CN114921560A - 一种肝纤维化和肝癌无创生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝纤维化和肝癌无创生物标志物，属于生物医药技术领域。本发明公开了ELF3基因作为无创生物标志物在制备诊断肝纤维化和/或肝癌产品中的应用，该产品包括检测ELF3基因表达量的试剂盒或试剂。本发明实验标本易得，不需复杂的处理，实验过程简单易操作。并且本发明提供一种用于诊断肝纤维化和肝癌的无创生物标志物ELF3基因，其可以帮助肝纤维化和肝癌患者进行早期诊断，对及时阻断病情恶化，尽早治疗肝纤维化和肝癌有着重要的临床意义。ELF3基因的特异性改变为肝纤维化和肝癌的诊断提供了新的参考依据，可作为肝纤维化和肝癌的诊断生物标志物，为临床肝纤维化和肝癌的早期诊断和预后评估提供了新的方向。

Description

一种肝纤维化和肝癌无创生物标志物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种肝纤维化和肝癌无创生物标志物。

背景技术

肝脏长期的慢性炎性病变引起的肝纤维化是导致肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)发生的最主要的诱因。肝纤维化是由于肝脏持续受到如病毒感染、酒精滥用等原因，进而活化肝脏中的肌成纤维细胞分泌细胞外基质蛋白，导致细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)的过度沉积和分布异常，产生纤维性瘢痕，是一种肝脏针对慢性肝损伤的创面愈合反应过程，其后果是肝功能的丧失和肝脏结构的破坏。肝纤维化是慢性肝病向肝硬化、HCC发展的关键步骤，是影响慢性肝病预后的重要因素。如果在此期间积极治疗，肝纤维化在组织学上是可逆的，但当纤维化发展到肝硬化阶段时，逆转非常困难，导致不良预后。

已有的研究表明，大约90％的肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)患者与肝硬化有关。无论哪种原因诱发的肝硬化都是导致HCC发生的危险诱因，其中酒精性肝硬化仅占肝癌病例的15-30％，HCC仍是肝硬化患者死亡的主要原因。慢性肝病患者持续的肝脏炎症和纤维化，可导致肝硬化，进一步形成发育不良的结节，即癌前病变，结节内异常增生的细胞具有增殖、侵袭和生存优势，并最终完成向HCC的转变。

传统上肝纤维化的诊断是通过肝活检进行的，这是目前诊断的黄金标准，是一种有潜在并发症的侵入性手术，如疼痛(20％)和出血(0.5％)。除潜在并发症外，肝活检还受到抽样误差、肝病病因和观察员内部和观察员之间差异等诸多因素限制。由于肝活检的这些局限性，许多非侵入性肝纤维化评估工具已经被开发出来，如基于成像技术测量肝脏硬度作为纤维化的替代指标，包括基于超声和核磁共振成像的方法。然而，考虑到成本和前期资金投资的要求，这些成像方式的可用性仅限于某些临床环境且这些非侵入诊断需要对照肝活检进行验证。以实验室为基础的肝纤维化血清学标志物检测由于操作简便，无创，更为临床广泛接受和使用，通过受试者工作曲线下面积来评估检测指标的敏感性和特异性，目前使用最多的如：转氨酶/血小板比率指数(APRI)、纤维化-4评分(FIB-4)和γ-谷氨酰转肽酶与血小板比率(GPR)等。虽然基于血清生物标志物的诊断更便宜且更容易被患者接受，但迄今为止，没有一个指标被认为是标准的，它们不能对纤维化等级分层、预测能力有限并且可能导致假阳性错误，仍然需要筛选更为理想的肝纤维化血清生物标志物。

当前，临床上仍然缺乏能同时作为肝纤维化和肝癌发生的生物标记物，因此，迫切需要寻找新的生物标记物，作为肝纤维化和HCC早期筛查的标记物，为肝细胞癌的早期防治提供新思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝纤维化和肝癌无创生物标志物，以解决上述现有技术存在的问题，ELF3指标可以诊断肝纤维化和肝癌，为肝纤维化和肝癌的早期防治提供新的诊断靶点。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供ELF3基因作为无创生物标志物在制备诊断肝纤维化和/或肝癌产品中的应用。

