CZ203998A3 - Způsob přípravy 2,4-dihydroxypyridinu a 2,4-dihydroxy-3-nitropyridinu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobů přípravy 2,4-dihydroxypyridinu a 2,4-dihydroxy-3-nitropyridinu, sloučenin které jsou vhodné jako meziprodukty pro přípravu adenosinových sloučenin a jejich analogů, které jsou vhodné pro léčení hypertense a myokardiální ischemie, slouží jako kardioprotektivní prostředky pro zlepšení následků poškození ischemií nebo velikosti infarktu myokardu vyplývajících z myokardiální ischemie, dále slouží jako antilipolytické prostředky které snižují hladiny lipidů v plasmě, hladiny triglyceridů v séru a hladiny cholesterolu v plasmě.

Dosavadní stav techniky

Hypertense

Hypertense je stav se zvýšeným krevním tlakem, který postihuje značný podíl lidské populace. Následky trvalé hypertense zahrnují vaskulární poškození očního, ledvinového, srdečního a mozkového systému a riziko těchto komplikací se zvyšuje se zvyšujícím se krevním tlakem. Základní faktory řídící krevní tlak zahrnují srdeční výstup a periferní vaskulární odpor přičemž uvedený druhý faktor je hlavním společným mechanismem, který je řízen různými vlivy. Sympatický nervový systém reguluje periferní vaskulární odpor přímými účinky na alfa- a beta-adrenergní receptory a rovněž nepřímými vlivy na uvolňování reninu. Terapie léčivy je zaměřena na specifické složky těchto regulačních systémů krevního tlaku s různým mechanismem účinku podle kterého je definováno několik tříd léčiv, které zahrnují diuretika, antagonisty beta-adrenergního receptorů ··· · · · · · · · (beta blokátory) , inhibitory angiotenzin-konvertujíciho enzymu (inhibitory ACE) a antagonisty vápníkového kanálu.

Diuretika thiazidového typu se používají při hypertensi ke snížení periferního vaskulárního odporu na základě jejich účinků na vylučování sodíku a vody. Tato třída léčiv zahrnuje hydrochlorthiazid, chlorthiazid, methyklothiazid, a cyklothiazid a rovněž příbuzné prostředky jako indapamid, metazolon a chlorthalidon. Ačkoliv se dříve předpokládalo, že mechanismus působení beta blokátorů spočívá v blokování betai-adrenergního subtypu receptorů v srdci se snížením srdeční frekvence a srdečního výstupu, novější beta blokátory s vlastní sympatomimetickou aktivitou (ISA), které zahrnují pindolol, acebutolol, penbutolol, a karteolol jsou účinné jako ne-ISA beta blokátory, vyvolávající menší snížení srdeční frekvence a srdečního výstupu. Další předpokládaný mechanismus účinku těchto léčiv zahrnuje inhibici uvolňování reninu, centrální mechanismus a účinky na presynaptické beta-adrenergní receptory s následnou inhibici uvolňování norepinefřinu, Kardioselektivní beta blokátory, metaprolol (Lopressor-Geigy), acebutolol (Sectral-Wyeth), a atenolol (Tenormin-ICI), mají větší účinek na betaι-adrenergní receptory než na subtypy beta2^_adrenergního receptorů umístěné v bronchiálních a krevních cévách.

Neselektivní beta blokátory působí na oba subtypy beta-adrenergních receptorů a zahrnují propranolol (Inderal-Ayerst), timolol (Blocadren-Merck), nadolol (Corgard-Squibb), pindolol (Visken-Sandoz), penbutolol (Levato 1-Hoechst-Rousse 1) a karteolol (Cartrol-Abbott) . Nežádoucí účinky beta blokátorů zahrnují asymptomatickou bradykardii, exacerbaci městnavého srdečního selhání, gastroinestinální poruchy, zvýšený odpor v dýchacích cestách, skryté symptomy hypoglykemie a deprese. Mohou také vyvolat zvýšení sérových triglyceridú a mohou snížit 1ipoproteinový cholesterol o vysoké • · • · ( : •Φ * ···· « · « * • ·· · · ·· · ··· · · · • · · · · · • · φ · w ·· r | «· hustotě.

Inhibitory ACE zabraňují tvorbě angiotensinu II a inhibují rozklad bradykininu. Angiotensin II je silný vasokonstriktor a také stimuluje uvolňování aldosteronu. Zablokováním systému renin-angiotensin-aldosteron tyto prostředky snižují periferní vaskulární odpor a rovněž retenci sodíku a vody. Kromě toho, inhibitory ACE zvyšují hladiny bradykininu a prostaglandinů, endogenních vasodilatatorů. Mezi hlavní inhibitory ACE patří kaptopril (Capoten-Squibb) a enalapril (Vasotec-Merck).

Nežádoucí účinky inhibitorů ACE zahrnují vyrážku, poruchy chuti, proteinurii a neutropenii.

Antagonisté vápníkového kanálu snižují vstupní tok vápníku do vaskulárních buněk hladkého svalstva a produkují systemickou vasodilataci s vyplývajícím antihypertensivním účinkem. Další účinky antagonistů vápníkového kanálu zahrnují interferenci s účinkem angiotentenzinu II a blokádou alfa₂-adrenergního receptorů, které mohou přispívat k jejich antihypertensivnímu účinku. Antagonisté vápníkového kanálu nemají nežádoucí metabolické a farmakologické účinky thiazidů nebo beta blokátorů a mohou proto být vhodné u pacientů trpících diabetem, periferní vaskulární chorobou nebo chronickou obstruktivní plicní chorobou. Dva antagonisté vápníkového kanálu, verapamil a diltiazem, mají vážné nežádoucí kardiovaskulární účinky na atrioventrikulární srdeční vedení u pacientů již majících abnormality vedení, a mohou zhoršit bradykardii, srdeční blok a městnavé srdeční selhání. Další menší vedlejší účinky antagonistů vápníkového kanálu zahrnují periferní edém, závrat, sklon k mdlobám, bolest hlavy, nevolnost a návaly, zejména pokud se týká nifedipinu a nikardipinu.

Pro léčení esenciální hypertense je k dispozici mnoho

9 9 · * β » '*·»«

Í* · ·1 · · · · · «·· 9 9 9 • · · · · · ·

X »·» * » ·· ·· « · dalších prostředků. Ty zahrnují prazosin a terazocin, antagonisty alfai-adrenergního receptorů, jejichž antihypertensivní účinky jsou způsobeny vzniklou arteriální vasodilatací; klonidin, alfa2-adrenergního agonistů který působí centrálně i periferně na alfa2~adrenegní receptory a snižuje sympatickou odezvu. Další centrálně působící prostředky zahrnují methyldopu, guanabenz a guanfacin; reserpin, který způsobuje vyčerpání zásobních katecholaminů; guanadrel, což je periferní adrenergní antagonista podobný guanethidinu s kratším trváním účinku; a přímo působící vasodilatátory jako je hvdralazin minoxidil. Tyto prostředky, ačkoliv jsou účinné, mají zřetelné symptomatické vedlejší účinky, které zahrnují reflexní sympatickou stimulaci a retenci tekutin, ortostatickou hypotenzi a impotenci.

Mnoho antihypertensiv aktivuje kompenzační presorové mechanismy, jako je zvýšené uvolňování reninu, zvýšené uvolňování aldosteronu, zvýšení sympatického vasokonstrikčního tonu, kde tyto mechanismy směřují k úpravě arteriálního tlaku na hodnoty před léčbou a mohou vyvolat retenci soli a vody, edém a nakonec mohou vést k toleranci na účinky prostředku. Dále díky zkušenostem s různými vedlejšími účinky současně používaných antihypertensiv a problémy spojenými se speciálními populacemi hypertensivních pacientů, které zahrnují starší lidi, černou populaci, pacienty s chronickou obstruktivní pulmonální chorobou, diabetem, nebo periferními vaskulárními chorobami, existuje potřeba dalších tříd léčiv pro léčení hypertense.

Ischemie

Myokardiální ischemie vzniká následkem nerovnováhy mezi přívodem kyslíku do myokardu a jeho potřebou a zahrnuje námahovou a vasospastickou myokardiální dysfunkci. Námahová ischemie je obvykle připisována přítomnosti kritických aterosklerotických stenóz zasahujících velké koronární arterie vyvolávajících snížení subendokardiálního toku. Vasospastická ischemie je spojována se spazmem ložiskového typu, jehož nástup nesouvisí s námahou nebo stresem. Tento spazmus je lépe definován jako náhlé zvýšení vaskulárního tonu. Mechanismy vasospastické ischemie zahrnují: (i) zvýšený vaskulární tonus v místě stenózy způsobený zvýšeným uvolněním kat echo 1aminu; (ii) přechodné ucpání vnitřní světlosti a (iii) uvolnění vasoaktivních substancí vytvořených krevními destičkami v místě endotheliálních lézí.

Koronární cirkulace je specifická v tom, že promývá orgán který dále generuje perfusní tlak pro celou cirkulaci. Zásahy, které změní stav periferní cirkulace a její kontrakt i 1 i tu mají tedy významný účinek na koronární cirkulaci. Regulační složku koronární vaskulatury tvoří malá koronární arteriola, která může ve velkém rozsahu měnit svůj vnitřní průměr. Změna tohoto vnitřního poloměru je výsledkem bud vlastní kontrakce cévního hladkého svalu (autoregulace) nebo extravaskulární komprese způsobená ventrikulární kontrakcí. Výsledný účinek terapií ischemie zahrnuje komplex interakcí protichůdných faktorů který určuje přívod a potřebu kyslíku.

Kardioprotekce a prevence ischemického poškození.

Vývoj nových terapeutických prostředků schopných omezit rozsah poškození myokardu, t.j.rozsah infarktu myokardu který vyplývá z akutní ischemie myokardu, je hlavním cílem moderní kardiologie.

Nástup trombolytické (rozpouštějící krevní sraženiny) terapie během poslední dekády prokazuje, že včasný zásah během srdečního záchvatu může významně snížit poškození tkáně myokardu. Ve velkých klinických studiích již bylo dokumentováno, že trombolytická terapie snižuje riziko vývoje poruch srdečního rytmu a rovněž udržuje schopnost srdce působit jako pumpa. Touto ochranou normální srdeční funkce se prokázalo, že dochází ke snížení dlouhodobé úmrtnosti po infarktu.

Při vývoji terapií schopných poskytnout další ochranu myokardu, při současné aplikaci s trombolytickou terapií nebo samostatně, bylo významné, že retrospektivní epidemiologické studie prokázaly, že mortalita v několika prvních letech po infarktu má vztah k původní velikosti infarktu.

V preklinických studiích infarktu, prováděných na různých modelech na zvířatech, bylo prokázáno, že mnoho typů farmakologických prostředků jako jsou blokátory vápníkového kanálu, analogy prostacyklinu, a prostředky schopné inhibovat určité metabolické systémy je schopno redukovat ischemické poškození u několika druhů zvířat.

V současných studiích se prokázalo, že vystavení myokardu krátkým periodám ischemie (přerušení krevního toku do srdce) po kterých následuje reperfuse (obnovení krevního toku) je schopné chránit srdce před následným ischemickým poškozením které by jinak mohlo vyplynout z následné expozice dlouhodobé ischemii. Tento jev je označován jako myokardiální prekondice a předpokládá se že částečně souvisí s uvolňováním adenosinu během období prekondice.

V dalších studiích bylo prokázáno, že adenosin a agonisté adenosinu snižují rozsah poškození tkáně ke kterému dochází po přerušení krevního toku do srdce na různých modelech ischemického poškození (viz například Toombs C. a sp., Myocardial protective effects of adenosin. Infarct size reduction with pretreatment and continued receptor stimulation during ischemia, Circulation 86,

Ί pretreatment with infaretion,

986-994 (1992); Thornton J. a sp., Intravenous A-^-selective analogs protects the heart against Circulation 85, 659-665 (1992); a Downey J., Ischemie preconditioning-nature's own cardioprotective intervention, Trends Cardiovasc. Med., 2(5), 170-176 (1992)).

Způsoby podle vynálezu se připraví meziprodukty, které jsou vhodné pro přípravu sloučenin které napodobují myokardiální prekondici a tak zlepšují stav ischemického poškození nebo poskytují snížení velikosti infarktu myokardu vyplývajícího z ischemie myokardu a jsou vhodné jako kardioprotektivní prostředky.

Antilipolysa

Hyperlipidemie a hypercholesterolemie jsou známé jako dva hlavní rizikové faktory aterosklerosy a koronární srdeční choroby, které jsou hlavní příčinou úmrtí a neschopností v západních zemích. Ačkoliv etiologie aterosklerosy je vícefaktorová, vývoj aterosklerosy a stavů zahrnujících chorobu koronárních arterií, periferní vaskulární chorobu cerebrovaskulární chorobu vyplývá z omezeného krevního toku a tyto stavy jsou rovněž spojeny s abnormalitami v hladinách sérového cholesterolu a hladinami lipidů. Etiologie hypercholesterolemie a hyperlipidemie je především genetická, ačkoliv přispívat mohou i faktory zahrnující příjem nasycených tuků a cholesterolu v potravě.

Antilipolytická aktivita adenosinu a analogů adenosinu vyplývá z aktivace subtypu receptoru Aj (Lohse M.J. a sp., Recent Advances in Receptor Chemistry, Melchiorre C. and Gianella, Eds, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1988, 107-121). Stimulace tohoto subtypu receptoru snižuje koncentraci ι φ · ·· · · * » · · · · · · · * Λ · ·» * · · • · «· , · · · ·· ·· intracelulárního cyklického AMP v adipocytech. Cyklický AMP je nutný ko-faktor pro enzym 1ipoproteinlipasu, který hydrolyticky štěpí v adipocytech triglyceridy na volné mastné kyseliny a glycerol (Egan J.J. a sp., Proč.Nat1.Acad.Sci., 1992 (89), 8357-8541). Podle tohoto, snížení koncentrace intracelulární cyklické AMP v adipocytech snižuje aktivitu 1ipoproteinlipasy a tím také hydrolýzu triglyceridů.

Zvýšený krevní tlak a hladina lipidů v plasmě, včetně triglyceridů, jsou dva akceptované rizikové faktory související s mortalitou vyplývající z kardiovaskulárních chorob.

U diabetických pacientů, u kterých pravděpodobnost mortality následkem kardiovaskulární choroby je podstatně větší, je riziko spojené s těmito faktory dále zvýšeno (Bierman E.L.,

Arteriosclerosis and Thrombosis 1992 (12), 647-656). Navíc z údajů vyplývá, že nadměrná lipolysa je charakteristická pro ne-insulin závislý diabetes a pravděpodobně přispívá k rezistenci na insulin a hyperglykemii ( Swislocki A.L., Horm.Metab.Pes.,

1993 (25), 90-95).

Způsoby podle vynálezu se připraví meziprodukty, které jsou vhodné pro přípravu sloučenin sloužících jako antihypertensivní a anti 1ipolytické prostředky a které jsou vhodné pro léčení a zlepšování jak vaskulárních tak metabolických rizikových faktorů.

Adenosinové sloučeniny a jejich aktivita

Adenosin má více různých fyziologických a farmakologických účinků, které zahrnují průvodní změnu kardiovaskulární a renální funkce. U zvířat i u člověka vyvolá intravenósní injekce adenosinnukleotidu hypotensi.

Fyziologické a farmakologičké účinky adenosinu jsou zprostředkovány specifickými receptory umístěnými na buněčném povrchu. Byly identifikovány dva subtypy receptorů adenosinu, které jsou označovány jako receptory Ai a A2. Receptor Ai inhibuje tvorbu cAMP potlačením aktivity adenylat-cyklasy, zatímco stimulace receptorů A2 zvyšuje aktivitu adenylat cyklasy a intracelulární cAMP. Každý receptor se zdá být určen ke zprostředkování specifických účinků adenosinu v různých tkáních: například vaskulární účinky adenosinu se zdají být zprostředkovány stimulací receptorů A2, což podporuje pozitivní korelace mezi tvorbou cAMP a vasorelaxací v adenosinem ošetřeném izolovaném vaskulárním hladkém svalu; zatímco stimulace srdečních Ai receptorů snižuje tvorbu cAMP v srdci což přispívá k negativním dromotropním, inotropním a chronotropním srdečním jevům. Proto, na rozdíl od většiny vasodilatatorů, podání adenosinu nevyvolává reflexní tachykardii.

Adenosin má také významný vliv na renální funkci. Intrarenální infuse adenosinu způsobí přechodné snížení renálního průtoku krve a zvýšení renálního vaskulárního odporu. S pokračující infuzí adenosinu se renální průtok krve vrací na regulované hodnoty a renální vaskulární odpor se sníží. Počáteční renální vasokonstrikční odezvy na adenosin nejsou způsobeny přímým vasokonstrikčním účinkem nukleotidu, ale zahrnují interakci mezi adenosinem a systémem renin-angiotensin.

Adenosin je v širokém smyslu pokládán za primární fyziologický mediátor reaktivní hyperemie a autoregulace koronárního řečiště v odezvě na myokardiální ischemií. Bylo zveřejněno, že koronární endothelium obsahuje receptory A2 adenosinu spojované na adenylat-cyklasu, které jsou aktivovány současně se zvyšujícím se koronárním tokem a že kardiomyocytové receptory jsou hlavně receptory adenosinu

	• · · • * *	•«- · · • · · «· ·
10	• » · • · · · ·	» * 4 • * « ·
subtypu A3 a souvisí s bradykardií. Z adenosin nabízí jedinečný mechanismus	toho vyplývá, že terapie ischemie

Kardiovaskulární odezvy na adenosin jsou krátkodobé díky rychlému příjmu a metabolismu endogenního nukleotidu. Na rozdíl od toho, analogy adenosinu jsou více rezistentní metabolické degradaci a uvádí se o nich, že jejich účinky vyvolávají trvalejší změny arteriálního tlaku a srdeční frekvence.

