude ukazovat na úspěch léčby nebo na nové cesty výzkumu.

V dalším provedení se používá srovnávací frekvenční analýza genových transkriptů k rozlišení mezi bronchiálními hlenovými tekutinami ze zdravých pacientů a z nemocných pacientů s řadou onemocnění.

V dalším provedení se používá srovnávací frekvenční analýza genových transkriptů k rozlišení mezi buňkami rostlinných, mikrobiálních a zvířecích mutantů a buňkami druhů divokého typu. Navíc je program výskytu transkriptů přizpůsoben k tomu, aby badatelům umožňoval hodnotit transkripci jednoho genu v mnohých různých tkáních. Takováto porovnání mohou určit deleční mutanty, které nevytvářejí některý genový produkt a bodové mutanty, které produkují méně zastoupenou nebo jinak odlišnou genetickou zprávu. Takovéto mutace mohou ovlivnit základní biochemické a farmakologické procesy, jako je výživa minerály a metabolismus, a lze je izolovat způsoby známými těm, co jsou zběhlí v oboru. Mohou být tedy vyvinuty plodiny s lepší úrodou, resistencí ke škůdcům a s jinými faktory.

V dalším provedení se používá srovnávací frekvenční analýza genových transkriptů k mezidruhové srovnávací analýze, která by umožňovala výběr lepších farmakologických zvířecích modelů. U tohoto provedení jsou lidé a jiní živočichové (jako je myš), nebo jejich kultivované buňky, podrobováni působení specifického testovaného činidla. Relativní hojnost sekvencí se stanoví pro každou populaci cDNA. Pokud je zvířecí testovací systém vhodným modelem, homologní geny ve zvířecí populaci cDNA musí měnit expresi podobně jako v lidských buňkách. Když se u léku projeví vedlejší účinky, provede se ke sledování změn genovýčh transkriptů podrobná analýza jejich hojnosti. Modely se pak zhodnotí porovnáním základních fyziologických změn.

V dalším provedení se používá srovnávací frekvenční analýža genových transkriptů v klinickém rozhodování pro získání vysoge podrobného profilu genových transkriptů v pacientových buňkách nebo tkáních (například ve vzorku krve). Obzvláště se frekvenční analýza genových transkriptů použije k získaní profilu genové exprese s vysokým rozlišením pro chorobné stavy nebo podmínky.

Ve výhodném provedení používá tento způsob výkonné sekvenování cDNA k identifikaci specifických transkriptů, jež jsou předmětem zájmu. Generovaná cDNA a odvozené sekvence aminokyselin jsou pak rozsáhle porovnávány s GENBANK nebo jinými bankami sekvenčních dat, jak se popisuje níže. Tento způsob poskytuje několik výhod v porovnání s běžným zjišťováním bílkovin dvojrozměrnou elektroforézou, kde je snahou určit jednotlivé bílkoviny zapojené do konkrétního biologického účinku. Podle tohoto vynálezu odhaluje podrobné porovnání profilů aktivovaných a neaktivních buněk četné změny exprese jednotlivých transkriptů. Poté co se určí, zda stanovená sekvence souhlasí přesně, je podobná nebo nesouhlasí, sekvence se vloží do databáze. Jako další se tabelují počty kopií cDNA, odpovídajících každému genu. I když toto lze provádět, pomalu a pracně, pokud vůbec, lidskýma rukama z výtisků všech vstupů, počítačový program je rychlou a užitečnou cestou k tabelování informací. Celkové počty kopií cDNA (případně vydělené celkovým počtem sekvencí v souboru dat) poskytují obraz relativní hojnosti transkriptů pro každý odpovídající gen. Seznam zahrnutých genů může pak být uspořádán podle hojnosti v populaci cDNA. Vícečetné nebo další typy srovnání jsou možné a jejich příklady jsou uvedeny níže.

Alternativní způsob vytvoření obrazu genových transkriptů obsahuje kroky získání směsi testovaných mRNA a zajištění unikátního souboru sond, jejichž sekvence jsou komplementární přinejmenším k některým testovaným mRNA. Pak se přidá fixní uspořádanému poli sond. Testovaná mRNA po dobu postačující k tomu, aby se a sond. Hybridy mRNA-sonda se detegují množství testované mRNA k se inkubuje se sondami vytvořily hybridy mRNA a stanovují se jejich množství,

Hybridy se identifikují podle umístění v uspořádaném poli sond. Množství všech hybridů se sečte a poskytne populační číslo. Množství každého hybridu se vydělí populačním číslem za poskytnutí souboru dat relativní hojnosti, jenž se označuje jako analýza obrazu genových transkriptů.

Příklady provedení vynálezu

Příklady uváděné níže jsou poskytnuty pro osvětlení předmětného vynálezu. Tyto příklady jsou poskytnuty prostřednictvím ilustrací a nejsou zahrnuty za účelem omezení vynálezu.

Příklad 1

Zdroje tkání a buněčných linií

Pro analýzu počítačovým programem, zde nárokovaným, mohou být biologické sekvence získány snad z každého zdroje. Nejpopulárnější jsou tkáně získané z lidského těla. Tkáně mohou být získány ze všech tělesných orgánů, při jakémkoli věku dárce, jakékoli abnormalitě nebo z jakékoli imortalizovné buněčné linie. Imortalizované buněčné linie mohou být v některých případech výhodné pro čistotu buněčného typu; ostatní vzorky tkání vždy zahrnují smíšené typy buněk. Je dostupná speciální technika k odebrání jednotlivé buňky (například mozkové buňky) a k popohnání buněčné mašinérie k syntéze množství cDNA dostatečného pro sekvenování; techniky a analýzy jsou zde popsány (viz US patenty č. 5 021 335 a 5 168 038, jež jsou zahrnuty odkazem). Příklady tam udávané zahrnují následující imortalizované buněčné linie; U-937 buňky podobné monocytům, THP-l buňky podobné aktivovaným makrofágům, indukované vaskulární endothelové buňky (HUVEC buňky) a buňky HMC-1 podobné žírným buňkám.

Buněčná linie U-937 je linie lidských histiocytických lymfomových buněk s monocytárními charakteristikami, založepá z maligních buněk získaných pleurálním výplachera jednoho pacienta s difúzním histiocytickým lymfomem (Sundstrom, C. a Nilsson, K· (1976) Int. J. Cancer 17:568). U-937 je jednou z mála lidských buněčných linií s morfologickými, cytochemickými, povrchově-receptorovými a monocytům podobnými charakteristikami histiocytických buněk. Tyto buňky mohou být indukovápy k terminální monocytové diferenciaci a při aktivaci supernatanty ze směsných kultur lidských lymfocytů budou exprimovat nové molekuly buněčného povrchu. Při tomto typu in vitro aktivace nastanou v buňkách morfologické a funkční změny, včetně vzrůstu buněčné, na protilátkách závislé cytotoxicity (ADCC) proti erythroidním a nádorovým cílovým buňkám (jedna z hlavních funkcí makrofágů). Aktivace U-937 buněk PMA (phorbol 12-myristátem 13-acetátem) in vitro stimuluje tvorbu několika látek, včetně prostaglandinů, leukotrienů a faktorů aktivujících destičky (PAF), jež jsou potentními mediátory zánětů. U-937 je tedy buněčnou linií, která je velmi vhodná pro identifikaci a izolaci genových transkriptů spojených s normálními monocyty.

Buněčná linie HUVEC je normální, homogenní, dobře charakterizovaná kultura ranných pasáží endothelových buněk z lidské pupeční žíly (Cell Systems Corp., 12815 NE 124th Street, Kirkland, WA 98034). Sekvenovány byly jen genové transkripty z indukovaných nebo opracovaných HUVEC buněk. Na jednu šarži před sklizením působilo po 5 hodin ng/ml E.coli lipopolysacharidového (LPS) endotoxinu. Na separátní šarži 10 x 10⁸ buněk se při konfluenci působilo před sklizením 4U/ml TNF a 2U/ml interferonu gama (IFN-gama).

THP-1 je linie lidských leukemických buněk se zřetelnými x 10⁸ buněk se lU/ml rlL-lb a 100 monocytovými charakteristikami. z krve 1-letého chlapce s (Tschuiya, S. et al. (1980)

Tato buněčná linie je odvozena akutní monocytickou leukémií

Int. J. Cancer: 171-76). Pro stanovení monocytového charakteru této buněčné linie byla použita následující cytologická a cytochemická kritéria: 1) přítomnost alfa-naftylbytyrát esterasové aktivity inhibovatelné fluoridem sodným, 2) produkce lysozymu, 3) a senzitizovaných SRBC (ovčích schopnost THP-1 buněk, aktivovat T-lymfocyty

Morfologicky obsahovala fagocytóza latexových částic červených krevních buněk), se působilo mitomycinem C, nez na po působení ConA (konkavalinu A), cytoplazma malé azurofilní granule a jádro nebylo zubaté a mělo nepravidelný tvar s hlubokými sklady. Buněčná linie měla receptory Fc a C3b, pravděpodobně působící ve fagocytóze. THP-1 buňky po působení nádorového promotoru TPA (12-o-tetradekanoyl-phorbol-13 acetátu) zastavují proliferaci a diferencují na v mnohých ohledech napodobují monocytů. Morfologicky mění buňky podobné makrofágům, které přirozené makrofágy odvozené od buňky tvar, jádro se stává nepravidelnějším a v cytoplazmě se objevují další fagocytové vakuoly. Diferencované THP-1 buňky také vykazují zvýšenou přilnavost k plastovému materiálu pro tkáňové kultury.

Buňky HMC-1 (linie lidských žírných buněk) byly založeny z periferní krve jednoho pacienta Mayo Clinics s leukémií žírných buněk (Leukemia Res. (1988) 12:345-55). Kultivované buňky vypadaly podobně jako nezralé klonované myší žírné buňky, obsahovaly histamin, barvily se pozitivně na chloracetát esterasu, aminokaproát esterasu, eosinofil MBP (hlavní bazickou bílkovinu) a tryptasu. Buňky HMC-1 však ztratily schopnost syntetizovat normální IgE receptory. Buňky HMC-1 mají také 10;16 translokaci, která je přítomná v buňkách původně získaných od pacienta leukoforézou a není kultivačním artefaktem. Buňky HMC-1 jsou tedy dobrým modelem žírných buněk.

Příklad 2

Konstrukce knihoven cDNA

Pro srovnávání mezi knihovnami musejí být knihovny připravovány podobnými způsoby. Jako obzvlášť důležité se jeví dohlédnout na určité konkrétní parametry. Jedním takovýmto parametrem je způsob izolace mRNA. Důležité je použít stejné podmínky pro odstraňování DNA a heterogenní jaderné RNA ze porovnávaných knihoven. Frakcionace cDNA podle velikosti musí být pečlivě řízena. S výhodu se má pro přípravu knihoven, jež mají být srovnávány, použít stejný vektor. Aby bylo zajištěno platné srovnání, musí se použít přinejmenším vektor stejného typu (např. s jednosměrnou orientací insertů). Vektor s jednosměrnou orientací může být výhodou pro snadnější analýzu výstupu.

Je výhodné startovat pouze s jednosměrným oligo dT primerem, aby se při získávání cDNA získal pouze jeden klon na jeden mRNA transkript. Uznává se však, že využívání směsi oligo dT a náhodných primerů může být také výhodné, protože s takovouto směsí vzniká větší různost sekvencí, když je cílem odkrytí genů. Podobné efekty lze získat s DR2 (Clontech) a HXLOX (US Biochemical) a také s vektory od Invitrogen a Novagen. Tyto vektory mají dva požadavky. Předně musí existovat startovací místa pro komerčně dostupné primery, jako jsou T3 nebo Ml3 reverzní primery. Za druhé: vektor musí přijímat inserty až do 10 kB.

Důležité je také, aby vzorek klonů byl náhodný a aby se používala významná populace klonů. Data byla generována i s 5 000 klony, ale pokud se mají získat vzácné geny nebo stanovit jejich relativní hojnost, může být zapotřebí vzorek až 100 000 klonů z jedné knihovny. Frakcionace cDNA podle velikosti musí také být pečlivě řízena. Alternativně se mohou selektovat plaky místo klonů.

Má se za to, že vedle Uni-Zap™ vektorového systému od fy. Stratagene, popsaného níže, se dají použít také jiné podobně jednosměrné vektory. Například se má za to, že takovéto vektory zahrnují, ale bez omezení, DR2 (Clontech) a HXLOX (U.S. Biochemical).

S výhodu se podrobnosti konstrukce knihovny shromažďují (jak je ukázáno v Obrázku 1) a ukládají v databázi pro další vytažení s ohledem na porovnávanou sekvenci. Obr. 1 ukazuje důležité informace vztahující se ke spolupracovníkovi z konstrukce knihovny nebo k dodavateli buněk nebo cDNA, k předchozímu zpracování, biologickému zdroji, kultuře, preparaci mRNA a konstrukci cDNA. Podobné podrobné informace jsou prospěšné pro hloubkovou analýzu sekvencí a knihoven.

RNA se musí získat z buněk a vzorků tkání, a následně se konstruují cDNA knihovny. cDNA knihovny se konstruují podle technik známých v oboru. (Viz např. Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). cDNA knihovny lze rovněž zakoupit. U-937 cDNA knihovna (kat. č. 937207) byla získána od Stratagene, lne., 11099 M. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037.

THP-l cDNA knihovna byla konstruována na zakázku u Stratagene z THP-l buněk kultivovaných 48 hodin s 100 nM TPA a 4 hodiny s 1 μg/ml LPS. Knihovna cDNA lidských žírných buněk zakázku u Stratagene cDNA knihovna byla dvou šarží indukovaných

HMC-1 byla rovněž konstruována na z kultivovaných buněk HMC-1. HUVEC konstruována na zakázku u Stratagene ze

HUVEC buněk, které byly zpracovány odděleně.

V podstatě byly všechny knihovny připravovány stejným způsobem. Za prvé byla vyčištěna poly(A+) RNA (mRNA). U syntézy cDNA se u RNA U-937 a HMC-1 použilo startování pouze pomocí oligo dT. U RNA THP-1 a HUVEC byla syntéza cDNA startována odděleně jak oligo dT, tak náhodnými hexamery, a tyto dvě cDNA knihovny byly zpracovávány odděleně. Ke koncům cDNA byly ligovány syntetické adaptorové oligonukleotidy umožňující její inserci do Uni-Zap™ vektorového systému (Stratagene), což dovoluje vysoce účinnou konstrukci jednosměrné lambda knihovny (v sensé orientaci) a pohodlí plasmidového systému s barevnou selekcí modrá-bílá u detekce klonů s inserty cDNA. Konečně: Tyto dvě knihovny byly spojeny do jediné knihovny smícháním stejných počtů bakteriofága.

Knihovny byly hodnoceny bud s DNA sondami nebo s protilátkovými sondami a bylo možno rychle in vivo vystřihnout pBluescript^R fagemidy (Stratagene). Fagemid umožňuje použít plasmidový systém ke snadné charakterizaci insertu, sekvenování, řízené mutagenese, vytváření deleqí v jednom směru a k expresi fúzovaných bílkovin. Fágové částice knihoven konstruovaných na zakázku byly použity k infekci E. coli hostitelského kmene XLl-Blue^R (Stratagene), jenž má vysokou transformační účinnost, což zvyšuje pravděpodobnost získání vzácných, málo zastoupených klonů v knihovně cDNA.

Příklad 3

Izolace cDNA klonů

Fagemidové formy jednotlivých cDNA klonů byly získány in vivo vyštěpovacím procesem, u kterého byl hostitelský bakteriální kmen infikován současně lambda fágem knihovny a pomocným fágem fl. Bílkoviny odvozené jak z fága obsaženého v knihovně, tak z pomocného fága, tvoří jednovláknová přerušení [nick] v lambda DNA, iniciují syntézu nové DNA z definovaných sekvencí cílové lambda DNA a tvoří menší, jednovláknové cirkulární molekuly fagemidové DNA, které zahrnují všechny DNA sekvence pBluescript^R plasmidu a cDNA insertu. Fagemidové DNA je secernována z buněk a purifikuje se, pak se použije na reinfekqi čerstvých hostitelských buněk, kde se dvoří dvouvláknová fagemidová DNA. Protože fagemid nese gen pro beta-laktamasu, nově transformované bakterie jsou selektovány na médiu obsahujícím ampicilin.

Fagemidová DNA byla čištěna s použitím Magie Minipreps^R DNA Purification System (Promega katalogové č. A7100, Promega Corp., 2800 Woods Hollow Rd. , Maison, WI 53711). Tento postup v malém měřítku poskytuje jednoduchý a spolehlivý způsob lyse bakteriálních buněk a rychlé izolace purifikované fagemidové DNA s použitím vlastnicky chráněné náplně pro vazbu DNA. DNA byla eluována z purifikační náplně, jež je už připravována pro účely sekvenování a dalších analytických operací.

Fagemidová DNA byla purifikována také s použitím QIAwell-8 Plasmid Purification System z QIAGEN^R DNA Purification System (QIAGEN lne., 9259 Eton Ave., Chattsworth, CA 91311). Takováto produkce poskytuje pohodlný, rychlý a spolehlivý výkonný způsob pro lysi bakteriálních buněk a izolaci vysoce purifikované fagemidové DNA s použitím částic QIAGEN anexové s technologií EMPORE™ membrány od 3M ve formátu více jamek. DNA byla eluována z purifikační náplně, jež je už připravována pro účely sekvenování a dalších analytických operací.

Nedávno se stal dostupným alternativní způsob purifikace fagemidů. Používá Miniprep Kit (katalogové č. 77468, dostupný u Advanced Genetic Technologies Corp., 19212 Orbit Drive, Githersburg, Maryland). Tato souprava je ve formátu 96 jamek a poskytuje reagenty postačující na 960 purifikací. Každá souprava je poskytována s doporučovaným protokolem, jenž byl dodržován, až na následující změny. Za prvé byla každá z 96 jamek naplněna jen 1 ml sterilní terrific půdy s karbenicilinem o koncentraci 25 mg/1 a 0,4 % glycerolem. Po naočkování jamek byly bakterie kultivovány po lysačního pufru. Centrifugační provádí předtím, než se obsah hodin a lysovány s 60 μΐ krok (2900 rpm po 5 minut) se bloku dá na primární filtrovací destičky. Případný krok přidání isopropanolu do TRIS pufru se rutinně neprovádí. Po posledním kroku protokolu se vzorky přenesou do 96-jamkového bloku Beckman ke skladování.

Další nový systém purifikace DNA je výrobek WIZARD , jenž je dostupný u Promega (katalogové č. A7071) a je přizpůsobitelný pro 96-jamkový formát.

Příklad 4

Sekvenace cDNA klonů prekursorů). Nová sekvenaci a analýze cDNA inserty náhodných izolátů z knihoven U-937 a THP-1 byly částečně sekvenovány. Způsoby sekvenace DNA jsou v oboru dobře známé. Konvenční enzymatické metody používají Klenowův fragment DNA polymerasy, Sequenase™ nebo Taq polymerasu k extendování řetězců DNA z oligonukleotidového primeru přihybridizováného [annelaed] k DNA templátu, jenž je předmětem zájmu. Byly vyvinuty metody pro používání jak jedno-, tak dvouvláknových templátů. Produkty terminace řetězce se obvykle elektroforézuji ha akrylamidových gelech s močovinou a detegují bud pomocí autoradiografie (u prekursorů značených radionuklidy) nebo fluoresčence (u fluorescenčně značených vylepšení v mechanizované přípravě reakcí, s použitím fluorescenční detekce dovolují nárůst počtu sekvencí, jež lze stanovit za jeden den (jako u Applied Biosystems 373 a 377 DNA sekvenátoru, Catalyst 800). V současnosti se systémy, jak jsou popsány, délky čtení kolísají od 250 do 400 baží a jsou závislé na klonech. Délka čtení kolísá také s délkou a časem, s nimiž běží gel. Všeobecně mají kratší běhy gelu tendenci ubírat ze sekvence. Pro identifikaci a pro stanovení stupně homologie sekvence je potřebné minimum o pouhých 25 až 50 bazích Zobrazování genových transkriptů lze použít s jakoukoli sekvenčně specifickou metodou včetně, ale bez omezení, hybridizace, hmotové spektroskopie, kapilární elektroforézy a elektroforézy s 505 gelem.

Příklad 5

Vyhledávání homologie cDNA klonu a odvozené bílkovin (a následující kroky)

S použitím nukleotidových sekvencí odvozených od cDNA klonu jako zkoumaných sekvencí (sekvence ze Seznamu sekvencí) se v databázích dříve identifikovaných sekvencí vyhledávají oblasti homologie (podobnosti). Příklady takovýchto databází zahrnuji

Genbank a vyhledávání následující dvou algoritmů pak popisujeme provádění podle

EMBL. Dále popisujeme příklady homologií, jež lze používat, a počítačem implementované kroky k výhodných provedení vynálezu.

V následujícím popisu počítačem implementovaných kroků vynálezu označuje slovo knihovna soubor (nebo populaci) sekvencí nukleových kyselin biologického vzorku. Knihovna může sestávat z cDNA sekvencí, RNA sekvencí, nebo podobně, jež charakterizují biologický vzorek. Biologický vzorek může sestávat z buněk jediného lidského buněčného typu (nebo může být kterýmkoli ze shora uvedených typů vzorků). Očekáváme, že sekvence v knihovně byly stanoveny tak, že věrně reprezentují nebo charakterizují biologický vzorek (mohou například sestávat z reprezentativních cDNA sekvencí z klonů RNA vzaté z jediné lidské buňky).