进一步地，所述产品包括检测ELF3基因表达量的试剂盒或试剂。

进一步地，所述试剂盒或试剂包括检测ELF3基因表达量的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

进一步地，所述产品以血液为待测样本，利用权利要求3中所述引物组检测待测样本中ELF3基因表达量以诊断肝纤维化和/或肝癌。

本发明还提供一种用于诊断肝纤维化和/或肝癌疾病的试剂盒，包括检测ELF3基因表达量的引物组。

进一步地，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明公开了以下技术效果：

本发明实验标本易得，不需复杂的处理，实验过程简单易操作。并且本发明提供一种用于诊断肝纤维化和肝癌的无创生物标志物ELF3基因，其可以帮助肝纤维化或肝癌患者进行早期诊断，对及时阻断病情恶化，尽早治疗肝纤维化或肝癌有着重要的临床意义。ELF3基因的特异性改变为肝纤维化和肝癌的诊断提供了新的参考依据，可作为肝纤维化和肝癌的诊断生物标志物，为临床肝纤维化和肝癌的早期诊断和预后评估提供了新的方向。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为三组肝纤维化小鼠模型的血液和组织转录组测序共同差异基因的交集情况；

图2为在线数据集验证血液样本中共同差异基因表达；A：E-MTAB-6863肝纤维化数据集；B：GSE84044肝纤维化数据集；C：TCGA-LIHC肝细胞癌数据集；

图3为血液样本RNA代表性琼脂糖凝胶电泳图；A：正常人血RNA电泳图；B：肝纤维患者血RNA电泳图；C：肝癌患者血RNA电泳图；

图4为ELF3在各样本类型中扩增曲线和熔解曲线；A：正常人血样；B：肝纤维化患者血样；C：肝癌患者血样；

图5为RT-qRCR验证核心基因在肝纤维化、肝癌患者血液中的表达差异；A：正常人与肝纤维化患者血液核心基因差异表达；B：正常人与肝癌患者血液核心基因差异表达；C：肝纤维化与肝癌患者血液核心基因差异表达；

图6为RT-qRCR进一步验证核心基因在肝癌术前及总肝癌患者血液中的表达差异；A：ELF3在正常人与肝癌术前血液样本中表达差异；B：GPNMB在正常人与肝癌术前血液样本中表达差异；C：ELF3在正常人与总肝癌血液样本中表达差异；D：GPNMB在正常人与总肝癌血液样本中表达差异；

图7为核心基因ROC曲线分析；A.：ROC曲线分析评价肝纤维化检验效能；B：ROC曲线分析评价肝癌检验效能。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所使用的材料、仪器及试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。

一、药物诱导C57小鼠肝纤维化模型的构建

1.实验动物

购买自广西医科大学实验动物中心，动物品系为C57BL/6雄性小鼠，6周龄，体重18±2g。

2.实验方法

2.1C57BL/6小鼠的饲养

C57BL/6雄性小鼠饲养根据国际相关的条例要求及广西医科大学伦理学的相关规定。饲养于广西医科大学普通级动物房，实行12小时光照和12小时黑暗循环。每笼6-8只小鼠，鼠笼规格为20×40cm，小鼠生长环境为恒温25℃，湿度控制在30％至60％。每3-4天更换垫料一次。

2.2药物诱导C57BL/6小鼠肝纤维化

(1)使用耳标钳给每只小鼠在耳朵处打耳标进行标记。

(2)按随机分组原则，将C57BL/6随机分成6组，每组12只。依次是WT组、NaCl组、橄榄油组、AAP组、CCl4组和DEN组。

(3)配制腹腔注射药物：电子天平称取AAP药物粉末溶于生理盐水中，混匀配制成浓度为150mg/10mL的AAP溶液，用微波炉加热至药物溶解；CCl4溶液用医用橄榄油做溶剂配成20％。DEN溶液用生理盐水做溶剂配成1μg/μL。

(4)C57BL/6小鼠给药方式、剂量及频率：野生型WT组不给予药物处理；NaCl和橄榄油组分别按小鼠当日体重给药：每5μL/g；AAP组按照体重300μg/g量进行注射，CCl4组按照体重4μL/g量进行注射，DEN组则按照5μL/g量进行注射。所有组给药方式均为腹腔注射给药，给药频率为两天一次，药物处理6周后，AAP，CCl4和DEN三种化学药物成功构建出小鼠肝纤维化模型。