Bylo již syntetizováno několik účinných metabolicky stabilních analogů adenosinu, které vykazují různé stupně selektivity na uvedené dva subtypy receptorů. Agonisté adenosinu jsou obecně selektivnější vůči receptorům A^ ve srovnání s receptory A₂· Standardními agonisty adenosinu jsou cyklopentyladenosin (CPA) a R-fenylisopropyladenosin (R-PIA), které vykazují význačnou selektivitu vůči receptorů A-l ( poměr A^A^ 780 a 106 v příslušném pořadí). Na rozdíl od toho, N-5'-ethyl-karboxamido-adenosin (NECA) je účinný agonista receptorů A₂ (Ki-12 nM), ale má stejnou afinitu vůči receptorů Aj (Ki-6,3 nM; poměr A₂/A₁= 1,87). Dosud nejselektivnějším dostupným agonistou A₂ byla sloučenina CV-1808 (A₂/A₁= 0,19), i když tato sloučenina je z hlediska afinity vůči receptorů A₂ 10-krát méně účinná než NECA. V současném výzkumu byly objeveny nové sloučeniny, které jsou velmi účinnými a selektivními agonisty A₂ (Ki=3-8 nM pro A₃; poměr A₂/A₁= 0,027-0,042).

V literatuře jsou uváděny různé N6-aryl- a N6-heteroarylalkyl- substituované adenosiny a substituované (2-amino- a 2-hydroxy)adenosiny, u kterých se uvádí různá farmakologická účinnost včetně srdeční a oběhové aktivity, viz například britský patentový spis č. 1 123 245, DE zvěř.

• to · ···· · · · · • · to ·· · ···· «·· toto· ···**· » · • to ··· *· ·· ·· ·· spis č. 2 136 624, 2 059 922 a

514 284, jihoafrický patent č. 67/7630, U.S. patent

č. 4 501 735, EP publikace č. 0 139 358 (uvádí N6[geminální diaryl-substituované-alkyl]adenosiny), EP patentová přihláška č. 88106818.3 (uvádí, že N6-heterocyklickysubstituované deriváty adenosinu mají srdeční vasodilatační účinnost), DE zvěř. spis č. 2 131 938 (uvádí aryl- a heteroarylalkylhydrazinyladenosinové deriváty), DE zvěř. spis č. 2 151 013 (uvádí N6-aryl- a heteroaryl-substituované adenosiny),

DE zvěř. spis č. 2 205 002 (uvádí adenosiny s N6-substituenty obsahujícími můstkové kruhové struktury spojující N6-dusík se substituenty zahrnujícími thienyl) a jihoafrický patent č. 68/5477 (uvádí N6-indolyl-substituované 2-hydroxyadenosiny).

U.S.patent č. 4 954 504 a EP publikace č. 0 267 878 genericky uvádějí karbocyklická ribosové analogy adenosinu a jejich farmaceuticky přijatelné estery, substituované v polohách 2- a/nebo N6- aryl-nižší alkyl skupinami zahrnujícími thienyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, a bicyklické benzo-kondenzované 5- nebo 6-členné nasycené heterocyklické-nižší alkyl deriváty které vykazují agonistické vlastnosti vůči adenosinovým receptorům. Analogy adenosinu, které mají substituenty thienylového typu jsou popsány v EP publikaci č. 0 277 917 ( uvádí N6-substituované-2heteroarylalkylaminosubstituované adenosiny zahrnující 2[(2-[thien-2-yl]ethyl)amino]-substituovaný adenosin), DE zvěř. spis č. 2 139 107 (uvádí N6-[benzothienylmethyl]-adenosin), PCT WO 85/04882 (uvádí, že N6-heterocyklické alkyl-substituované deriváty adenosinu, zahrnující N6-[2-(2-thienyl)ethyl]amino9-(D-ribofuranosyl)-9H-purin vykazují kardiovaskulární vasodilatační aktivitu a že N6-chirální substituenty mají zvýšenou aktivitu), EP zveřejněná přihláška č. 0 232 813 • · · (uvádí, že N6-(l-substituovaný thienyl)cyklopropylmethylsubstituované adenosiny vykazují kardiovaskulární aktivitu),

U.S. patent č. 4 683 223 (uvádí, že N6-benzothiopyranylsubstituované adenosiny vykazují antihypertensivní vlastnosti), PCT WO 88/03147 a WO 88/03148 (uvádí, že N6-[2aryl-2-(thien-2-yl)Jethyl-substituované adenosiny vykazují antihypertensivní vlastnosti), U.S. patent č.4 636 493 a 4 600 707 (uvádějí, že N6-benzothienylethyl- substituované adenosiny vykazují antihypertensivní vlastnosti).

V U.S. patentu č. 3 914 415 jsou uvedeny amidy adenosin-5'karboxylové kyseliny jako antihypertensivní a antianginální prostředky, zatímco U.S. patent č. 4 738 954 uvádí, že N6-substituované aryl- a arylalkyl-adenosin-5'ethylkarboxamidy vykazují různé účinky na srdce a mají antihypertensivní účinky.

V EP publikaci č. 0 378 518 a UK patentovém spisu

č. 2 226 027 jsou uvedeny N6-alkyl-2'-O-alkyl- adenosiny jako sloučeniny mající antihypertensivní účinnost. N6-Alkyl-2',3'di-O-alkyl- adenosiny uvádí rovněž U.S. patent č. 4 843 066 jako sloučeniny, které lze využít jako antihypertensivní prostředky.

V pracech Stein a sp., J.Med.Chem., 23, 313-319 (1980) a J. Med. Chem., 19(10), 1180 (1976) jsou uvedeny adenosin-5'(N-substituované)karboxamidy a karboxylatové estery jako sloučeniny, které jsou koronárními vasodilatatory. Adenosin5'-karboxamidy a jejich Nl-oxidy jsou rovněž uvedeny v

U.S. patentu č. 4 167 565 jako slabší živočišné jedy.

Antilipolytická aktivita adenosinu je popsána v práci Dole V.P., J.Biol.Chem., 236(12), 3125-3130 (1961). Inhibice lipolysy pomocí (R)-N6-fenylisopropyladenosinu je uvedena v práci Westermann E. a sp., Adipose Tissue, Regulation and Metabolic Functions, Jeanrenaud B. a Hepp D., Eds., George

Thieme	, Stuttgart	47	-54	(1970) .	V	U.S	. patentu
3	817	981,	3	838	147,	3	840 521,	3	835	035,
3	851	056,	3	880	829,	3	929 763,	3	929	764,
3	988	317	a	5	032	583	jsou uvedeny :	N6-mono- a

disubstituované analogy adenosinu jako sloučeniny mající antilipolytickou, antihypercholesterolitickou a antihyperlipemickou aktivitu.

Předpokládá se, že uváděná toxicita, vlastnosti na CNS a na zvýšení srdečního rytmu spojené s podáváním analogů adenosinu přispěly k problémům zabraňujícím vývoji obchodně dostupného adenosinového analogu sloužícího jako antihypertensivní/antiischemický prostředek.

U.S. patentových přihláškách č. 08/484 811 a 08/316 61, které vychází z publikované PCT přihlášky PCT/US91/06990, uvádějí třídu metabolicky stabilních agonistů adenosinu a jeho derivátů, které mají nečekaně žádoucí farmakologické vlastnosti, t.j. antihypertensivní, kardioprotektivní, antiischemické a antilipolytické prostředky s jedinečným terapeutickým profilem.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu přípravy 2,4-dihydropyridinu který zahrnuje zahřívání sloučeniny vzorce A • · ·» · · • *

ve kterém R znamená H, alkylskupinu nebo aralkylskupinu, a kyselinu fosforečnou, přičemž poměr kyseliny fosforečné k vodě není menší než asi 27 k 1 % hmotnostnímu. Vynález se rovněž týká způsobu přípravy 2,4-dihydroxy-3-nitropyridinu, který zahrnuje reakci 2,4-dihydroxypyridinu s kyselinou dusičnou.

Způsoby podle vynálezu se připraví meziprodukty které jsou vhodné pro přípravu sloučenin použitelných při léčení kardiovaskulární choroby provázené hypertensí nebo myokardiální ischemií, pro zlepšení stavu ischemického poškození nebo velikosti infarktu myokardu, nebo léčení hyperlipidemie něho hypercholesterolemie.

Ve výše uvedeném textu a v dalším popisu vynálezu mají následující výrazy pokud není uvedeno jinak následující významy:

Výraz acyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkyl-C(=0)skupinu. Výhodné acylskupiny zahrnují nižší alkanoylskupiny mající od 1 do asi 6 atomů uhlíku v alkylskupině.

Výraz alkyl znamená nasycenou alifatickou uhlovodíkovou skupinu, která může mít přímý nebo rozvětvený řetězec a obsahuje asi l až asi 20 atomů uhlíku v řetězci. Rozvětvený • · · ···· · · · · • · · ·· · ···· · · · ··· ······ · · • · » · · · κ ·· · · ·· řetězec je řetězec, ve kterém k lineárnímu alkylovému řetězci je připojena nižší alkylskupina jako je skupina zahrnující methyl, ethyl nebo propyl.

Výraz nižší alkyl znamená alkylskupinu o 1 až asi 6 atomech uhlíku.

Výraz alkylen znamená přímý nebo rozvětvený dvojmocný uhlíkový řetězec o 1 až asi 20 atomech uhlíku. Výhodné alkylenové skupiny jsou nižší alkylenové skupiny o 1 až asi 6 atomech uhlíku. Nejvýhodnější alkylenové skupiny jsou methylen, ethylen, ethylethy1en, methylethylen a dimethy1ethy1en.

Výraz cykloalkylen znamená 1,2- nebo 1,3-dvojmocnou karbocyklickou skupinu o asi 4 až asi 8 atomech uhlíku.

Výhodné cyk1oalky1enové skupiny zahrnují 4,5-cis- nebo transcyklohexenylen, 1,2-cyklohexanylen a 1,2-cyklopentylen.

Výraz případně substitovaný znamená, že daný substituent může a nemusí být přítomen.

Výraz alkylamino znamená, že aminoskupinu substituovanou jednou nebo dvěma alky 1 skupinami. Výhodné skupiny jsou nižší alky1-aminoskupiny.

Výraz alkylkarbamoyl znamená karbamoy1ovou skupinu substituovanou jednou nebo dvěma alkyl skupinami. Výhodné jsou nižší alkyl-karbamoylové skupiny.

Výraz alkylmerkapto znamená alkylskupinu substituovanou merkaptoskupinou. Výhodné skupiny jsou skupiny merkapto-nižší alkyl.

Výraz alkoxy znamená alky1-oxyskupinu, ve které výraz alkyl je popsán výše. Výhodné jsou nižší alkoxyskupiny. Příklady těchto skupin zahrnují methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy a n-butoxy.

Výraz alkoxyalkyl znamená alkylovou skupinu popsanou výše substituovanou alkoxyskupinou rovněž popsanou výše.

Výraz aralkyl znamená alkylovou skupinu substituovanou arylovým radikálem, kde aryl znamená fenyiovou skupinu nebo fenyiovou skupinu substituovanou jedním nebo více substituenty které mohou být ze skupiny zahrnující alkyl, alkoxy, amino, nitro, karboxy, karboalkoxy, kyan, alkylamino, halogen, hydroxy, hydroxyalkyl, merkapto, alkylmerkapto, karbalkyl nebo karbamoyl.

Výraz karbalkoxy znamená karboxylový substituent esterifikovaný alkoholem vzorce C_nH2n+iOH, kde n je od 1 do asi 6.

Výraz halogen (nebo halo) znamená chlor, fluor, brom nebo jod.

Výraz heterocyklyl znamená asi 4 člennou až asi 10 člennou kruhovou strukturu ve které jeden nebo více z atomů v kruhu mají jiný význam prvku než je uhlík, například N, O nebo S.

Vzorec I je popsán následujícím vzorcem a definicemi:

I · · · · · · · • · · · · · · · ·· · • · · · • · ·· · · · · (I) kde :

K znamená Ν, Ν —>0, nebo CH;

Q znamená CH2 nebo 0;

T znamená

Rix ° N-C

R/ nebo R3O-CH2;

X znamená přímý nebo rozvětvený řetězec alkylenové, cykloalkylenové nebo cykloalkenylenové skupiny, z nichž každá je případně substituovaná nejméně jednou skupinou zahrnující CH₃, CH3CH2, Cl, F, CF3, nebo CH3O;

Y znamená NR4, 0 nebo S;

a = 0 nebo 1

Z znamená skupinu vzorce (Z2)_n

7..,2^¾ nebo

Zi	znamená	N,	CRs,	(CH)b-CR5	nebo (CH)m-N, kde m je 1
2;
Z2	znamená	N,	nr6,	0 nebo S,	a n j e 0 nebo 1;

Ri, R2, R3, R4, Rs a Ré nezávisle znamenají skupinu zahrnující H, alkyl, aryl nebo heterocyklyl;

R_a a Rb nezávisle znamenají skupinu zahrnující H, OH, alkyl, hydroxyalkyl, alkylmerkapto, thioalkyl, alkoxy, alkyloxyalkyl, amino, alkylamino, karboxyl, acyl, halogen, karbamoyl, alkylkarbamoy1, aryl nebo heterocyklyl; a

R' a R'¹ nezávisle znamenají skupinu zahrnující vodík, alkyl, aralkyl, karbamoyl, alkylkarbamoyl, dialkylkarbamoyl, acyl, alkoxykarbonyl, aralkoxykarbonyl, ary1oxykarbonyl, nebo R' a R'’ mohou společně tvořit c* o

'C' s

H^ORe kde R_c znamená vodík nebo aíkyí, kde Ra a R_e nezávisle znamenají skupinu zahrnující vodík, alkyl, nebo společně s atomem uhlíku ke kterému jsou připojeny mohou tvořit 1,1-cykloalkylovou skupinu;

s výhradou, Že když X znamená přímý řetězec alkylenové skupiny a Q znamená kyslík, pak Z znamená heterocyklylovou skupinu obsahující nejméně dva heteroatomy;

nebo jsou to jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Reprezentativní heterocyklická skupiny obsažené v N6 substituentu sloučenin vzorce I zahrnují následující:

Výhodné heterocyklická skupiny zahrnují nesubstituovanou a substituovanou thienylovou, thiazolylovou a benzothiazolylovou skupinu, kde uvedenými substituenty může být jeden nebo více substituentů ze skupiny zahrnující alkoxy, alkylamino, aryl, karbalkoxy, karbamoyl, kyan, halogen, hydroxy, merkapto, alkylmerkapto nebo nitro.

Výraz hydroxyalkyl znamená alkylskupinu substituovanou hydroxyskupinou. Výhodné jsou skupiny hydroxy-nižší alkyl. Příklady výhodných skupin zahrnují hydroxymethyl,

2-hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl a 3-hydroxypropyl.

Výraz proléčivo znamená prekurzor léčiva, tedy sloučeninu, která může nebo nemusí být sama biologicky aktivní, ale která může metabolicky, solvolyticky nebo jinými fyziologickými způsoby být převedena na biologicky aktivní chemickou složku.

Výraz kardioprotekce se týká účinku, kterým se myokard stane méně náchylný ischemickému poškození a infarktu myokardu na následky myokardiální ischemie.

Výraz zlepšení ischemického poškození znamená redukci ischemického poškození myokardu následkem myokardiální • · i schemi e.

Výraz zlepšení rozsahu infarktu myokardu znamená snížení velikosti infarktu myokardu nebo jeho prevenci při myokardiální ischemii.

Sloučeniny vzorce I výhodně obsahují chirální (asymetrické) centrum. Například, výhodné sloučeniny mající takové asymetrické centrum zahrnují například ty sloučeniny, kde X znamená isopropylen, a mají pak bud R nebo S konfiguraci, přičemž R je nejvýhodnější konfigurace.

Sloučeniny vzorce I zahrnují jednotlivé stereoisomery a jejich směsi. Tyto jednotlivé isomery se připraví nebo izolují způsoby v oboru dobře známými a v oboru popsanými.

Tyto sloučeniny, které se připraví z meziproduktů připravených způsobem podle vynálezu lze použít ve formě volné baze, ve formě adičních solí s kyselinami nebo jako hydráty. Všechny tyto formy jsou v rozsahu definice sloučenin vzorce I. Adiční soli s kyselinami jsou z hlediska použití jednodušší a výhodnější formou. V praxi však použití solné formy přirozeně odpovídá použití ve formě baze. Kyseliny, které lze použít k přípravě adičních solí s kyselinou výhodně zahrnují ty, ze kterých při kombinaci s volnou baží vznikají farmaceuticky přijatelné soli, t.j. soli, jejichž anionty jsou ve farmaceutických dávkách těchto solí netoxické příjemci, takže prospěšné antihypertensivní, kardioprotektivní, anti ischemické a anti 1ipolytické účinky poskytované volnou hází nejsou narušeny vedlejšími účinky které by bylo možné připsat aniontům. Ačkoliv farmaceuticky přijatelné soli těchto sloučenin jsou výhodné, všechny adiční soli s kyselinami jsou vhodné jako zdroje volné bazické formy, a to i tehdy, když jednotlivá sůl je požádována pouze jako meziprodukt, například • · · ·· · ·« · · · · · • · · ·· · · · • · · · · · · ·· · · · · tehdy, když sůl je připravena pouze pro účely přečištění a identifikace, nebo když je určena k použití jako meziprodukt při přípravě farmaceuticky přijatelné soli způsoby vyměny iontů. Farmaceuticky přijatelné soli v rozsahu tohoto vynálezu jsou soli odvozené od následujících kyselin které zahrnují: minerální kyseliny jako je kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná a kyselina amidosírová; a organické kyseliny jako je kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina mléčná, kyselina vinná, kyselina malonová, kyselina methansulfonové, kyselina fumarová, kyselina ethansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina cyklohexylamidosírová, kyselina chinová a podobně. Odpovídající adiční soli s kyselinami zahrnující následující: hydrochlorid, sulfát, fosfát, amidosulfát, octan, citrát, laktat, tartrat, methansulfonát, fumarat, ethansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat, cyklohexylsulfonat a chinat.

Adiční soli sloučenin vzorce I s kyselinami se vhodně připraví buď rozpuštěním volné baze ve vodném nebo vodně-alkoholickém roztoku nebo v jiných vhodných rozpouštědlech obsahujících příslušnou kyselinu a izolací této soli odpařením roztoku, nebo reakcí volné baze s kyselinou v organickém rozpouštědle za přímé separace soli nebo za získání této soli zahuštěním roztoku.