V následujícím popisu počítačem implementovaných kroků vynálezu označuje výraz databáze soubor uložených dat, která představují sbírku sekvencí, které zase představují sbírku referenčních biologických materiálů. Databáze může například sestávat z dat představujících mnohé uložené cDNA sekvence, které jsou zase reprezentativní pro lidské buňky infikované různými viry, buňky lidí různého věku, buňky z různých savčích druhů, a tak dále.

Ve výhodných provedeních používá vynález počítač programovaný software (bude popsáno) k provádění následujících kroků:

a) zpracování dat indikativních pro knihovnu cDNA sekvencí (generovanou jako výsledek výkonného sekvenování cDNA nebo jiným způsobem) k určení, zda každá sekvence knihovny odpovídá nějaké DNA sekvenci referenční databáze DNA sekvencí (a když je tomu tak, určení vstupu referenční databáze, jenž odpovídá této sekvenci, a vyznačení stupně shody mezi referenční sekvencí a sekvencí knihovny) a přiřazení hodnoty identifikované sekvence, založené na anotaci sekvence a stupni shody s každou ze sekvencí v knihovně,

b) pro některé nebo všechny vstupy databáze se tabeluje počet odpovídajících hodnot identifikovaných sekvencí v knihovně (i když toto lze provádět lidskou rukou z výtisků všech vstupů, dáváme přednost provedení tohoto kroku s počítačovým software, jež bude popsáno níže) a takto se generuje konečný soubor hodnot dat neboli číslo výskytu, a

c) když mají knihovny různé velikosti, dělení každého čís výskytu celkovým počtem sekvencí v knihovně, za získání relativního čísla výskytu pro každou hodnotu identifikované sekvence (t.j. relativní hojnost každého genového transkriptů).

Seznam hodnot identifikovaných sekvencí (nebo jím odpovídajících genů) může pak být uspořádán podle hojnosti v populaci cDNA. Je možných mnoho dalších typů srovnávání nebo rozměrů.

Například (což bude popsáno podrobněji níže) kroky a) a b) lze opakovat se dvěma různými knihovnami (na něž se někdy odkazuje jako na cílovou knihovnu a na odčítanou knihovnu)<, Pak se pro každou hodnotu identifikované sekvence (nebo genového transkriptů) získá hodnota podílu vydělením čísla výskytu (pro tuto hodnotu identifikované sekvence) pro cílovou knihovnu číslem výskytu (pro tuto hodnotu identifikované sekvence) pro odčítanou knihovnu.

Ve skutečnosti lze provádět odčítání na početnějších knihovnách. Je možné sečíst transkripty z několika knihoven (například tří) a pak je dělit jiným souborem transkriptů z početnějších knihoven (znovu, například, ze tří). Zapsání této operace může být ve zkratce (A+B+ C) / (D + E + F), kde každé z velkých písmen označuje celou knihovnu. Čísla výskytu transkriptů v sečtených knihovnách mohou být případně dělena celkovou velikostí vzorku před odčítáním.

Na rozdíl od standardní hybridizační technologie, která umožňuje jediné odečtení dvou knihoven, jakmile je zpracován soubor (či knihovna) sekvencí transkriptů a je uložen v počítači, lze s touto knihovnou provádět odčítání v jakémkoli počtu. Například mohou být tímto způsobem získány hodnoty podílů vydělením hodnot relativní hojnosti v první knihovpě odpovídajícími hodnotami v druhé knihovně a naopak.

Ve variacích kroku a) sestává knihovna z nukleotidovýčh sekvencí odvozených od cDNA klonů. Příklady databází, v nichž lze vyhledávat oblasti homologie (podobnosti) v kroku a), zahrnují komerčně dostupné databáze známé jako Genbank (NIH), EMBL (European Molecular Biology Labs, Německo) a GENESEQ (Intelligenetics, Montain View, Kalifornie).

Jeden algoritmus vyhledávání homologií, jehož lze využít pro implementaci kroku a), je algoritmus popsaný v publikaci od D.J. Lipmana a W.R. Persona, nazvané Rychlá a citlivá vyhledávání podobnosti bílkovin, Science 227:1435 (1985). U tohoto algoritmu jsou homologní úseky prohledávány dvoustupňovým způsobem. V prvním kroku jsou nejhomolognější úseky stanoveny pomocí výpočtu výsledku shody [matching score] s použitím tabulky výsledků homologie [homology score], K určení minimální velikosti okénka, jež se posunuje při porovnávání dvou sekvencí, se používá parametr Ktup. Ktup také určuje počet baží, jež musí být shodné, pro vyjmutí nejhomolognějšího úseku sekvencí. V tomto kroku se nepoužívají žádné inserce nebo delece a homologie je předvedena jako iniciální (INIT) hodnota.

Ve druhém kroku jsou homologní úseky vzájemně přiloženy k sobě [ aligrned], k získání nej vyššího výsledku shody pomocí insercí a mezer, za účelem přidání pravděpodobně deletované části. Výsledek shody získaný v prvním kroku je přepočítán s použitím tabulky výsledků shody a tabulky výsledků insercí [insertion score] na optimalizovanou (OPT) hodnotu v konečné výstupu.

DNA homologie mezi dvěma sekvencemi mohou být zkoumány graficky s použitím Harrovy metody konstrukce bodové matrice vynesení homologií (Needleman, S.B. a Wunch, C.O., J. Mol. Biol. 48:443 (1970)). Tato metoda produkuje dvojrozměrné vynesení, které může být užitečné pro stanovení úseků homologie versus úsekům repetice.

Ve třídě výhodných provedení se však krok a) implementuje zpracování dat knihovny komerčně dostupným počítačovým programem, známým jako INHERIT 670 Sequence Analysis System, dostupným od Applied Biosystems lne. (Foster City, Kalifornie), zahrnujícím software, známé jako Factura (také dostupné od Applied Biosystems lne.). Program Factura předzpracovává sekvence knihovny za vyškrtávání těch jejich částí, u nichž není pravděpodobné, že by byly předmětem zájmu, jako je vektorová část použitá u přípravy knihovny. Další sekvence jež mohou být vyřazeny nebo maskovány (ignorovány vyhledávacími prostředky) jsou, ale bez omezení, póly A konce a repetitivní GAG a CCC sekvence. Může být napsán omezující vyhledávací program k zamaskování takovýchto málo informativních sekvencí, nebo je mohou ignorovat programy jako je BLAST.

V algoritmu implementovaném pomocí INHERIT 670 Sequence Analysis System, se ke stanovení úseků homologie používá'Pattern Specification Language (vyvinutá u TRW lne.). Existují tri parametry, jež určují jak analýza INHERIT provádí srovnávání sekvencí: velikost okénka, nastavování okénka a tolerance k chybám. Velikost okénka určuje délku segmentů do kterých je zkoumaná sekvence rozdělována. Nastavování okénka určuje, kde se začne s dalším porovnávaným segmentem, počítáno od začátku předešlého segmentu. Tolerance k chybám určuje celkový počet inserci, delecí nebo substitucí, jež jsou tolerovány v rámci určené délky slova. Tolerance k chybám může být nastavena na jakékoli celé číslo mezi 0 a 6. Defaultová nastavení jspu velikost okénka = 20, nastavování okénka = 10 a tolerance k chybám = 3. INHERIT Analysis Users Manual, str. 2-15, verze 1.0, Applied Biosystems, lne., říjen 1991.

S použitím kombinace těchto tří parametrů může být databáze i

(jako je DNA databáze) prohledávána na sekvence obsahující úseky homologie a patřičné sekvence dostanou iniciální hodnotu. Následně jsou tyto homologní úseky zkoumány s použitím vynesení bodové matrice pro určení úseků homologie versus úseků repetice. Pro vyjádření výsledků vyhledávání homologií lze použít Smithova-Watermanova přikládání. Software INHERIT může běžet na počítačovém systému Sun, programovaném operačním systémem UNIX.

Vyhledávací alternativy k INHERIT zahrnují BLAST program, GCG (dostupný od Genetics Computer Group, WI) a program Dasher (Temple Smith, Boston University, Boston, MA). Nukleotidové sekvence mohou být prohledávány proti Genbank, EMBL nebo databázím na zakázku, jako je GENESEQ (dostupná od Intelligenetics, Montain View, Kalifornie), nebo jiným databázím pro geny. Navíc jsme některé sekvence prohledávali proti naší vlastní domácí databázi.

Ve výhodných provedeních jsou sekvence transkriptú analyzovány software INHERIT, pro dosažení nejlepšího souhlasu s referenčním transkriptem, k přiřazení identifikátoru sekvence a přiřazení stupně homologie, což je spolu hodnotou identifikované sekvence a vstupem (k dalšímu zpracování) do osobního počítače Macintosh (dostupného od Apple), programovaného k uspořádání hojností a odčítací analýze počítačovým programem (bude popsán níže).

Před programem uspořádání hojností a odčítací analýzy (označovaným také jako program uspořádání hojností) se přiřazují identifikovaným sekvencím z cDNA klonů hodnoty (podle parametrů uváděných výše) se stupněm shody podle následujících kategorií: přesná shoda (úseky s vysokým stupněm identity), homologní lidská shoda (úseky s vysokou podobností, ale ne přesnou shodou, homologní ne-lidská shoda (v druzích jiných než člověk jsou přítomné úseky vysoké podobnosti) nebo žádná shoda (žádné významné úseky homologie s dříve identifikovanými nukleotidovými sekvencemi uloženými ve formě databáze). Alternativně může být stupeň shody číselnou hodnotou jak je popsáno níže.

Znovu s odkazem na krok identifikace shod mezi referenčními sekvencemi a vstupy databáze, ze sekvencí nukleových kyselin mohou být odvozeny sekvence peptidů a bílkovin. Při používání odvozených sekvencí polypeptidů může být identifikace shody prováděna způsobem analogickým tomu, co se provádí s cDNA sekvencemi. Sekvence bílkoviny se používá jako zkoumaná sekvence a pro nalezení homologní bílkoviny se porovnává s dříve identifikovanými sekvencemi obsaženými v

Swiss/Prot, PIR a proteinová databáze NBRF.

iniciálně vyhodnocovány na homologii s použitím tabulky hodnocení homologie (Orcutt, B,C. a Dayoff, M.O. Scoring Matrices, PIR Report MAT - 0285 (únor 1985)), což vede k INIT hodnotě.

Homologní úseky jsou přikládány k sobě pro získání nejvyššího výsledku shody za vložení mezery, která přidává pravděpodobně deletovanou část. Výsledek shody je přepočítán s použitím tabulky výsledků shody a tabulky výsledků insercí na optimalizovanou (OPT) hodnotu v konečné výstupu. I bez znalosti správného čtecího rámce izolované sekvence lze provádět shora popsané vyhledávání homologie bílkovin prohledáváním všech tří čtecích rámců.

Homologie sekvencí peptidů a bílkovin lze určit pomocí INHERIT 670 Sequence Analysis System podobně jako u homologii DNA sekvencí. Používá Pattern Specification Language a parametrovaná okénka se používají k prohledávání bílkovinových databází na sekvence obsahující úseky homologie, jíž se dává iniciální hodnota. Následně znázornění v grafu bodové matrice ukazuje úseky databázi jako je Tyto bílkoviny jsou homologie versus repetice. Další nástroje vyhledávání jsou dostupné k prohledávání motivů (pattern] v databázích a zahrnují PLearch Blocks (dostupné od Henikoff & Henikoff, University of Washington, Seattle), Dasher a GCG. Databáze k vyhledávání motivů zahrnují, ale bez omezení, Protein Blocks (dostupnou od Henikoff & Henikoff, University of Washington, Seattle), Brookhaven Protein (dostupnou od Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, MA), PROSÍTE (dostupnou od Amose Bairocha, Ženevská universita, Švýcarsko), ProDom (dostupnou od Temple Smithe, Boston University) a PROTEIN MOTIF FINGERPRINT (dostupnou z University of Leeds, Velká Británie).

Aplikační software ABI Assembler, část systému DNA analýzy INHERIT (dostupného od Applied Biosystems, lne., Foster City, Kalifornie), lze použít k projektům vytvoření a používání složených sekvencí s pomocí skládání dat z vybraných fragmentů do větší sekvence. Software Assembler spojuje dvě pokročilé počítačové technologie, což maximalizuje schopnost složit sekvenované fragmenty DNA do Assemblage, zvláštního uskupení dat, kde jsou vztahy mezi sekvencemi ukázány grafickým překryvem, přiložením a ze statistického pohledu. Postup je založen na Meyersově-Kaceciogluově modelu skládání fragmentů (INHERIT™ Assemler User's Manual, Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) a používá teorii grafů jako základ velice rigorózního stroje k přikládání více sekvencí pro složení fragmentů DNA. Jiné skládací programy, jež mohou být použity, zahrnují MEGALIGN a STÁD (dostupný od DNASTAR lne., Madison, WI), Dasher (dostupný u Rogera Stadena, Cambridge, Anglie).

Dále, s odkazem na Obr. 2., popisujeme podrobněji program uspořádání hojností, jenž implementuje krok b) k tabelováhí počtu sekvencí knihovny, jež se shodují s každým vstupem databá (počet výskytu pro každý vstup databáze).

Obr. 2 je schéma výhodného provedení programu uspořádávání hojností. Seznam kódů zdrojů pro toto provedení je zad v Tabulce 5. Při implementaci Tabulky 5 je program uspořádává hojností napsán s použitím programovacího jazýka FoxBASjE, komerčně dostupného od Microsoft Corporation. I když FoxBASE byl programem vybraným pro první iteraci této technologie, nesmí se považovat za omezující. Mohou být použity mnohé jiné programovací jazyky, přičemž Sybase je obzvlášt: žádoucí alternativou, jak bude

EN ze an ní jasné tomu, kdo je normálně zběhlý v oboru. Názvy subrutin specifikované v Obr. 2 odpovídají subrutinám uváděným v Tabulce 5.

Znovu s odkazem na Obr. 2, identifikované sekvence jsou sekvence transkriptů, reprezentující každou sekvenci knihovny a odpovídající identifikaci shodného vstupu databáze (pokud existuje). Jinými slovy jsou identifikované sekvence výstupem shora rozebraného kroku a).

Obr. 3 je blokový diagram sytému pro implementaci vynálezu. Systém v Obr. 3 zahrnuje jednotku 2 generování knihovny, jež generuje knihovnu a určuje tok výstupu sekvencí transkriptů indikativních pro biologické sekvence tvořící knihovnu. Programovaný procesor 4 proud dat výstupu z jednotky 2 a zpracovává tato data v souladu se shora rozebraným krokem a) za generování identifikovaných sekvencí. Procesor 4 může být procesor programovaný komerčně dostupným počítačovým programem, známým jako INHERIT 670 Sequence Analysis System a komerčně dostupným počítačovým programem, známým jako Factura (oba dostupné od Applied Biosystems lne.) a operačním systémem UNIX.

Stále s odkazem na Obr.3, identifikované sekvence se plní do procesoru 6, jež je programován programem uspořádávání hojností. Procesor 6 generuje konečné sekvence transkriptů, předvedené v Obr. 2 a 3. V Obr. 4 je ukázán podrobný blokový diagram plánovaného vztahového počítačového systému, jež zahrnuje různé vyhledávací techniky, jež mohou být implementovány, spolu s výběrem databází, proti kterým lze zkoumat.

S odkazem na Obr. 2, program uspořádávání hojností napřed provede na identifikované sekvenci operaci známou jako Tempnum, k vyřazení všech identifikovaných sekvencí kromě těch, jež mají protějšek vybraného typu ve vstupech databáze. Například proces Tempnum může vybírat identifikované sekvence, které představují následující typy shody se vstupy databáze (viz výše ohledně definic): přesné shody, lidské homologní shody, shody s jiným druhem (představující geny přítomné v druzích jiných než člověk), žádné shody (žádné významné úseky homologie s databázovými vstupy reprezentujícími dříve identifikované nukleotidové sekvence), I shody (Incyte pro dříve neznámé DNA sekvence), nebo X shody (shody s ETS v referenční databázi).

Toto eliminuje sekvence U, S, Μ, V, A, Ra D (ohledně definic viz Tabulku 1.

Hodnoty identifikovaných sekvencí, vybraných během procesu Tempnum ,pak projdou další výběrovou operací (odplevelením), jež je známa jako Tempred. Tato operace může například vyřadit všechny hodnoty identifikovaných sekvencí, představujících shodu s vybranými vstupy databáze.

Hodnoty identifikovaných sekvencí vybraných v procesu Tempred jsou pak klasifikovány podle knihovny během operace Tempdesig. Očekává se, že identifikované sekvence mohou představovat sekvence z jedné knihovny, nebo ze dvou nebo více knihoven.

Uvažujme napřed případ, kdy identifikované sekvence představují sekvence z jedné knihovny. V tomto případě projdou všechny hodnoty identifikovaných sekvencí stanovené během Tempred tříděním v operaci Templib, dalším tříděním v operaci Libsort a konečně dalším tříděním v operaci Temptarsort. Například: Tyto tři operace mohou uspořádávat identifikované sekvence v pořadí klesajícího čísla výskytu (za generování seznamu klesajících počtů výskytu, kde každé číslo výskytu odpovídá unikátnímu sekvenčnímu vstupu, nebo několik seznamů klesajících počtů výskytu, kde čísla výskytu v každém seznamu odpovídají databázovým vstupům vybraného typu) s odstraněním redundancí z každého uspořádaného seznamu. V tomto případě lze obejít operaci identifikovanou jako Cruncher, takže hodnotami konečných dat jsou organizované sekvence transkriptů, produkované během operace Temptarsort.

Dále uvažujme případ, kdy sekvence transkriptů produkované během operace Tempred představují sekvence ze dvou knihoven (jež budeme označovat jako cílovou knihovnu a odčítací knihovnu). Například: Cílová knihovna může sestávat z cDNA sekvencí z klonů chorobné buňky, zatímco odčítací knihovna může sestávat z cDNA sekvencí z klonů chorobné buňky, vystavené působení léku. Jiný příklad: Cílová knihovna může sestávat z cDNA sekvencí z klonů buněčného typu z mladého člověka, zatímco odčítací knihovna může sestávat z cDNA sekvencí z klonů téhož buněčného typu ze stejného člověka v různém jiném věku.

V tomto případě směruje operace Tempdesig všechny sekvence transkriptů, reprezentující cílovou knihovnu, ke zpracování v souladu s Templib (a pak s Libsort a Temptarsort”) a směruje všechny sekvence transkriptů, reprezentující odčítanou knihovnu, ke zpracování v souladu s Tempsub (a pak s Subsort a Tempsubsort). Například: Následné třídící operace Templib, Libsort a Temptarsort uspořádávají identifikované sekvence cílové knihovny v pořadí klesajícího čísla výskytu (za generování seznamu klesajících počtů výskytu, kde každé číslo výskytu odpovídá unikátnímu sekvenčnímu vstupu, nebo několik seznamů klesajících počtů výskytu, kde čísla výskytu v každém seznamu odpovídají databázovým vstupům vybraného typu) s odstraněním redundancí z každého uspořádaného seznamu. Následné třídící operace Tempsub, Subsort a Tempsubsort uspořádávají identifikované sekvence odčítané knihovny v pořadí klesajícího čísla výskytu (za generování seznamu klesajících počtů výskytu, kde každé číslo výskytu odpovídá unikátnímu sekvenčnímu vstupu, nebo několik seznamů klesajících počtů výskytu, kde čísla výskytu v každém seznamu odpovídají databázovým vstupům vybraného typy) s odstraněním redundancí z každého uspořádaného seznamu.

Výstup sekvencí transkriptů z operace Temptarsort představuje typicky uspořádaný seznam, z něhož lze konstruovat histogram, kde pozice podél jedné (např. horizontální) ošy ukazují počet výskytu (sekvencí cílové knihovny) a pozice podél druhé (např. vertikální) osy ukazují hodnotu identifikované sekvence (např. lidský nebo ne-lidský typ genu). Podobně: Výstup sekvencí transkriptů z operace Tempsubsort představuje typicky uspořádaný seznam, z něhož lze konstruovat histogram, kde pozice podél jedné (např. horizontální) osy ukazují počet výskytu (sekvencí odčítané knihovny) a pozice podél druhé (např· vertikální) osy ukazují hodnotu identifikované sekvence (např· lidský nebo ne-lidský typ genu).

Výstup sekvencí transkriptů (uspořádané seznamy) z třídících operací Tempsubsort a Temptarsort se spojí během operace identifikované jako Cruncher [drtic]. Proces Cruncher identifikuje páry odpovídajících cílových a odčítaných počtů výskytu (oba reprezentují stejnou hodnotu identifikované sekvence), a dělí jeden druhým za generování hodnoty podílu pro každý pár odpovídajících počtů výskytů, a pak uspořádává hodnoty podílů v pořadí klesajících hodnot podílů. Výstup dat z operace Cruncher (konečný transkript v Obr. 2) je typicky uspořádaným seznamem, z něhož lze konstruovat histogram, kde pozice podél jedné osy ukazují velikost podílu počtů výskytu (pro odpovídající hodnoty identifikovaných sekvencí z cílové a odčítané knihovny) a pozice podél druhé osy ukazují hodnotou identifikované sekvence (např. typ genu).

S výhodou je, když před získárjím poměru mezi hodnotami hojnosti ve dvou knihovnách vydělí operace Cruncher každou hodnotu podílu celkovým počtem sekvencí v cílové nebo v odčítané knihovně, nebo v obou. Výsledné seznamy relativních hodnot podílů, generované touto Cruncher operac-í, jsou užitečné pro řadu lékařských, vědeckých a průmyslovýqh aplikací. Je rovněž s výhodou, když výstupem operace Cruncher je soubor seznamů, kde každý seznam reprezentuje sekvenci s klqsajícími hodnotami podílu v různé vybrané podtřídě vstupů databáze (např. v rodině bílkovin).