二、转录组测序挖掘肝纤维化相关基因

1.方法

1.1小鼠血样转录组测序样本前处理

(1)收集正常组、AAP、CCl4和DEN药物组处理六周后小鼠血液样本，计划各取3只，测序鉴定后合格样本数量不足再补充。

(2)血液收集采用小鼠眼球取血法，可收集大约1mL血液于EDTA抗凝采血管中。

(3)加入5倍体积1xRBC Lysis Buffer，颠倒混匀5-10次。

(4)冰上放置10-15min，其间颠倒混匀两次，观察血液由雾状变成透明即可。

(5)4℃，500xg离心10min，小心弃去上清液。

(6)加入2倍体积1xRBC Lysis Buffer，短暂涡旋重悬细胞。

(7)4℃，500xg离心10min，小心弃去上清液。残液不超过100μL。

(8)涡旋10sec，松散白细胞沉淀。立即加入0.5mLInvitrogen TRIzol试剂至白细胞沉淀中。涡旋重悬细胞。

(9)收集好的血液样本，放于干冰中运送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行转录组测序，测序深度为6G。

1.2小鼠肝组织转录组测序样本前处理

(1)收集正常组、AAP、CCl4和DEN药物处理六周后小鼠肝脏组织。计划各取3只，测序鉴定后合格样本数量不足再补充。

(2)分离肝组织后，快速用1xPBS清洗，以去除血渍和污物。

(3)将肝组织剪成黄豆大小，放于研钵中，倒入液氮速冻肝组织。

(4)肝组织样本速冻后立即放于负80℃冰箱，运输时放于干冰中运送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行转录组测序。

1.3转录组测序数据处理

(1)使用Illumina Hiseq测序平台得到原始数据，使用FastQC对样本的测序数据质量进行评估，使用Trimmomatic进行数据处理。三种药物处理组的血液和组织分别与野生型血液和组织比对，共有六种比对方案：AAP b VS WT b、CCl4 b VS WT b、DEN b VS WT b、AAP t VS WT t、CCl4 t VS WT t、DEN t VS WT t(b：血液，t：组织)。对于有生物学重复的样本，差异基因我们采用DESeq R包进行分析。为了得到显著差异的基因，我们将筛选条件设为：p值<0.05且差异倍数|FoldChange|>1.5。

(2)使用Upset R包和ggplot R包绘制upset图和韦恩图进行差异基因交集可视化。

(3)差异基因的GO、KEGG富集分析，使用org.Hs.eg.db R包进行ID转换，ClusterProfiler包用于富集分析。p值<0.05被视为有意义。

1.4数据集收集

(1)基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)首页(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)搜索：“GSE84044”，下载GSE84044-series-matrix.txt.gz文件和GPL570测序平台[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0Array文件。GSE84044数据集包括124名慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的肝活检样本。病理scheuer scores评分可作为评估每个样本肝纤维化严重程度的指标，该数据集包含了43例scheuer scores为0无纤维化患者和81例scheuer scores为1-4的纤维化患者。

(2)从欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所(European MolecularBiology Laboratory-European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI)网站下载：E-MTAB-6863-raw-counts.tsv、E-MTAB-6863-experiment-design.tsv文件(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-6863)。E-MTAB-6863数据集收集了不同病因(HCV或脂肪肝(fatty liver disease，FLD))和纤维化阶段(n＝69)的患者的肝活检组织。根据病理fibrosis stage评分，该数据集包含了12例无纤维化fibrosis score为0患者和57例fibrosis score为1-4纤维化患者。

(3)癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)首页(https://portal.gdc.cancer.gov/)，点击Repository，Cases栏下拉Primary Site选择liver andintrahepatic bile ducts；Program选择TCGA；Project选择TCGA-LIHC。Files栏下拉DataCategory选择transcriptome profiling；Data Type选择Gene ExpressionQuantification；Experimental Strategy选择RNA-Seq；Workflow Type选择HTSeq-FPKM。点击Add All Files to Cart,下载Cart格式。该数据集包含了374个肝细胞癌和50个正常肝组织的转录组测序表达谱。