V rozsahu definice vzorce I jsou zahrnuty třídy sloučenin, které lze obecně charakterizovat jako N6-heterocyklicky-substituované adenosiny; N6-heterocyklickysubstituované karbocyklické adenosiny (nebo alternativně dihydroxy[N6-heterocyklicky substituované-9-adenyl]cyklopentany) a jejich N-oxidy; a N6-heterocyklicky-substituovanéN'-l-deazaaristeromyciny (nebo alternativně dihydroxy-[N722 • ·· · * · · · • · · ···· · · · ··· • · · · · heterocykli cky-subst i tuované[4,5-b]imidazopyridyljcyklopentaný) V rozsahu vzorce I jsou také 5'-alkylkarboxamidové deriváty adenosinů, karbocyklických adenosinů a 1-deazaaristeromycinú, deriváty sloučenin výše uvedených tříd ve kterých jedna nebo obě z 2- nebo 3- hydroxylových skupin cyklopentanového kruhu, nebo v případě tříd sloučenin obsahujících ribosovou složku hydroxylové skupiny v polohách 2' nebo 3' ribosového kruhu, jsou substituované. Tyto deriváty již samy mohou obsahovat biologicky aktivní chemickou složku vhodnou pro léčení hypertense a myokardiální ischemie a mohou být použity jako kardioprotektivní a a anti 1ipolytické prostředky, nebo mohou působit jako proléčiva pro tyto biologicky aktivní sloučeniny které z nich vzniknou za fyziologických podmínek.

Reprezentativní sloučeniny podle vynálezu zahrnují: N6-[trans-2-(thiof en-2-yl)cyklohex-4-en-l-y1]adenos in; N6-[trans-2-(thiofen-3-yl)-cyklohex-4-en-l-yl]adenosin·, N6-[trans-2-(thiofen-2-yl)cyklohex-4-en-l-y1]adenos in-5'N-ethyl- karboxamid; N6-[2-(2¹-aminobenzothiazolyl)ethy1]adenosin; N6-[2-(2'-thiobenzothiazolyl)ethy1]adenosin; N6-[2(6'-ethoxy-2'-thiobenzothiazo1y1)ethyl]adenosin; N6—[2—(2' — aminobenzothiazoly1)ethyl]adenos in-5'-N-ethyl- karboxamid;

N6-[2-(2'-aminothiazoly1)ethy1]karbocyklický adenos in-5'-Nethyl- karboxamid; N6-[2-(4'-methy1thiazol-5'-yl)ethy1]adenosin; N6-[2-(2'-thiazolyl)ethyl]adenosin; N6-[(R)-1 (5'-chlorthien-2'-yl)-2-propy1]adenos in-5'-N-ethylkarboxamid; N6-[2-(2'-methyl-4'-thiazolyl)ethyl]adenosin;

N6-[(R)-1-methy1-2-(2’-benzo[b]thiofenyl)etbyl]adenosin;

N6—[2—(4''-methyl-5''-thiazo1y1)ethy1]karbocyklicky adenosin5'-N-ethyl- karboxamid; N6-[2-(2''-thiazoly1)ethyl]karbocyklický adenosin-5'-N-ethyl- karboxamid; N6-[2-(4’-fenyl2'-thiazolyl)ethy1]adenosin; N6-[(R)-1-(5''-chlor-2''thi eny1)prop-2-yl]karbocyklický adenos in-5'-N-ethyl23 ·« · · • · » · • · · · • · · · · • · · • · v « • · · t • · · · • · « · · · karboxamid; (-)-N6-[thiofen-2''-yl]karbocyklický adenosin5'-N-e thy1-karboxamid; N6-[l-(thiofen-3-yl)ethan-2-y1]karbocyklický adenosin-5'-N-ethy1- karboxamid; N6-[(R)-1((thi of en-2-yl)prop-2-yl)]karbocykli cký adenos in-5'-N-ethy1karboxamid; N6-[l-(thiofen-2-yl)ethan-2-yl]-N'-ldeazaaristeromycin-5’-N-ethyl- karboxamid; N6-[(R)-l-((thiazo2-y1)-prop-2-y1)]adenosin-5'-N-ethyl- karboxamid; N6-[l-thiofen-2-yl)-2-methy1propyl]adenos in-5'-N-ethy1karboxamid; N6-[(R)-l-(5'-chlorthien-2-yl)-2-buty1]karbocyklický adenosin-5¹-N-ethylkarboxamid; N6-[2-(4¹-methyl2'-thiazolyl)ethyl]adenosin; N6-[4'-fenyl-2-thiazolyl)methyl]adenosin; (-)-[2 S—[2a,3a-dimethy1methy1endi oxy-4-β-[N6-[2(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethyl]amino]-9-adenyl]cy klopen tan] -1-β-N-e thy 1 karboxamid ; (2S)-2a, 3a-dihydroxy-4(l[N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethyl]amino-9-adenyl]cyklopentan-1β-N-ethy1karboxamid; (2S)-2a,3a-dihydroxy-4p-[N6[2-(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethyl]amino-9-adenyl]cyklopentan-1β-N-ethy1karboxamid-Nl-oxid; [lS-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(5-chlor-2-thi eny1)-1-methy1ethy1]amino]-3Himidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethy1-2,3-dihydroxycyklopentankarboxamid; [lS-[la,2b,3b,4a]]-4-[7-[[2-(3-chlor-2-thienyl)l-ethylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3yl]-N-ethy12.3- di hydroxycyklopentan-karboxamid; [1S-[1 a,2b,3b,4a]]-4[7-[[2-(2-thi enyl)-l-isopropylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethy1-2,3-dihydroxycyk1 opentankarboxamid; [lS-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-chlor-2-thienyl)-lethy1ethy1]ami no]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-y1]-N-ethy12.3- d i hydroxycyklopentan-karboxamid; [lS-[la,2b,3b,4a(S*)]]~

4- [7- [ [2-(2-thi eny 1 ·)-1 -methy 1 ethy 1 ] amino] -3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-yl]-N-ethy1-2,3-dihydroxycyklopentan-karboxamid; [lS-[lá,2b,3b,4a]]-4-[7-[[2-(5-chlor-2-thienyl)-l-ethylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethy1-2,3-dihydroxycvklopentan-karboxamid; (2S)-2a,3a-bi s-methoxykarbony 1οχγ-4β24 • · ·* ·· « · · · « « · · • » · · · · » · · ·· ·· ·· *<· • * · · • * · · • · « * · ·

Λ · « · % * [N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)-(IR)-1-methy1ethy1]amino-9-adeny1]cyklopentan-1β-N-ethylkarboxamid; (2S)-2a,3a-dihydroxy-4p[N6-[2-(5-chlor-2-thi eny1)-(IR)-1-methy1ethy1]amino-9-adeny1]cyklopentan-lp-N-ethylkarboxamid- ethoxymethylen- acetal;

(2S)-2a,3a-dihydroxy-43~[N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-lmethylethyl]amino-9-adeny1]cyklopentan-1β-N-ethy1karboxamid2.3- karbonát; (2S)-2a,3a-bi s-methyIkarbamoy1oxy-4β-[N6- [2(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-1-methy1ethy1]amino-9-adeny1]cyklopentan-1β-N-ethylkarboxamid; (2S)-2a,3a-dihydroxy-4B~ [N6-[2-(5-chlor-2-thi eny1)-(IR)-1-methy1ethy1]amino-9-adeny1]cyk1opentan-1β-N-ethy]karboxamid-2,3-thiokarbonat; N6-[2-(3chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethy1]—2'-O-methy1adenos in;

N6-[2-(5-chlor-2-thi enyl)-(IR)-t-methylethy1]-2'-0methyladenosin; a N6-[trans-5-(2-thi eny1)cyklohex-t-en-4-y1]2'-0-methy1adenos i n.

Výhodnou třídu sloučenin popsaných vzorcem I jsou sloučeniny ve kterých R' a R¹' znamenají H.

Další výhodnou třídou sloučenin vzorce I jsou 5'-Nalkylkarboxamidové deriváty N6-heterocyklicky-substituovaných karbocyklických adenosinů, jinak řečeno sloučenin vzorce I, ve kterých K znamená N, Q znamená CH2 a T znamená RiR2N-C=0, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Ještě další výhodnou třídou sloučenin vzorce I jsou 5'-N-alkylkarboxamidové deriváty N6-heterocyklickysubstituovaných-N'-1-deazaaristeromycinů, t.j. 4-[7[heterocyklylamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-alkyl2.3- dihydroxycyklopentankarboxamidů, jinak řečeno sloučenin vzorce I, ve kterých K znamená CH, Q znamená CH2, a T znamená RiR2N~C=0, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí.

«. · • e · · · · · ···> · λ » · · • · « · i w ···· ··· · · * ···»·· · · ·» e r· *· « * ♦ ♦

Nej výhodnější třída sloučenin vzorce I je charakterizována přítomností chirálního centra v poloze alfa vzhledem N6 atomu purinového nebo 1-deazapurinového kruhu, přičemž speciální skupina této třídy zahrnuje sloučeniny, charakterizované chirální ethyl skupinou připojenou k atomu uhliku v poloze alfa vzhledem N6-dusíku. Zvláště výhodná třída sloučenin je charakterizována N6-[l-nižší alkyl-2-(3halogenthien-2-y1)ethy1] substituční skupinou.

Nejvýhodnější struktury sloučenin vzorce I zahrnují následující sloučeniny: (-) - [ 2S— [2a, 3a-d ihydroxy-4(l- [N6—[2 — (5-chlor-2-thienyl)-l-(R)-methylethyl]amino]-9-adenyl]cyklopentan-1β-ethy1karboxamid, (-)-[2S-[2a,3a-dihydroxy-4p[N6-[l-(R)-ethyl-2-(3-chlor-2-thienyl)ethyl]amino]-9-adeny1]cyklopentan-1β-ethy1karboxamid, [1S-[1 a,2b,3b,4a(S*)]]-4[7-[[2-(5-chlor-2-thi enyl)-1-methy1 ethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-y1]-N-ethyl-2,3-dihydrocyklopentankarboxamid, [lS-[la,2b,3b,4a(S*)]j-4-[7-[[2-(3-chlor-2-thi enyl)-Ιέ thyl ethy 1 ] amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-y1]-N-ethy12,3-dihydrocyklopentankarboxamid, a jejich farmaceuticky při jatelné soli.

Sloučeniny vzorce I lze připravit známými způsoby nebo sledem reakcí uvedených níže. Výchozí složky použ i té při přípravě sloučenin vzorce I jsou známé nebo obchodně dostupné, nebo je lze připravit známými způsoby nebo podle specifických reakčních schémat uvedených v tomto popise, která zahrnují způsoby podle vynálezu.

Způsoby podle vynálezu pro přípravu 2,4-dihydroxypyridinu a 2,4-dihydroxy-3-nitropyridinu jsou znázorněny na schématu Al .

• »

Reakční schéma A1‘

RO₂C

CO₂R

2.

1. Ac₂O, HC(OMe)₃, Δ, N₂

->_ deštil- AcOH/AcOR 3. NH₄OH, HCI

OH

R znamená alkyl nebo aralkyl; výhodně nižší alkyl, nejvýhodněji methyl • ·

Na schématu Al je znázorněna nejprve tvorba (alkyl nebo aralkyl) 4-6-dihydroxynikotinatu reakcí di(alkyl nebo aralkyl) aceton-dikarboxylatu s trimethy1ortomravenčanem a anhydridem kyseliny octové v inertní atmosféře jako je atmosféra dusíku, destilací kyseliny octové/(alky 1 nebo aralkyl)acetatu (výhodně za sníženého tlaku jako je tlak asi 20 mm Hg), a postupnou reakcí získané směsi s hydroxidem amonným a kyselinou chlorovodíkovou.

Jedním aspektem vynálezu je, že po tvorbě (alkyl nebo aralkyl) 4,6-dihydroxynikotinatu podle schématu Al se produkt převede na 2,4-dihydroxypyridin zahříváním s kyselinou fosforečnou, přičemž poměr kyseliny fosforečné k vodě není menší než asi 27 % k 1 % hmotnostnímu (H3PO4:H2O= 27:1 % hmotn.). Tento poměr lze získat zahříváním až na teplotu, při které se z reakční směsi odstraní dostatečné množství vody. Po odstranění tohoto dostatečného množství vody se teplota reakční směsi zvýší na teplotu asi 210 °C (±5 °C). Reakční směs se pak udržuje asi 4 až 5 hodin přibližně při této teplotě dokud nezmizí (alkyl nebo aralkyl) 4,6-dihydroxynikotinat nebo meziprodukt, kyselina 4,6-dihydroxynikotinová.

V tomto aspektu podle vynálezu tato reakce zahrnuje dekarboxylaci pyridylové složky katalyzovanou kyselinou fosforečnou za v podstatě bezvodých podmínek.

Podle dalšího aspektu vynálezu, alternativně znázorněného na schématu Al, 2,4-dihydroxypyridin lze připravit konverzí uvedeného (alkyl nebo aralkyl) 4,6-dihydroxynikotinatu na kyselinu 4,6-dihydroxynikoti novou hydrolýzou silnou baží jako je NaOH nebo KOH a následným zpracováním kyseliny

4,6-dihydroxynikotinové stejným způsobem jaký je uveden pro (alkyl nebo aralkyl) 4,6-dihydroxynikotinat.

• · • k

Další aspekt vynálezu, který rovněž znázorňuje schéma Al je, že uvedený (alkyl nebo aralkyl) 4,6-dihydroxynikotinat nebo kyselina 4,6-dihydroxynikotinová mohou být převedeny na

2.4- dihydroxy-3-nitropyridin bez izolace 2,4-dihydropyridinu. Tato reakce zahrnuje postup dekarboxylace jak je popsán výše a potom zpracování reakční směsi s kyselinou dusičnou. Výhodný je přídavek kyselého organického rozpouštědla jako je kyselina octová před zpracováním s kyselinou dusičnou. Nitrace probíhá výhodně za podmínek ohřevu, jako při teplotě od asi 80 °C do asi 100 °C , výhodněji při teplotě 90 °C až do přídavku vody a přerušení zahřívání.

Podle ještě dalšího aspektui vynálezu znázorňuje schéma Al, že 2,4-dihydroxypyridin lze převést na 2,4-dihydroxy-3nitropyridin aplikací předcházejícího nitračního způsobu.

Ve schématu Al je rovněž znázorněna konverze

2.4- dihydroxy-3-nitropyridinu na 2,4-dichlor-3-nitropyridin reakcí fosforoxychloridu a 2,4-dihydroxy-3-nitropyridinu v přítomnosti diisopropylethylaminu (DIPEA). Tato reakce probíhá při asi 100 °C. Uvedený 2,4-dichlor-3-nitropyridin lze použít místo jiných dihalogenheteroarylů k přípravě meziproduktů tak, jak je znázorněno v tomto popise, ve schématu K.

Nakonec je ve schématu Al znázorněna konverze

2.4- dichlor-3-nitropyridinu na 3-amino-2,4-dich1orpyridin za redukčních podmínek jako je Zn/HCl nebo hydrogenační podmínky. Tento 3-amino-2,4-dichlorpyridin lze použít místo jiných aminodihalogenheteroarylů tak jak je znázorněno v tomto popise, ve schématu B.

Sloučeniny vzorce I, ve kterých K znamená N, Q znamená O

a T znamená R3O-CH2, lze připravit reakcí obchodně dostupného

6-chlorpurinribosidu s různými heterocyklickými aminy jak je pomocí příkladů uvedeno níže.

Sloučeniny vzorce I, ve kterých K znamená N, Q znamená 0 a T znamená RiR2N-C=O se připraví podobným způsobem za použití výchozího produktu podle reakčního schématu A. V této reakci se 6-chlorpurinribosid, ve kterém hydroxyskupiny v polohách 2'- a 3'- jsou chráněné, zpracuje s oxidačním prostředkem, například Jonesovým činidlem, a produkt se zpracuje bud s dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) nebo BOP-C1 v přítomnosti vybraného aminu za výtěžku 5'-alkylkarboxamidového derivátu.

Reakční schéma A

(P=chránící skupina)

Vhodné výchozí složky pro sloučeniny vzorce I ve kterých K znamená N, Q znamená CH2 a T znamená RiR2N-C=O lze připravit způsobem popsaným v práci Chen a sp., Tetrahedron Letters 30: 5543-46 (1989). Alternativně lze k přípravě těchto výchozích složek použít způsob podle reakčního schématu B. Ve způsobu podle reakčního schématu B 4-ethylkarboxamidový derivát, • · připravený způsobem popsaným v práci Chen a sp., reaguje s

3-amino- 2,4-dichlorpyrimidinem. Produkt této počáteční reakce se pak zahřívá s aldehydylamidinacetatem, například formamidinacetatem v dioxanu a methoxyethanolu, po dobu dostatečnou k vytvoření uzavřeného kruhu (od asi 30 minut do asi 4 hodin), čímž se získá produkt, který může vhodně reagovat s různými heterocyklickými aminy způsobem popsaným níže za tvorby sloučenin podle vynálezu. Pořadí reakcí není rozhodující. Například meziprodukt vzniklý podle reakčniho schématu B může reagovat s heterocyklickým aminem a pak může následovat uzavření kruhu za získání konečného požadovaného produktu.

Reakční schéma B

Cl

Η O θ H

Různé heterocyklické aminy, vhodné pro přípravu sloučenin podle vynálezu, lze připravit jednou nebo více reakcemi znázorněnými v reakčních schématech C-J a preparátivních příkladech B až G a příkladech 50 až 74 popsaných níže (Het= • * heterocyklická skupina; Halo=halogen; R= například H nebo nižší alkyl; R_a a Y jsou definovány výše).

Reakční schéma C

Reakční schéma D

ZH

1) n-BuLi,THF

OH

2) O.

\.....

r₂ r₂ ^< r₃

1) DEAD, Ph₃P ftalimid -)

2) NH₂NH₂

NH, r₃ 'r₂

Reakční schéma E

R₃NO₂

NO,

1) NaBH₄

Z-CHO

B-alanin

BuOH

2) LAH ?X nh₂

··· » · · · » • · «·» ·· ·· * · · e

Reakční schéma F

Rx no₂

R₂

-->.

zvýšená teplota

Reakční schéma G

· «· 9 · · · · · * · · · · « · · · · · · ·· a·· · · · · ·· ··

Reakční schéma H

Reakční schéma I

O

Sled reakcí uvedených ve schématu I výše popisuje U.S.Patent č.4,321,398 s patřičnými informacemi, který je včleněn do tohoto textu odkazem.