V jednom příkladu tabeluje program uspořádávání hojností podle vynálezu pro některou knihovnq počty mRNA transkriptů, odpovídající každému genu identifikovanému v databázi. Tato čísla se dělí celkovým počtem klonů vzorkq. Výsledek dělení odráží relativní hojnost mRNA transkriptů v buqěčném typu nebo ve tkáni, z níž byly získány. Získání tohoto konečného souboru dat se zde označuje jako analýza obrazu genových transkriptů). Výsledná data po odečtení ukazují přesně, podrobně a komplexně, které bílkoviny a geny jsou regulovány směry '^nahoru a dolů.

Příklad 6 cDNA knihovna HUVEC

Tabulka 2 je tabulka hojností, poskytující seznam různých genových transkriptů v knihovně indukovaných buněk HUVEC. Transkripty jsou v seznamu uspořádány v pořadí klesající hojnosti. Toto počítačové třídění zjednodušuje analýzu tkáně a urychluje identifikaci význačných nových bílkovin, jež jsou specifické pro tento buněčný typ. Tento typ endothelových buněčných linií vytváří tkáň kardiovaskulárního systému, a čím víc se ví o jejich složení, obzvlášť při odezvě na aktivaci, tím dále se zvětšuje výběr cílových bílkovin, na něž lze působit při léčbě poruch této tkáně, jako třeba při hojně se vyskytující atheroskleróze.

Příklad 7 cDNA knihovny buněk monocytů a žírných buněk

Části srovnání dvou knihoven jsou ukázány v Tabulkách 3 a 4. V Tabulkách 3a 4 jsou normálními monocyty buňky HMC-1 a aktivovanými makrofágy buňky THP-1 po předcházejícím působení PMA a aktivaci LPS. Tabulka 3 uvádí pro oba typy buněk seznam nejhojnějších genových transkriptů v pořadí snižující se hojnosti. S pouhými patnácti genovými transkripty pro každý typ buněk umožňuje tato tabulka rychlé, kvalitativní srovnání nejběžnějších transkriptů. Tato uspořádání hojností, s jejich pohodlným přiložením vedle sebe, poskytují okamžitě užitečný nástroj výzkumu. V daném případě tento nástroj výzkumu odhaluje, že 1) jenom jeden z patnácti předních transkriptů aktivovaných makrofágů se nalézá mezi patnácti předními genovými transkripty normálních monocytů (póly A vážící bílkovina) a 2) nový genový transkript (nezaznamenaný dříve v jiných databázích) je poměrně vysoce reprezentován v aktivovaných makrofázích, ale není podobně prominentní u normálních makrofágů. Takovýto výzkumný nástroj poskytuje badatelům krátkou cestu k novým bílkovinám, jako k receptorů<* povrchovým buněčným a intracelulárním signálním molekulám, jež mohou sloužit jako cílová místa léků u komerčních vyhledávacích programů. Takovýto nástroj ušetří značný čas v porovnání s tím, co se ztratí při odhalování systémem zásah nebo vedle, když se jedná o programy identifikace důležitých bílkovin na buňkách nebo uvnitř nich, a je tomu tak proto, že bílkoviny, jež jsou nositeli běžných buněčných funkcí a jež jsou reprezentovány mRNA v rovnovážném stavu jsou rychle eliminovány z další charakterizace.

Tímto se ilustruje, jak se profily genových transkriptů mění se změnou buněčné funkce. Těm, co jsou zběhlí v oboru je známo, že biochemické složení buněk se také mění s jinými funkčními změnami, jako je rakovina, včetně různých stádií rakoviny, a vystavení toxickému působení. Odečtené (substrakční) profily genových transkriptů, jako ty, co jsou v Tabulce 3, jsou užitečné jako první nástroj výzkumu v takovýchto studiích genové exprese a bílkovin.

Příklad 8

Odčítací analýza cDNA knihoven buněk normálních monocytů a buněk aktivovaných makrofágů

Jakmile jsou cDNA data v počítači, použije se pro získání poměrů všech genových transkriptů těchto dvou knihoven, diskutovaných v Příkladu 7, počítačový program uvedený v Tabulce 5 a genové transkripty se uspořádají podle klesajících hodnot svých poměrů. Když některý genový transkrip není v jedné knihovně zastoupen, hojnost takovéhoto genového transkriptů není známa, ale zdá se být menší než 1. Jako přiblížení - a pro získání poměru, což by nebylo možné, pokud by se pro nezastoupený gen brala nulová hojnost - mají geny, jež jsou zastoupené pouze v jedné ze dvou knihoven, přiřazenou hojnost 1/2. Použití 1/2 pro nezastoupené klony zvyšuje relativní význam zapnutých a vypnutých genů, jejichž produkty by mohly být kandidáty pro léčebný zásah. Výsledný výtisk se nazývá odečtená (substrakční) tabulka a představuje mimořádně cennou vyhledávací metodu, jak ukazují následující data.

Tabulka 4 je odečtená tabulka, ve které byla knihovna normálních monocytů elektronicky odečtena od knihovny aktivovaných makrofágů. Tato tabulka nejefektivněji zdůrazňuje změny v hojnosti genových transkriptů při aktivaci makrofágů. Několik neznámých genových transkriptů existuje dokonce mezi transkripty seznamu. Elektronické nástroj, jenž pomůže výzkumníkům mnohem rychleji identifikovat základní biochemické změny u dvou typů buněk. Takovýto nástroj může v ranných stadiích objevných prací ušetřit drahocenný čas universitám a farmaceutickým společnostem, jež utrácejí miliardy dolarů na výzkum, a urychlit cyklus vývoje léků, což zase umožní výzkumníkům zakládat programy hodnocení léků mnohem dříve. Tento výzkumný nástroj tedy prvními odčítání dvaceti genovými je tedy užitečný je různých počet v aktivovaných poskytuje cestu, jak dát nové léky veřejnosti rychleji a hospodárněji.

Odečtená tabulka může také být získána k diagnóze pacienta. Vzorek od individuálního pacienta (jako jsou monocyty získané biopsí nebo vzorek krve) lze srovnat se zde poskytnutými daty k diagnóze stavu, spojeného s aktivací makrofágů.

Tabulka 4 odhalila mnoho nových transkriptů (označovaných jak Incyte klony). Je vidět, že mnohé geny jsou v aktivovaných makrofázích zapnuty (t.j. monocyty mají nulu ve sloupci bgfreq). Tato metoda prohledávání je lepší než jiné, jako western analýza, jež nemohou odkrýt takový genových transkriptů.

Prohledávací odčítací technika také odkryla makrofázích vysoký počet nádorových genových transkriptů (onkogeny rho, ETS2, rab-2 ras, onkogeny příbuzné YPT1 a mRÍíA akutní myeloidní leukémie). Tyto transkripty mohou být připsáňy použití imortalizovaných buněk a jsou z tohoto důvodu jako takoýé zajímavé. Tato prohledávací technika dává podrobný obraz nahoru regulovaných transkriptů, včetně onkogenů, což pomáhá vysvětlit, proč protinádorové léky ovlivňují s pacientovou imunitou, zprostředkovanou aktivovanými makrofágy. Vyzbrojeni znalostmi, získanými z této prohledávací metody, mohou ti, co jsou zběhlí v oboru, založit lépe cílené a efektivnější vyhledávací programy k identifikaci léků, které jsou diferenčně účinné proti 1) jak proti rakovině, tak proti podmínkám s aktivovanými makrofágy při témže profilu genových transkriptů, 2) samotné rakovině a 3) podmínkám s aktivovanými makrofágy.

Senescentní bílkovina hladkého svalu (22 kDa) byla v aktivovaných makrofázích regulována nahoru, což ukazuje, že je kandidátem pro blok při kontrole zánětů.

Příklad 9

Odčítací analýza normálních jaterních buněk a buněk jater inf ikovaných hepatitidou

V tomto příkladě jsou potkani vystaveni viru hepatitidy a udržováni v kolonii dokud nevykazují definitivní známky hepatitidy. Z potkanů s diagnostikovanou hepatitidou je jedna polovina léčena novým antihepatitickým činidlem (AHA). Ze všech potkanů se získají vzorky jater před vystavením hepatitickému viru a na konci působení AHA nebo bez jeho působení. Navíc mohou být jaterní vzorky získány těsně před léčbou AHA.

Jaterní tkáň se zpracuje jak je popsáno v Příkladech 2 a 3 k získání mRNA a následnému sekvenování cDNA. Tato cDNA z každého vzorku se analyzuje na hojnost počítačovým programem podle Tabulky 5. Výsledná zobrazení cDNA genových transkriptů poskytují podrobný obraz zvířat základního stavu (kontroly) a zvířat ve stavu infekce nebo léčby. cDNA ze skupin vzorků mohou být spojována do skupin sumárního profilu genových transkriptů pro všechny kontrolní vzorky, všechny vzorky infikovaných potkanů a všechny vzorky potkanů léčených AHA.

Odčítání se provádějí mezi patřičnými jednotlivými knihovnami a seskupenými knihovnami. U jednotlivých zvířat mohou být odečteny vzorky kontroly a vzorky po pokuse. Též: Pokud se vzorky získají před a po působením AHA, tato data mohou být odčítána pro jednotlivá zvířata a pro skupiny působení. Navíc mohou být data všech kontrolních vzorků dána dohromady a zprůměrována. Průměr kontrol může být odečten od průměru vzorků jak po pokuse s AHA, tak po pokuse bez AHA. Když jsou dostupné vzorky před léčbou a po ní, tyto vzorky mohou být srovnávány individuálně (nebo elektronicky zprůměrovány) a odečteny.

Tyto odečtené tabulky se použijí ve dvou obecných směrech. Za prvé: Analyzují se rozdíly mezi genovými transkripty, jež jsou spojeny s postupujícím poškozením jater nebo s hojením. Odečtené tabulky jsou nástrojem k osamostatnění výsledku působení léku z podkladu daného základní patologií hepatitidy. Protože hepatitida ovlivňuje mnohé parametry, další toxické působení na játra se těžko zjišťovalo pouhými krevními testy na obvyklé enzymy. Profil genových transkriptů a odčítání poskytují mnohem komplexnější biochemický obraz, jejž badatelé, potřebují u analýz takto složitých problémů.

Za druhé: Odečtené tabulky poskytují nástroj k identifikac klinických markérů, jednotlivých bílkovin nebo jiných biochemických determinant, jež hodnocení konečného klinického prostřednictvím léku, a dokonce se používají k předpovědi nebo bodu, jako je choroba, zlepšení další patologie způsobená lékem.

Odečtené tabulky specificky vystihují geny jež jsou zapínány a vypínány. Odečtené tabulky tedy poskytují první vyhodnocení kandidátů genových transkriptů pro využití jako klinické markéry. Následně elektronická odečtení knihoven dalších buněk a tkání odhalí, které z potenciálních markérů se skutečně najdou v knihovnách různých buněk a tkání. Kandidátní genové transkripty nalezené v dalších knihovnách se odstraní ze skupiny potenciálních klinických markérů. Potom se pro oprávnění výběru klinického markéru porovnají vzorky krve nebo jiné relevantní vzorky, u nichž se zná, zda jsou nebo nejsou v relevantním stavu. K tomu, aby se genový transkript kvalifikoval jako klinický markér, nemusí být při tomto způsobu stanovena konkrétní fyziologická funkce bílkoviny transkriptů.

Příklad 10

Elektronická northern analýza

Jedním z omezení elektronického odčítání je, že je těžké srovnávat najednou víc než jeden pár obrazů. Jakmile jsou produkty jednotlivých genů identifikovány jako relevantní pro další studium (prostřednictvím elektronického odčítání nebo jiným způsobem), stane se užitečným studovat expresi jednotlivých genů v řadě různých tkání. V laboratořích se pro tento účel používá technika hybridizace Northernových přenosů. U této techniky se označí jednotlivá cDNA, nebo jí odpovídající sonda, a hybridizuje se proti přenesenému materiálu, zahrnujícímu vzorky RNÁ připravené z řady tkání a buněčných typů. Po autoradiografii lzě ve všech zahrnutých vzorcích kvantifikovat obraz exprese tohoto konkrétního genu, vždy jen jednoho.

Další provedení tohoto vynálezu je naproti tomu komputerizovanou formou tohoto postupu a nazývá se zde elektronická northern zkoumá jednotlivý gen knihoven přítomných v analýza. U této varianty se na expresi proti řadě připravených a sekvenovaných databázi. Touto cestou se obraz exprese kteréhokoli jednotlivého kandidátního genu zjištuje okamžitě a bez námahy. Takto může být prohlíženo více kandidátních genů, což vede k častějším a plodnějším relevantním odhalením. Počítačový program zahrnutý jako Tabulka 5 obsahuje program pro provádění této funkce, a Tabulka 6 je částečný seznam vstupů databáze, jež byly použity v elektronická northern analýze.

Příklad 11

Fáze I klinických zkoušek

Na základě zjištěné bezpečnosti a účinnosti shora uvedených testů na zvířatech se podnikají klinické zkoušky fáze I. Normální pacienti se podrobují obvyklým předběžným klinickým laboratorním testům. Navíc se odebírají patřičné vzorky, jež se podrobují analýze genových transkriptů. Další vzorky se během zkoušek odebírají pacientům v předem stanovených intervalech. Tyto vzorky se podrobují analýze genových transkriptů, jak je popsáno shora. Navíc: Změny genových transkriptů, zaznamenané dříve u studie toxicity na potkanech, jsou u sledovaných pacientů pečlivě hodnoceny jako klinické markéry. Změny u analýz genových transkriptů se hodnotí jako ukazatele toxicity korelací ke klinickým známkám a symptomům a jiným laboratorním výsledkům. Navíc se provádí odčítání se vzorky jednotlivého pacienta a se zprůměrovanými vzorky pacientů. Odčítací analýza zvýrazňuje toxikologické změny u léčených pacientů. Jde o vysoce propracovanou determinantu toxicity. Odčítací metoda také uvádí klinické markéry. Odčítací analýzou lze také analyzovat další podskupiny, zahrnující například 1) segregaci podle výskytu a typu škodlivých účinků a 2) segregaci podle dávkování.

Příklad 12

- 37 Zobrazovací studiích analýza genových transkriptů v klinických

Zobrazovací analýza genových transkriptů (nebo mnohočethá zobrazovací analýza genových transkriptů) je užitečný nástroj v dalších klinických studiích. Určit lze například rozdíly zobrazovací analýzy genových transkriptů před a po léčbě u pacientů, jimž se podávalo placebo nebo lék. Tato metoda také umožňuje efektivně vybírat klinické markéry pro sledováni klinického použití léku.

Příklad 13

Mezidruhová srovnávací analýza genových transkriptů

Odčítací metodu lze použít k hodnocení cDNA z odlišných zdrojů. Například: Buňky stejného typu z rozdílných biologických druhů lze srovnávat analýzou genových transkriptů k vyhledávání specifických rozdílů, jaké jsou třeba u detoxifikačních enzymových systémů. Takovéto testování napomáhá ve výběru a opravňování zvířecího modelu pro komerční účel hodnocení léků nebo pro toxikologické zkoušky léků zamýšlených pro humánní použití nebo použití u zvířat. Když se srovnání mezi zvířaty různých druhů předvádějí ve sloupcích pro každý druh, odkazujeme na ně jako na mezidruhové srovnání nebo Zoo přenos.

Provedení tohoto vynálezu mohou používat databáze, jako jsou ty, co jsou zapsány v programovém jazyku FoxBASE, komerčhě dostupného od Microsoft Corporation. Další provedení vynálezu používají jiné databáze, jako je databáze náhodných peptidů, nebo oligonukleotidová databáze typu popsaného v U.S. patentu 5 270 170, vydaném 14. prosince 1993 Cullovi et al.; publikaci mezinárodní přihlášky PCT WO 9322684, vydané 11. listopadu 1993; publikaci mezinárodní přihlášky PCT WO 9306121, vydané 1. dubna 1993; nebo publikaci mezinárodní přihlášky PCT WO 9119818, vydané 26. prosince 1991. Tyto čtyři odkazy (jejichž text je zde zahrnut odkazem) obsahují poznatky, jež se mohou použít v implementaci takovýchto dalších provedení vynálezu.

Všechny odkazy, na něž se odkazuje v předešlém textu, jsou tímto zde výslovně zahrnuty odkazem.

Těm, co jsou zběhlí v oboru, budou zřejmé různé modifikace a variace popsaného způsobu a systému podle tohoto vynálezu bez odklonu od rozsahu a ducha vynálezu. I když vynález byl popsán ve spojitostech s výhodnými provedeními, musí se chápat, že vynález, jak je nárokován, nesmí být nevhodně omezován na tato konkrétní provedení.

TABULKA 1

Označení	Rozdělení	Lokalizace
(D)	(F)	(Z)
E = přesný	C = nespecifické	N 3 jaderná
H = homologní	P = buněčně/tkáňově	C 3 cytoplasma
0 = jiný druh	specifické	K = cytoskelet
N = žádná shoda	U s neznámé	E = povrch buňky
D = nekódující gen		Z 3 vnitrobuněčná
U = nečitelný		membrána
R 3 repetitivní DNA	Druh	M 3 mitochondrie
A = pouze póly A	(S)	S = secemovaný
V = pouze vektor		U = neznámá
M = mitochondriální DNA	H 3 člověk	X 3 jiná
S 3 přeskok	A = opice
I = shoda s Incyte klonem	P = prase
X = shoda s EST	D = pes V = bovinní	Status
Knihovna	B 3 králík	(I)
(I*)	R = potkan H = myš	0 3 žádný současný zájem
U = U937	S = křeček	1 = proved primární analýzu
H 3 HHC	C 3 kuře	2 3 prim. analýza provedena
T = THP-1	F = obojživelníci	3 = sekvence plné délky
H 3 HUVEC	I 3 bezobratlí	4 = sekundární analýza
S = slezina	Z 3 prvoci	5 = tkáňový northern
L = plíce Y = buňky T i B A - adenoid	G = houby	6 3 získej plnou délku

Funkce (R)

T = translace

L - zpracování bílkovin R = ribosomální bílkovina 0 = onkogen

G ³ GTP vážící bílk.

V = virový element

Y = kinasa/fosfatasa

A = svázán s nádorovým antigenem

I - vazebná bílkovina

D = NA vážící/tránskripce B = buněčný povrch/ receptor C = Ca++ vážící bílk.

S = ligandy/efektory

N = bílkovina odezvy na stres E = enzymy

F = ferroprotein P = proteasa/inhibitor Z = oxidativní fosforyláce Q ³ cukerný metabolismus M = metabol. aminokyselin N = metabol. nukl. kyselin W = lipidový metabolismus K = strukturní X = jiný U = neznámý

TABULKA 2

Počet klonů 15 000 až 20 000 Knihovny: HUVEC Uspořádáno podle hojnosti Celkové analyzováno klonů: 5 000 319 genů pro celkem 1 713 klonů

	číslo	N	c vstup	a	popiska
1	15365	67	HSRPL41		Riboptn L41
2	15004	65	NCY015004		INCYTE 015004
3	1563§.	63	NCY015638		INCYTE 015638
4	15390	50	NCY015390		INCYTE 015390
5	15193	47	HSFIB1		Fibronectin
6	15220	47	RRRPL9	R	Riboptn L9
7	15280	47	NCY015280		INCYTE 015280
8	15583	33	M62060		EST HHCH09 (IGR)
9	15662	31	HSACTCGR		Actin, gamroa .
10	15026	29	NCY015026		INCYTE 015026
11	15279	24	HSEF1AR		Elf 1-alpha
12	15027	23	NCY015027		INCYTE 015027
13	15033	20	NCY015033		INCYTE 015033
14	15198	20	NCY015198		INCYTE 015198
15	15809	20	HSCOLL1		Collagenase
16	15221	19	NCY015221		INCYTE 015221
17	15263	19	NCY015263		INCYTE 015263
13	15290	19	NCY015290		INCYTE 015290
19	15350	18	NCY015350		INCYTE 015350
20	15030	17	NCY015030		INCYTE 015030
21	15234	17	NCY015234		INCYTE 015234
22	15459	16	NCY015459		INCYTE 015459
23	15353	15	NCY015353		INCYTE 015353
24	15378	15	S76965		Ptn kinase inhib
25	15255	14	HUMTHYB4		Thymosin beta-4
26	15401	14	HSLIPCR		Lipocortin I
27	15425 '	14	HSPOLYAB		Poly-A bp
28	18212	14	HUMTHYMA		Thymosin, alpha
29	18216	14	HSMRP1		Motility relat ptn; MRP·
30	15189	13	HS18D		Interferon induc ptn 1-
31	15031	12	HUMFKBP		FK506 bp
32	15306	12	HSH2AZ	-	Histone H2A
33	15621	12	_HUMLEC		Lectin, B-galbp, 14kDa
34	15789	11	NCY015789		INCYTE 015789
35	16578	11	HSRPS11		Riboptn Sil
36	16632	11	M61984		EST HHCA13 (IGR)
37	18314	11	NCY018314		INCYTE 018314
38	15367	10	NCY015367		INCYTE 015367
39	15415	10	HSIFNIN1		interferon induc mRNA
40	15633	10	HSLDHAR		Lactate dehydrogenase
41	15813	10	CHKNMHCB		C Myosin heavy Chain B
42	18210	10	NCY018210		INCYTE 018210
43	18233	10	HSRPII140		RNA polymerase II
44	18996	10	NCY018996		INCYTE 018996
45	15088	9	HUMFERL		Ferritin, light chain
46	15714	9	NCY015714		INCYTE 015714
47	15720	9	NCY015720		INCYTE 015720
48	15863	9	NCY015863		INCYTE 015863
49	16121	9	HSET		Endothelin
50	18252	9	' NCY018252		INCYTE 018252 -
51	15351	8	HUMALBP		Lipid bp, adipocyte
52	15370	8	NCY015370		INCYTE 015370

TABULKA 2, pokr.