(4)数据集的ID转换和整编使用R 4.0.2和Strawberry Perl完成。基因在各分组样本间的差异分析使用ggpubr R包完成，统计方法采用wilcox秩和检验。显著性用p值表示：p<0.05为*；p<0.01为**；p<0.001为***；p<0.0001为****。

2.结果

2.1肝组织转录组测序差异基因分析

收集野生小鼠和各药物处理六周后小鼠肝组织和血液样本进行转录组测序。将野生组与各处理组的血液和组织样本分别进行比对，得到六种比对方案(见表1)。样本质量经检验合格，能进行测序后方纳入计算。差异基因的统计学阈值采用|FoldChange|>1.5，p值<0.05。总体上，上调基因数目多于下调基因数目。接下来我们对各组差异基因取交集，试图找到三种不同药物诱导肝纤维化模型中与肝纤维化相关的血液和组织共同差异基因。各药物组与野生组组织样本比对共得252个差异基因，血液样本比对得到44个差异基因。如图1和表2可见，基因Krt18、Aif1l、Gpnmb、Mgll、Elf3、Enc1、Cacna2d4、Gins2和Pls1等九个基因在表1六种比对方案中任五种都存在差异。

表1转录组测序差异基因分析

差异基因统计学阈值采用：|FoldChange|>1.5，p值<0.05；b：血液；t：肝脏组织。

表2血液和组织转录组测序共同差异基因分析结果

血液和组织共同差异基因为表1中六种比对方案中任五种存在差异即可。

2.2在线数据集验证基因表达

如表3所示，从EMBL-EBL和GEO数据库下载了由不同病因(HBV、HCV感染和脂肪肝)造成的慢性肝病患者肝组织样本转录组测序数据集。根据病理活检对肝纤维化程度进行评分，以此分为正常组(纤维化评分0级)和纤维化组(纤维化评分1-4级)。从TCGA下载TCGA-LIHC涉及374个肝细胞癌和50个正常组织的转录组测序数据集。分别将上述表2中转录组筛选到的9种小鼠血液和组织转录组测序共同差异基因进行数据集基因表达验证。如图2所示，发现在血液和组织样本：ELF3/GPNMB/KRT18这三个基因在人肝纤维化样本中表达量高于正常组，且ELF3和GPNMB在肝细胞癌组织中高于正常组织。后续将ELF3、GPNMB和KRT18这三个基因视为肝纤维化和肝癌相关核心基因，用于后续鉴定。

表3人纤维化相关在线数据集

三、临床样本验证基因表达

1.实验方法

1.1临床样本收集

从广西医科大学附属医院和附属肿瘤医院收集肝纤维化四项：III型前胶原，IV型胶原，层粘连蛋白，透明质酸均正常的体检病人患者血液15例；经病理活检证实为肝纤维化甚至肝硬化的肝纤维化患者血液22例、肝细胞癌患者血液16例和未经治疗的肝细胞癌患者血液10例。本研究经广西医科大学伦理委员会批准(批准文号:20200035)。所有人体组织标本的处理都严格遵守《赫尔辛基宣言》中的道德准则。所有患者均提供知情同意。

1.2血样样本总RNA提取

(1)在15mL离心管中，根据血量，加入5倍体积的已稀释好的1xRBC Lysis Buffer工作液，颠倒混匀5-10次。

(2)于冰上放置15min，期间颠倒混匀两次，观察血液由雾状变为透亮溶液即可。

(3)4℃，500x g离心10min，小心弃去上清液。

(4)加入2倍体积1xRBC Lysis Buffer，涡旋使细胞重悬。

(5)4℃，500x g离心10min，小心吸弃上清，尽量保证残液不超过100μl。

(6)涡旋剧烈震荡底部白细胞沉淀，立即加入1mL MagZol Reagent至白细胞沉淀中，用移液枪抽打5-10次重悬细胞。

(7)室温静置10min，充分裂解细胞。

(8)加入100μL 1-Bromo-2chloropropane溶液至裂解液中，震荡器上剧烈震荡15sec，室温放置3min。

(9)4℃，12000x g离心15min。

(10)转移上清液至新的离心管中，加入等倍体积的已用无水乙醇配置好的BufferRW2，涡旋混匀15sec。

(11)把HiPure RNA Mini Column I装在2mL离心管中。将混合液分两次转移至柱子中，每次8000x g离心1min。

(12)弃去滤液把柱子装回收集管中，加入600μL Buffer RW2至柱子中，8000x g离心1min。

(13)弃去滤液把柱子装回收集管中，13000x g空离柱子3min使柱子基质甩干。

(14)将柱子转移至新的1.5mL离心管中，加入15μL RNase Free Water至柱子膜的正中央，室温放置5min，13000x g离心1min，RNase Free Water提前放至65℃水浴锅中预热。