Příklad B

Příprava l-(thiofen-3-y])ethylaminu • ·

3-thiofenkarboxaldehyd (1 mmol), nitromethan (1,5 mmol) a beta-alanin (0,1 mmol) v butanolu poskytnou za 6 hodin 3-nitrovinylenthiofen, který redukcí 1 ithiumaluminiumhydridem (2,5 mmol) poskytne požadovaný amin.

3-substituované thienylalkylaminy se připraví náhradou 3-substituovanými thiofeny jako je 3-chlorthiofen za thiofenové výchozí složky podle výše uvedeného příkladu B.

Příklad C

Příprava trans-2-(thiofen-2-yl)cyklohex-4-enylaminu

Směs 1,3-butadienu (5 ml) a 2-nitrovinylenthiofenu (7 g) v toluenu se zahřívá přes noc v uzavřené zkumavce při 140 °C. Vzniklý nitrocyklohexen se hydrogenuje (~ 35 psi H2)(5% Pd/C MeOH) a zpracuje se s 1 ithiumaluminiumhydridem (2,5 g). Racemický trans-2-(thiofen-2yl)-cyklohexylamin se získá standardním zpracováním.

Příklad D

Obecná příprava 2-suhstituovaných thiazolaminů

Reakcí benzoylchloridu a aminoethylkyanidu se získá N-benzoylaminoethy1cyanin, který se nechá dále reagovat se sirovodíkem v amoniaku a získá se thioamid, který reakcí s vhodným a-ha1ogenketoněm poskytne požadovaný thiazol. Zpracováním s 5N kyselinou chlorovodíkovou se odstraní chránící benzoylová skupina a získá se požadovaný aminový produkt.

Příklad E • ·

Obecná příprava 4-substituovaných thiazolylaminů

Syntéza 2-(2'-methy1-4'-thiazolyl)ethylaminu se výhodně provede reakcí thioacetamidu s ethyl-monobromacetoacetatem za tvorby thiazolového esteru ze kterého se redukcí výhodně borhydridem sodným získá alkohol který se převede na amin. Výhodné prostředky k transformaci na amin zahrnují zpracování s (i) diethylazodikarboxylatem, trifenfosfinem a ftalimidem a (2) hydrazin-hydratem.

Příprava 4-substituovaných thiazolaminů může také být provedena použitím předcházejícího reakčního schématu reakcí substituovaného thioamidu a ethylmonobromacetoacetatu.

Konverze vzniklého thiazoly1 esteru na amid se provede použitím vodného amoniaku a amin se získá redukcí boranem. Příkladná příprava 2-(1,1-dimethy1-1'-thiofeny1)ethy1 aminu je uvedena v U.S.Patentu č.4,321,398.

Diastereomerní směsi sloučenin nebo meziproduktů získané podle reakčního schématu Al výše, lze separovat na jednotlivé racemické nebo opticky aktivní enantiomery způsoby známými v oboru; například chromatografií, frakční destilací nebo frakční krystalizaci d- nebo 1-(vinanových, dibenzoylvinanových, mandlanových nebo kafrsulfonatových) solí.

Příklad F

Příprava (+) a (-) trans-2-(thiofen-2-y1)cyklohex-4-enylaminu

K roztoku příkladu C v is racemického aminu (3,4 g) připraveného podle opropanolu se přidá kyselina (S)-(+)-mandlová • · · · · ·· · • · · · · ·· · (0,55 ekv.). Sraženina se rekrystalizuje z isopropanolu a získá se 1,78 g soli ( [a]D, teplota místnosti=+ 4,13 (c=l,3, MeOH)). Tyto aminy se izolují extrakcí neutralizovaných solí (nasycený NaHC03) pomocí CH2CI2, vysuší se (Na2SO4) a zahuštěním se získají částečně rozštěpené aminy.

Přibližně 1 g levotočivého aminu ( [a]d teplota místnosti = -25,8 (c=l,54, MeOH) se zpracuje s 2 g kyseliny 1-(-)-diberizoy 1-vi nné v methanolu a zpracováním získané soli se získá 0,64 g levotočivého aminu ( [a]D teplota místnosti= -28,8 (c=l,65, MeOH)). NMP analýzou MPTA amidu levotočivého aminu s použitím vysokého magnetického pole lze zjistit > 96% enantiomerní přebytek.

Přibližně 1,6 g směsi obohaceného pravotočivého amidu se zpracuje s 3,2 g kyseliny d (+)-dibenzylvinné v methanolu. Zpracováním se získá 0,87 g pravotočivého aminu ([a]D teplota místnosti=+25,8 (c=l,67,MeOH))).

N6-heterocyklicky-substi tuované adenos i ny a karbocyklické adenosiny podle vynálezu lze připravit reakcí

6-chlorpurinribosidu nebo produktů reakčních schémat A nebo B s různými heterocyk1 ickými aminy syntetickým způsobem znázorněným níže v reakčnírnh schématu J, kde Κ, P, Q a T mají výše uvedený význam.

Reakční schéma J

N6-heterocykli cky-N'alky1-deazaari steromyciny podle vynálezu lze připravit způsobem znázorněným na schématu K.

Reakční schéma K

R1R2N

Sloučeniny vzorce I , které mohou mít účinky jako proléčivo, zahrnují ty sloučeniny, ve kterých hydroxylové skupiny na ribosovém nabo cyklopentanovém kruhu jsou substituovány skupinami R' a R'¹ definovanými výše pro vzorec I. Tyto sloučeniny lze připravit známými způsoby , které jsou jako příklad uvedeny v přípravách znázorněných v reakčním schématu L níže.

Reakční schéma L

·· · · * · · ···· • · · ·· · ···· · · · ··· ··· ··· · · • · ··· ·· ·· ·v ··

Zpracováním dihydroxy- sloučenin s esterem chlormravenčanu za přítomnosti organické baze, například triethylaminu, se získají odpovídající bis-karhonaty. Alkoxymethylenacetal lze připravit zpracováním odpovídajícího ortoesteru v přítomnosti katalytického množství kyseliny p-toluensulfonové. Karbonát se získá zpracováním s 1,1'-karbonyldiimidazo1em a thiokarbonat zpracováním s thiokarbonyldiimidazolem. Alkylové a dialkylkarbamoylové deriváty lze připravit zpracováním odpovídajícího alkyl isokyanatanu nebo dialkylkarbamoylchloridu v přítomnosti organické baze.

Sloučeniny vzorce I, ve kterých K znamená N/EO, t.j. N-oxidy, lze připravit oxidací odpovídajícího adenosinu nebo karbocyklického adenosinu známými způsoby, například zpracováním s peroxidem vodíku v kyselině octové.

2'-O-alkylderiváty lze připravit známými způsoby, například reakcí příslušného heterocyklylaminu s 6-chlor-9(2'-0-methyl-b-D-ribofuranosyl)-9H-purinem.

Funkční skupiny výchozích sloučenin a meziproduktů použitých k přípravě sloučenin vzorce I lze chránit obvyklými chránícími skupinami známými v oboru. Obvyklé chránící skupiny pro aminovou a hydroxylovou funkční skupinu jsou popsány například v práci T.W.Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York (1984).

Hydroxylové skupiny mohou být chráněny formou esterů, jako jsou acylderiváty,nebo formou etherů. Hydroxylové skupiny na sousedních atomech uhlíku mohou být výhodně chráněny ve formě ketalů nebo acetalů. V praxi se sousedící hydroxylové skupiny v polohách 2' a 3' výchozích sloučenin podle reakčních • fe • · ♦ fefe fe fefe schémat A a B výhodně chrání tvorbou 2',3'-isopropylidenových derivátů. Volné hydroxylové skupiny lze znovu získat například kyselou hydrolýzou nebo jinou solvolytickou nebo hydrogenolytickou reakcí běžně používanou v organické chemii.

Po syntéze se sloučeniny vzorce I obvykle čistí kapalinovou chromatografií za středního tlaku (MPLC), na chromatotronu, chromatografií na tenké vrstvě s radiálním zrychlením, rychlou chromatografií nebo chromatografií na sloupci za použití silikagelové nebo Florsilové fáze, s následnou krystalizací. Obvyklé soustavy rozpouštědel pro sloučeniny vzorce I ve kterých K znamená N, Q znamená O a T znamená R3O-CH2 zahrnují chloroform ; methanol, ethylacetát ; hexan a methylenchlorid : methanol. Krystalizace eluátú pak může být provedena z methanolu, ethylacetatu, hexanu nebo chloroformu.

Obvyklé soustavy rozpouštědel pro sloučeniny vzorce I ve kterých K znamená N, Q znamená 0 a T znamená RiR2N-C=O zahrnují chloroform : methanol. Krystalizace eluátů se pak může provést z 50-100% ethanolu (vodného).

Obvyklé soustavy rozpouštědel pro sloučeniny vzorce I ve kterých Q znamená CH2, K znamená N nebo CH2 a T znamená RiR2N-C=O, zahrnují methylenchlorid-methanol. Eluáty mohou být krystalizovány z ethylacetatu s nebo bez methanolu, ethanolu nebo hexanu.

Sloučeniny vyžadující neutralizaci mohou být neutralizovány mírnou baží jako je hydrogenuhličitan sodný a potom promyty methylenchloridem a solným roztokem. Produkty, které se po přečištění získají ve formě oleje se někdy před konečnou krystalizací triturují s hexanem/ethanolem.

• · • ·

Dále je uveden zlepšený způsob přípravy v podstatě opticky čistého 2-substituovaného-2-amino-l-(heteroar-2- nebo 3-yl)-ethanového derivátu. 2-(heteroaryl)ethy1 aminy a jejich alkylové a rylové deriváty byly připraveny různými způsoby zahrnujícími redukci 2-b-nitroviny1heteroary1ových sloučenin připravených z heteroary1formaldehydů (viz například W.Foye a

S.Tovivich, J.Pharm.Scien. 68(5), 591 (1979), S.Conde a sp.,

J.Med.Chem. 21(9), 978 (1978), M.Dressler a M.Joullie,

J.Het.Chem. 7, 1257 (1970)); redukci kyanmethylheteroary1ových sloučenin (viz například B.Crowe a F.Nord, J.Org.Chem. 15, 81 (1950), J.McFarland a H.Howes, J.Med.Chem. 12, 1079 (1969)); Hoffmanovu degradační reakci 2-(2-thieny1)propylamidu (viz například G.Barger a A.Easson, J.Chem.Soc. 1938, 2100); a aminaci 2-(2-thieny1)ethy1paratoluensulfonatů, U.S.Patent č.4,128,561.

Uvedený způsob zahrnuje reakci chirálního 2-substituovaného derivátu ethylenoxidu s 2- nebo 3-yl“ radikálem heteroarylové sloučeniny, a převedení hydroxyskupiny vzniklé v uvedené reakci stereospecifickými prostředky na aminoskupinu. Tento způsob je znázorněn níže na schématu M.

Reakční schéma M

Het :© o

Z-7-X .

\ub ⁺ nebo

Sub

Het

Sub v

» · · · · · • · · • · · · kde Sub znamená substituční skupinu na uvedeném chirálním ethylenoxidu a Het znamená heterocyklickou skupinu.

Výhoda tohoto způsobu vůči způsobům přípravy

2- substituovaných-2-amino-l-(heteroar-2- nebo 3-yl)ethanových derivátů známých v oboru je v tom, že se připraví přímo v podstatě opticky čistý derivát na rozdíl od racemické směsi která pak musí být dalšími způsoby rozštěpena k získaní opticky čistých isomerů.

Výhodnou třídou zahrnutou v tomto způsobu je třída, kde heteroar-1- nebo 3-ylová skupina je substituovaná nebo nesubsti tuovaná thi en-2- nebo 3-ylová skupina nebo substituovaná nebo nesubstituovaná benzothiofen-2- nebo

3- ylová skupina.

Výhodnější třídou zahrnutou v tomto způsobu je ta, kde uvedený aniont se vytvoří reakcí substituovaného nebo nesubstituovaného thiofenu nebo benzothiofenu majícího v poloze 2- nebo 3- vodíkový substituent, s organokovovou baží v aprotickém polárním rozpouštědle.

Jinou výhodnější třídou zahrnutou v tomto způsobu je ta, ve které uvedený chirální 2-substituovaný ethylenoxid je substituován v poloze 2-skupinou vybranou ze skupiny zahrnující alkyl, aryl, trihalogenmethyl a benzyloxy.

Nejvýhodnější třídou zahrnutou v tomto způsobu je ta, ve které uvedenou organokovovou baží je alkyl lithium nebo 1 ithiumdiisopropyíamid, uvedeným aprotickým organickým rozpouštědlem je tetrahydrofuran, ether, hexan nebo směs těchto rozpouštědel, a uvedeným chirálním 2-substituovaným ethylenoxidem je 2-alkylethylenoxidový derivát.

ft* • ft

V ft • · ft «ft ftft • · « · « · • · · · · ft ft · ft · · · ft · · · • ftft ftft < · • ft • · · ftft· · « « ft · • · ftft

Prostředky pro stereospecifickou konverzi hydroxyskupiny na aminoskupinu jsou v oboru dobře známé (viz například Mitsunobu, Synthesis 1981 (1), 1).

Mělo by být zřejmé, že (R)- nebo (S)-2-substituované2-hydroxy-l-heteroarylethanové deriváty lze připravit přímo jak je popsáno výše použitím odpovídajících (S) nebo (R)2-substituovaných ethy1enoxidových derivátů, nebo, je-li to žádoucí, vzniklj' (R) nebo (S)-2-substi tuovaný-2-hydroxy-lheteroarylethan převést na odpovídající (S) nebo (R)-2substituovaný-2-hydroxy-l-heteroarylethanový derivát způsoby v oboru dobře známými pro inverzi konfigurace na hydroxylové skupině (viz například Mitsunobu, Synthesis 1981 (1), 1).

Specifické provedení tohoto způsobu zahrnuje: (a) substituovaný nebo nesubstituovaný thiofen nebo benzothiofen mající v poloze 2- nebo 3- vodíkový substituent se zpracuje s butyllithiem při snížené teplotě například asi -30 °C, ve směsi tetrahydrofuranu a hexanů, a po dobu dostatečnou k tvorbě aniontu uvedeného thiofenu nebo benzothiofenu; (b) Pak se přidá (S) nebo (R)-2-alky1ethy1enoxid a směs udržuje při vyšší teplotě, například asi 0 °C, po dobu dostatečnou k tvorbě odpovídajících (R) nebo (S)-2-alkyl-2-hydroxy-lthienyl- nebo benzothiofenyl-ethanových derivátů; a (c) převedení hydroxyskupiny uvedeného ethanového derivátu na aminoskupinu stereospecifickými prostředky.

Uvedený způsob je dále znázorněn a vysvětlen pomocí příkladů 50 až 74 uvedených níže.

Příklady 1-3 popisují přípravu prekurzorových sloučenin používaných při přípravě sloučenin vzorce I popsaných níže.

• *- ♦ fl · · · · · · · * · · «« · · · · · ··· · · · '···«· · » ♦ · « · · flfl · · ·· 44

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava 6-chlor-2',3'-dimethyl-methylendioxy-N-5'-ethylkarboxamidoadenosinu

Stupeň 1: 2',3'-dimethylmethylenový derivát 6-chlorpurinribosidu

6-Chlorpurinribosid (31,5 g), triethylortomravenčan (73 ml) a TsOH (19,8 g) se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti v 600 ml acetonu. Pak se reakční směs zahustí ve vakuu, spojí se s ethylacetátem, promyje se nasyceným roztokem NaHCO₃ a solným roztokem a zahuštěním se získá ve formě bílé pevné látky 2',3'-dimethylmethylenový derivát 6-chlorpurin-ribosidu.

Stupeň 2: kyselina 6-chlor-2',3¹-dimethylmethylendioxyadenosin-5'-karboxylová

Produkt ze stupně 1 (10 g) se podrobí oxidaci podle Jonese, kyselina se extrahuje z ethylacetátu 2,5% roztokem NaOH, vodný podíl se promyje ethylacetátem, okyselí se koncentrovanou HCl a extrahuje se ethylacetátem. organická vrstva se promyje H₂O a solným roztokem, vysuší se (Na₂SO₄), zfiltruje se a zahuštěním ve vakuu do sucha se získá požadovaná 5'-karboxylová kyselina.

Stupeň 3: 6-chlor-2',3-dimethylmethylendioxy-N-5'-ethylkarboxamid-adenos in

Produkt ze stupně 2 (5,7 g) se míchá s BOP-C1 (bis-(2-oxo-3-oxazoladinyl)chlorid kyseliny fosforné) (4,26 g) a s triethylaminem (2,33 ml) 20 minut při teplotě místnosti ve 100 ml methylenchloridu. Do tohoto roztoku se pak vmísí ethylamin (3,46 g) a roztok se pak míchá 2 hodiny při teplotě místnosti. Organický podíl se promyje zředěnou HCI, zředěným NaOH, H₂O, solným roztokem a vysušením (Na₂SO₄) se získá konečný produkt ve formě pěny.

Příklad 2

Příprava (+)-2S-[2a,3a-dimethylmethylendioxy]-4p[6-chlor-9-adenyl]cyklopentan-l-p-N-ethyl- karboxamidu.

Stupeň 1: 5,6-dimethylendioxy-2-azabicyklo[2,2,1Jheptan3-onu

5,6-Dihydroxy-2-azabicyklo[2.2.1]heptan-3-on (23,5 g) (Aldrich) nebo připravený způsobem podle práce Čermák a Vince, Nucleic Acid Chemistry, Improved and New Synthetic Procedures, Methods and Techniques, část 3, str.26 (J.Wiley 1986) se rozpustí v acetonu (150 ml) obsahujícím 2,2-dimethoxypropan (185 ml) a kyselinu p-toluensulfonovou (5,25 g) a tato směs se zahřívá 10 minut při teplotě zpětného toku, ochladí se, zpracuje se s NaHCO₃ (9,3 g) a zahustí se ve vakuu. Zbytek se rozpustí v CH₂C1₂, promyje se solným roztokem, vysuší se MgSO₄ a odpařením rozpouštědla se získá olej. Chromatografií tohoto oleje přes SiO₂ (ethylacetát.-hexan, 4:1) se získá 17,0 g (63 %) tříslově bílé pevné látky (t.t. 153-154 °C).