	číslo	N C	vstup	a	popiska
53	15670	8	BTCZASKI	v	NADH-ubiq oxidoreductase
54	15795	8	NCY015795		INCYTE 015795
55	16245	8	NCY016245		INCYTE 016245
56	18262	8	NCY018262		INCYTE 018262
57	18321	8	HSRPL17		Riboptn LI7
58	15126 t	7	XLRPL1BRF		Riboptn LI
59	15133	7	HSAC07		Actin; beta
60	15245	7	NCY015245		INCYTE 015245
61	15288	7	NCY015288		INCYTE 015288
62	15294	7	HSGAPDR		G-3-PD
63	15442	7	HUMLAMB		Laminin receptor, 54kDa
64	15485	7	HSNGMRNA		Uráčil DNA glycoeylase
65	16646	7	NCY016646		INCYTE 016646
66	18003	7	HUMPAIA		Plsmnogen activ gene
67	15032	6	HUMUB		Ubiquitin
68	15267	6	HSRPS8		Riboptn S8
69	15295	6	NCY015295		INCYTE 015295
70	15458	6	RNRPS10R	R	Riboptn S10
71	15832	6	RSGALEM	R	UDP-gaiactose epimerase
72	15928	6	HUMAPOJ		Apolipoptn J
73	16598	6	HUMTBBM40		Tubulin, beta
74	18218	6	NCY018218		INCYTE 018218
75	18499	6	HSP27		Hydrophobic ptn p27
76	18963	6	NCY018963		INCYTE 018963
77	18997	6	NCY018997		INCYTE 018997
78	15432	5	HSAGALAR		Galactcsidase Á, alpba
79	15475	5	NCY015475		INCYTE 015475
80	15721	5	NCY015721		INCYTE 015721
81	15865	5	NCY015865		INCYTE 015865
82	16270	5	NCY016270		INCYTE 016270
83	16886	5	NCY016886		INCYTE 016886
84	18500	5	NCY018500		INCYTE 018500
85	18503	5	NCY018S03		INCYTE 018503
86	19672	5	RRRPL34	R	Riboptn L34
87	15086	4	XLRPL1AR	F	Riboptn Lla
88	15113	4	HUKIFNWRS		tRNA synthetase, trp
89	15242	4	NCY01S242		INCYTE 015242
90	15249	4	NCY015249		INCYTE 015249
91	15377	4	NCY015377		INCYTE 015377
92	15407	4	NCY015407		INCYTE 015407
93	15473	4	NCY015473		INCYTE 015473
94	15588	4	HSRPS12		Riboptn S12
95	15684	4	HSEF1G		Elf 1-ganuna
96	15782 ~	4	NCY015782		INCYTE 015782
97	15916	4	HSRPS18		Riboptn S18
98	15930	4	NCY015930		INCYTE 015930
99	16108	4	NCY016108		INCYTE 016108
100	16133	4	NCY016133		INCYTE 016133

TABULKA 3

Normální monocyty versus aktivované makrofágy

Prvních 15 nejhojnějších genů normální

Elongační faktor-I alfa

Ribosomální fosfoprotein

Homolog S8 ribosomální bílkoviny

Beta globin

H řetězec feritinu

Ribosomální bílkovina L7

Nukleoplasmin

Homolog S20 ribosomální bílkoviny

Transferinový receptor

Póly A vážící bílkovina

Translačně kontrolovaná nádorová bílk.

Ribosomální bílkovina S25

Signální rozeznávací částice SRP9

Histon H2A.Z

Ribosomální bílkovina Ke-3 aktivované

Interleukin-I beta

Makrofágový zánětový protein-I Interleukin 8 Gen aktivace lymfocytů Elongační faktor-I alfa Beta aktin

Specifický protein Rantes B-buněk Póly A vážící bílkovina Osteopontin; nefropontin Faktor nekrosy nádorů alfa INCYTE klon 011050 Cu/Zn superoxid dismutasa Adenylát cyklasa (kvasink. homolog) NGF-příbuzná molekula aktivace B-buněk Proteasa Nexin-1, odvozená z glií

TABULKA 4

Knihovny: THP-1

Odčítání: HMC

Uspořádáno podle hojnosti Celkově analyzováno klonů: 7 375

057 genů pro celkově 2 151 klonů

číslo	vstup	s popiska	bgref	rfend	podíl
10022	HUMIL1 '	IL 1-beta	0	131	262.00
10036	KSMDNCF	IL-8	0	119	238.00
10089	KSLAG1CDN	Lymphoeyte aer i v gene	0	71	142.00
10060	HUMTCSM	RANTBS	0	23	46.000
10003	HUMMIP1A	MXP-1	3	121	40.333
10689	KSOP	Osteooontin	0	20	40.000
11050	NCY011050	INCYTE 011050	0	17	34.000
10937	KSTNFR	TNF-alpha	0	17	34.000
10176	KSSOD	Superoxide dismutase	0	14	28.000
10886	HSCDW40	B-cell activ,NGF-relat	c	10	20.000
10186	HUMAPR	Early resp PMA-induc	0	9	18.000
10967	HUMGDN	PN-1, glial-deriv	0	9	18.000
11353	NCY011353	INCYTE 011353	0	8	16.000
10298	NCY010298	INCYTE 010298	0	7	14.000
10215	HUM4COLA	Collagenase, type IV	0	6	12.000
10276	NCY010276	INCYTE 010276	0	6	12.000
10488	NCY010488	INCYTE 010488	0	6	12.000
11138	NCY011138	INCYTE 011138	0	6	12.000
10037	HUMCAPPRO	Adenylate cyclase	1	10	10.000
10840	HUMADCY	Adenylate cyclase	0	5	10.000
10672	HSCD44E	Cell adhesion glptn	0	5	10.000
12837	KUMCYCLOX	Cvclooxygenase-2	0	5	10.000
10001	NCY010001	INCYTB 010001	0	5	10.000
10005	NCY010005	INCYTB 010005 '	0	5	10.000 ·
10294-	NCY010294	INCYTB 010294	0	5	10.000
10297	NCY010297	INCYTB 010297	0	5	10.000
10403	NCY010403	INCYTB 010403	0	5	10.000
10699	NCY010699	INCYTB 010699	0	5	10.000
10966	NCY010966	INCYTB 010966	0	5	10.000
12092	NCY012092	INCYTE 012092	0	5	10.000
12549	KSRHOB	Oncogene rho	0	5	10.000
10691	HUMARF1BA	ADP-ribosylation fctr	0	4	8.000
12106	HSADSS	Adenylosuccinate synthetase	0	4	8.000
10194	HSCATHL	Cathepain L	0	4	8.000
10479	CLMCYCA	I Cyclin A	0	4	8.000
10031	NCY010031	INCYTE 010031	0	4	8.000
10203	NCY010203	-INCYTE 010203	0	4	8.000
10288	NCY010288	INCYTE 010288	0	4	8.000
10372	NCY010372	INCYTE 010372	0	4 ·	8.000
10471	NCY010471	INCYTE 010471	0	4	8.000
10484	NCY010484	INCYTE 010484	0	4	8.000
10859	NCY010859	INCYTB 010859	0	4	8.000
10890	NCY010890	INCYTE 010890	σ	4	8.006
11511	NCY011511	INCYTE 011511	0	4	8.000
11868	NCY011868	INCYTE 011868	0	4	8.000
12820	NCY012820	INCYTE 012820	0	4	8.000
10133	HSI1RAP	IL-1 antagonist	0	4	8.000
10516	HUMP2A	Phosphatase, regul 2A	0	4	8.000 -
11063	HUMB94	TNF-induc response	0	4	8.000
11140	HSHB15RNA	HB15 gene; new Ig	0	3	6.000
10788	NCY001713	INCYTE 001713	0	3	6.000
10033	NCY010033	INCYTE 010033	0	3	6.000
10035	NCY010035	INCYTE 010035 .	0	3	6.000
10084	NCY010084	'INCYTE 010084	0	3	6.ΘΘΘ
10236	NCY010236	INCYTE 010236	0	3	6.000
10383	NCY010383	INCYTE 010383	0	3	6.000

TABULKA 4, pokr.

číslo	vstup	s popiska	bgref	rfend	podíl
10450	NCY010450	INCYTE 010450............	o	3 '	έϊοοο
10470	NCY010470	INCYTE 010470	0	3	6.000
10504	NCY010504	INCYTE 010504	0	3	6.000,.
10507	NCY010507	INCYTE 010507	0	3	6.000’
10598	NCY010598	INCYTE 010598	0	3	6.000
10779	NCY010779	INCYTE 010779	0	3	6.000'
10909	NCY010909	INCYTE 010909	0	3	6.000
10976	NCY010976	INCYTE 010976	0	3	6.000
10985	NCY010985	INCYTE 010985	0	3	6.000
11052	NCY011052	INCYTE 011052	0	3	6.000
11068	NCY011068	INCYTE 011068	0	3	6.000
11134	NCY011134	INCYTE 011134	0	3	6.000
11136	NCY011136	INCYTE 011136	0	3	6.000
11191	NCY011191	INCYTE 011191	0	3	6.000
11219	NCY011219	INCYTE 011219	0	3	6.000
11386	NCY011386	INCYTE 011386	0	3	6.000
11403	NCY011403	INCYTE 011403	0	3	6.000
11460	NCY011460	INCYTE 011460	0	3	6.000
11618	NCY011618	INCYTE 011618	0	3	6.000
11686	NCY011686	INCYTE 011686	0	3	6.000
12021	NCY012021	INCYTE 012021	0	3	6.000
12025	NCY012025	INCYTE 012025	0	3	6.000
12320	NCY012320	INCYTE 012320	0	3	6.000
12330	NCY012330	INCYTE 012330	0	3	6.000
-12853	NCY012853	INCYTE 012853·	0	3	6.000 ·
14386	NCY014386	INCYTE 014386	0	3	6.000
14391	NCY014391	INCYTE 014391	0	3	6.000

TABULKA 5 • Master menu. ias SB3TRACT3CN oqtput asi ΌΛΧ OF?

SST SAFETY OFF SET ESOkSF CN

SBT TYPSAH2AD TO 0 .

CLEAR · _

SST DEVICE TO SCREEN

USE-'3martGuy:PoxBAS3+/MaCifex £iles:Clonec.ab£

CO TOP '

SWRS NOKBER TO XNXTIMS CO BOTKK

STORS KOMBER T0'TE3UQ3OTE stors ' ' to Targeti

STORS ¹ ' TO Tárg«t2

STORS ' ¹ TO Targ«t3

STORS.' ¹ TO ObJteti

STORS ¹ ' TO Object2

STORS ' ¹ TO Ctoject3

STORS 0 TO ANAL ' stors o to naros STORS 0 TO HMATCH STORS 0 TO CKKTOl STORS 0 TO XMATQi STORS 0 TO FTT gXORS 1 TO 8AXL DO WH1LE .T.

• Trojná. i -Subcractioa 2. fot ••Dáte......10/11/94 ... · • Versi», i FoxBASE+-/Kac, revicioá 1.10 • Kotec....: Požrat filé Subtraeťioa 2 ·*.*’·

SCKZST 1 TYFS 0 KEADING 'Sereea 1* AT 40,2 EXZS 286,492 FXXELS PONT 'Geaeva',9 COLOR 0,0,0, β FXXELS 75,120 TO 178,241 STYLS 3871 COLOR 0,0,-1,24610,-1,8947

FXXELS 27,154 SAY 'Subtraction Menu* STYLE 65536 FONT 'Ceaeva',274 COLOR 0,0,-1^-1,-1,-1 6 FXXELS. 117,126 GET ŠftTCH STYLE 65536.FONT 'Chicago’; 12 FXCOTR2 δ*Ο Exact * SIZS IS) 62'CO

8‘FXXELS 135,.126 GST JBATCK STYLE 65536 FONT 'Chicago',12 .FICTOSB *β·Ο flonologouc·· SXZS 15,1

FXXELS 153,126 GST CHATCE STYLE 65536 FONT 'Chicago*,12 FXCTORE ’ř'C Otber cpe· SXZS 15,84 β FXXELS 90,152 SKY 'Kateheat*. STYLE 65536 FONT •Geaeva',12 COLOR 0,0,rl,-l,-1,-1 .

FXXELS 171,126 GST Xa&teh STYLE 65536 FONT 'Chicago»,13 FXGTORB *«'C Xaeyte’ SXZS -15,65 CO β FXXELS 252,137 GST iňitiate STYLE 0 FONT 'Oeaeva',12 SXZS 15,70 COEOR 0,0,-1,-1,-1,-1

FXXELS 252,236 GET tenninate STYLE 0 FONT 'Geaeva',12 SXZS 15,70 COIXJR 0,0,-1,-1,-1,-1 β PIXZLS 252,35 SKt 'Xaelude dotec·* STYLE 65536 FONT 'Gencva',12 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1 8 FXJELS· 252,215 BXl STYLE'65536 FONT 'Geaeva',14 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1 '8 FXXELS -198,126 GET FTP 6TYX£ 65536 FONT 'Chicago·,12 FXCTORE 'e«C.Fsiat to filé* SXZS 15',S 8‘FXXELS 90,9 TO 181rM9 STYXÉ 3871 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1 8 FXXELS 90,288 TO*181,397 STYLE 3871 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1

FXXELS 81,296 SKI 'Backgrcuai:' 6TYLE 65536 FONT 'Gen<va',270 COLOR 0,0,-1.-1,-1,-1.

PIXELS 45,135 GET ANAL STYLE 65536 FCNT 'Chicago*,12 PXCTORE '8'R OvwallíFuoctich· OT 4 8 IXffiLS 81,26 SUT 'Targeti* STYLE 65536 FORT 'Gnnevt’,270 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

FXXELS 108,20 GET targetl STYLE OTONT 'Gesěva-,9 SXZS 12,79 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

FXXELS 135,30 GST tazget2 STYLS 0 FOíT 'Ccnevt',9 SXZS 12,79 G0L0R 0,0,-1,-1,-1,-1 .8 FXXELS 162,20 GET target3 STYLE 0 FCNT *0«a«Vt*,9 SXZZ 12,79 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

FXXELS 108,*299 GET Cbjeetl STYLE 0 FONT »Geo«va«,9 SXZS 12.79-COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

FXXZLB 135,399 GST obj*et2 STYLS O.FCNT 'Ceaeva',9 8XZZ 12,79 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

FXXELS 162,299 GET object3 STYLE 0 FONT 'Geseva',9 SXZS 12,78 COLOR 0,0,-1,-1-,-1,-1 '8 FXXELS 276,324’GET Bail STYLS 65536 FONT 'Chicago, 12 FXCTORE «8*R RisuSail ouf SXZS 4112 •

• SOF: 6ubtraet±aa.2.£mt KEAD ·

XF Bail«2 CLEAR

CLOSS DATMASSS

OSS 'anartGiv»FoxBASS+/Naei£ox filectdotec.dbf .SET 8AFEIT ON SCREEN. 1 OFF RSTORN

ENDXF

STOXS VAL(5YS(2>) TO STARTDffi

STORE UPPEJWargetll TO Target!

STORE. UPPER.(Target2) TO Targ«t2

STORE UPPER{Targei3) TO Target3.

STOPE UPPER. (Objectl) TO Objectl

STORE UPPER(Object2) TO-Object2

STORE UPPER(Objěct3) TO Object3 eléar

SET TALK ON

GAP e TERMXNAra-INXTXATB+l go ηατίλΐΕ copy NEOT GAP FXEDDS NUM3SR, lÍteasy,D,F,Z,R, ENISY.S.DESCRXPTOR,START,RPSTO.I TO USE TStENUM COOOT TO TOT

COPY TO TEMPRED POR D-'B' .OR.D-Ό' .OR.D-Ή' .OR.D» Ή¹ .OR.D·'!··

OSE TEMPRED

TEMPNUM..

X? íinatChiO .AND. Kraátch-O .AND. Omatdh-0 .AND. XMATCR-Ó

COPY TO TEMPDESXG

ELSE

COPY STROCTORE TO TEÍPOESXG

USE TEMPDESXG XT Baatch-1

APPEND FROK TOONUM POR D»'S’

ESDI?

X7'»weeh«l

APPEND PROM TEMPNDM POR D-’K'

ENDIP

XP Čnatchxl

APPEND FRČK TEMPNUM POR D-‘O'

ENDXF

XP 2aatch«l

APPEND FROK TEMPNUM POR D»’T'.OR.D-’X'

•.OR.D-'Ν' .smír endxp

CODNT TO STARTOT

COPY STRtXTORE TO HMPDXB ··-····

USE TEHPDIB ... -«iAPPEND PROM tempdesxg FOR library-UPPBR(targetl) -' ^·

IP targetSo' . * -t-’·”

APPEND frqh TEMPDESIO FOR library»U?PSR(tnrget2) d:

- ENDIP ' '

XF cargetSo· . - ¹ ·

APPEND FROK. TEMPDESXG FOR lihraxy-UPPBR(target3)

ENDXF

COOOT TO anaiziot' _ USE TEMPDESXG

COPY STRUCtURE TO TEKPSUB

USB TEMPSUB

APPEND FROK TEMPDESXG FOR llbraxy-UPPER(Objectl)

XP target2o'

APPEND FRCM TEMPDESXG POR.libraxy-UFPER(Cbject2)

ENDXF ·' _

XF target3o' •APPEND PROM TEMPDESXG FOR lÍbrary»UPPER{Cbject3)

ENDXF '

COOOT TO 60BSRACT0T

EST TALK OFF «*«»····——··**·*·♦*·***·♦·♦♦*·♦**♦♦««····****♦<·♦··*·········»*»···»·»···—··«···«*♦**♦«·« * COMPRZSSXCN SUBROOTXNE A ' ? 'CCMPRBSSXSW QUERS tXBRARY'

USE TEOLXB

SORT CWRNIW.OTMBER TO LX2S0RT

USB U2SQRP

COUOT TO ZDGBS

RSPLACS AUj RFEJTO WITH 1

MARXI «X

SW3«0

WKXLB SW3.0 Rdi

IP MARK1 >c ZDGENB

PACK

COCNT TO ADMZQQB •SW2.1

MOP

ENDXF GO mapki WP ’ 1

STORB ΕΝΓΡΪ TO TĚSTA STOPE O TO DSSXGA ·

SM - O '00 HKXLE SM-0 TEST SKIP

STORZ ZNTRf TO TESTB STOPE O TO DSSZGB

X7 TĚSTA > TESTB. AMD. OSSZGAbQESIGB oedbts

DUP DOP+l

LOOP

ENDXF GO KARKl

RZPIACZ RPENO WXTS COP MARXI b MARXX+DU? ’·

SWsl

LOOP

SHODO. TEST LOOP

DIODO RXCf.

SORT <27 RFEND/DiHUMBER TO TEWÍARSORT.

USB TEKPTARSORT *RBELACZ ACi START KXTH ΗΡΒΟ/ΧΚΕΝΕΊΟΟΟΟ '

COCW? TO TEKFEARCO ···-- **************** ***************************************·*·· ýfcfciřfc * CCMPRĚSSXOH SUBROUIBS s ? ’CaORSSSB& TARGET LXBRABY'

USE TEKPSUE SORT ON ΒΠΚΪ,ΜΠΗΒΕΒ TO*SUBSORT

OSC SUBSORT

COQNT TO SUSGEHE

RSPLACS Ali R7SHD WXS3 1

MARXI « 1 - '

SW2-0 •DO TO2 8Ν3·0 Rdi _

ZF MARKL > SUBGENS

PACK

COUNT TO 8MXQBB

SW«1

LOOP

XNDXP GO MARXI DUP - 1 _

STORB. ENTW TO TE9SA

STORB D TO DSSXGA sw o

DO WHlia SWbO TEST _ .·

SKIP

STOPE BOTO TO. TESTB

STORB D TO DESIGB

XT TĚSTA TESTB.AMD.DBSZGAsDBSBSB

DXLXTE ~-an > dot+1 LOOP _

2ZB3XF

GO'MARXI

RS7IACB RPEND WXTH DUP MARXI · MARX1+DCP SWbl

LOOP

EKDOO TEST LOOP :

ENDDO ROLL

SORT CM RF3MD/D.MDMSER TO TZKPSUBSOR?

.-OSE TEMP5UBS0KT ♦WSPLACS ALL START WXTH RFEND/XDSDIE*10000 OOCNT TO TSCPSOBCO »****·♦»***»··»»»·»·»»».·»».♦*’·**·****»**♦************······♦»*»·«*♦*♦♦****·«*»»«»«»»»**>·** ♦FUSION ROUT3NE ? 'SUBTRACTXKG LX3RARXES'

USE SOBTRACTXCN

COPY STRUCTOR2 TO CKJMCH2R

SStSCT 3

OSE TSÍPSOBSORT S2LECT 1·

USB CRDNCKER

ΑΡΣΟΟ PROM TEMPTARSORT

CÓUNT TO BULOU?

MARX e 0 DO WELS

SSXÁBST X ·

KAHX « ΜΆΚΚ+1 IP MÁSX>BAXLCOT SXXT ENDI?