(15)再次加入15μL预热的RNase Free Water至膜的正中央进行二次洗脱，室温放置5min，13000x g离心1min。

(16)弃去柱子，得到RNA样品。

1.3RNA浓度和纯度测定

(1)使用BioTek酶标仪的Take 3Trio Volume Plate可对RNA样品进行2μL体积的吸光度检测，对浓度进行定量。

(2)根据样本数目计算凝胶电泳所需孔数，选择合适的电泳制胶槽、梳子和电泳槽。安装固定好电泳装置。

(3)根据胶的大小，配置1％的琼脂糖凝胶，于电子天平称量所需琼脂糖粉末，用无菌水稀释好的1x TAE溶解。将琼脂糖溶液置于微波炉中中火加热至溶液沸腾，溶液澄清透亮即可，于室温降温。

(4)根据琼脂糖溶液加入10％的核酸染料，混匀，倒入制胶槽中。置于暗环境室温静置30min，等其凝固。

(5)凝胶凝固后，拔掉梳子，将凝胶转移到电泳槽中，往电泳槽倒入新鲜配置好的1x TAE溶液，淹没琼脂凝胶即可。为减少污染，可先用1x TAE溶液润洗电泳槽一遍。

(7)取2μL RNA溶液、3μL无菌水和1μL loading buffer按此体系配成上样溶液，按一定顺序点样，同时设置5μL的marker孔。

(8)根据凝胶大小，调节电泳仪的电压电流。20mL小块凝胶采用恒压80V，35min；40mL大块凝胶采用恒压100V，35min。

(9)电泳结束，使用凝胶成像仪观察电泳结果。

1.4 RNA逆转录合成cDNA

(1)去除基因组DNA反应：按表4所示，在冰上配制反应体系，根据后续实验计算样品所需反应数，按反应数+2配制每个样品的总反应体系，混匀后分装，最后加入各自RNA样品。

表4去除基因组DNA反应体系

(2)分装于PCR小管后，短暂离心，避免气泡。设定PCR程序：42℃，2min。于PCR仪器中反应。

(3)逆转录反应：按下表5，根据反应数+2冰上配制总体系，混匀后取10μL加入到(2)中各PCR小管中。

表5逆转录反应体系

(4)轻柔短暂离心混匀后，避免产生气泡，于PCR仪中37℃15min，85℃5sec反应。反应结束后，得到cDNA，置于负80℃长期保存。

1.5荧光定量PCR反应

(1)根据基因物种、基因和实验目的设计如下引物，引物设计遵循以下原则：引物长度一般在15-30bp；CG含量一般在40-60％；引物Tm值一般在55℃-65℃，前后引物Tm值相差大于5℃；产物长度小于150bp。最终本实验所涉及引物序列见下表6：

表6引物序列

(2)按表7所示，配制荧光定量PCR反应体系，每个样品做3个复孔。

表7荧光定量PCR反应体系

(3)分装20μl于八连PCR管中，轻轻混匀避免气泡，采用两步法PCR扩增标准程序：第一阶段：预变性(95℃，30sec，循坏一次)；第二阶段：PCR反应(95℃，5sec、60℃，34sec，循坏40次)。最后在仪器程序设置上添加溶解曲线：Melting Curve。

1.6荧光定量PCR结果处理

(1)通过RT-qRCR仪器，获得各组每个样本各分子的Ct复孔均值。

(2)计算各组每个样本各靶标分子的ΔCt值：各组每个样本各靶标分子的Ct值-同一样本内参分子的Ct值。

(3)计算对照组中所有样本各靶标分子的ΔCt均值。

(4)计算各组各样品各个靶标分子的ΔΔCt值：各组各样品各个靶标分子的ΔCt值-对照组中所有样本靶标分子的ΔCt均值。

(5)计算各组各样品各靶标分子对应的相对表达(2^-ΔΔCt)