Stupeň 2: (+)-4p-amino-2a,3a-dimethylendioxycyklopentanΙβ-N-ethyl- karboxamid (A) 5,6-5,6-Dimethylendioxy-2-azabicyklo[2.2.1]heptan-3• * • · » · · · ···· ··· ··· » · · · · « ·· «» ·>· ·v ·· ac ·· on (5 g) připravený ve stupni 1 se zpracovává asi 7 hodin při 140 °C s ethylaminem (15 ml). Získaný produkt se přečistí rychlou chromatografií (CH₂Cl₂/CH₃OH/N,N-dimethylethylamin, 90/7/3) a získá se tak (±)-4p-amino-2a,3a-dimethylendioxycyklopentan-ip-ethylkarboxamid (5,8 g).

(B) Zpracováním racemického aminu (13,1 g) připraveného způsobem uvedeným v části A s kyselinou D-dibenzoylvinnou (21,6 g) se získá 15,1 g enantiomerně čisté soli, [a]_D teplota místnosti=+70,1 (c 1,77, CHgOH). Tato sůl se rozpustí v 10% vodném NaOH a vodná fáze se extrahuje ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se promyji solným roztokem, vysuší se MgSO₄ a odstraněním rozpouštědla se získá opticky čistá sloučenina; [a]_D teplota místnosti = +31,4 ° (c 1,40, MeOH).

Stupeň 3: 4-p-(3-amino-4-chlor-2-pyrimidinylamino)-2,3dimethylen-dioxycyklopentan-ip-N-ethyl-karboxamid.

Kondenzací (+)-43~amino-2a,3a-dimethylendioxycyklopentanΙβ-N-ethyl-karboxamidu (2,10 g), připraveného ve stupni 2, části B, s 3-amino-2,4-dichlorpyridinem (1,5 g) v n-butanolu (70 ml) obsahujícím triethylamin (3 ml) prováděnou po dobu asi 14 hodin při teplotě zpětného toku s následným odstraněním rozpouštědla ve vakuu se získá olej, který se rozpustí v ethylacetátu a promyje se vodným NaHCO₃. Organický extrakt se vysuší Na₂SO₄ a zahuštěním ve vakuu se získá opticky čistá sloučenina; [a]_D teplota místnosti = +15,8 ° (c 41,48, CH₃OH).

Stupeň 4: (+)-4β-(3-amino-4-chlor-2-pyrimidinylamino)2a,3a-dimethylen-dioxycyklopentan (2,10 g), formamidinacetat (1,85 g) v methoxyethanolu (2 ml) a dioxanu (80 ml) se míchají asi 3 hodiny při 70 °C. Tato směs se pak ochladí na teplotu místnosti a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Zbytek se

A t

»

Μ

• · · * • » · · · rozpustí v ethylacetátu, promyje se vodným NaHCCb a solným roztokem, organický extrakt se vysuší NazSCU, zahustí se ve vakuu a přečištěním rychlou chromatografíí na sloupci (methylenchlorid/methanol 95:5) se získá čistý (+)-[2a,3adime thy 1 methy 1 end i oxy] -4β- [ 6-chl or-9-adeny 1 jcyklopentan-ΐβN-ethyl-karboxamid (1,45 g) .

Alternativně lze připravit podle reakčního schématu v příkladu 3 opticky čisté 2a , 3a-d i chráněné dioxy-4(B-6subs t i tuované-9-adeny1-cyklopentan-1β-N-ethy1- karboxami dové deriváty.

Příklad 3

Příprava 2S-[2a,3a-cyklohexylidendioxy]-43-[N6-(2-thienethan2-yl)-9-adenyl]cyk1 opentan-Ιβ-Ν-ethyl-karboxamid.

Stupeň 1: 4β-βΐ1ιν1 en-2a , 3a- [cykl ohexyl idendioxy] cyklopentanon, (-)-2a,3a-[cyklohexy1 idendioxy]-4-cyk1opentanon (2,95 g), připravený způsobem podle práce Borchardt a sp., J.Org.Chem 1987, 52, 5457, se přidá ve formě roztoku v THF (5 ml) ke směsi vinylmagnesiumbromidu (15,2 mmol) a Cul (15,2 mmol) v THF (100 ml). Tato směs se udržuje asi 2 hodiny v atmosféře inertního plynu při -78 °C, pak se ohřeje na 0 °C a zalije se nasyceným vodným NH4CI. Organická fáze se promyje solným roztokem, vysuší se MgSO4 a zahuštěním ve vakuu se získá žlutý olej, ze kterého se přečištěním rychlou chromatografíí (methylenchlorid 100 %) získá 2,9 g požadované sloučeniny ve formě oleje.

Stupeň 2: 4β—ethylen-l^-hydroxy-2a,3a-[cyklohexyliden48 dioxy]cyklopentan.

3,95 ml IM roztoku diisobutylaluminiumhydridu v tetrahydrofuranu se přidá k roztoku ketonu připraveného ve stupni 1 (0,73 g) v THF (75 ml) ochlazeného na -78 °C. Tato směs se zahřeje během asi 2,5 hodiny na -40 °C, zpracuje se s 2N NaOH (5 ml), ohřeje se na teplotu místnosti a míchá se asi 1,5 hodiny. Vodná fáze se pak extrahuje diethyletherem, spojené organické fáze se promyjí solným roztokem, vysuší se MgSO4 a zahuštěním ve vakuu se získá žlutý olej, ze kterého se přečištěním rychlou chromatografií (methylenchlorid/methanol, 95:5) se získá 0,65 g čistého produktu ve formě viskosního oleje.

Stupeň 3: 4(5-ethy len-l(l-tr i f luormethansulfonyl-2,3[cyklohexylidendioxy]cyklopentan.

Roztok 4p-ethylen-lp-hydroxy-2a,3 a-[cyk1ohexy1idend i oxy]cyklopentanu (0,65 g) v methylenchloridu (5 ml) a pyridinu (0,24 ml) se přidá v atmosféře argonu k míchanému roztoku trifluormethylsulfonylanhydridu (0,49 ml) v methylenchloridu při 0 °C. Po asi 20 minutách se k reakční směsi přidá solný roztok, organická fáze se vysuší Na2SO4, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a získá se tak požadovaný produkt ve formě oranžového oleje, který se použije bez dalšího čištění.

Stupeň 4: l-p-ethylen-[2a,3a-cyklohexylidendioxy]-4-p[N6-(2-thienylethan-2-yl)-9-adeny1]cyk1opentan.

Roztok N6-thiofenylethylpurinu (2,13 g), NaH (50% olejová disperze, 0,35 g), a 18-crown-6 (0,15 g) v DMF (60 ml) se přidá k roztoku 40-ethy1en-1 β-trifluormethylsu1fony1-2a,3a[cyklohexylidendioxy]cyklopentanu připraveného ve stupni 4 v * · · · · ·· · 4 · · · t · · ···· 4 » · · • · « » · ··· w 4 4 4 · · · ······ 4 4

4 ··· 4 * « · 4 4 4 t>

DMF (2 ml) při teplotě 0 °C. Tato směs se míchá asi 8 hodin při 0 °C, pak se zalije nasyceným NHaCI, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a zbytek se spojí s ethylacetátem (100 ml) a solným roztokem. Organická vrstva se vysuší MgSOá, zahustí se ve vakuu a surový produkt se přečistí rychlou chromatografií (methylenchlorid/methanol, 99:1) a získá se tak 0,85 g čistého produktu.

Stupeň 5: 2S-[2a,3a-cyklohexy1idendioxy]-4β-[N6-(2thi eny1e than-2-y1)-9-adeny1]cyklopentan-l-β-Ν-ethy1-karboxamid

Roztok 1β-ethy1en-[2a,3a-cyk1ohexy1 idendi oxy]-4-β-[N6(2—thienylethan-2-yl)-9-adeny1]cyklopentan (0,32 g) ve 2 ml benzenu se přidá k benzenovému roztoku manganistanu draselného (0,29 g) a 18-crown-6 (0,016 g) při 0 °C. Reakční směs se udržuje asi 6 hodin při teplotě místnosti, přidá se 5% vodný NaOH (15 ml) a vodná fáze se zfiltruje přes Celit^R, okyselí se na pH 5 IN HCl, a extrahuje se ethylacetátem. Organické extrakty se vysuší MgSO-j a zahuštěním ve vakuu se získá 0,1 g [2a , 3a-cyklohexy 1 idendioxy]-4(3- [N6-(2-thi eny 1 ethan-2-y 1 )-9adenyl]cyklopentan-l-p-karboxylatu ve formě žlutého oleje, který se rozpustí v methylenchloridu (4 ml) obsahujícím dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (0,044 g). Ke směsi se přidá ethylamin (0,4 ml), míchá se asi 18 hodin při teplotě místnosti, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a přečištěním surového produktu rychlou chromatografií (methylenchlorid/ methanol 98:2) se získá 0,077 g čistého produktu.

Příklad 4

Příprava N6-[trans-2-(thiofen-2-yl)cyklohex-4-en-y1]adenos in.

Trans-2-(2'-thiofeny1)-cyklohex-4-enylamin (0,3 g) připravený způsobem uvedeným výše v příkladu C, 6-ch1orpurinribosid (0,28 g) , a triethylamin (0,27 ml) v 20 ml ethanolu se zahřívají v 20 ml ethanolu přes noc při teplotě zpětného toku a v atmosféře argonu. Pak se reakční směs ochladí na teplotu místnosti, rozpouštědlo se odstraní a přečištěním pomocí MPLC (chloroform:methano1, 95:5), potom vysušením ve vakuu při asi 80 °C se získá konečný produkt ve formě pevné látky, t.t. 105110 °C; elementární analýza, C20H23N5O4S.

Příklad 5

Příprava N6-[trans-2-(thiofen-2-yl)cyklohex-4-en-l-yl]adenosin-5'-ethylkarboxamidu.

Stupeň 1: (+)-trans-2-(thiofen-2-yl)-cyklohex-4-enylamin a 2',3'-dimethylmethylendioxy-derivát 6-C1-NECA se nechají reagovat za podmínek uvedených v příkladu 4 a získá se tak 2',3'-dimethylmethylendioxy-derivát konečného produktu.

Stupeň 2: 2',3’-dimethylmethylendioxyderivát požadovaného produktu se mísí při teplotě místnosti po dobu 30 minut s kyselinou trifluoroctovou/vodou (90/10), zneutralisuje se pomalým vlitím této směsi do nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, a směs se extrahuje methylenchloridem. Vodná vrstva se vyextrahuje methy1enchloridem, organické vrstvy se spojí, promyjí se solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým a zfiltrují se, zfiltrovaný čirý roztok se pak odpaří. Zbytek se pak přečistí rychlou chromatografií (methy1enchlorid:methano1 9:1) a po vysušení ve vakuu se tak získá konečný produkt ve formě skelné Pěny; t.t. 112-117 <>C; C22H26N6O4S.

Příklad 6

Φ * · · * · · φ · * * φ » * φφφφ ···· φ · · φ φ φ φφφφ φφφ φφφ φφφ φφφ φφ φφ φ · φ φ» «φ φφ φφ

Příprava (-)-[2S-[2a,3a-dihydroxy-4-p-[2-(5-chlor-2-thienyl)(IR)-1-methylethyl]amino]-9-adenyl]cyklopentan]-Ι-β-N-ethylkarboxamidu

Stupeň 1: opticky čistý (+)-[2S-[2a,3a-dimethylmethylendioxy]—4—β — (6-chlor-9-adenyl)]cyklopentan-l-^-N-ethylkarboxamid, připravený způsobem podle příkladu 2, a 2'R-(5chlorthien-2-yl)-2-propylamin, [a]_D teplota místnosti=-15,6 (c 3,7, CH3OH), připravený způsobem podle příkladu 4, se spojí jak je uvedeno v příkladu 4 a získá se tak 2,3-dimethylmethylendioxyderivát konečného produktu.

Stupeň 2: tento dimethylmethylendioxyderivát připravený ve stupni (1) se zahřívá v 5 ml 50% vodné kyseliny mravenčí asi 3 hodiny při teplotě zpětného toku. Ochlazená reakční směs se odpaří, k pevnému zbytku se přidá toluen a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu, promyje se roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solným roztokem, vysuší se, zfiltruje se a po sušení v sušárně přes noc se získá bílý pevný produkt (0,240 g); t.t. 188 až 184 °C; C₂₀H₂₅N₆S0₃C1, [a]_D teplota místnosti = -86,49 ⁰ (c 5,5, MeOH).

Příklady 7 až 29 a 31 až 34

Sloučeniny uvedené v tabulce I se připraví podle obecných způsobů uvedených v příkladech 1 až 6. V příkladech 7 až 21, 31, a 32 heterocyklický amin reaguje s obchodně dostupným

6-chlorpurinribosidem; v příkladech 22 a 23 heterocyklický amin reaguje s N6-chlor-5'-N-ethylkarboxamidadenosinem; a v příkladech 24 až 31, 33 a 34 heterocyklický amin reaguje bud s (±) nebo (+)-[2S-[2a,3a-dimethylmethylendioxy]-4-p-(6-chlor9-adenyl)]-cyklopentan-l-p-N-ethylkarboxamidem « ·

	• » · ···· » · v · » · · « · · ···« «·· «·* «·· · · · « · • · ··« ·· · · · · · ·
Příklad/	amin	Tabulka I	produkt t.t./
reak.schéma			OC

7(F)

8(F)

N6-[trans-2-(thiofen- 165-170

2- y1)-cyklohex-1-y1]adenos i n

N6-[trans-2-(thiofen- 99-105

3- y1)-cyk1ohex-4-en1—y1]-adenos in

9(C)

10(C) nh₂

N6-[2—(2'-aminobenzo- 218-219 thiazolyl)ethyl]~ adenos i n

N6-[2-(2'-thiobenzo- 149-150 thiazolyl)-ethyl]adenos in

Π (C)

N6-[2-(6'-ethoxyl-2'- 154-155 thi obenzothi azolylethyl]adenos in

N6-[2-(4'-methylthiazol-5'-yl)ethyl]adenos in

202-203

12(H) « · • « · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 · 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Tabulka I (pokračování)

Příklad/ amin produkt reak.schéma

t.t./ °C

13 (G)	Fit	N6-[2-(2'-thiazolyl)- ethyl]adenos in	181-183
1 4 (H)	K’N—v, «Α	N6-[2-(2'-methy1-4’- thiazolyl)-ethyl]~ adenos i n	116-118
15(D)		N6-[(R)-l-methyl-2- 133-134 (2'-benzo[b]-thiofenyl)- ethyl]adenos ina
16 (G)	ζ^ΜΗ,	N6-[2-(4'-feny1- 2'-thiazolyl)- ethy1]adenos in	124-126
17(1)		N6-[2 - (1,1-dimethy1- 2'-thiofenyl)- ethyl]adenos in	172-176
18(G)	NH2	N6-[2-(4'-methyl- 2'-thiazol- methyl]adenos in	104-105

• ·

Příklad/ reak.schéma (G)

20(D) (D)

22(F^d)

23(C^d) • · to to · · · · · to to • · · toto · to··· · ·· ··· • toto · · · ·· ·· ··· ·· ·· ·· ··

Tabulka I (pokračování) amin produkt t.t./ °C

N6-[4-f enyl-2thiazolyl)methyljadenosin

137-139

N6-[1-(thiazo1-2-y1)- 99-106 prop-2-y1]adenos i n

N6-[1-(5''-chlor- 135-136 thien-2''-y1)-2butyl]adenosin

N6-[trans-2-thiofen- 108-112 2-yl)-cyklohex-4-en-1 -y1]adenos in-5-Nethy1karboxamid^b

N6-[2-(2'-(amino- 123-124 benzothiazolyl)ethyl]adenos in-5-N-ethy1karboxamid (±)-N6-[2-(4''-methy1- 92-93 5''thiazolyl)ethyl]karbocyklický adenosin-5' N-ethy1karboxamid

24(H)

• · · · · ·

Tabulka I (pokračování)

Příklad/ amin produkt reak.schéma

t.t./ °C (G)

NH, (D)

28(E))

(±)-N6-[2-(2’- 170 thiazolyl)ethyl]karbocyk1 ický adenosin5'-N-ethylkarboxamid (—)—N6—[(thiofen-2'185-187 yl)ethan-2-y1]karbocyklický adenosin5'-N-ethylkarboxamid (-)-N6-[(R)-1- 85-87 (thiofen-2-yl)prop2- y1]karbocykli cký adenos in-5'-N-ethy1karboxamid^c (±)-N6-[l-(thiofen- 195-198

3- yl)ethan-2-y1]karbocyklický adenosin5'-N-ethylkarboxamid

(±)—N6—[2—(2'-amino- 209-211 benzothiazolyl)ethyl]karbocyklický adenosin5'-N-ethylkarboxamid

29(C)

Tabulka I (pokračování)

Příklad/ amin produkt reak.schéma

t.t./

OC • ·

31 (D)		N6-[l-ethyl-2- 137-139 (3-chlorthi en-2y1)- ethyl]adenos in
32(D)	cl_	N6-[l-methyl-2- 137-139
	ϊ	(3-chlorthien-2-yl)-
		ethyl]adenosin
33 (D)	„Xo	(-)-[2S-[2a,3a- 88-91
	dihydroxy-4b-[N6-
	HjN S	[2-(3-chlor-2-thi eny1)- 1(R,S)-ethylethyl]amino]- 9-adenyl]cyklopentan-lb- ethy1karboxamid
34	CL	(-)-[2S[2a,3a- 95-96
		d i hydroxy-4h-[N6-[2-
	(3-chlor-2-thienyl)-l(R)- ethylethyl]amino]-9-adenyl]- cyklopentan-1b-ethyl- karboxamid
a /	optická otáčivost	alkoholového prekurzoru aminu:
	[a] teplota místnosti=+14,90 (c 1,27, CH3OH),

^b1 optická otáčivost aminu: [a] teplota mí stnosti=+25,8° (c 1,67, CH3OH), • * » ···· ···· • · · · · · ···· ··· ··· • · · · · · · · • · ··« · · 9 9 9 9 9 9 ^c/ optická otáčivost; [a] teplota místnosti=-15,6° (c 3,04, CH₃OH), ^d/ amin reaguje s 2',3'isopropy1idenovým derivátem

N6-chlor-5'-N-ethylkarboxamid- adenosinu; odstranění chránící skupiny se provede způsobem podle příkladu 1 1 .

Příklad 30

Příprava (±)-N6-[l-(thiofen-2-yl)ethan-2-yl]-N'-1-deazaari steromycin-5'-N-ethylkarboxamidu.