<30 tftRX

STORE'ENTKY TO SCANNER

SELSCT 2

LOCATE. POR EOTKYaSCAÍWER

X? FOUNDO

STORE RTHO TO BITI

STORE KTCND TO BXT2

JJSB ·

STORE 1/2 TO BITI

STORE O TO ΒΓΓ2

BOXF

SXUSCT 1

RXPLACE BGFRBQ WXTSi BXT2 ~

RBPLACE ACTUAL HXTH BXTX

LOOP

ENCCO

SEUBOX¹ 1

R2PLACS ALL RATXO MTÍH REEND/ACTUAL 'DOXNQ FINÁL SORT BY RATXO'

SORT CM RATXO/S_rBSFR8Q/D,OESCRI?TQR. TO FXHAL

XJSS FIKAL “ ·<·*·»··«··♦<«*♦<**#·«»·****«**♦·······*»·*»»***♦**'*»»******·»»*·»·«·*»*·*»«*'*·****«»*♦«*«**· eb b*ík ctí DO CASE.

CASE PTFa0‘ ’

SET DEVICE TO PRXNT — .

SET PRXNT CW

E3BCT ···· čase Trrai

SET ALTERMATZ TO ‘Adenoid .Patent Figures: Stístxacfciaa.txt·

SET ALTERNATS CN ZNSCASE

STORE VAL (SYS (2) )to FZNTJME if Π2<τζχε«9ΐ!λΐπ3ΐα STCR2 FXNTSffi+86400 TO ·?ZHIDS samy

STORE FINTÍME ** ΕΤΜΠΏίΕ.ΤΟ COMPSEC

STORE CCMPSEC/SO TO COKBON

ΕΕΓ MARGIN TO 10

61,1 EAZ ‘Lihrary Subtxácfcion Aaalyaii* STYLE 65536 PONT *Geneva’,274 0,0,0,-1,-1,7

Ί <Sate() ?? ' · '

7? tseo 'Cloně nuabess ¹ ?7_:-STR(ZKITZA,TS, 5,0) .7? through ' ·

7? STR(TERXXNATS,6,0) ? 'Lihrarieei '

Targetl

I? Tasget3o'

7? Target!

ENDZT

IP Target3o'

7? ' ·

7? Target3

ESDI?

'Suhtraecisgr:

Objeetl

IP-G&jestSo¹ ??··',·'

7? Objeet2

DOIP

ZF CtojectSo' ·

7? Cbjectl

SOI? .

'Designaticnar

ZF Bsatcfa«0 .AND. ttnateb«0 .AND, Cnateh«0' .AND. IKATCKbO ?? ’A11*

DOIP ..

ZP Enatchal ?? ’&eaet,' endzp

ZF Oaacehsl 'Xonaa, * man- ,

ZP OMtebal

7? Other ap.’ aozp '

ZP Zsateb·!

'XNCSTE'

BOX?

ZP ANALbí *8orted hy AKJNDWCE'·

BUF· — ZP AKAL«2 'Arsaaged ty POWCTXCK'

DfflZP 'Totil elones representedi *

STRWOT,5,0) 'Total -olcnea «n&lyšed: ' ?? fiTRÍSTARTOT,5,0) 'Total. ccnputation. fcime:

??· STRfCCKPHXN,5,2) “ ¹ ainutea* ' ‘

?'d deiignaticn £ distribution < e ločaticn. z « funetion species i «= ia*_e

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG ‘Screen 1* AT 40,2 ŠXZ2 285,492 PXXELS FONT 'Geneva',9 COLOR 0.0.0 DO CASE . ·

CASE ANAL-1 77 STR{AONIQUE,4,0) '7? ¹ genes, for & total o£ ¹ ·

7? STR(ANALK!T,.4,0) ' ?? ' člene»' . · .

SCREEN 1 TYPE 0 HEMXDO ’Scrt«a 1' AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS FOOT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, lise OPT fields nunber,D,F,Z,RjENIKY,S,DESCRX?T0R,BGFR2Q,KFHXD,RATI0,I SET PRXOTCFF'

CLOSE DATMASBS . '

USE '£rartGuy:Fcx3ASE+/Mac:£ax fil es i dones, dbf'

CASE.ANAL-2 * erranga/funetion

SET FRXNTCN

SET EZADEOG «ί

SCREEN 1 TYPE. 0 HEADXN3 'Screen 1* AT 40,2 SXZS 286,492 PXXSL9 'FONT 'Helvetica',268 COLOR 0 7 · > SINDXNG FROTSXHS'

SCREEN'1 TYPE 0 HBADXN3 'Screen 1.'AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS 7 ¹ surface nolecules sad receptore i¹

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1* AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS list OFF fields nuinbeE,D,'F,'Z,R,ENTRY,S,EESCRX?T0R,BGFR3Q,RFEND,RATX0,X FOR R«’B

PQOT Helvetica·,265 COLOR 0 BWT ·α«ηβνκ·,7 COLOR 0,0,0, • » ’ « SCREEN -1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1’ ’λΤ 40,2 GIZE 286,4.92 PXXELS .PONT .'Helvetica·,265 CODOR 0 7 'Calciua-binding proteinsi'

SCREEN 1 TYPE 0 EEADING 'Screen 1' AT 40,2'SIZE 286,492 PXXELS FONT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, list GFF fields nunt>er,D,F,Z,R,ENrRY,S,DESCŘIPTOR,BGFREQ,RrEND,RATXO,X FOR Rs'C'

SCREEN* 1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1' AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS FONT 'Helvetica',265 COLOR 0 7 'Liganda-and effactors:!

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG 'Screen 1' AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS FONT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, list OFF fields auaíber,D,,F,Z,R,ENraY,S,DESCRXPTQR,BGFREQ,RrKNDjRATXO,X FOR R«'S'

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1* AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS FONT 'Helvetica* ,265 COLOR 0 7 'jOther binding proteine:'

SCREEN 1 TYPE -0 HEADXNG 'Screen 1* AT'40,2 SXZS 286,492 PXX2LS FONT 'Geneva‘,7 COLOR 0,0,0, lise OFF fields'nuober,D,F,Z,R,ENnCf,S,DESCRXPTOR,B3FRSQ,RřBO,RATXO,X FOR R='X' *

SCS22N 1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1' AT 40,2 SXZS 286,492 -PIXEL5 FONT 'Helvetica',268 COLOR 0 ? r . . CrJCOGHOZS' .·.·.SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1* AT 40,2 SXZS 286,492 PXXEL9 FONT 'Helvetica',265 COLOR 0 7 'Generel cncogeneei',,

SCSSBBH 1 TYPE 0, HEADXNG *· Screen 1* AT .40,2 SXZS 286,492 PXXELS • FOTT 'Geneva‘,7 COLOR 0,0,0, list OFF fields’nuaber,D»F,Z,R,EOTRY,S,DESCRIPTOR,BGFREQ,RFB©,RATIO,X FOR R»'O' • · ’

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1* AT 40.2 SXZS 286,492 PXXELS FONT 'Helvetica',265 COLOR 0 7 ‘GTP-biading protein»:'

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Screen 1' AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS FONT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, list GFT fields nuraber,D,?,Z,R,B7XKY,S,DesCRXFTOR,B3FREQ,RFSND,RATXO,X FOR R*'G*

SCREEN 1 TYPE O H3ADXR3 'Scraei 1* AT 10,2 SXZE 386,192 FXXELS FONT ‘Helvetiea‘,265 COUR 0 7 'Viral «lenentsi' _D -i '<ie

SCREEN 1 TYJE 0 B5ABXN3 ‘Sereen 1· AT. 40,2 SXZE 386,492 FXXELS FCNT ·&&&&,·} c5tt3R070,0, lise QSV fields nufflber,D,_F,Z,R,ERrRY,S,DESCRIPTOR₍BGFREQ,XFEND,RATIO,X JOR R*'V'

SCREEN 1 TYFE O HEADXNG ‘Sereen 1' AT 40,2 SXZE 286’, 192 FXXELS FORT 'Kelvetica,2S5 COLOR o 1- 'Xinases and Phoaphataeaaj' · .

SCREEN 1 TYFE 0 'HEADXNG 'Screea 1* AT 10,2 SXZE 386,492 FXXELS FORT ‘Geneva‘,7 COLOR 0,0,0, liSC OFF.fields nusÚ9er,D,F,Z,R,ENTEY,S,nBSCRXFTOR,BGFRBQ,RFEND,RATXO,I FOR Rm'Y''

SCREEN 1-TYFE 0 KEADXN5 ‘Sereen 1« AT 40,2 SXZE 286,492 FXXELS FCNT 'Hélvetica·,265 COLOR 0 ? 'Turor-related aátiganai¹

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG .‘Sereen 1* AT 10,2 SXZE 286,492 FXXELS PONT *Ganev&*,7 COLOR 0,0,0, lise OFP'fields nuaber,D,F,Z,R,ENTRY,S»DESCRXPTOR,8GFREQ,RFa©,RATXO, X FOR R«'A'

7.

SCRSai i TYFE O HEADH» ‘Screea l* AT 40,2 SXZE 286,492 P33BLS FONT *belwbica*,268 COLOR o 7 · ' PROTEIN SYRXHBTXC HACHXMERY· FROTEINS!

? · .

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXN3 ‘Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286.492 FXXELS FORT ‘Helvettica',265 COLOR 0 ? 'Tranacriptioa and NUeleic Aeid-binding proteine i *

SCREEN 1 TYPE 0 KEADXNS Sereen 1' AT 10,2 SXZE 286,492 PXXELS FONT ‘Geneva‘,7 COLOR 0,0,0, lise OFF fields nuDber,D,F,Z,R,ENTRY,S,DESC2aPTOR,S(3RBQ;RFIND,FATXO,X FOR R«'O'

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG ‘Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,492 FXXELS FORT ‘Hélvetica·,265 COUR.0 7 'Traaslaeien:' -

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG ‘Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,492 FXXELS FONT 'Oeneva‘,7 COLOR 0,0,0, list OFF'fields nunbex,D,F,Z,R>anRY.,S,DESCRXFTQR,BCFREQ,RPEND,RATXO,2 FOR R»'T'

SCREEN 1 TYFE o'.HEADING 'Sereen 1' AT'10,2 SXZE 286,492 PXXELS FONT 'Helvetice',265 COLOR 0 7 protein*:'

SCRESN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Sereen 1‘ AŤ 40,2 SXZE 286,492 PXXELS FONT ‘Geiwva',7 COLOR ΜΛ list OFF fields nurber,D;F,Z,R,QTrKY,S,DESCRIPT0R,SGFR2Q,RnND,RATX0,X FQR R»'R'

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG .‘.Sereen 1* AT 40,2 SXZE 28&,492 PS02LS FORT ‘Kelvetica’,265 C8&& 0 ? 'Protein processios,’

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG ‘Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,492 FXXELS FONT *O«neva‘,7 OQLQR-0,0,0, list OFF fields number,D,F,Z,R,ENIRY,S,DESCRXFTOR,BSFRSQ,RFEND,RATIO,I FOR R-'L'

·) '

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Sereen 1* AT 40,.2 SXZE 286,492 PÍXBLS. FORT 'Kelvetica.’,268'COLOR 0 7 ‘

ENZYNES'

SCŘSEN 1 TYPE 0 HEADXNG ‘Sereen 1' AT 40,2 SXZE 286.492 FXXELS FONT ‘Helvetica‘,265 COLOR 0 7- 'Ferroproteinet'

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG 'Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,492 FXXELS FONT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, list OFF fields &unber,D,F,Z,R,SRTRY,S,DESCRXFXCR,BSFREQ,RFEND,RATXO,X FOR R»'F*

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG 'Sereen· 1’ 'AT 40,2 SXZE 286,492 FXXELS FORT ‘Helvetica·,265 COLOR 0 7 'Froeeaaes and inhibitore!'

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG 'Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,192 FXXELS FORT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, list OFF fields numb«r,'O,F,Z,R,BTOY,S,tSSCRXPXOR,BGPREQ,RPEND,RAT2O,I FOR R«'P·

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG ‘Sereen 1* AT 40,2 SXZS 286,492 FXXELS PONT ‘Helvetica·,265 COLOR © 7 'Oxidative pbóephorylationt.¹

SCREEN i TYFE O HEMSNG ‘Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,492 PXXELS FONT ‘Oeaeva',7 COLOR Θ,Ο,6, lise OFF fields nusber,S,F,Z,R,XRXRY,6,DBSCRXFTOR,SGFREQ,RFQO.RATXO,X POR R>'Z* '

SCREEN 1 TYPE 0 HEADXNG' ‘Sáře«η 1' AŤ 40,2 SXZS 286,492 FXXELS PONT ‘Helvetica,255 COLOR 8 7 'Suear MCaboliasu ' '

SCREEN 1 TYFE 0 HEADXNG ‘Sereen 1' AT 40,2 SXZE 236,192 FXXELS PONT 'Geneva',7 COLOR 0,(^,0, list OFF fields nunbex,S_fF,Z,R,ZRTRY,S,OES^XFXOR,BGFR£Q,RFEND,RATXO,X FOR R-'Q'

SCRESN‘1 TYFE 0 HEADXNG ‘Sereen 1* AŤ 10,2 SXZE 286,192 PXXELS PONT ‘Helvetica‘,265 éůL® ? ’AnLno acid im· *

SCRESN 1 TYFE 0 HEADXNG 'Sereen 1* AT 40,2 SXZS 286,492 FXXELS FONT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0,'

- 52 list ΟΣΤ fields wasber,D,P,Z,R.ENniY,8,DESCRIPTOR,SOPRSa,RPEND,RATXO,I POR R.'M'

SCREEN 1 ΌΒΕ Ο.-ΚΒΛΙΜΒ 'Sereen 1* AT 40,3 SIZS 286,492 PIXELS PCNT 0 'Nueleie aeid netabolisa: *SCREEN l.TYPB 0'HEADING 'Sereen'1' AT 40,2 SIZS 284,492 PIXELS PCNT 'Géneva’,7 COLOR 0,0,0,' list, QPP fields «naber,D,F,Z,R,ENTOY,S,DESCRXPTOR,BGPREQ,RPEND,RATXO,-I POR R«'N' 'SCRZEN‘1 TYPZ o XEADXNG 'Sereen 1* AT 40,2 SXZE 284,492 PIXELS' PCNT 'Helvetica*,245 COLOR 0 ? ¹ Lipid znecabolim: ’

SCREEN 1 TYPE 0 HBADING 'Sereen 1* AT 40,2 SIZS 284,492 PIXZLS PCNT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, list OF? fields nusiber,D,P,Z,R,EOTRY,S,DESCRIPTOR,BGPREQ,RPaO3,RATIO,I POR R.’W'

SCREEN 1 ? Other SCREEN 1 liít OPP 7

SCRZEN 1 7 '

TYPE 0 HEADXKG Sere®» 1' AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS PONT 'Helvetica',265 COLOR 0 enzymea:¹

TYPE 0 HEADIN3 'Sereen 1* AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS PCNT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, fields «fitiber.D.P, Z,R,ENIRY,S,DSSCRXPTOR,BGPRB3, RFENS.RATXO, X FOR R=’E'

TYPE 0 HEADXKG 'Sereen 1' AT 40,.2 SIZE 286,492 PIXELS PCNT 'Helvetica·,268 COLOR 0

MISCELIANEOOS CASEGORIES' 'Sereen 1' AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS PONT 'Helvetica',265 COLOR 0 Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,492 PIXELS PONT 'Geneve·,7 COLOR 0,0,0,

SCRZEN 1 TYPE 0 HZADXN3 ? 'Sereea responsei'

SCREEN-1 TYPE 0 HEROINO li»t OPP íielda ma«ber;D,F',Z,R,ENTOY,S,DESCRIPTOR.BGFEBQ,RPJ2®,RATXO,I POR R='H

SCRZEN 1 TYPE 0 HZADXNG 'Sereen 1' AT 40,2 SIZS 286,492 PIXELS PCNT 'Helvetica',265 CCLOR'0 7 'Strueciirals'

SCREQÍ 1 TYPE 0 HEADING 'Sereen 1* AT 40,2 SXZE 286,492 PIXELS PCNT 'Geneva',7 COLOR 0,0,0, list OFP fields OU»ber,D,?,Z,R,BNISY,S,Ď2SCRIPTOR,BGFREa,RPEřJD,RATXO,I'POR R»'K'

SCREEN 1 TYPE 0 HEADING 'Sereen 1* AT 40)2 SIZE 286,492 PIXELS PCNT 'Helvetica·.265 COLOR-0 7-'Other cloaesj' ' ’ * ‘ SCRZEN 1 TYPE 0 HEADXNG 'Sereen 1' AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS * PONT' 'Geneva·, 7. COLOR 0,0.0. list OPP fields maiiber,D,?,Z,R,QíTR2f,9,tlBSCRIPTOR,SGPREQ,RPEND,RATIO,X POR R='X*

SCREEN 1 TYPE 0 EEADING 'Scréen 1' AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS PCNT 'Helvetica',265 COLOR 0 7 'Clenea-of unknewn functian:' - · .

SCREQí 1 TYPE 0 HEADING 'Sereen 1' AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS PONT 'Geneva',7 COLOR-0,0)0, list OFP fialds aunber,D,?,Z,R,ENTRY,S,D2SCRIPTOR,BGFREQ/Rn2ro.RATIO,I POR R-'ϋ'

QÍDCASE

DO Teat print.pru*

SET PRIOT OPP

SET DEVICE TO SCREEN

CLOSE DAIASASES

ERASE TEMPUCB.DBP

SRASS TEKPNUK.DBF

ERASS TEKPDBSIG.DBP

SET NARGIN TO 0

CLEAR

LOOP

QCXO •řtorfchexn (single), version 11*25-94 cloae databases set mx cep ssr frzot offset ezaci asv cuop. *

STORE ·' 'TO Zobjeet

STORB ' 'TO Dobjeet

STORE 0 TO Nudí».

STQRB 0'TO ZOJf STORE 1 TO Bail 00 WHILE ,T.

.* řxogran.» Northesa (eíngle).fee * Data....: 8/ 8/94 * Vexaion. i .FoxBXSB+ZNac,' réviaioa 1.10 * Notes.*....: 'Pomát filé Northern (single)

SCREEN 1 8 F3Q3LS 8 PDCELS 8 PZXSLS 8 PDCELS e PZXSLS 8 JDC2LS 8 PDCSLS 8 PDCELS 8 PDCELS 8' FZXELS 8 PDCELS

TYPE 0 ΗΞΑΠΣΝ3 'Scrsen 1· AT 40,2 SZZE 286,492 PDCELS FCOT 'Geneva',12 COIOR'0,0,0 15,81 TO 46,397 STYLB 28447 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1 89,79 TO 192,422 STYLE 28447 OOLQR 0,0,0,-25600,-1,-1

113.98 SAY *2ntry ♦ « * STYLE. 65536 FCOT 'Oeaeva',12 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1

115.173 GST Eobject STYLB 0 PONT 'Geaeva*,12 SIZZ 15,142 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1

145.89 SAY 'Deieription* STYLE 65536 PONT *Geaeva',12 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 .

145.173 GST Dobjeet STYLE 0 PONT *Geaeva*,12 SZZZ 15,241 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1

35.89 SAY 'Single.Northern aeeseh aeseen* STYLE 65536 FCOT Oenava')274 COLOR 0,0,220,162 GST Bail STYLE 65536 POST 'Chicago*,12 PXCTORE »«*R CentisuejBail out* SIZZ

175.98 SAY 'Člene ♦:* STYLE 65536 FCOT *G«n<vn'.,12 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1

175.173 GET Numb STYLE 0 FCOT 'Geneva',12 SZZE 15,70 COLOR 0,0,0,-Ι,-ΐ',-1 80,152 SAY 'toter tsy ONE of the ťollowing:· STYLE 65536 PONT ‘Geneva',12 COLOR -Γ, *'BOPs Northern (single), fmt RSAD

IF Bail«2

CLSAR · acreen 1 off 'RSIURN

2SDIF

USE ''SmartGuyiFoxBASB*/Hac:Fox fileaiLobkup.dbf SET ŤAtK-CN · '

IP Eobjecto'

STORE UPPZR(Sobject) to Eobject

SET SAPSTY OF?

sort CN aitry TO 'JLookup entxy.dbf ·

SET SAFETY Ctí

USB 'Lookup entxy.dbf*

LOCAZE FOR Loaka^object

ΪΡ ..NOT.FOÓNDO ¹

CDEAR

LOOP

2NDZP

SR0R3S

STORE Eatry TO SearehvalCL0S2 DATABASES

ERAS5 -'Lookup entxy.dbf·

END33· •ZF'DQbjeeto* ·

SET EXACT OF?

SST SAFEW OP?

SORT' ON deaeriptor TO 'Lootojp deacriptor.dbf ·

SET 5ΑΡΙΠΥ On

OSE ‘Lootafl? deseriptor.dbf*

LCCATE FOR OFFER(TRZH(deseeiptox))>OFPER(TRZH(Dobject·)) I? .NOT.FOCKDO

CLBAR to XIHdVS £35 «« ’,gqp-«4TH. 01 ZáOO iáQ JUXRS £25 ,;6ρ·«»Βοχβίβ»χχ; xojwxz+aswsxoaiAiovws. asn ÍO 2ΡΤΌ. £23 •••woe Β»χπ3οα »ιχ3 ββχοα, í wsa jfSÁt?» αχκχνοκ » «ΠΟΪ 030ΪΗ docri τ+τ»ΝΚ - 'τ»ΝΗ coa

312733 p.tct.ť. · >nsa£ 4T sxszi oi xracctn auois dDÍS.