(6)通过GraphPad软件绘制柱状图，统计分析采用两独立样本T检验比较差异基因在两组样本的相对表达情况。显著性用p值表示：*：p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001；****:p<0.0001。

1.7ROC分析核心基因检验效能

(1)将样本类型和各指标相对表达量(2^-ΔΔCt)，导入SPSS软件中。

(2)选择“分析”-“分类”-“ROC曲线”

(3)将各指标相对表达量作为检验变量，将样本类型作为状态变量。

(4)输出结果，可得到曲线下面积和各坐标点

(5)将坐标点复制到excel中，计算约登指数。约登指数＝灵敏度+特异度-1＝灵敏度-(1-特异度)，选择约登指数最大值作为最佳临界点，对应的结果为cut-off值。

2.实验结果

2.1血液样本RNA电泳图

对提取的RNA质量进行琼脂糖电泳评估，如图3所示，各组样本RNA的电泳能看见三条带：5S、18S和28S。其中28S条带亮度最亮，18S条带次之，5S条带最暗。28S条带亮度约为18S的两倍，未见条带拖尾等降解现象。说明RNA的提取质量较高，可用于后续实验。

2.2 RT-qRCR检测各组血液样本核心基因表达量

RT-qRCR实验处理之前，对数据结果质量进行分析，如图4所示，各组ELF3基因的扩增曲线平滑，呈S型。熔解曲线呈单峰，无非特异扩增。可用于数据处理。如图5所示，将正常组各基因表达分别与肝纤维化患者和肝癌患者比较，发现基因GPNMB在肝纤维化患者和肝癌患者血液中表达量均高于正常人，且在肝纤维化患者血液表达量高于肝癌患者；ELF3在肝纤维化患者血液中表达量高于正常人，在肝癌患者血液中表达量有增高趋势；而KRT18基因在三组间表达无明显差异。

考虑到核心基因表达可能与肝癌患者是否进行手术相关，本课题组进一步收集了10例肝癌患者术前样本，如图6A-B所示，发现ELF3和GPNMB在肝癌患者术前血液中表达量高于正常人血液(p<0.05)。汇总之前收集的16例肝癌样本和10例已知肝癌术前样本，如图6C-D所示，差异分析发现ELF3在正常人血液与肝癌患者血液中差异表达，从无明显差异转变为高表达(p<0.05)。推测肝癌患者术前状态与ELF3和GPNMB的高表达有关。上述结果可见，基因ELF3和GPNMB有望成为同时诊断肝纤维和肝癌的无创生物标志物。

3.ELF3指标敏感性和特异性检验

为评估GPNMB和ELF3作为肝纤维和肝癌的诊断标志物的潜力，采用受试者工作特征曲线(ROC)进行分析，明确新型标志物能否成为新的肝纤维和肝癌诊断标志物应用于临床。

如图7A所示，发现ELF3、GPNMB、和KRT18检验肝纤维化的AUC值分别是0.694、0.936和0.635，ELF3 AUC值接近0.7，GPNMB AUC值甚至超过0.9，具有一定的检验效能。表8为三个基因评价肝纤维化检验效能相关指标结果。ELF3和GPNMB的特异度都接近1。如图7B所示，ELF3和GPNMB检验肝癌的AUC值分别是0.687和0.814。表9为ELF3和GPNMB检验肝癌检验效能相关指标。

表8核心基因检验肝纤维化效能

表9核心基因检验肝癌效能

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广西医科大学

<120> 一种肝纤维化和肝癌无创生物标志物

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaaactcac ggaccactcg 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatggctgac aatacaccaa aac 23

Claims (6)

1.ELF3基因作为无创生物标志物在制备诊断肝纤维化和/或肝癌产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测ELF3基因表达量的试剂盒或试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒或试剂包括检测ELF3基因表达量的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品以血液为待测样本，利用权利要求3中所述引物组检测待测样本中ELF3基因表达量以诊断肝纤维化和/或肝癌。

5.一种用于诊断肝纤维化和/或肝癌疾病的试剂盒，其特征在于，包括检测ELF3基因表达量的引物组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。

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