Stupeň 1: 2-chlor-3-nitro-4-[2-(2-thiofenyl)ethy1]aminopyridin.

Směs 2,4-dichlor-3-nitropyridinu (1,5 g), 2-aminoethylthiofenu (1 g) a triethylaminu (5 ml) se zahřeje na teplotu zpětného toku v EtOH (60 ml). Pak se reakční směs ochladí, rozpouštědlo se odpaří a chromatografií zbytku na silikagelu (10% hexan/CHaCl2) se získá požadovaný adiční produkt.

Stupeň 2: (±)-13-N-ethylkarboxamid-2a,3a-isopropylidendioxy-43~[2-(3-nitro-4-[2-(2-thiofenyl)ethyl]aminopyridyl)ami no]cyk1opentan.

Směs thiofenylaminopyridinu ze stupně (1) (1,8 mmol), (±)-1β-N-e thy1karboxamid-4p-amino-2a,3a-isopropylidendioxycyklopentanu (0,3 g) a triethylaminu (0,3 ml) se zahřívá v nitromethanu (15 ml) asi 5 hodin při teplotě zpětného toku. Pak se rozpouštědlo odstraní, zbytek se vyjme do methylenchloridu a chromatografií na silikagelu (2% methanol/ • ·· · · ·· · • · · · · · · · • · · · · · ··· ··· • · · · · • · · · · · ·· chloroform) se získá produkt, který se použije v dalším s tupni.

Stupeň 3: (±)-ip-N-ethylkarboxamid-2a,3a-isopropylidendioxy-4(S-[2-(amino-4-[2-(2-thiofenyl)ethyl]aminopyridyl)amino]cyklopentan.

Směs nitros1oučeniny připravené ve stupni (2) (0,39 g), Pd/C (0,01 g) v ethanolu (7 ml) se míchá asi 5 hodin v atmosféře vodíku. Katalyzátor se odfiltruje a odpařením filtrátu se získá olej, který se přečistí na florisilu (10% methanol/methylenchlorid) a získá se tak požadovaný produkt ve formě pevné látky.

Stupeň 4: (±)-N6-[1-(thiofen-2-y1)ethan-2-y1]-N'-1deazaari steromycin-5'-N-ethylkarboxamid.

Směs aminosloučeniny připravené ve stupni (3) (0,31 g) a formamidinace tátu (0,72 g) v methoxyethanolu (30 ml) se zahřívá asi 3 hodiny při teplotě zpětného toku. Pak se reakční směs ochladí, rozpouštědlo se odpaří a ke zbytku se přidá voda (5 ml) a kyselina mravenčí (5 ml). Tato kyselá směs se zahřívá asi 5 hodin při 50 °C, pak se rozpouštědlo odstraní a chromatografií zbytku na silikagelu (10% methanol/ methylenchlorid) se získá olej, který rekrystalizací z ethylacetátu poskytne požadovaný produkt ve formě krystalické pevné látky; t.t.=155-156 °C.

Optická čistá sloučenina se připraví použitím + nebo enantiomeru cyklopentanaminu ve stupni (2).

Příklad 35

Příprava (2S)-2a,3a-dihydroxy-4P~[N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)(lR)-l-methylethyl]amino-9-adeny1]cyklopentan-1β-N-ethylkarboxami d-N1-oxi du.

Roztok 2S-2a,3a-d ihydroxy-43~[N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)(1R)-1-methy1ethy1]ami no-9-adeny1]cyk1opentan-1 β-N-ethy1karboxamidu (0,25 g) a ledové kyseliny octové (20 ml) v 30% peroxidu vodíku (1 1) se míchá 4 dny při teplotě místnosti a pak se směs zahustí ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií za použití 20% methanolu v ethylacetátu jako elučního činidla, míchá se s horkým methanolem a filtrací se získá požadovaný produkt; t.t.> 240 °C.

Příklad 36

Příprava [1S-[1 a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(5-chlor-2-thi eny1)1-methylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-e thy12,3-d i hydroxycyklopentankarboxami du.

Stupeň 1: příprava 2-ch1or-4-[2-(5-chlor-2-thieny1)-(1R)1-methy1ethy1]amino-3-ni tropyrid i nu.

Požadovaný produkt se připraví z 2-(5-chlor-2-thienyl)(lR)-l-methylaminu v zásadě s použitím způsobu podle příkladu 30, stupně 1 a přečištěním produktu rychlou chromatografií s gradientovou elucí 10% až 30% ethylacetátem v heptanu.

Stupeň 2: příprava (-)-1p-N~ethyl-2a,3a-isopropylidendioxy-4p-[4-[2-(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethyl]amino-3ni tro-2-pyridy1]ami nocyk1opentankarboxamidu.

2-chlor-4-[2-(5-chlor-2-thi eny1)-(IR)-1-methy1ethy1]• · · · • · · · amino-3-nitropyridin (0,68 g), (-)-lb-N-ethyl-2a,3aisopropy1idendioxy-4b-aminocyklopentankarboxamid (0,381 g) a triethylamin (0,85 ml) se spojí v ethanolu (50 ml) a směs se zahřívá asi 18 hodin při teplotě zpětného toku. Tato směs se pak zahustí ve vakuu a rychlou chromatografií za použití 0,5% methanolu v methylenchloridu jako elučního činidla se získá požadovaný produkt.

Stupeň 3: příprava (-)-1p-N-ethyl-2a,3a-isopropy1idendi oxy-43~[3-amino-4-[2-(5-chlor-2-thienyl)-(IR)-1-methylethyl ] amino-2-pyridy1]aminocyklopentankarboxamidu.

(-)-1β-N-ethy1-2a,3a-isopropylidendioxy-4p-[4—[2—(5— chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethy1]ami no-3-ni tro-2pyridyl]aminocyklopentankarboxamid (0,9 g) a dihydrát chloridu cínatého (II) (2,1 g) se spojí v ethanolu (20 ml) a směs se zahřívá asi 30 minut při 70 °C. Pak se směs vlije na led, slabě se zalkalizuje vodným hydrogenuhličitanem sodným a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetatový roztok se vysuší síranem hořečnatým a zahuštěním ve vakuu se získá požadovaný produkt který se použije bez dalšího čištění v následujícím stupni.

Stupeň 4: příprava [lS-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[[7-[[2(5-chlor-2-thienyl)-1-methylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethy1-2,3-dihydroxycyklopentankarboxamidu.

Požadovaný produkt o t.t. 164-165 °C se připraví z (-)-1β-N-ethy1-2a,3a-isopropylidendi οχγ-4β-[3-amino-4-[2(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethyl]amino-cyklopentankarboxamidu v zásadě s použitím způsobu podle příkladu 30, stupně 4.

• · · • · · ·· · · · · • · · · · · • · ··· ·· ··

Sloučeniny podle dalších příkladů se připraví z vhodných výchozích složek v podstatě způsoby podle příkladu 30.

Příklad 37 [IS-[la,2b,3b,4a]]-4-[7-[[2-(3-chlor-2-thienyl)-1-ethylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]-pyridin-3-yl]-N-ethyl-2,3-dihydroxycyklopentankarboxamid; t.t. 79-82 °C.

Příklad 38 [IS-[la,2b,3b,4a]]-4-[7-[[2-(2-thienyl)-1-isopropylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethyl-2,3-dihydroxycyklopentankarboxamid; t.t. 75-85 °C.

Příklad 39 [lS-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-chlor-2-thienyl)-lethylethylJamino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethyl2,3-dihydroxycyklopentankarboxamid; t.t. 75-78 °C.

Příklad 40 [IS-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(2-thienyl)-1-methylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethyl-2,3-dihydroxycyklopentankarboxamid; t.t. 155-160 °C.

Příklad 41

Příprava [lS-[la,2b,3b,4a]]-4—[7—[[2-(5-chlor-2-thienyl)-lethylethyl]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethyl2,3-dihydroxycyklopentankarboxamid.

• · · ·

Požadovaný produkt o t.t. 77-85 °C se připraví z 2-(5-chlor-2-thieny1)-(1R)-1-ethy1ethy1aminu s použitím v podstatě stejných způsobů jako v příkladu 36.

Příklad 42

Příprava (2S)-2a,3a-bi s-methoxykarbonyloxy-4p-[N6—[2—(5— chlor-2-thienyl)-(lR)-1-me thy1 ethyl]amino-9-adeny1]cyklopentan-1 β-N-ethy1karboxami du.

K roztoku (2S)-2a,3a-dihydroxy-43-[N6-[2-(5-chlor-2thienyl)-(lR)-lmethylethyl]amino-9-adeny1]cyklopentan-1βN-ethylkarboxamidu (0,56 g), triethylaminu (0,5 ml) a

4-dimethylaminopyridinu (] mg) v tetrahydrofuranu (25 ml) se přidá methylchlormravenčanan (0,21 ml) a roztok se míchá 1 hodinu při teplotě místnosti. Tato směs se zředí ethylacetátem, promyje se solným roztokem, a organický roztok se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahustí se ve vakuu. Rekrystalizací surového produktu z hexanu/ethylacetatu se získá požadovaný produkt; t.t. 74-76 °C.

Příklad 43

Příprava (2S)-2a,3a-dihydroxy-40~[N6-[2-(5-chlor-2-thieny1)(1R)-1-methylethyl]amino-9-adenyl]cyklopentan-1β-N-ethy1karboxamidu- ethoxymethylen-acetalu.

Roztok (2S)-2a,3a-di hydroxy-4β-[N6-[2-(5-chlor-2th i eny1)-(1R)-1-methy1e thy1]ami no-9-adeny1]cyk1opentan-1βN-ethylkarboxamidu (0,14 g), tri ethylortomravenčanu (3 ml) a kyseliny p-toluensulfonové (1 mg) se zahřívá asi 1 hodinu při teplotě zpětného toku a pak se rozpouštědlo odstraní ve vakuu. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu, roztok se promyje solným • ft • ft ftft • ftft · • ftft · • · · · · · • ft « ftft · • · · · • ftft · · · • · • ft ftft roztokem, vysuší se síranem sodným, zfiltruje se a zahustí se ve vakuu. Surový produkt se přečistí rychlou chromatografií s použitím 5% methanolu v methylenchloridu jako elučního činidla a následnou rekrystali žací z hexanu/ethylacetatu se získá požadovaný produkt; t.t. 67-70 °C.

Příklad 44

Příprava (2S)-2a,3a-dihydroxy-4β-[N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)~ (IR)-1-methylethyl]amino-9-adenyl]cyklopentan-lp-N-ethylkarboxamid-2,3-karbonátu.

Roztok (2S)-2a,3a-dihydroxy-4p-[N6-[2-(5-chlor-2thienyl)-(lR)-l-methylethyl]amino-9-adeny1]cyklopentan-1βN-ethylkarboxamidu (0,17 g) a 1,1'-karbonyldiimidazolu (0,071

g) v benzenu (5 ml) se zahřívá 5 hodin při teplotě zpětného toku a pak se míchá asi 18 hodin při 60 °C. Tento roztok se pak promyje solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a vysuší se ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií za použití 5% methanolu v methylenchloridu jako elučního činidla a následnou krystalizací z hexanu/ ethylacetátu se získá požadovaný produkt; t.t. 87-89°C.

Příklad 45

Příprava (2S)-2a,3a-bi s-methylkarbamoy1oxy-48~[N6-[2-(5chlor-2-thi eny1)-(lR)-l-methylethyl]amino-9-adeny1 ] cyk1opentan-1β-N-ethy1karboxamidu.

K roztoku (2S)-2a,3a-dihydroxy-43-[N6-[2-(5-chlor2-thienyl)-(lR)-l-methylethyl]amino-9-adenyl]cyklopentan1β-N-ethylkarboxamidu (0,16 g) v tetrahydrofuranu (5 ml) se přidá methy1 isokyanatan (0,05 ml) a 1,8-diaza·· · «e ·» ·· ♦·

9··· *··« · · · · ·· · ···» «··· • ♦ · * · * ··· « · ·. · ··· ····*·· · · bicyklo[5,4,O]undec-7-en (1 kapka). Tento roztok se míchá asi 2,5 hodiny při 50 °C, pak se ochladí na teplotu místnosti, zředí se ethylacetátem a promyje se solným roztokem. Organický roztok se promyje solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým a zahustí se ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií za použití 5% methanolu v methylenchloridu jako elučního činidla a následnou krystalizací z hexanu/ethylacetatu se získá požadovaný produkt; t.t.97-99 °C.

Příklad 46

Příprava (2S)-2a,3a-dihydroxy-4p-[N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)(IR)-1-methylethyl]amino-9-adenyl]cyklopentan-^-N-ethylkarboxamid-2,3-thiokarbonat.

Roztok (2S)-2a,3a-dihydroxy-4p-[N6-[2-(5-chlor-2thienyl)-(IR)-1-methylethyl]amino-9-adenyl]cyklopentan-Ιβ-Νethylkarboxamidu (0,35 g) a thiokarbonyldiimidazolu (0,134 g) v benzenu (10 ml) se zahřívá asi 2 hodiny při 45 °C. Roztok se pak promyje solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým a zahustí se ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií za použití 5% methanolu v hexanu jako elučního činidla a následnou krystalizací se získá požadovaný produkt; t.t. 115-117 °C.

Příklad 47

Příprava N6-[2-(3-chlor-2-thienyl)-(IR)-1-methylethyl]-2'-0methyladenosinu.

Roztok 6-chlor-9-(2'-O-methyl-b-D-ribofuranosyl)-9Hpurinu (připravený podle EP publikace č. 0 378 518) (0,28 g),

2-(3-chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethylaminu (0,163 g) a • · · to··· · * · · • » · · · · ···· ··· ··· • to···· · · «· « · · · · ·· ·· ·· triéthylaminu (0,5 ml) v ethanolu (30 ml) se zahřívá asi 18 hodin při teplotě zpětného toku, ochladí se a zahustí se ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií s použitím 10% methanolu v methylenchloridu a následnou krystalizací z hexanu/ethylacetatu se získá požadovaný produkt; t.t.75-76 °C

Příklad 48

Příprava N6-[2-(5-chlor-2-thienyl)-(lR)-l-methylethyl]-2'-0methyladenosinu.

Požadovaný produkt se připraví z 2-(5-chlor-2-thienyl)(IR)-1-methylaminu v podstatě způsobem podle příkladu 47; t.t 84-85 °C.

Příklad 49

Příprava N6-[trans-5-(2-thi eny1)cyklohex-l-en-4-yl]-2'-0methyladenos inu.

Požadovaný produkt se připraví z trans-2-(2-thieny1)cyklohex-4-enylaminu v podstatě způsobem podle příkladu 47; t.t.86-89 OC.

Příklad 50

Příprava 1(P)-2-(5-chlor-2-thieny1)-1-methy1ethy1aminu.

Stupeň 1: příprava 1(S)-2-(5-chlor-2-thieny1)-1-hydroxy1-methy1 ethanu.

Roztok 2-chlorthiofenu (8,17 g) v tetrahydrofuranu (80 ml) se ochladí na -30 °C a po kapkách se přidá roztok 1,6 M • · • · · n-butyllithia v hexanech (43,0 ml). Tato směs se míchá asi 1 hodinu při -30 °C, přidá se (S) propylenoxid (4 g), směs se ohřeje na 0 °C a míchá se při této teplotě asi 3 hodiny. Pak se reakční směs zalije nasyceným vodným roztokem chloridu amonného, zředí se etherem a vrstvy se oddělí. Organická vrstva se promyje solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým a zahuštěním ve vakuu se získá požadovaný produkt.

Stupeň 2: příprava 1(R)-2-(5-chlor-2-thieny1)-1-methy11-f talimidoethanu.

K roztoku 1(S)-2-(5-chlor-2-thieny1)-1-hydroxy-1-methy1ethanu (8,8 g), trifenylfosfinu (13,1 g), a ftalimidu (7,35 g) v tetrahydrofuranu (80 ml) se přidá po kapkách diethylazodikarboxylat (7,9 ml). Tento roztok se míchá asi 18 hodin a pak se rozpouštědlo odstraní ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií s použitím 20% hexanů v methylenchloridu a získá se tak požadovaná sloučenina.

Stupeň 3: příprava l(R)-2-(5-chlor-2-thienyl)-lmethylethylaminu.

1(R)-2-(5-chlor-2-thienyl)-1-methy1-1-ftalimidoethan (13

g) se rozpustí v ethanolu (75 ml), přidá se hydrazin-hydrat (2,5 ml) a směs se míchá při teplotě zpětného toku asi 1 hodinu. Pak se směs ochladí na teplotu místnosti, pevné látky se oddělí filtrací a filtrát se zahustí ve vakuu. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a tento roztok se míchá s 5N vodnou kyselinou chlorovodíkovou. Vrstvy se rozdělí a vodná vrstva se upraví pomocí 10% roztoku hydroxidu sodného na pH > 10 a potom se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahuštěním ve vakuu se získá požadovaný produkt; [a]d=-22,96°, ·· * ·· ·· · · • · · · 3 · · · · · · • · · ·· · · · · · ··· ·· • · · · e · · (c=l 1,5, methano1).

Příklad 51

Příprava 1(R)-2-(2-thieny1)-1-methy1ethy1 aminu.

Stupeň 1: příprava 1(S)-2-(2-thienyl)-l-hydroxy-lmethy1 ethanu.

Požadovaný produkt se připraví z thiofenu v zásadě s použitím způsobu podle příkladu 50, stupně 1.

Stupeň 2: příprava 1(R)-2-(2-thieny1)-1-methy1-1f talimidoethanu.

Požadovaný produkt se připraví z 1(S)-2-(2-thieny1)1-hydroxy-l-methylethanu v zásadě způsobem podle příkladu 50, stupně 2.

Stupeň 3: příprava 1(R)-2-(2-thieny1)-l-methylethylaminu

Požadovaný produkt se připraví z 1(R)-2-(2-thienyl)-lmethyl-l-ftalimidoethanu v zásadě způsobem podle příkladu 50, stupně 3; [a]D=-15,6° (c=t, methanol).

Příklad 52

Příprava 1(S)-2-(5-chlor-2-thieny1)-1-methy1ethy1aminu.

Stupeň 1: příprava 1(S)-2-(5-ch1or-2-thieny1)-1-hydroxy1-methy1 ethanu.