XX521 Ol -λΏΚΒΠτ ZHQXS •xxaw oo aaos ..... «KOT

Í«JMS . ' XXd· £O1 «< tííHW dl. TTO8 O-a-JS 2TXSM 03 ’ O«CMS X XXSYH £01 01 1N030 30«

0«ρβ»3» BOJ SISTSO «ΜΡ·3·?*«?3Π pwsajdtoo, 3SQ

ŇO h&ks && 0<P«aya HCá * .jqp-ea-piKqn paeaasdnoo, οΐ'ΧΣ«κπτ NO 180S * 33Ω M&fíS S3S ,;qp-Baw2rgn:s>rp; xoá:čsH/+asvS»=d^:^io^aS. 3SQ ',···.·μο« ax73 eapraaqri asm ββχβββπΛιβο, i jqp'&rexcm aoa arcuoossns.roissaaáJKO hots nacuaa ;j o χ uaoxoe iX.oOtODSdda £E sxro • 30 Ol ITťM .paaoosl 03 Λ J»3i3, i • i

XíAxprros 44 , Xxitxa «; >χ«Ζχοο8 uzatpjoKi 4 «TO axtsa

XaAqajeeg Q1 XX3OS 38013· . 2SM0H2 · «mj oo <;qp’9»t»xo:s»rr? xoí^^lV+SSXaxeáS^nOiiwíS. 2Sfl fteottw jt • Jma ŇO £0X33 133 ,;<&· :oyiyz2svp ďii3(0oq_a 23Y82 * sssxhxixg ssoto

XBAxpaws Ol &3t33 SHOIS 25U08S jxma axn

- ťS 55 * MASTER ANALYSIS 3j VERSION 12-9-94 * Master menu £07 analysia output

CLOSS DATABASES

SET TALK OFF

SET SAFETY OFF

CLEAR

SET DEVICE TO SCRSsN

SET DEFAULT TO *SmartGuy:FoxBASE+/Mac: ťox fileslOutput programe:' USE 'SmartGuy:Fox3ASE+/Mac:fox filesiClones.dbf

GO TOP

STORE NUMBER TO INITIATE

GO 3OTT0M

STORE NUMBER TO TERMINATE

STORE 0 10 ENTIRE

STORE O TO CONDEN

STORE O TO ANAL

STORE O TO EMATCE

STORE O TO HMATOH

STORE O TO OMATOH

STORE O TO IMATCK

STORE O TO XMATOH

STORE O TO PRINTON

STORE O TO PTF

DO WHILE ,T.

* Program.: Master analyais.fmt * Dáte....: 12/ 9/94 * Version.: FoxBASE+/Mac, revialon 1.10 * Notes....: Formát filé Master analysis

SCREEN 1 S PIXELS e pixels Φ PIXELS

PIXELS a PIXELS a PIXELS

PIXELS 8'PIXELS 9 PIXELS 9 PIXELS 9 PIXELS 9 PIXELS 9 PIXELS

PTvgr.c PTygr.c PIXELSβ PIXELS a PIXELS a PIXELS

TYPE O HEADING 'Screen 1* AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS FONT 'Geneva',9 COLOR 0 0,0, 39,255 TO 277,430 SKLE 28447 COLOR 0,0,-1,-25600,-1.-1 75,120 TO 178,241 SKLE 3871 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1

27,98 SAY 'Customized Output Menu· STYLE 65536 FCNT 'Geněva',274 COLOR 0,0,-1,+1,-1

45.54 GET conden STYLE 65536 WH? 'Chicago·, 12 PICTORE '8*c Condensed fernet· SIZE 54,261 GET anal STYLE 65536 FONT 'Chicago',12 PICTORE ’8*RV Sort/number:Sort/eůtryi

117.126 GET BOSCH STYLE 65536 FONT 'Chicago·,12 PICTORE ’8*C Exact · SIZS 15,¢2 CO

135.126 GET HMATOH STYLE 65536 FONT 'Chicago·,12 PICTORE '9»C Hcroologous* SIZE 15,1

153,126'GET OMATOH STYLE 65536 FONT 'Chicago', 12 PICTORE *»*C Other spC SIZS 15,84

90,152 SAY 'Matches:' STYLE 65536 FONT 'Oeaeva',268 COLOR 0,0,-1/-1,-1,-1 '

63.54 GET PRINTON STYLE 65536 FONT 'Chicago',12 PICTORE '8*C Include cloně listin?·

171.126 GET Imatch STYLE 65536 WNT 'Chicago',12 PICTORE '8*C Incyte SIZE 15,65 CO

252.146 GET initiate STYLE 0 WNT 'Geneva',12 SIZE'15,70 COLOR 0,0,-1,-1,™1,1

270.146 GET terminate STYLE 0 WH? 'Geaeva',12 SIZE 15,70 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1 234,134 SAY 'include dones · STYLE 65536 FONT 'Geneva',12 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1 270,125’SAY ·->'STYLE 65536 WNT 'Genéya‘,14 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

198.126 GET PTF STYLE 65S36 FCNT 'Chicago',12 PICTORE ’»*q Print te filé' SIZE 15,9 189,0 TO 257,120 STYLE 3871 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1

209,8 SAY 'Libraxy aelection* STYLE 65536 WNT 'Geneva',266 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1 227,18 GET FNTIRE STYLE 65536'WNT 'Chicago',12 PICTORE '8'RV AU;Selecteď SIZE 16 * EOF: Master analysie.fmt READ

IF ANAL-9

CLEAR

CLOSS DATABASES

ERASE TEMFMASTER.DBF

USE *SnartGuy:FoxBASE+/Mac:£ox files:dones.dbf· SET SAFETY CN SCREEN 1 OFF

RETY IRM ? ematch ? Hmatch ? Cdiatch ? XMATCE SET TALK CN

I? ENTIREe2

USB -Uhique libraries .'dbf ·

RSP1ACS.ALL i WITE · '

BROWSE FIELDS i, lihnaae, librazy,total,entered AT 0,0 SNDIF

USE ^,SmrbGuy:FoxSASE+/3toc:£ox filessclones.dbf* ♦COPY TO TEMENŮM FOR NUM3ER>«INITIATE.AND.NUMSER<sTSRMIKATE ♦USE TEMENŮM

COPY STRUCTURE TO TEKPLIB

USE TEMELIB IF ENTCRE-1

APPEND FROM ·SaartGúy:FoJSASS+/Mací£ox files:Clonee,dbf·

SNDIF

TF EOTIRE*2

USE Unique librarie·,dbf’

COPY TO SELECTED FOR UPP3R(i)-'Y'

USE SSLECTSD

STORS SECCOÚNPO TO STOPIT MARX-1

DO KKILE .T.

IF MARK>STOPIT clear

EXIT

ENDIF

USE SELECTED GO MARX

STORS library TO THISCNE ? 'COPYIN3 ' ?? THISONE USE TEMPXjIB

APPEND FROM *Sn&rtGuy:FoxBASE+/Mac:fox ťilea:Cloaes.dbf· FOR library-TKISONE

STORS MARX+1 TO MARX

LOO?

SNDDO

ENDIF

USE *Sm&rbGuy:FoxBASE+/Ka.c:£ox £ile«selenes.dbř

COUNT TO STARTOT

COPY STRUCTURE TO TEMPDESIG

USE TEMPDESIG

IF aaatch-0 .AND.. Hmateh»0 .AND. CSratch«0 .AND. XM&TCHaO

APPEND FROM TEMPLIB

ENDIF

IF Eroateh»l

APPEND FRCM TEMPLIB FOR D='S'

ENDIF

IF Hrnežehal

APPEND FROM TEMPLI3 FOR Dm’2'

ENDIF

IF Omatchsl

APPEND FRCM TEMPLIB FOR D»'O'

ENDIF

IF Inacehal APPEND FRCM TEMPLIB FOR D»'I' .OR.D»'X'.OR.D-'Ν'

ENDXJT

IF Xmatzhol

APPEND FRCM TEMPLIB FOR D«'X’

ENDIF

CCUOT TO ANALTOT set talk ořf

DO CASE s—- / γ>σ

CASE ΡΤΡ·Ο

SET DEVICE TO PSINT

SST PRINT ON E3B2T CASE PTFel SET ALTERNATE TO •SET ALTERNATE TO •SET ALTERNATE TO •SET ALTERNATE TO ★SST ALTERNATE TO •SET ALTERNATE TO •SET ALTERNATE TO •SET ALTERNATE TO SET ALTERNATE ON ENDCASS

Total funetion eort.txt •H and o functioa sort.txt‘

Shear Stress HUVEC 2:Abucdasce sort.txt· •Shear Stress HUVEC 2 tAbundance con.txt· Shear Stress HUVEC 2:Funetion sort.txt* •Shear Stress HUVEC 2:Distributlon sort.txt •Shear stress HUVEC 1;Cloně liat.txt’

Shear Stress HUVEC 2:Loeaeicn sort.txt’

I? PRINTONal

61,30 SAY •Da.tabase Subset Analysis STYLE ¢3536 PONT Ganava‘,274 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 ENDIF 7 7 o

? dáte() ?? * ¹ 7? TIMS{) ¹ Cloně· nanbars ¹ ?? STR(INITIATE,S,0)

7? * fchrough ·

7? STRfTERNINATS, 6,0) 'Libraríes: *

IP EOTIREal ? 'All libraríes'

ENDIF

IP EOTIRE.2 MARJČ-l DO WHZLE ,T.

IP MARK>STOPIT

EXIT _ ENDIF

USE SELECTED GO MARX 7 ' '

TRZM(libnaae)

STOR3 MARX+1 TO MARX LOOP

ENDOD

ENDIF 'Desion&eions: *

IP Bnatch*0 .AND. Knatch»0 .AND. Qaateh«0 .AND. IKATCH«0

77. *A11'

ENDIF

IP Boatchel 'Exact,'

ENDIF

IF Hmatch-1

7? 'Humen,' aoiF ·

ZF Coatchal . .

'Other sp.'

ENDIF '

IF Imatchal 77 'INCYTE'

ENDIF

IF Jtaatehal ?? 'EST'

ENDIF

I? CONDSN-1 ' ? ‘Conriensed formát analyaia'

ENDIF

IF ANALel ? 'Sorted ty NUM3ER'

SNDIF X'

ÍF ANAL«2 ? ‘Sorted ty ENTRY' “

ENDIF ‘ SF ANALe3 ? 'Arranged ty ABUNDANCS'

ENDIF _M I? ANAL-4 ? 'Sorted ty. JKIEREST'

ENDIF

I? ANAL=5 ? 'Arranged ty LOCATION'

ENDIF '

IF ANAL-6 'Arranged ty 015731130110^

ENDIF

IF ANAL-7 ? ‘Arraayed ty “JNCTICN'

ENDIF ? 'Total dones reprssented: ¹ ,7? STR(STARTOT,S,O) ? 'Tocal dones analýzeds *

7? STRCANALTOT, 6,0} ' 1 = librařy d = desisnation i » distributicn z « location r « function c « cer ♦♦Ir*··*****»**»»»»»»»***»*·»*******»»* *«*r****************************** *********************

USE TEMPDESIG • SCREEN 1 TYFE 0 KEADING Screen 1’ AT 40,2 SIZE 286,492 PXXELS FQOT ‘Geneva·',? COLOR 0,0,0,

DO CASE CASE ANALel * sort/number SET HEADC4G ON IF CCNDSN.L

SORT TO ΤΞΜΡ1 CN ENTRY,NUMSER DO CCMPSESSICN ntóber.PRG’

ELSE

SORT TO TSKP1 CN N0M3ZR

OSE TEMP1 _ list off fialda number,L,D,F,Z.R»C,ENTRY,S,DSSCRIPTQR •list off fialfiS nunber,L»D,F,Z,R,C,E2írRY,S,OSSCRIPTOR,U5XCIH,RFEND,INIT,I CLOSE DATASASES ERASE TEMP1.D3F

ENDIF — ...

CASE ANAU2 * sort/DSSCRIPTOR SET EEADDJ3 CN •SORT TO TEMP1 ON DSSCRIPTOR, ENTRY, NOMSER/S íor E»'E'.CR.D-^ŮOR.D^O'.OR.I>'X'.0R.De'I' •SORT TO ΤΞΜΡ1 CN ENTRY, DESCRIPTOR.NUMSER/S íor D»'2‘ .OR.D-^,H^,‘.OR.D-‘O' .0R.Dm‘X‘ .OR.D-‘I' SORT TO TSMP1 ON ENTRY,START/S for D-Έ'.OR.D='K‘.CR.D-‘O'.OR.D='X'.OR.D*¹1'

IF CCNDEN-1

D3 COMPRESSION eatry.PRG*

ELSE

USE TEMP1 list off fields number, L, D,?,Z,R.C,EN7RY,S,DESCRI?TCK,LE©IH,RJEND, INIT, I

CLOSE DATASASES ERASE TEMPl.DBF ENDIF

CASE * sort by abundance

SET ΗΞΑΟΣΝ3 ON

SORT TO TEKPl ON ENTRY.NUM3ER for D»'S' .OR.D»'H' .OR.D»'O' .OR.D*'X' .OR.D·'!'’ DO ‘CCkpressiqn abundance.srg·

CASE ANAL-4 * aort/interest

SET KEADXN5 ON

IF CQNDEN.l

SORT TO TEMF1 ON ENTKY, NUMBER FOR I>0

DO ‘CGMFRESSIGN intexect.FFG‘

ELSE

SORT CN I/D.ENTRY TO TEMP1 FOR I>1

USB TEMP1 lise eií fielda numbex,L.D,F,Z.R,C,ŠUTRY,S.DESCRIPTOR.LENOTK,RFEND,ΙΝΣΤ,Ι CLOSE DATASASES ERASE TEMP1.DBF

ENDIF

CASE ANAL-5 * arxanae/lecatiea

SET KEAD34S CN

ST0R3 4 TO AMPLIFIE3 'Nuclear:¹

SORT ON ENTRY,NUMBER FIELDS RFEND,NUK3ER,L,D,F,Z,R.C.ENTRY.S.DESCRIPTOR.LZNBTH, CTÍT, X.CCMMEN IF CCNDEN-1

DO ’Conpxessíon location.prg*

ELSE

DO ‘Normál subroutina 1*

ENDIF ? 'Cycoplaamics'

SORT CN ENIRY.N0M3ER FIELDS RFEND,NUMS2R,L,D,?,Z.R,C,SNTRY,S,DESCRIFTOR,LENGTH, ZNIT.I.CCMIOÍ IF CCNEEN-l

DO “Ccmpresaion location.prg·

ELSE _

DO ‘Normál aubroutine 1*

ENDIF ? 'Cyťoakelecon:' _ SORT CN ENTKY,NUMBER FIELDS RFSND,NUM3ER.L.D,F,Z,R,C,ENTRY,S.DESCRIPIOR,LENGTH,INIT,I IF CCNEOU1

CO ‘Cotpreasion location.prg·

ELSE

CO *Normal aubroutine 1* .

ENDIF

7 eurfaee: *

SORT CN OTÍKY,NUMBER FIELDS RFEND,NUMBER,L,D,F,Z,R,C.EOTKY,S,DESCRIPTOR, ISN3IK, INIŤ. X IF OCNDEN-1

DO ‘Canpreaeion location.prg* ELSE

DO ‘Normál aubroutine 1' endif ' Intracellular membráně;¹

SORT ON SNIRY,NUMBER FIELDS RF3ID,NUMBER,L,D,F,Z,R,C.ENIRY,S,DESCRIPT0R,LEM3TH.INXT„X, IF CCNEEN»1

DO ‘Compreaaion location.prg·

COMMEN cctínai

CCMMEN

ELSE .

DO ‘Normál aubroutine 1*

ENDIP 'Mitocbondrial: *

SORT CN ΟΠΚΥ,NUMBER FIELDS RFEND,NUMBER,L,D,F,Z,R,C,SNIRY,S,DESCRIPTOR,LSNUTa,INXT_sí, IF COfflEtfal

DO ‘Conpreaaloa location.prg·

ELSE.

DO ‘Normál aubroutine 1*

ENDIF

CCWMEN ? * SecsObedti¹

SORT ON BOTKY, NOMBER FIELDS RFEND,NUK3ER,L,D,F,Z,R,C,2NTRY,S,DESCRIPT0R.L2N3TK,INIT,I,CCMMSN IF CONDSN=1

DO Compreaaion location.prg'

ELSE

DO 'Normál eubroutine 1'

ENDIF ? 'Otheri'

SORT ON EOTKY, NUMBER FIELDS RFSND,NUMBER,L,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIPT0R,LEN3TH,INIT,I,CC«MEN Z? CONDENsl

DO Canpression locatior..prg

ELSE

DO· Normál oubroutine 1'

ENDIF ? 'Untaewn.·'

SORT ON ENTRY,NUMBER FIELDS RFEŇD,NUMBERzL,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIPTOR,LENGTE.INIT,I,Ca®íSN IF CONDEN«1

DO Ccanpression locatioa.prg’

ELSE

DO Normál aubroutiae 1

ENDIF

IF CQNDENsl

SET DEVICE. TO PRINTER

SET PRINTER ON

EJECT

DO Output heading.prff

USE Aaa-lysis location.dbf ·

DO Create bargraph,prg*

SET -KEADIKO OFF ' ' FUNCTIONAL CLASS TOTAL UNIQUE NEW % TOTAL'

LIST OF? FIELDS Z,NAME.CLONES,GENES,NEW,PERCEOT,GRAPH

CLOSE DATABASES

ERASE TEKP2.DBF

SET HEADIN3 ON ♦USE SmarcGuysFoxBASE·»·/Mac:fox filesiTEKEMASTER.dbf

ENDIF

CASE ANAL«6 * arrange/distribution

SET HEADING ON

STORE 3 TO AMEWXER ? 'Cell/cieeue epeciCic diatributioni'

SORT CN B7TRY,NUMBER FIELDS RFEND,NUKBER,L,D,F,Z,R,C, ENTRY, S,DESCRIPTOR,LENGTH,INIT,I,CCNK=N IF CCNCEN-1

DO Cccpreeeloo diacrib.prg —

ELSE

DO Norma! eufaroutina 1*

ENDIF 'Noo-specific distsibution:' __

SORT ON BTCKY,NUMBER FIELDS RFEND,NOMBER,L,D,F,Z,R,C.ENTRY,S,DESCRIPTOR,LENGTS,INIT,I,COMKEN· IF CCNOEN-1

DO Ccrapression dietrib.prg .

ELSE

DO Normál subroutin* 1

LNUIF ? 'Unknown discribuclBtrr' _ ·

SORT CN EOTRY,NUMBER FIELDS R?SND)NOMBER,L,D,F,Z,R,C,E7:RY,S.DESCRIPTOR,LEN3TH.INIT,I₍CCÍ®£N IP CCMDEN-1

DO Cerpresaicn dietrib.prg·

ELSE

DO Normál aubroucine 1*

ENDIF

IP CCNDEN-1 .....

SET DEVICE TO FRTOTER

SET PRINTER QN

SUBCT

DO' * Output heading. prg *

USE 'Anályeis distribution.dbf‘

DO 'Create bargraph.prg'

SET HEADING OFF ? ' FUNCTICNAL CLASS TOTAL UNIQUE % TOTAL' ·

LIST OFF FIELDS P.NAME,CLQNES,GENES,PEBCENT,GRA?H

CLOSE DATABASES

ERASE TENP2.DBF

SET HEADIN3 ON •USE 'SmartGuy:FoxHASE+/Mac:řox files:TEMPMASTER.dbf*

ENDIF

BINDING PROTEINS*

CASE ANAL«7 • arrange/funetion SET HEADING ON STORE 10 TO AMPLIFIER ? ' 'Surface nolecules and receptorsi'

SORT ON ENTRY.IOQER FIELDS RFEřro,NUMBER,L,D,F»Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIPTOR,LENGTK,INIT_řI_fCCMMEN IF CONDENal

DO ‘Canpressíon funetion.pro

ELSE

DO 'Normál subroutine 1*

ENDIF 7 'Calcíum-binding proteine s'

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RFSND.NUMSERíL.D.F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIPTGR,LENGTH,INIT₍I₄CQÍ®C5N IF CONDEN«1

DO 'Campression funetion.pxg*

ELSE

DO 'Normál subroutine 1*

ENDIF ? 'Ligands and efťectorsi'

SORT ON ENTRY.NUM3ER FIELDS RFEND,NOMBER,L,D,F,Z,R,C,ENrRY,S,DSSCRIPT0R,I5NGra,INIT,I_fCCHHSN IF CONDEN-1

DO 'Ccmpression funetion.prg*

ELSE

DO 'Normál subroutine 1*

ENDIF 'Other hinding proteine i¹

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RFEND,NOMBER,L,D,F,Z,R,C,ENERY,S,DESCRIPTOR,LB»3TS,INIT,I.COMHŽN IF CONDEN«1

DO 'Coopression funetion .prg'

SLSE

DO 'Normál subroutine 1' ~

ENDIF •EJECT ? ¹ CNCOGENES* ? .