K míchanému roztoku 1(S)-2-(5-chlor-2-thieny1)-1-hydroxy • · • · • * · · · · · · · · · · • · · « · · · ···· 9 ♦ · · · · ···· ··· ··· ·«···· ·· • · ··· ·· · · * · ··

1- methylethanu (5,7 g) v tetrahydrofuranu (100 ml) se přidá trifenylfosfin (5,34 g) a kyselina benzoová (2,49 g). Pak se po kapkách přidá diethylazodikarboxylát (3,22 ml) a směs se míchá asi 18 hodin při teplotě místnosti. Potom se rozpouštědlo odstraní ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií s použitím 30% hexanů v methylenchloridu jako elučního činidla a získá se tak (R)-3-(5-chlor-2-thieny1)2- propylbenzoat. Tento ester (3,91 g) se rozpustí v dioxanu (50 ml) a přidá se 20% vodný hydroxid sodný (15 ml). Směs se zahřívá 3 hodiny při 55 °C a pak se zahustí ve vakuu.

Zbytek se vyjme do ethylacetátu (200 ml), organická vrstva se promyje solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahuštěním ve vakuu se získá požadovaný produkt.

Stupeň 2: příprava 1(S)-2-(5-chlor-2-thienyl)-lmethylethylaminu.

Požadovaný produkt se připraví z 1(S)-2-(5-chlor-2thieny1)-1-hydroxy-1-methy1ethanu v zásadě s použitím způsobů podle příkladu 50, stupně 2 a stupně 3; aD=+21,71° (c=l,1, methano1).

Následující sloučeniny se připraví z příslušných výchozích sloučenin v zásadě s použitím způsobů podle příkladů 50, 51 a 52.

Příklad 53 l(R)-2-(benzothiofen-2-yl)-l-methylethylamin

Příklad 54 • · ·

1(S)-2-(2-thienyl)-l-methylethylamin; aD=15,5° (c=l , methanol)

Příklad 55

1(R)-2-(3-brom-2-thienyl)-l-methylethylamin

Příklad 56

1(R)-2- [5-(2-pyridyl)-2-thi enyl]-1-methy1ethy1 amin

Příklad 57 l(R)-2-[5-(2-thienyl)-2-thienyl]-1-methy1ethylamin

Příklad 58

1(R)-2-(5-feny1-2-thi enyl)-1-methylethylamin

Příklad 59

1(R)-2-(5-methoxy-2-thi eny1)-1-methy1ethylamin

Příklad 60 l(R)-2-(5-methyl-2-thienyl)-l-methylethylamin

Příklad 61

1(R)-2-(5-brom-2-thi eny1)-1-methy1ethy1ami n

Příklad 62 l(R)-2-(5-jod-2-thienyl)-l-methylethylamin • · • ·

Příklad 63 (R)-2-(5-methy1thio-2-thieny1)-1-methyl ethyl amin

Příklad 64

1(R)-2-(5-methy1 sulf ony 1-2-thi eny1)-1-methy1ethy1amin

Příklad 65 l(R)-2-(5-ethyl-2-thienyl)-l-methylethylamin

Příklad 66

1(R)-2-(5-n-hepty1-2-thienyl)-l-methylethylamin

Příklad 67

1(R)-2-(3-methyl-2-thi enyl) -1-methylethylamin

Příklad 68

1(R)-2-(4-methyl-2-thieny1)-1-methy1ethy1 amin

Příklad 69

1(R)-2-(3-chlor-2-thieny1)-1-methylamin; [a]D=-6,l° (c=l, methano1) l(R)-2-(4-chlor-2-thienyl)-l-methylethylamin

Příklad 70 • · • ·

Příklad 71

1(R)-2-(3-chlor-5-fenyl-2-thienyl)-1-methylethylamin

Příklad 72

1(R)-2-(5-brom-2-chlor-2-thi eny1)-1-methy1ethy1amin

Příklad 73

1(R)-2-(4-methy1-5-chlor-2-thi eny1)-1-methylethylamin

Příklad 74

1(R)-2-(2,5-dichlor-3-thienyl)-l-methylethylamin

Příklad 75

Směs 13,88 g (29,7 mmol) produktu podle příkladu 37 a

4,27 g (41 mmol) formamidinacetatu v n-BuOAc se zahřívá za teploty zpětného toku 1 hodinu. Jak lze zjistit HPLC, reakce je po této době ukončena. Po ochlazení se reakční směs promyje 5% (hmotn.) NaHCC>3 a solným roztokem, vysuší se Na2SO4 a zfiltruje se. Fitrát se zpracuje s 13,8 g (59,4 mmol) (1R)~ (-)-lO-kafrsulfonové kyseliny čímž se oddělí lepkavá pevná hmota. Tato kaše se uvede na teplotu zpětného toku aby sraženina vytvořila lepší granulát. Po ochlazení se pevná látka oddělí, promyje se EtOAc a vysušením ve vakuu se získá 10,41 g soli di[(IR)-(-)-kafrsulfonové kyseliny) [1S— [la,2b,3b,4a,(S*)]]-4-[7-[[2-(3-chlor-2-thi eny1)-1-ethy1ethy1] amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyr idin-3-y1]-N-ethyl-2,3-dihydrocyklo pentankarboxamidu ve formě šedobílého prášku. Tento produkt,

je-li to žádoucí může být rekrystalizován (CH₃CN) ve vysokém výtěžku a se zlepšenou čistotou.

Následující analytické výsledky byly získány na reprezentativním vzorku soli di[(lR)-(-)-kafrsulfonové kyseliny) [lS-[la,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-chlor-2-thienyl)1-ethylethy1]amino]-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-3-yl]-N-ethyl2, 3-dihydroxycyklopentankarboxamidu:

Diferenční skanovací kalorimetrie (DSC): t.t. 188 °C.

Elementární analýza: vypočteno: C 53,51; H 6,42; N 7,43; Cl 3,76; S 10,20; nalezeno: C 53,41; H 6,47; N 7,34; Cl 4,03;

S 10,07.

Příklad 76

Do tříhrdlé baňky s kulovým dnem objemu 5 1 opatřené horem zavedeným míchadlem, teplotní sondou se zapisovačem a chladičem (chlazeným sylthermem XLT na teplotu 2,6 °C) se vnese v atmosféře dusíku dimethylacetondikarboxylat (696,6 g, mol), trimethylortomravenčan (424,5 g, 4 mol) a anhydrid kyseliny octové (816,72 g, 8 mol). Vzniklý, jantarově zbarvený ;homogenní roztok se rychlé míchá (400 ot/min) za zahřátí na teplotu zpětného toku 115 °C během 40 minut za použití topného ‘.hnízda. Mírný ref lux se udržuje během další hodiny úpravou zahřívání (teplota varu směsi se postupně snižuje na 95 °C s průběhem reakce). Vzniklá oranžová homogenní směs se pak destiluje ve vakuu (20 mm Hg) při nejvyšší teplotě 115 °C za použití Claisenova nástavce. Shromáždí se asi 1000 ml destilátu (obsahujícího AcOH a AcOMe). Tmavě oranžový zbytek se ochladí ve vodní lázni (teploty okolo 6 °C) a po kapkách se přidává hydroxid amonný (11, 8 mol) tak aby bylo možné řídit • ·

exotermní průběh reakce a teplota nepřesáhla 25 °C při celkové době přidávání rovné 1,5 hodině. Žlutá suspenze se okyselí HCl (pH 2,0) (750 ml, 9 mol) a získaná tříslově zbarvená pevná látka se odfiltruje, promyje se 1 1 MeOH a suší se za sání do konstantní hmotnosti. Tímto způsobem se získá první podíl methyl-4,6-dihydroxy-nikotinatu (351 g, 51 %) o 97% čistotě. Druhý podíl methyl-4,6-dihydroxy-nikotinatu (35 g) lze získat zahuštěním methano1 ického filtrátu na polovinu.

Hmotnostní spektrum, 169 (M+, 97 %) 137 (100 %).

Produkt se podrobí chromatografické analýze provedené dvěma způsoby:

HPLC, způsob A: použije se kolona typu Alltec Absobosphere-SCX 5 μ, 250 x 4,6 mm; mobilní fáze A: 50 mm NaHzPOá, pH=3,5 pomocí H3PO4, B: CH3CN, A : B = 95 : 5; průtok 1,0 ml/min; detekce: absorbance v UV světle při 210 nm; retenční čas 3,9 minuty. Čistota produktu je 97,8 %.

HPLC, způsob B: použije se kolona typu Sulpeco Sulpecosi1-SAX, 5 μ, 250 x 4,6 mm; mobilní fáze A: 200 mm KH2PO4 s 0,1 % TEA, pH=6,0 pomocí H3PO4, B: CH3CN,

A : B = 85 : 15; průtok 1,0 ml/min; detekce: absorbance v UV světle při 210 nm; retenční čas 4,9 minuty.

Příklad 77

Do tříhrdlé baňky objemu 2 1 opatřené teplotní sondou se zapisovačem, mechanickým míchadlem, Dean-Starkovým zařízením a chladičem pro zpětný tok se vnese methy1-4,6-dihydroxynikot i nat (100 g 97% čistoty, 0,59 mol) a kyselina fosforečná (85%, 300 ml). Suspenze se zahřeje pomocí topného hnízda na • · · · • · teplotu 120 °C a získá se burgundově červený roztok (hnízdo má teplotu okolo 290 °C doba zahřívání je 1 hodina). Při teplotě 140 °C se najednou objeví bílá sraženiny kyseliny

4,6-dihydroxynikotinové (ačkoliv se tvoří methanol, v destilátu není methanol zjišfován což naznačuje tvorbu fosforečnanového esteru) a od tohoto bodu dochází k významné tvorbě pěny. Tvorba pěny je kontrolovatelná přídavkem povrchově aktivní látky jako je silikonový olej 550 (5 až 6 kapek). Voda, včetně té která pochází z kyseliny fosforečné se pak odstraní (asi 60 ml), například dehydratací kyseliny fosforečné, dokud vnitřní teplota nedosáhne 210 °C ± 5 °C (hnízdo má teplotu 290 °C, celková doba zahřívání je 2,5 hodiny). Bez dehydratace kyseliny fosforečné karboxylace neproběhne. Po míchání 4 až 5 hodin při uvedené teplotě kyselina 4,6-dihydroxynikotinová zmizí a metodou HPLC se potvrdí přítomnost methyl-4,6-dihydroxynikotinatu. Reakční směs se pak ochladí na teplotu pod 100 °C, kdy se přidá kyselina octová (300 ml) a teplota se udržuje na 90 °C. K této směsi se pak přidává konstantní rychlostí (5 až 6 ml/min) kyselina dusičná (25 ml) dokud se metodou HPLC nepotvrdí nepřítomnost 2,4-dihydroxypyridinu. K reakční směsi se pak přidá voda (300 1) a zahřívání se přeruší. Při teplotě pod 80 °C se začne objevovat tmavě hnědá pevná látka, která se za míchání po dobu 2 až 3 hodin nechá vysrážet. Pak se filtrací přes nálevku ze slinutého skla (střední porozita) získá tmavě hnědá pevná látka, která se promyje 250 ml isopropylalkoholu.

Získaný filtrační koláč se pak suší 1 hodinu na vzduchu a pak se vnese do vakuové (20 in.Hg, s odsáváním vzduchu) sušárny při 50 °C na dva dny. 2,4-dihydroxy-3-nitropyridin (60 g) se získá v 60% výtěžku.

Diferenční skanovací kalorimetrie: t.t. 183,85 °C; elementární analýza pro C₅H₄N₂O₄: vypočteno: C 38,47, H 2,58, • · • · • ·

Ν 17,95; nalezeno: C 38,42, Η 2,62, Ν 17,69; IR, 3194,9 (OH),

1689,2 (C=0), 1616,5 (C=C); hmotnostní spektrum (M+H), 157.

Produkt se podrobí chromatografické analýze provedené dvěma způsoby:

HPLC, způsob A: použije se kolona typu Alltec Absobosphere-SCX 5 μ, 250 x 4,6 mm; mobilní fáze A: 50 mm NaH2PO4, pH=3,5 pomocí H3PO4, B: CH3CN, A : B = 95 : 5; průtok 1,0 ml/min; detekce: absorbance v UV světle při 210 nm; retenční čas 4,2 minuty. Čistota produktu je 99,92 %.

HPLC, způsob B: použije se kolona typu Sulpeco Sulpecosi 1-SAX, 5 μ, 250 x 4,6 mm; mobilní fáze A: 200 mm KH2PO4 s 0,1 % TEA, pH=6,0 pomocí H3PO4, B: CH3CN,

A : B = 85 : 15; průtok 1,0 ml/min; detekce: absorbance v UV světle při 210 nm; retenční čas 10 minut.

Příklad 78

Do tříhrdlé baňky objemu 22 1 opatřené teplotní sondou se zapisovačem, mechanickým míchadlem, Dean-Starkovým zařízením a chladičem pro zpětný tok se vnese kyselina 4,6-dihydroxynikotinová (88 %, 2,0 kg, 12,81 mol) a kyselina fosforečná (85%, 6 1, 103,15 mol). Plyny odcházející z chladiče se promývají přes 50% vodný NaOH. Suspenze se zahřívá až do odstranění dostatečného množství vody (asi 1,2 1), t.j. dehydratuje se kyselina fosforečná. Bez dehydratace kyseliny fosforečné karboxylace neproběhne. Teplota hnízda se udržuje na 290 °C tak aby vnitřní teplota dosáhla za 3,5 hodiny 210 ⁰ ± 5 °C.

Po míchání 4 až 5 hodin při uvedené teplotě se metodou HPLC potvrdí nepřítomnost výchozí složky. Reakční směs se pak ochladí na teplotu pod 100 °C, kdy se přidá kyselina octová (6 1, 104,81 mol) a teplota se udržuje na 90 °C. K této směsi se pak přidává konstantní rychlostí (5 až 6 ml/min) kyselina dusičná (485 ml, 12,11 mol) dokud se metodou HPLC nepotvrdí nepřítomnost kyseliny 4,6-dihydroxynikotinové.Pak se k reakční směsi přidá voda (61, 333,3 mol) a zahřívání se přeruší. Při teplotě pod 80 °C se začne objevovat žlutá pevná látka, která se za míchání přes noc nechá vysrážet.

Pak se filtrací přes nálevku ze slinutého skla (vhodné porozity) získá žlutá pevná látka, která se promyje 2,5 1 isopropylalkoholu. Získaný filtrační koláč se pak suší 1 hodinu na vzduchu a pak se vnese do vakuové (20 in.Hg, s odsáváním vzduchu) sušárny při 50 °C na tři dny. 2,4-dihydroxy3-nitropyridin (1,050 kg) se získá v 60% výtěžku.

Upozornění: Tato sloučenina vykazuje značný exotermní průběh při nástupu tání při 262,62 °C (DSC), a proto se nedoporučuje zahřívat tuto sloučeninu v dosahu 100 °C její teploty tání.

Diferenční skanovací kalorimetrie: t.t. 183,85 °C; elementární analýza pro C₅H₄N₂O₄: vypočteno: C 38,47, H 2,58,

N 17,95; nalezeno: C 38,42, H 2,62, N 17,69; IR, 3194,9 (OH),

1689,2 (C=O), 1616,5 (C=C); hmotnostní spektrum, 157 (M=H, 100 %).

Produkt se podrobí chromatografické analýze provedené dvěma způsoby:

HPLC, způsob A: použije se kolona typu Alltec

Absobosphere-SCX 5 μ, 250 x 4,6 mm; mobilní fáze A: 50 mm

NaH₂PO₄, pH=3,5 pomocí H₃PO₄, B: CH₃CN, A : B = 95 : 5; průtok

1,0 ml/min; detekce: absorbance v UV světle při 210 nm;

retenční čas 4,2 minuty. Čistota produktu je 99,92 %.

HPLC, způsob B: použije se kolona typu Sulpeco Sulpecosi1-SAX, 5 μ, 250 x 4,6 mm; mobilní fáze A; 200 mm KH2PO4 s 0,1 % TEA, pH=6,0 pomocí H3PO4, B: CH3CN,

A : B = 85 : 15; průtok 1,0 ml/min; detekce; absorbance v UV světle při 210 nm; retenční čas 10 minut.

Příklad 79

2,4-dihydroxv-3-nitropyridin (590 g, 3,78 mol) se vnese do tříhrdlé baňky objemu 12 1 opatřené teplotní sondou se zapisovačem, přidávací nálevkou, Claisenovou hlavou, chladičem a mechanickým míchadlem. Plyny unikající z chladiče se vedou přes promývačku plynů obsahující 50% vodný NaOH. Zapne se míchání k promíchání pevných složek. Přidá se POCL3 (1058 ml) a vzniklá polopevná hmota se zahřeje na 45 °C k získání promíchané suspenze. K té se přidá během 1 hodiny DIPEA (988 ml). Tato exotermní reakce se řídí rychlostí přidávání diisopropylethylaminu (DIPEA). Po ukončeném přídavku se reakční směs zahřeje na 100 °C ±5 °C. Konverze 2,4-dihydroxy3-nitropyridinu, přes monochlorsloučeninu jako meziprodukt je ukončena za 4 hodiny (HPLC: způsob C). Pak se reakční směs ochladí na 20 °C a vlije se za intezivního míchání do směsi led-voda. Vysráží se tříslově zbarvená pevná látka, led se nechá roztát a výsledná směs se zfiltruje přes nálevku s filtrem ze slinutého skla. Produkt se suší přes noc na vzduchu a pak se převede do vakuové sušárny a suší se do konstantní hmotnosti (29 in. Hg, 20 °C). 2,4-dich1or-3-nitropyridin se získá ve formě špinavě bílé pevné látky (699 g, 96% výtěžek).

Jestliže barva nebo čistota produktu získaného výše uvedeným způsobem je neuspokojivá, lze jej rekrystalizovat následujícím způsobem; pevná látka se převede do baňky • tt 0 «* tttt ·· · · « · · · c tt« · tt · ♦ · «· · · · · » ···· « · tt » · · ···· ·»· 99>

··· ··· ·· • » »<· ·· «· ·· ·· opatřené mechanickým míchadlem a Dean-Starkovým zařízením. Pak se přidá heptan (5 ml/mg) a směs se zahřívá na teplotu zpětného toku. Jakýkoli zbytek vody se odstraní azeotropní destilací. Tento roztok se pak zfiltruje přes Celit, filtrát se za míchání ponechá ochladit, tříslově zbarvená pevná látka se oddělí filtrací a vysuší se na vzduchu do konstantní hmotnost i.