'General oneogeneu·

SORT ON ENTRY.NOMBER FIELDS FFEND,NafflER,L₍D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIPTOR,iaOIH,INIT,:

IF CONDENal

DO 'Compression funetion.prg'

E^SS

DO 'Normál subroutine 1'

ENDIF ' GTP-binding protein* i'

SORT CN ENTRY.NOMBER FIELDS RFEND, NOMBER, L,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRXPTOR,LEN3TK,XNIT,;

IF CONDENal

DO Compression funetion.prg*

ELSE

DO 'Normál subroutine 1*

ENDIF 'Viral elementu'

SORT ON ENTRY.NUMBER FISLDS RFEND.NUMBER.L.D.F.Z.R.C.ENTRY.S.DESCRIPTOR.LENGTíI.INIT.I.COMMSN IF CQNDENsl

DO čonpreasion function.prg

ELSS

DO Normál subroutine 1* endif ? 'Kinases and Phosphatases:'

SORT ON 3NTRY.NUM3ER FIELDS RFEND,NUMBER,L,D,?,Z,R,C,ENTRY,3,DESCRIPT0R,LENSTH,INIT,I,'C0MMEN IF CONDSN.i

DO Cůnpreasioa function.prg

ELSS * DO Normál subroutine 1'

ENDIF ? 'Tumor-related antigensi'

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RFSND,NUN3SR,L,D,F,Z,R,C,SNTRY.S.DESC3aPTOR,LDKřI«.INIT,I,CCMCN IF CONDEN-l

DO Conpreaaion function.prg

ELSE

DO Noma.1 subroutine 1'

SNDIF

SJECT ’ PROTEIN SYNTHETIC MAOffiSRY PROTSENS¹ < · 'Transcription and Nucleic Acid-binding proteins:¹

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RFEND.NUMBSR.D.D.F.Z.R.C.aTCRY.S.DSSCRIPTOR.ISNGTO, JNIT.I.COMMEN IF CQNDENsl

DO Coepreasion function.prg’

ELSE

DO Normál subroutine' 1

ENDIF 'Translation:'

SORT CN ENTRY.NUMBER FT^TK RFEKD,NUKBER,L,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIPTOR,LENGTE,INIT,I,CCMMEN IF CONDENxl

DO Compression function.prg’

DO Normál subroutine 1

SNDIF ¹ Riboscnal proteins:'

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RFEND.NUKBER.L.D.F.Z.R.C.SNIKY, S,DSSCRIPTOR.LENGTH, INU, I.CCMMEN IF CCNDEN-1

DO Ccmpresaioa function.prg’

ELSE

DO Normál subroutine 1 .ENDIF 'Protein Processing:'

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RF£ND,NUMBER,L,D,P,Z,R,C,OITOY,S,DESCRIPTOR,E5N3TH,XNIT.I»CCMMEN if ccndsi-i

DO ‘Compression function.prg.

ELSE

DO Normál subroutine 1

ENDIF

EJECT ’ ENZYMES' 'Ferroproteiasi' _M

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RPEND.NUMBER.L.D.F.Z.R.C.ENTKY, S.DESCRIPTOR.LENSTH.XNIT.I.CafcMSN IF CONDENxl DO Compresaíon function.prg

ELSE

DO Normál subroutine 1'

ENDIF 'Proteaaes and inhibitore:'

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RFEND,NUMBER,L,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRI?TOR,LENQTH,INIT,I.CCMMEN IP CQNDENsl

DO Conpreaaion function.prg .....— .......

ELSE co NoctíI subroutiae 1*

ENDIF ? 'Oxidativa phosphorylation:'

SORT ON EOTRY.NUMBER FIELDS RFEND,NUMBER,L,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIFTOR.LEW3TH,INIT,I,CŮNHEN IF CONODI«1

DO Coapreaaioa fuaccion.prg'

ELSE

DO ‘Norma! eubroutine 1*

BDI?

? ' Sugar metabolism»¹

SORT ON STORY,NUM3SR FIELDS RFEND,N0MB2R,L,D,F,Z,R,C,ENTRY, S,DSSGRIPTOR,LBIGTH, ΙΝΙΤ/Ι,ΟΟΜΜΕΝ IF CONDEN-1 DO 'Compression functioa.prg·

ELSE

DO 'Normál subroutine 1*

EDI?

? 'Ámiao aeid metabolism: ’

SORT ON INTRY,NUK3ER FIELDS R?END,NUM3ER,L,D,F,Z,R,C,ENrRY,S,DBSCRIPTOR,LEŇ3TH,INIT_#I_fCOMíEN I? CONDEN-1

DO 'Comprassion functioa.prg'

ELSE

DO ‘Normál subroutine 1*

ENDIF ? 'Nucleic acid metabolism:'

SORT ON SNTRY,NUMBER FIELDS RFEND,NUM8ER,L,D,F,Z,R,C,E(n5Qr,S,DiSCRIPTOR,LEMOTH₍INIT,l,CCtó®3 IF-CONDSJ·!

DO 'Conpreaaion function.prg·

ELSE

DO 'Normál subroutine 1* endif ? 'Lipid metabolism:'

SORT ON ENTRY.NOMBER FIELDS EFE®4K»lBSR,L,D,F,Z,R,C,ENm,S,DESCRIETOR,LBMSIK>ÍÉNIT,I.OCttSBN 17 CONDEN-1 do ‘Canpressioa function.prg'

ELSE

DO 'Nonn&l subroutine 1*

ENDIF ? ' Other enrymet i'

SORT ON ENTRY.NOMBER FIELDS RFa©,NUMSER,L,D,F,Z,R,CENTRY, S,DESCRIFTOR,La«3TH,INIT, I.CXWN IF CONDEN-1

DO 'Corapression function.prg'

ELSE

DO 'Normál subroutine 1*

ENDIF •EJECT ? ¹ MI9SELEANEOOS OWBGOBJES' ?

? 'Stress*responser'

SORT ON £NTRY,NUKBSR FIELDS RFEKD.NCMBER,L,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIFTOR,LENGTH,2NIT,I.COMMEN 17 CQNEEN-l

DO 'Compresaioa function.prg* _

ELSE

DO 'Normál eubroutine 1*

ENDIF ? 'Structuxel:'

SORT ON ENTRY.NUKBER FIELDS RFEND,N0MBER,L,D,F,Z,R,C,INTRY,S,DESCRIPT0R,IiEN3TH,INIT,I,

IF CCMDEN-1

DO 'Conpression function.prg* rr.gr

DO 'Normál eubroutine 1*

ENDIF ? Other clenea:'

SORT ON ENTRY.NUMBER FIELDS RFEND,NUMBER,L,D,P, Z,R, C,ENTRY,S,'DESCRIFTOR,UENSTH, ΙΝΣΤ,Ι,

IF CONDEN-1

DO 'Coopression function.prg*

ELSE

DO ’ΝοεχγαΙ subroutine 1* ~

ENDIF ? ‘Clones oí unknown íuaction!'

SORT ON ENTRY,NUM3ER FIELD5 RPEND,NUK3ER,L,D,F,Z,R,C,EfírRY,S,DESCRIPTQR,LENGra,INIT,I,'C0MiířN IF CCMDENxl

DO 'Compressior, ťuncticn.prj'

ELSE

DO ‘Normál subroutine 1*

ENDIF

I? CONDEN«1 EJECT •SET DEVICE TO PRINTER •SET PRINT ON DO Output heading.prg·

USE ‘Aaalysis ťuncticn.dbf·

DO ‘Create bargraph.prp·

SET EEADING OFF

SCREEN 1 TYPE 0 HEADING Screen 1* AT 40,2 SIZS 296,482 PIXELS FONT Gen£va,12 COLOR 0,0,0 ? ' TOTAL TOTAL NSW DIST ? ' FUNCTICNAL CLASS CLCNES GENES GENES FUNCTICNAL CLASS' • ·> · ·»« •LIST OP? FZELDS Ρ,ΝΑΜΞ, CLCNES, GENES,NEW, PSRCSNT,GRA?H,CCMPANY LIST OFF FZELDS P.NAME, CLCNES, GENES, NEW, PERCEOT,GRAPH CLOSE DATABASES

ERASE TEMP2.D8F

SET HEADXN3 ON •USE *Sff.artGuy:FaxBASS+/Macifox files:TQÍPMASTER.dbť·

ENDIF

CASE ANAL»8

DO “Subgrcup sunnary 3.prsr‘

ENDCASE

DO Test print.pxp*

SET PRIOT OFF

SET DEVICE TO SCREEN

CLOSE DATABASES •ERASE TEMPLIB.DBF •ERASE TEMPřWM.DBF «ERASE TEMPDESIG.DBF •ERASE SELECTED.DBF

CLEAR.

LOOP

2NDDO * COMPRESSION SUBRCUTHE FOR ANALYSIS PSOGRAMS

USE TEKP1

COUNT TO TOT

RSPLACE ALL RFEND WITH 1

MARXI = 1

SW2-0

DO WHILE SW2«0 ROLL IF MARXI > TOT PACX

COUNT TO UNIQUE

COUNT TO NEWGSNES FOR D- Ή* .OR.D· ‘0'

SW2»1

LOOP

ENDIF

GO MARXI

DUP s 1

STORE ENTRY TO TĚSTA

SW O

DO WHILE SW»O TEST

SSOT

STORE ENTRY TO TESTE IF TĚSTA · TESTE dsiete DUP - DUP-rl LOOP ·

ENDIF

GO MARXI.

RSPLACE RFEND WITH DUP

MARXI ·> KARX1+DUP

SWsl

LOOP

ENDDO TEST

LOOP

ENDDO ROLL •GO TO?

STORS Z TO LOC '

USE 'Analysis locaťion.dbř'

LOCATE FOR Z-LOC

RSPLACE CLONES WITH TOT

RSPLACE GENES WITH UNIQUE

RSPLACE NEW WITH NEWGENES

USE TEMPL

SORT ON RFEND/D TO TEMP2

USE TEHP2 ?? STR(UNIQUE,5,0) ?? ¹ genes, for a total of ’ ?? STR(TOT, 5,0) ?? * .cloaes¹ ? ¹ V Coincidence' liat off Halda neober,RFEMD,L,D,F,Z,R,C,HNTRY,S,DSSCRIFTOR,LBI3TH,INIT,I •SET PRINTOFF CLOSE DATA3ASES ERASE TSMPl.DBF ERASE T5KP2.DBF USE TEMPDESIG * COMPRESSION SUBROUTINS FOR ANALYSIS PROGRAMS

USE TEMP1

COUNT TO TOT

REPLACE ALL RFEND WITR 1

MARXI - 1

SW2-0

DO WHXLE SW2=0 ROLL I? MARXI >= TOT PACK

COUNT TO UNIQUE > SW2=1

LOOP

ENDIF

GO MARXI DUP = 1

STORE ENTRY TO TĚSTA SH - 0

DO WKILE SW«0 TEST SKIP

STORE ENTRY TO TESTB IF TĚSTA χ TESTB DELETE DUP « DUP+1 LOOP 'ENDIF

GO MARXI

REPLACE RFEND WITH DUP MARXI χ MARX1+DU?

SWxl

LOOP

ENDDO TEST LOOP

ENDDO ROLL ♦BRCWSE ♦SET PRINTER CN SORT ON DÁTE TO TEMP2 USE TEMP2 ?? STR{UNIQUE,4,0) ?? ¹ genes, for a total of 7? STR{TOT,4,0) · cionee' ? ¹ V Coincidence¹

COUNT TO P4 FOR Ι·4 IF P4>0 _

STR(P4,3,0) ?? ' genes with priority χ 4 (Secosdary analysis:)¹ list off fields nnBiber,Rřa®,L,D,F,Z,R,C,Bíneř,S,DSSCRIPTOR₍La«TH,IKÍP for 2-4 ·>

ENDIF __

COUNT TO P3 FOR 1-3 IF P3>0 ? STR(P3,3,0) ?? ¹ genes with priority χ 3 (Full insert sequence:)¹ list off fielda a«inber.KaO,L,D,ř,Z,R,C,aíHK,S,M^RI?TOR,LS»STK,IHIT for 1-3 z

ENDIF

COUNT TO P2 FOR 1x2.

IF P2>0 ? STR(P2,3,0) ' genes with priority - 2 (Priaiary analysis complete;)' liflt off fields nunber, RFEND,L,D,F,Z,R,C,ENIRY,S.DESCRIPTOR,LENGTH,INIT for 1x2 7

ENDIF

COUNT TO ?1 FOR 1-1 IF Pl>0 ? STR(Fl,3,0) ?? * geaee with priority » 1 (Primasy onalysia naadedi) * liet ofi iieláe auabeXiBFEND/L/DjP/Z/RjC^SNIRYiS<KSCRI?T0R,IjENGTH,3N3T for I«1 ENDIF •SET FRINT OFF

CLOSS DATABASES

ERASS TEMPl.DBF

ERASS TEMP2.DBF

USE 'SaartGuyjFoxBASE+ZMacsfox files«dones, ábf* ’ CCMPRSSSION SU3R0UTINE FOR ANALYSIS PROGRAMS ........

USE TEMP1

COUOT TO TOT

REPLACS ALL RFEND WITH 1

MARXI « 1

SW2-0

DO TOHLE SW2-0 ROLL I? MARXI >= TOT PACX

COOOT TO UNIQUE

SW2-1

LOO?

ENDIF

7· GO MARXI

DUP = 1

STORE EOTRY TO TĚSTA SW = 0

DO TOHLE SW-0 TEST

SKIP

STORE EOTRY TO TESTE IF TĚSTA « TESTE DELSTE DUP - DUP+1 LOOP

ENDIF

GO MARXI

RSPLACE RFEND WITH DUP MARXI = MARXl+DUP SW=1

LOOP

ENDDO TEST LOOP

ENDDO ROLL ♦BROWSE . ♦SET PRINTER ON

SORT ON NOMBER TO ΤΉΜΡ2 USE TEMP2 ?? STR (UNIQUE, 4,0)

7? ¹ genes, for a Coeal of ¹ 77 STR(TOT,5,0) ?? ' elonea' ¹ V Coincidence* list off fieldfl nuaber,RPS®,L,D.F,Z,R,C,ENTSY,S,DESCRIPTaR,LENGTH,INIT,I ♦SET PRIOT OFF CLOSE DATABASES ERASE TEMP1.SBF ERASE TQÍP2.DBF

USE *SnartGuyjFoXBASE+/Mac:fee< filea:elonea.dbť' • COMPRESSION SOBROOTXNS FOR AHALYSIS FROGRAMS

OSE TEMP1

OCUNT ŤO TOT

RSPLACE tel, RFEND WITH 1

MARKl - 1

SW2»0

WHILE SW2bO ROLL XF MARKl >» TOT PACK

CCUNT TO UNIQOB

COUNT TO NEWGENES FOR D='H' .OR.D-O'

SW2«1

LOOP

ENDIF <30 MARKl DUP - 1

STORS ENTRY TO TĚSTA SW 0

DO WHILE SW=0 TEST SKIP

STORS ENTRY TO TESTE IF TĚSTA a TSSTB OHTiETS DUP = DUP-t-1 LOOP

ENDXF

GO MARKl'

REPLACE RFEND WITH DUP

MARKl « MARK1+DUP

SW«1

LOOP

ENDDO TEST

LOOP

ENDDO ROLL

GO TOP

STORS R TO FONC

OSS Analysi* function.dbť

LOCATE FOR P-FONC

-REPLACE CLONES WITH TOT

REPLACE GENES WITH ONXQOE ~

REPLACE NEW WITH NEWGENESUSE TEMP1

SORT ON RFÍND/D TO TEMP2

OSE ΤΈΜΡ2

SBT HEADXK3 CN

7? STR(ONXQUE,5,0) _ ?? * g«ncs, far & total ef *

STB(TCT,5,0) ¹ eiaaee* »»» ? ¹ V Coineidence' list' off fields TMiwWrr,RPBJP_r L_r D_f T, Z. R, C. SOTRY, S, DESCRIPTQR. L5NOIH. INIT, I »«« •SCREEN 1 TYPE O HEADXN3 'Screta 1’ AT 40,2 SXZS 286,492 PIXELS FONT Geneva‘,12 COLOR 0,0, •list c££ fields rfend, s,descriptor •SET PRXKT OFF

CLOSS DATABASES ERASE TEHF1.D3F ERASS TEMF2.DBF OSE TSKPDESIG * CCMPRESSICN SUBRQUTTNE FOR ANALYSIS PROGRAKS

USE T2ÍP1

COUNT TO TOT

REFLACE ALL RFEW WITH 1

MARXI « 1

SW2-0

DO WELLE SW2-0 ROLL IF MARXI > TOT FACX

COUNT TO UNIQUE

SW2=1

LOOP

ENDIF

C-0 MARXI

DUP « 1

STORE EOTRY TO TĚSTA

SW - 0

DO WHILE SW®0 TEST

SKIP

STORE EOTRY TO TESTB IF TĚSTA TESTB EELEIE DUP = CUP+1 LOOP

ENDIF

GO MARXI

REPLACE RFEND WITH DUP

MARXI = MARK1+OUP

SW«1

T.OOP

ENDDO TEST

LOOP

ENDDO ROLL ' ·

C-O TO?

STORE F TO DIST

USE Analysis distribution.dbf

LOCATE FOR P»DIST

REPLACE CLONES WITH TOT

REPLACE GENES’WITH UNIQUE

USE ΤΈΜΡ1 «ort caa rfead/d to TEMP2

USE TEMP2 ?? STR(UNIQUE,5,0)

7? * ganes, for a total of ¹

STR(TOT,5,0) ¹ clcoaa¹ ' V Coincidence' liat ofť fielda nuafeer,RFEJD,L,D,F, E,R,C, ETIKY, S,DESCRIPT0R,LEN3IH,INIT, I ‘SET PRIOT OFF

CLOSE DATABASES

ERASE TEMPl.DBF

ERASS TSMP2.DBF

USE TEMPDESIG * COMPRESSICN SUBROOTME FOR ANALYSIS PROGRAMS

USE TEMP1

COUNT TO TOT

RSPLACE ALL RFEND WITH 1

MARXI a 1

EW2-0

DO WHILE SW2-0 ROLL IF MARXI >- TOT PACX

COUNT TO UNIQUE

SW2«1

LOOP

ΗΟΠ

GO MARXI

DUP a 1

STORE ENTRY TO TĚSTA

SW < 0

DO WHILE SWaO TEST

SKI?

STORE ENTRY TO TESTB IF TĚSTA «· TESTB OBLETE DUP .a DUP+1 LOOP

ENDIF

GO MARXI

REPLACE -RFEND WITH COP

MARXI a MARKl+DUP

SWal

LOOP

ENDDO TEST

LOOP

ENDDO ROLL'

GO TO?

USE ΤΞΜΡ1

7? STR(UNIQUE,5,0) ' genes, for a_ total of '

7? STR(TOT,5,O)

7? ¹ clonee^{1 1} V Coiacidenc·' — list off fields znsnber,RFEND,L,D,F,Z,R,C,Q7IRY,S,DESCRIPIOR,XÁENGTH,INIT,I •SET PRINT OFF

CLOSS DATABASES

ERASE TEMF1.CB?

USE TEMPOESIS .

« COMPRSSSION SUBROOTINE FOR ANALYSIS PROGRAMS USE ’SjnarcCuy:Fo>í3ASE-*-/Mae:fox files:Clones.dbf·

COPY TO TSMP1 FOR

USS ΤΞΜΡ1

COUOT TO IDGENE FOR D«'E· .OR.D-Ό' .OR.D=’H' .OR.D-'Ν' .OR.D='R' .OR.D-'λ¹ DELETS FOR D=‘N' -OR.D='D' .OR.D=’A' ,OR.D=’U’.OR.D='S' .OR.D«’M' .OR.D»'R‘ .OR.D^V’

PACK

COUNT TO TOT

REPIACS ALL RFEND WITH 1

MARKl « 1

SW2=Q

DO WHILE SW2=0 ROLL I? MARKl >= TOT PACK

COUNT TO UHIQUE

SW2sl

LOOP

ENDIF

GO MARXI

DUP - 1

STORE ENTRY TO TĚSTA

SW - 0

DO WHILE SW«0 TEST

SKIP

STCRE ENTRY TO TESTB if Těsta = testb DELETE*

DUP - DUP+l LOOP

SNDIF

GO MARXI

RESLACE RFEND WITH DUP

MARXI » MARXl+DUP

SW=1

LOOP

ENDDO TEST

LOOP

ENDDO ROLL ‘BSOWSE_ ♦SET FRINTER ON

SORT ON RFEND/D.MUMBER TO TEMP2

USE TEMP2

REPIACS ALL START WITH RFEND/HX2NE*10000 ?? str(w:qce,5,0) ?? ' genes, for a total of · _ ?? STR(TOT,5,0J ?? ' elones’ ? ' Coincidence V V Cloaes/10000¹ set heading off

SCREEN 1 TYPE 0 HEADING 'Sereen 1’ AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS FONT *Geneva\2 COLOR 0,0,0 list fields aumber,RFEND,START,L,D,F,Z,R,C,ENTRY,S,DESCRIPTOR,INIT,I ♦SET PRIOT OFF

CLOSE DATABASES

ERASE TEMP1.DBF

ERASE TEMP2.DBF

USE 'SoartGuy:FoxBASE+/Mac:fox filea:dones.dbf* * COMPRESSION SUBROOTINS FOR ANALYSIS PROGRAMS

USE TEWP1

COUOT TO IDGENE FOR D»'3‘ .OR.D*'O' ,OR.D« Ή' .0R.D»'N' .OR.D»'R· .OR.D='A'

DELETE FOR D='N· .OR.D='D· .OR.D='λ'.OR.D=‘U’ ,OR.D«'S' .OR.D«'M' .OR.Cte’R' .OR.Da-V’

PACK

COGNT TO TOT

REPLACE ALL RFEND WXTH 1

MARK1 « 1' .

SW2»0

DO WHILE SW2-0 ROLL IF MA&K1 >- TOT PACK

COQNT TO UNIQU3

SW2=1

LOOP

ENDIF

GO MARXI

DG? a l

STORE ECHY TO TĚSTA

SW a 0

DO WHILE SW«0 TEST

SKIP

ST0R2 ENTRY TO TESTB IF TĚSTA s TESTS DELETE .

DUP - DGP+l LOOP ·

ENDIF

GO MARXI

REPLACE RFEND WITH DUP

MARK1 - HARXXvDOP

SWal

LOOP

ENDDO TEST

LOOP

ENDDO ROLL ♦BROWSE ♦SET PRIOTSR ON

SORT ON RFEND/D,NUMBER TO ΪΕΜΡ2

OSE TS4P2

REPLACE ALL START WXTH RFEND/IDGEME*10000 ?? STR(UNIQUE,5,0) ?? ' gen·», for a total of ¹

7? STR(TOT,5,0)

7? · cloae»* ? ¹ Coincideacj V V denes/10000'

Bet heading off

SCREEN 1 TYFE 0 HEAÍ5ING 'Screen 1' AT 40,2 SXZS 286,492 PXXELS FONT *Geneva\7 COLOR list fields nUDber,RFEND,START,L,D,?,Z)R,C,STIHY,S,DESCRIPTOR’, ΠΤΙΤ, I ♦SET PRIKT OFF

CLOSE DATA3ASES _

ERASE TOČÍ.DBF

ERASE TEMP2.DBF

USE 'SaertGuy:FoxBASE>/Mac«fox filé»:dones.dbf’

0,8,

- 74 USE TEMP!

COUNT TO TOT

7? ' Total of* ?? STR(TOT,4,0)

7? ' cionee' *liat Off fielda nwrb«r,L.D.F,2,R,C,SOTía,mSCRIPTCa,UaeTH,iar21©,IlIlT,I list off fielda ntanber,L,D,F,Z,R,C,ENTHY,EESCRIPTDR CLOSE DATABASES

ERASE-TEMP1.DBF

USE TsMPDESIG •Lifeecan menu; version 8-7-94

SET TALK OFF sec device to screen

CLEAR

USB 'SmBrtGuy:FcxEASE+/Mec:fox files t dones .dbf* STORE LUPDATEO TO Update CO BOTTCM

STOPE RECNOO TO doneno

STOPE 6 TO Chooser

DO WHHE .T.

* Program.: Lifeseg menu.fmt •Dáte....: 1/11/95 * Version.: FoxEASS+/Mac, revision 1.10 * Notes....: Fermat filé Lifeseg menu

SCREEN 1 G PIXELS

PIXELS

PIXELS a ptxels G PIXELS G PIXELS G PIXELS 0 PIXELS G PIXELS G PIXELS Θ PIXELS 8 PIXELS

TYPE 0 KEADIN3 *Screen 1* AT 40,2 SIZE 286,492. PIXELS FCNT ‘Geneva’,268 COLOR 18,126 TO 77,365 STYLE 28479 COLOR 32767,-25600,-1,-16223,-16721,-15725 110,29 TO 188,217 STYLE 3871 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1

45,161 SAY 'LIFESEO' STYLE 65536 PCMT *Geaeva’,536 COLOR 0,0,-1,-1,7135,5884 36,269 SAY 'TM* STYLE 65536 PONT *Geneva*,12 COLOR 0,0,-1,-1,7135,5884 63,143 SAY 'Mdecular Biology Desktop* STYLE 65536 FCNT *Helvetic&*, 18 COLOR 0 90,252 TO 251,467 STYLE 28447 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1

117,270 GET Chooser STYLE 65536 FONT 'Chicago*, 12 PICTURS *3*RV Transcript pro

135.128 SAY Update STYLE 0 FCNT *G«neva',12 SIZE 15,79 COLOR 0,0,0,-25600,-1,-:

171.128 SAY cloněno STYLE 0 FONT *Geneva*,12 SIZE 15,79 COLOR 0,0,0,-25600,-í,<

135.44 SAY 'Laflt Update:* STYLE 65536 FONT *Geieva*,12 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

171.44 SAY 'Total dones:* STYLE 65536 FONT *Geneva',12 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1 45,296 SAY *Vl.30* STYLE 65536 FCNT *Ceneva*,782 COLOR 0,0,-1,-1,-1,-1

0,0,

0,0, files . · •1 * EOF: Lifeseg menu.fmt

READ

DO CASE

CASE Chooser·!

DO SraartGuy:Fcx2ASE+/Mae:fox files:Output programetMaster analysis 3.prg' CASE Chooaer-2

DO 'SmarcGuy;Fox3ASE+/Mac:fox files:Output programssSubtractien 2.prg’ 'CASE Chooser«3

DO *SaartGuy:FaxSASE+/Mae:ťox ťilas:Output programesNorchem (single) .prg* CASE Chooser-4 USE 'Libraries.dbf·

SROWSE

CASE ChooserM5

DO *SmartGuy:FoxBASE+/Mae:fox fileslOutput programs iSee individual cloně.prg* CASE Chocs«r»6

DO 'SaartGuy:FaxBA£E-t-/Mae:fox filesiLibraries:Output programs:Nenu.prg'

CASE Choos«Xx7 CLEAR '

SCREEN 1 OFF

RETUFN

ENDCASB

LOOP

ENECO

81,30 SAY Database Subset Analysis* STYLE 55536 FONT *Geneva*,274 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 7 7 7 7 dáte O 7? ’ ’

ΊΤΜ8Ο 'Cloně nunbers ’

7? STRdNITIATE, 6,0) ?? ' through '

7? STR(TSRKINATE,6,0) 'Libraries: ' ‘ IF EOTIRE-1 'All libraxiea·

ENDIF

IF ENTHÍE=2 MARK-l , DO WHILE .T.

IF MARK>STO?IT

EXIT dDIF

USE SELECTED GO MASK 7 ' '

7? TMMdibnaa·)

STORS MARX+1 TO MARX LOOP

ENDDO

ENDIF 'Designationsi ¹

IF Exnatch»0 .AND. HaatchsO .AND. CnatchsO

7? 'All¹

ENDIF

Enatch-1 7? 'Exact,*

ENDIF

IF Hraatcbsl ?? 'Humen,’

ENDIF

Oaatch«l 7? 'Other ap.'

ENDIF

XF CONDEN-l 'Condensed formát analysis¹ snďif

IF ANAL-1

7· ‘Sorted by NOMBER'

ENDIF

IF’ANAL-2 ¹ Sorted by ENTKY' —

ENDIF IF ANAL-3 'Arranged ty ABUNDANCE'

ENDIF IF ANAL-4 'Sorted by ZNTEREST'

ENDIF

IP ANAL-5 'Arranged by LOCATICN'

ENDIF IF ANAL-5 'Arranged by DISTRIBUTICN ’

ENDIF IF ANAL-7 'Arranged by FUNCTTON’

ENBIF ? ''Total clonee rcpreseaced: * 7? STRCSTARTCT,6.0) ? Total clonee analyzedi *

7? STR(MJALTOT,6,0) ?

USE TEMP1 COUNT TO TOT ?? ' Total of ?? STR(TOT,4,0) ?? ' dones' ?

•list dff fields ηυιώΚΓ,Ε,Ο,Ρ,Ζ,Κ,Ο,ΣΝΤΚΥ,ΠΕΒΟΚΙΡΤΟΕ,ΙΒΝΟΤΗ,ΚΓΞΝΟ,ΣΝΙΤ,Ι list off fields nuntoer,L,D,F, Z,R,C,ENTRY,DESCRIPTQR CLOSE DATABASES

ERASE TEMP1.D3F USE TEMPDESIG »

USE TEMP1

COUNT TO TOT

7? ¹ Total of*

7? STR(TOT,4,0)

7? ’ dones!

.

♦list off fields number, L,D,F, Z,R,C,ENTRY,DSSCRIFT0R,LEN3IH, RFEND, INIT.I list off fields neober,L,D,F,Z,R,C,ENTRY,DSSCRIFTOR.

CLOSE DATABASES

ERASE TBIP1.DB?

USE TEMPDESIG •Northern (single), version 11-25-94 close databases SET TALK OF?

SET PRIOT OFF SET EXACT OFF CLEAR

STORE ¹ ' TO Eobject

STORE * ' TO Dobject

STORE 0 TO Numb

STORE 0 TO Zog

STORE 1 TO Bail

DO WHILE . T.

• Program.: Northern (single) .ánt • Dáte....: 8/ 8/94 • Version.: FoxBASE*/Mac, revision 1.10 • Notes....: Formát filé Northern (single)

SCREEN 1 TYPE 0 HEADING ‘Screen 1* AT 40,2 SIZE 286,492 PIXELS FONT 'Geneva',12 COLOR 0.0,0 ® PIXELS 15,81 TO 46,397 STYLE 28447 COLOR 0,0,-1,-25600,-1,-1 ® PIXELS 89,79 TO 192,422 STYLE 28447 COLOR 0,0,0,-25600,-1,-1 ® PIXELS 115,98 SAY ‘Entry I:’ STYLE 65536 PONT Geneva’,12 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 e PIXELS 115,173 GET Eobject STYLE 0 FONT ’Geneva’,12 5123 15,142 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 Q PIXELS 145,89 SAY Description' STYLE 65536 FONT Geneva’,12 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 ® PIXELS 145,173 GET Dobject STYLE 0 FONT Geneva',12 SIZE 15,241 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 ® PIXELS 35,89 SAY ‘Single Northern search screen STYLE 65536 FONT ’Geneva,274 COLOR 0,0,® PIXELS 220,162 GET Bail STYLE 65536 FCOT •Chicago’, 12 PICTDRS ’3*R Concinue;Bail cuť SIZE ® PIXELS- 175,98 SAY Cloně f:’ STYLE 65536 FONT Geneva’;12 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1 ® PIXELS 175,173 GST Numb STYLE 0 FONT ‘Geneva’,12 SIZE 15,70 COLOR 0,0,0,-1,-1,-1'

S PIXELS 80,152 SAY ’Enter any ONE of che following:' STYLE 65536 FONT Geneva’,12 COLOR -1, • EOF: Northern (single).fat

READ

IF Bail-2

CLEAR screen 1 off

R3TORN

ENDIF

USE •SmartGuy:FoxBASB+/Mae:Fox files:Lookup.dbf'

SET TALK-CN ·

IF Eobjecto' . '

STORE OPPER(Eobject) to Eobject

SET SAFETY OFF

SORT CN Entry TO Lookup entry.dbf·

SET SAFETY ON

USE Lookup entxy.dbf*

LCCATE FOR Look-Bobjeet

IF .NOT.PCONDO

CLEAR

LOOP

ENDIF

BRCWSE

STORE Entry TO Searehval

CLOSE DATABASES

ERASS Lookup · entry. dbf *

ENDIF _

IF Dabjecto' '

SET EXACT OFF

SET SAFETY OFF

SORT ON descriptor TO Lookup deseriptor.dbf’

SET SAFETY On

USE 'Lookup descriptor.dbf·

LOCATE FOR UPPER (TRIK (descriptor) )=U?PER(TRIK (Dobject))

IF .NOT.FCUNDO

CLEAR

LOOP

ENDIF

BROWSE

STOPE Entry TO Searchval

CLOSE DATABASES

ERASE Lookup descriptor.dbf·

SET EXACT CN ENDIF

IF NuaboO

USE *SmartCuy:FoxBASE4/Mac:Fox files:clcaea.dbf’

CO Numb BROWSS

STOPE Entry TO Searchval'

ENDIF

CLEAR ? 'Northern aaalyaia žer ěntry *

Searchval ?

'Enter Y to proceed'

WAIT TO OK CLEAR

IF UPPER(OK)<>'Y' aereen 1 off RETURN ENDIF · * cctcPKESSXON subrouttne for library.dbf 7 'Ccmpreasing the Libraries filé ncw.

USE 'SmartGuy:FoxSASE+/MaciFcx files:libraries.dbf* SET SAFETY OFF

SORT CN library TO ‘Coapreaaed libraries.dbf * FOR entcrcťbO SET SAFETY ON

USE 'Compraaaed libraríea.dbf

DELETE FOR entered-0

PACK

COUNT TO TOT'

MARK1 1 SW2aO

DO WHILE SW2«0 RDLL IF MARXI >- TOT PACK SW2«1 LOOP ENDIF

GO MAPJO.

STORE library TO TĚSTA SKIP

STORE Library TO TESTB IF TĚSTA « TESTB DELETE ENDIF

MARXI . MARX1+1 LOOP

ENDDO ROLL * Northern analys ia CLEAR 'Doing the northem now... ’

SET TALK ON

USE ^,SmartGuy:FoxSASE*/Mae:Fox fileasclonea.dbf· SET SAFETY OFF

COPY TO •Hita.dbf· FOR entry·searchval SET SAFETY ON

CLOSS DATABASES SELECT 1

USE 'Conpressed libraries.dbf·

STORE RSCCQONT0 TO Entries SSLECT 2

USE 'Hit*,dbf

Warksl

DO WHILE .T.

SELECT 1

IF říark>Entries

EXIT a ENDZF

GO MARK . STORE lihrary TO Jigcrer

SELECT 2 * COUNT TO Zog FOR library-Jigger

SELECT 1

RBPLACE hits witó Zog

Mark«Karktl

LOOP

ENDDO

SELECT 1

BRCMSE FIELDS LIBRARY,LIBNAMS,EtírSRED,HXTS AT 0,0 CLEAR 'Enter Y to print:'

WAIT TO PRINSET IF UPPSR(PRINSET)«'Y'

SET PRINT CN V

CLEAR zašeř·

SCREQf 1 TYPE 0 HEADING 'Screen 1' AT 40,2 SXZS 286,452 PIXELS FONT Geneva',14 COLOR 0,0,0 7 'DATABASE ENTRIES MATCHING ENTRY '

7? Searchval

DATEO

SCREEN 1 TYPE 0.HEADING 'Screen 1' AT 40,'2 SIZE 286,492 PIXELS FONT Geneva',7 COLOR 0,0,0, LIST OFF FIELDS librery, lihneme, entered. hits

SELECT 2

LIST OFF FIELDS NDMBSR,LIBRARY,D.S.F,Z,R,ENTRY,DESCRIPTOR.RFSTART,START,RFEND SET TALK OFF SET PRINT OFF ENDIF

CLOSE DATABASES

SET TALK OFF

CLEAR

DO ‘Test prínt.prg·

RETURN 83

TABULKA 6 b t a r y

ADSNINB01

ADRBQOR01

ADRHNOTO1

AWLSNOT01

BMARNOTOI

8MARNOTQ2

CARONOTOI

CHAONOTO1

CORNNOTU1

FBRAGT01

FIBRAGTC2

RSRANT01

FlSnNGTOl

FI2RNGTO

R9RNOT01

R8SNOTO2

HMC1NOT01

HUVELPBO1

HUVENOBOI

HUVESTBOÍ

HYPONO0O1

KIDNNQT01

UVRNOTO1

LUNG NOT01

MUSCNOT01

OVIONOB01

PANCNOTOI prruNOfloi pmjNOToi

PLACNO801

SiNTNOToa

SPLNFET01

SPVNNOTD2

STOWNOTDl

6YNORAB01

TBLYNOTD1

TESTNOTOI

THP1NOB01

THP1PEBO1

THP1PLBO1

U937NOT01 libname Inftamed adenoid Adrenal jland (0 Adrenal gland (T)

AWL blast eaUs (T) Bon· mano*

Bone mano* (T) Cardlao muaele (η Chin. hamaler ovaiy Comeal aroma Rbroblaet, AT 5 FibfofcJíít, AT 30 RbrobJasL AT RbroblasL uv 5 Fibroblíít, uv 30 Fibroblasl RbroblasL normál Mátl eeO Une HMC-1 HUVEC IFN.TNF, LPS HUVEC control HUVEC shear stře» Hypothalamus Wdney (T)

LiverfO Lung (T)

Skaletel muaele (T) Ovlduet

Panereas, normál Pltuitary (r)

PBullary (T)

Placenu

Smáli inteatíne (T) Spleen?liver, letel Spleen (T)

Slomach

Rheum. tyndvktm_

T + B lymphoblaet Teatia (TJ THP-l eonwl THPphorbol THP-1 photbol LPS U937, monoeytlc louk

number tibrary	d	af z r	enlry	deaerlptor	ríatariarart	rfend
2304	U837NOTOI	E	H	C C T	HUMEF1B	Eiongallon laelor 1-bela	0·	0	773
3240	HMC1NOT01	E	H	C C T	HUMEF1B	Elongalien laelor 1«beta	0	370	773
3269	HMC1NOT01	E	H	C C T	HUMEF1B	Elongation laetor i-beta	0	371	773 .
4693	HMC1NOTO1	E	K	C C T	HUMEFlB	Elongation laetor 1-bata	0	470	773
1989	HMC1 ΝΟΤΟΙ	E	H	C C T	HUMEF1B	Elongation laetor i-beia	0	327	773	A
9139	HMC1 ΝΟΤΟΙ	E	H	C C T	HUMEF18	Elongatloft laetor i-beia	0	375	773

1' <?£

	<
-o	i—
XJí
ř—'	to
	—1 2 O < —s

T?

X?

CTC

X o

O 55

- £ c O

o
	C3
;—	o
	CZM r—
(jO-	O

o n<

cn

PATENT

Claims (10)

1. Způsob analýzy vzorku obsahujícího genové transkripty, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

a) získání první směsi mRNA,

b) přípravy cDNA kopií této mRNA,

c) izolace reprezentativní populace klonů transfekovaných touto cDNA a vytvoření první knihovny biologických sekvencí z této řečené populace,

d) generování prvního souboru genových transkriptů, kde každý z prvních genových transkriptů v řečeném prvním souboru je indikativní pro jednu různou biologickou sekvenci z první knihovny, a dále kde jsou genové transkripty odvozeny z 5' konce cDNA,

e) zpracování prvních genových transkriptů v programovaném počítači, v němž je uložena databáze referenčních sekvencí transkriptů indikativní pro referenční biologické sekvence, ke generování první hodnoty identifikované sekvence pro každý z prvních genových transkriptů, kde každá řečená hodnota identifikované sekvence je indikativní pro anotaci sekvence a stupeň shody mezi jedním z druhých genových transkriptů a přinejmenším jedním z referenčních genových transkriptů , a

f) zpracování každé řečené druhé hodnoty identifikované sekvence za generování druhých konečných hodnot dat indikativních pro počet, v kterém je každá druhá hodnota identifikované sekvence přítomná v druhé knihovně biologických sekvencí.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že první knihovna biologických sekvencí zahrnuje alespoň 5 000 sekvencí získaných z linie lidských buněk.

1, vyznačující

3. Způsob podle nároku tím, že dále zahrnuje

g) získání druhé směsi mRNA z druhé linie lidských buněk,

h) přípravy cDNA kopií této mRNA,

i) izolace reprezentativní populace klonů transfekovanýqh touto cDNA a vytvoření druhé knihovny biologických sekvencí z této populace,

j) generování druhého souboru genových transkriptů, kde každý z druhých genových transkriptů v řečeném druhém souboru indikativní pro jednu různou biologickou sekvenci z druhé knihovny,

k) zpracování druhých genových transkriptů v programovaném počítači, v němž je uložena databáze referenčních sekvencí transkriptů indikativní pro referenční biologické sekvence, ke generování druhé hodnoty identifikované sekvence pro každý z druhých genových transkriptů, kde každá řečená druhá hodnota identifikované sekvence je indikativní pro anotaci sekvence a stupeň shody mezi jedním z prvních genových transkriptů a přinejmenším jednou z referenčních sekvencí transkriptů , a

f) zpracování každé řečené hodnoty identifikované sekvenče za generování prvních konečných hodnot dat indikativhích pro počet, v kterém je každá první hodnota identifikované sekvence přítomná v první knihovně biologických sekvencí.

4. Způsob podle nároku 3, vyznaču tím, že dále zahrnuje

m) zpracování prvních konečných hodnot dat konečných hodnot dat z 1) za generování hodnot transkriptů, kde každá řečená hodnota podílu je rozdíl v počtech genových transkriptů mezi a druhou směsí mRNA.

JÍCÍ z f) a druhýčh podílů genových indikativní pro první směsí mRNA

5. Způsob podle nároku 3, v tím, že dále zahrnuje

n) odečtení prvních konečných konečných hodnot dat z 1) za získání přičemž první směs mRNA je pacienta a druhá směs mRNA je pacienta.

č u j ící dat z f) od druhých hodnot rozdílů, ze zdravého lidského z nezdravého lidského y z n a hodnot souboru získána získána

6.

tím, primerů

Způsob podle nároku ž e cDNA kopie se

1, vyzná připravuj i s čující se použitím náhodných

7. Způsob kvantifikace relativní hojnosti mRNA v biologickém vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

a) izolace populace mRNA transkriptů z biologického vzorku,

b) identifikace genů, z nichž byla mRNA transkribována pomocí sekvenčně specifické metody,

c) stanovení počtů mRNA transkriptů, odpovídajících každému z těchto genů, a

d) použití počtů mRNA transkriptů ke stanovení relativní hojnosti mRNA transkriptů v populaci mRNA transkriptů.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že dále zahrnuje

e) vytvoření obrazu genových transkriptů, založeného na datech o relativní hojnosti mRNA transkriptů v populaci mRNA transkriptů,

f) porovnání obrazu transkriptů z e) s obrazem genových transkriptů, odvozeným z chorobného biologického vzorku nebo normálního biologického vzorku.

9. Způsob vytvoření obrazu genových transkriptů, vyznačující se tím,že zahrnuje kroky

a) izolace směsi mRNA z biologického vzorku,

b) přípravy cDNA kopií této mRNA,

c) inzerce této cDNA do vhodného vektoru a transfekce buněk vhodného hostitelského kmene a nárůstu klonů, kde každý klon reprezentuje jedinečnou mRNA,

d) izolace reprezentativní populace alespoň 5 000 rekombinantních klonů,

e) identifikace amplifikováných cDNA z každého klonu v populaci sekvenčně specifickou metodou, která identifikuje gen, z kterého byla mRNA transkribována,

f) stanovení počtu, kolikrát je každý gen zastoupen v populaci klonů, jako ukazatele relativní hojnosti, a

g) seřazení genů a jejich relativních hojností v pořadí hojnosti, a tímto vytvoření obrazu genových transkriptů.

10. Způsob podle nároku 9, vy tím, že dále zahrnuje

h) porovnání obrazu transkriptů transkriptů, odvozeným z chorobného normálního biologického vzorku.

znacujici se z e) s obrazem genových biologického vzorku nebo γο·

Spolupracovník číslo jméno adresa telefon fax