Elementární analýza pro C5H2N2O2CI2: vypočteno: C 31,26,

H 1,05, N 14,59, Cl 36,44; nalezeno: C 31,31, H 1,26, N 14,41; hmotnostní spektrum, 192 (M+, 90 %) .

Získaný produkt se podrobí chromatografické analýze provedené dvěma způsoby:

HPLC způsob A se provede způsobem popsaným v příkladu 76 a stanovená čistota je 99,33 %.

HPLC způsob C: použije se kolona Microsorb MV-C18, 5 μ, 250 x 4,6 mm; mobilní fáze, A: H2O s 0,1% AcOH, B: CH3CN, A :

B = 70 : 30; průtok 1,0 ml/min; detekce; absorbance v UV světle při 220 nm; retenční čas 5,3 min.

Příklad 80

2,4-dihydroxynitropyridin (85 ml, 0,914 mol) se vnese do baňky objemu 1 1, pak se přidá POCI3 a za míchání během 30 minut DMA. Exotermní reakce proběhne při teplotě 56 °C. Po ustoupení exotermní reakce se reakční směs zahřívá 1 hodinu při 90 °C a potom se zahřívá 4 hodiny při 105-115 °C. Po 5 hodinách se tato směs vlije na za míchání na led a zfiltruje se. Sedavá pevná látka se promyje 2 x 100 ml chladné vody a pak se suší na filtru a na vzduchu přes noc. Výtěžek šedé

79.

• · · · · · · ···· • * · · · · · · · · ··· ··· • · · ·· · · · • · ··· ·· · · «· · · pevné látky je 57 g. Tato pevná látka se pak rekrystalizuje z 500 ml heptanu, zpracuje se 2 g aktivního uhlí a zfiltruje se za horka přes celit. Objem filtrátu se pak zahustí na 75 ml a filtrací se získá pevná látka která se promyje heptanem a vysuší se na filtru. Získá se 47 g produktu. Objem filtrátu se pak opět sníží, vysrážená pevná látka se odfiltruje a získá se tak dalších 2,8 g produktu (2 podíly 85 %).

Příklad 81

Do baňky objemu 500 ml se vnese 2,4-dihydroxy-3nitropyridin (23,7 g, 0,152 ml) a potom za míchání POCL3 (42,5 ml, 0,457 mol). Pak se během 45 minut přidá DIPEA (39,7 ml, 0,228 mol) což vede k exotermnímu průběhu reakce a teplotě 67 °C. Po ustoupení exotermního průběhu se reakční směs zahřeje na 90 °C. Po stanovení čistoty, která má být 98,6 % se reakční směs zalije 250 g ledu/50 ml vody. Pevná látka se odfiltruje, promyje se 2 x 100 ml deionizované vody a ponechá se vysušit 72 hodin na filtru. Výtěžek produktu je 25,1 g (85 %) a produkt má světle tříslové zbarvení.

Sloučeniny připravené z meziproduktů připravených podle vynálezu jsou vhodné jako antihypertensivní prostředky pro léčení vysokého krevního tlaku; mohou také zvyšovat koronární krevní tok a podle toho jsou také vhodné při léčbě myokardiální ischemie; tyto sloučeniny také mohou mít kardioprotektivní účinky a mohou být proto vhodné při prevenci nebo redukci poškození myokardu následkem ischemie myokardu; a také mohou působit jako anti 1ipo1yticképrostředky vhodné pro léčení hyper 1ipidemie a hypercho1 estero1emie.

Sloučeniny připravené z meziproduktů připravených způsoby podle vynálezu vykazují aktivitu ve standardních stanoveních ♦ · · · · · · · · · · · ·· · ···· ···· • · · · · · · · · · ··· ··· ······ ·· ·· ··· · · ·· ·· · · vazby na receptory A1/A2 při stanovení adenosin receptorové agonistické aktivity u savců. Příklady testovacích postupů vhodných pro stanovení vazebné afinity těchto sloučenin na receptor jsou uvedeny níže.

A. Stanovení vazebné afinity na adenosinový receptor in vitro

Vazebná afinita na receptor A1 se stanoví kompetičním stanovením založeným na vytěsnění ligandu ³H-CHA (cyklohexyladenosin) [Research Biochemicals lne., Natick, Mass.] z receptoru za použití membrán zpracovaných z celého krysího mozku, způsobem podle práce R.F.Bruns a sp.,

Mol.Pharmacol., 29:331 (1986). Nespecifická vazba se stanoví v přítomnosti lmM theofylinu.

Vazebná afinita na receptor A2 se stanoví podobným způsobem založeným na vytěsnění ligandu ³H-CGS 21680, známého specifického adenosi nového agonisty receptoru A2, z receptoru, za použití membrán z corpus striatum mozku krysy. Nespecifická vazba se stanoví v přítomnosti 20 pm 2-chloradenosi nu.

Stanovení se provedou ve skleněných zkumavkách, paralelně při 25 °C. Po přídavku membrán se zkumavky vortexují a inkubují se 60 minut při 25 °C (stanovení Ai) nebo 90 minut (stanovení A2) na rotační třepačce. Obsah zkumavek se vortexuje v poloviční době inkubace a opět ke konci doby inkubace. Stanovení se ukončí rychlou filtrací přes filtry GF/B průměru 2,4 cm za použití Brandel Cell Harvestor.

Zkumavky se třikrát promyjí chladným 50 mM tris-HCl (pH 7,7 nebo 7,4) tak aby filtrace bylo ukončena během 15 sekund.

Vlhké kruhové filtry se pak vnesou do skleněných scinti lačních lahviček obsahujících 10 ml Aquasolu II (New England Nuclear). Lahvičky se umístí přes noc na rotační třepačku a potom do • · · · ·

scinti 1ačního analyzátoru na dvouminutový odečet. Hodnoty IC50 vazby na receptor, t.j. koncentrace při které sloučenina vzorce I nahradí radioaktivně značený standard se získají pomocí počítačového programu s vyhodnocením křivky (RS/1 ,

Bolt, Beranek a Newman, Boston,MA).

B. Stanovení vasorelaxace na i zolováných prasečích koronárních arteriích in vitro.

Koronární prasečí arterie získané na místních jatkách se opatrně vypreparují a zbaví se tuku, krve a ulpívajících tkání. Zpracují se na kroužky široké asi 2-3 mm převedou do tkáňových lázní (10 ml) s vodním pláštěm naplněných teplým (37 °C), prokysličeným (O2/CO2: 95%/5%) Krebs-Henseleitovým pufrem a upevní se na L-tvarované háky mezi tyčky z nerezové oceli a snímače síly. Složení Krebsova pufru je následující (mM): NaCl 118; KCl 4,7; CaCl₂ 2,5; MgSO* 1,2; KH2PO4 1,2; NaHCO₃ 25,0; a glukosa 10,0. Kroužky se uvádějí 90 minut do rovnovážného stavu častými změnami pufru na klidový tonus 5 g. Pro zajištění optimálního vývoje tonu se arteriální kroužky senzibi1 izují dvakrát 36 mM KCl a jednou 10 pm PGF2a před jejich expozicí 3 μΜ PGF2a. Po dosažení stabilizovaného stavu i zornétrického tonu, se přidávají do lázní kumulované dávky agonistů adenosinu podle vynálezu (obvykle 1 mM až 100 μΜ v polovičním ředění postupných dávek). Tonus dosažený 3 μΜ PGF2a se zvolí j ako 100%; všechny ostatní údaj e jsou vyj ádřeny v procentech tohoto maxima. Hodnoty IC50 pro relaxaci, t.j. koncentraci při které sloučenina vzorce I vyvolá 50% redukci tonu, se stanoví pomocí výše zmíněného počítačového vyhodnocovacího programu.

C. Stanovení středního arteriálního krevního tlaku (MAP) a srdeční frekvence (HR) na normotensních anestezovaných a ·· · ···· · · · · • · · ·· · · · · · ··· ··· ······ ·· ·· ··· · · ·· · · ·· spontánně hypertensních krysách.

1. Anestezované krysy

Normotensní krysy se anestezují pentobarbitalem sodným (50 mg/kg, i.p.) a umístí se na vyhřívaný chirurgický stůl. T>o femorálních arterií a ven se zavedou kanyly tak, aby umožňovaly měření arteriálního tlaku a rovněž umožňovaly intravenosní podání testovaných sloučenin. Po operaci se zvířata nechají 10 minut k dosažení rovnováhy. Kontinuálně se měří a zaznamenává střední arteriální tlak a srdeční frekvence se sleduje pomocí arteriálního tlakového pulsu jako impulzu pro kardiotachometr. Po stanovení a zaznamenání základních hodnot se začnou podávat zvyšující se dávky (1, 3, 10, 30,

100, 300 a 1000 pg/kg) sloučeniny vzorce I určené k hodnocení intravenosním způsobem. Po každé dávce adenosi nového agonisty se zanamenají se maximální změny kardiovaskulárních parametrů. Jedné kryse se podává pouze jedna sloučenina. Účinnost sloučenin na snížení srdeční frekvence a středního arteriálního tlaku se hodnotí stanovením dávky sloučeniny potřebné ke snížení srdeční frekvence nebo arteriálního tlaku o 25 % (ED25).

2. Spontánně hypertensní krysy (SHR)

Orální antihypertensní účinnost sloučenin vzorce I se hodnotí na spontánně hypertensních krysách za vědomí. Krysy se anestezují pentobarbitalem sodným (50 mg/kg, i.p.). Do břicha krysy se středním řezem zavede telemetrický převodník. Kanyla převodníku se zavede do břišní aorty tak aby bylo možné přímo měřit arteriální tlak SHR při vědomí. Převodník se zajistí na břišní stěně. Po zotavení z operace (minimálně sedm dní) se SHR umístí na zajišťovací desku a aktivuje se • ·

převodník/přenašeč. V 1,5 hodinovém intervalu se zaznamenává u neomezovaných krys systolický, diastnlický a střední arteriální tlak a srdeční frekvence pro stanovení stabilních základních hodnot. Každá krysa pak obdrží jednu dávku sloučeniny vzorce I určené k testování nebo vehikula a zaznamenávají se změny arteriálního tlaku a srdeční f rekvence.

V tabulce II jsou uvedeny výsledky stanovení biologické aktivity sloučenin uvedených v příkladech a u sloučeniny podle příkladu 6 i sloučeniny ze stupně 1, které jsou v rozsahu definice sloučenin vzorce I.

Tabulka II příklad vazebná akt ivi ta na adenos inový receptor č . IC5 o(nM) vasorelaxace prasečí koronární arteri e krevní tlak/ srdeční frekvence

ICso(pm) anestezované krysy SHR*

	Ai	A2	MAP/ED25 HR/ED25 dávka MAP/ HR/
(Pg/kg)	(pg/kg)	(mg/kg) %	%
4	1 ,66	55	0,73	13	19	5	28(D)	20 (D)
5	4,26	91	0,068	-	-	-	-	-
6	2,69	12,88	0,021	-	-	1	18(D)	7(1)
6(1)>1000	>1000	19,1	-	-	-	-	-
7	3,5	28	4	6	18	5	45'(D)	22(D)
8	5	138	-	10	23	-	-	-
9	4	1000	11,9	5	4	-	-	-
10	3,8	>1000	—	—	—	—	—

příklad vazebná aktivita na adenos inový

Tabulka vasorelaxace prasečí koronární arterie

II (pokračování) krevní tlak/ srdeční frekvence receptor

č .	ICso(nM)	IC5 0 (μπι)	anestezované krysy	SHR*
				MAP/ED25	HR/ED25	dávka	MAP/	HR/
	Ai	A2		(Ug/kg)	(Pg/kg)	(mg/kg) %	%
1 1	7,4	>1000	-	-	-	-	-	-
12	23	224	0,5	4	17	-	-	-
13	41	191	0,24	3	>10	-	-	-
14	79,4	>1000	-	-	-	-	-	-
15	4,07	1000	2,45	1,5	1,4	-	-	-
16	1,7	>1000	-	-	-	-	-	-
17	67,6	5248	18,77	-	-	-	-	-
18	166	52	0,46	2	>10	-	-	-
19	36	1000	0,75	-	-	-	-	-
20	3,98	158	-	-	-	-	-	-
21	0,09	14,8	-	-	-	-	-	-
22	2,69	29,5	0,1	-	-	-	-	-
23	0,32	891	4,4	6	7	-	-	-
24	>1000	>1000	-	6	>10	5	17 (D)	6(1)
25	1258,3	355	0,64	-	-	-	-	-
26	87, 1	63 , 1	0,082	4	>30	2,5	41 (D)	3(1)
27	5,01	29,5	0,043	-	-	1	27(D)	KI)
28	417	>1000	-	-	-	-	-	-
29	35,48	>1000	22	16	31	5	18 (D)	12(D)
30	562	>1000	12,1	6	>10	-	-	-
31	0,03	8,9	-	-	-	—	—	—

Tabulka II (pokračován í) příklad vazebná aktivita na adenos i nový receptor č . IC5 o(nM)

Ai A2 vasorelaxace krevní tlak/ prasečí srdeční frekvence koronární art er i e

ICsoÍpm) anestezované krysy SHR*

MAP/ED25 HR/ED25 dávka MAP/ HR/ (pg/kg) (pg/kg) (mg/kg) % %

32	0,049 45	-	-	-	—	-	-
34	1,6	23	0,072	-	-	-	-	-
35	1087	6351	3,3	-	-	-	-	-
36	8,8	43,4	0,493	-	-	-	-	-
37	16,2	110	0,45	-	-	-	-	-
38	5,7	55,5	0,47	-	-	-	-	-
39	3,98	46,8	-	-	-	-	-	-
40	9,3	68,8	283	-	-	-	-	-
41	14,2	158	-	-	-	-	-	-
42	>1000	>10000	2,44	-	-	-	-	-
43	8248	>10000	7,83	-	-	-	-	-
44	55	331	0,316	-	-	-	-	-
45	6351	>10000	4,1	-	-	-	-	-
46	13,5	81	3,52	-	-	-	-	-
47	23	2818	5,7	-	-	-	-	-
48	8,35	1445	-	-	-	-	-	-
49	69	2884	9,81	-	-	-	—	—

D významně klesá; I významně stoupá

Jestliže dojde k přerušení toku krve do srdce na krátkou dobu (2 až 5 minut), a následuje pak obnovení průtoku (reperfuse), dochází k zabránění vývoje poškození při přerušení průtoku krve na delší dobu (například 30 minut).

Sloučeniny vzorce I vykazují aktivitu v testech používaných ke stanovení schopnosti sloučenin napodobit kardioprotektivní aktivitu myokardiální prekondice. Příkladné testy vhodné pro stanovení kardioprotektivní aktivity sloučenin vzorce I jsou uvedeny níže.

Stanovení kardioprotektivní aktivity na krysách

1. Všeobecná chirurgická příprava

Dospělé krysy Sprague-Dawley se anestezují Inactinem (100 mg/kg i.p.). Provede se intubace trachey a malým animálním respirátorem se zavede pozitivní ventilace. Do femorální vény a arterie se zavedou katetry pro podání sloučenin podle vynálezu určených k testování a pro měření krevního tlaku.Na levé straně hrudníku se provede řez přes prsní svaly a provede se jejich retrakce aby se vystavil čtvrtý mezižeberní prostor. Otevře se dutina hrudní a obnaží se srdce. Ve ventrikulární stěně, blízko levé hlavní koronární arterie se provede prolinový steh délky 4-0, který se použije k přerušení toku krve koronární arterií utažením klouzavého uzlu. Na povrch srdce se umístí pulzní Dopplerova průtoková sonda (zařízení měřící krevní tlak) pro ověření správné identifikace koronární arterie. Do levé komory se rovněž zavede katétr ke sledování funkce levé komory během pokusu.

2. Prekondice a postupy testování • * » · · · ► · · · • · · · · · • · • · ·

Při prekondiciování srdce se zaškrtí koronární arterie (přeruší se průtok) na dobu dvou minut. Pak se klouzavý uzel uvolní k obnovení toku (reperfusi) na dobu tří minut. Tento postup zahrnující zaškrcení/reperfusi se opakuje dvakrát. Pět minut po ukončení posledního prekondičního stupně se arterie znovu zaškrtí na 30 minut a pak následuje tříhodinová reperfuse. Při hodnocení sloučeniny vzorce I se místo provedení postupu zaškrcení/reperfuse provede 30 minut před 30 minutovým zaškrcením aplikace této sloučeniny infusí. Na konci 3 hodinové reperfusní periody se arterie znovu zaškrtí a do levého ventrikulárního katetru se aplikuje 1 ml patentní modři a srdeční činnost se zastaví i.v.podáním chloridu draselného. Tento postup umožňuje perfusi barviva do normálních oblastí srdce zatímco ischemická oblast srdce toto barvivo nepřijímá (tato oblast se označuje jako riziková oblast). Pak se srdce rychle vyjme pro analýzu velikosti infarktu. Velikost infarktu se stanoví rozřezáním srdce od hrotu k bázi na čtyři až pět řezů silných 1-2 mm. Tyto řezy se inkubují v roztoku 1% trifeny1tetrazo1ia 15 minut. Toto barvivo reaguje s živou tkání a působí vývoj jasně červeného zbarvení. Infarktová tkáň s barvivém nereaguje a má světlý, bělavý vzhled. Bezy tkání se pak umístí do videoanalytického zařízení a velikost infarktu se vyhodnotí planimetricky. Vyhodnotí se účinek zkoušené sloučeniny podle vynálezu na velikost infarktu myokardu a kvantifikuje se rozsah kardioprotektivní aktivity. Výsledky jsou uvedeny v procentech rizikové oblasti která je infarzovaná.

Výsledky testování příkladů sloučenin vzorce I výše uvedenými způsoby jsou uvedeny níže v tabulce III.

4 • · 4

4 • 4 ·· 44 44 • ·· 4 4 44 4 • ·· 4 · 44 4 •4 · ···· ··· 4·4 • 4 4 ··

44 44 44

Tabulka III skupina zvířat % infarzované rizikové oblasti kontrolní¹ 63 ± 5 prekondici ováná² 15 ± 8 se sloučeninou (nízká dávka)³ 23 ± 9 se sloučeninou (vysoká dávka)⁴ 18 ± 5 ¹ Zvířata bez prekondice nebo ošetření sloučeninou.

² Zvířata prekondici ováná způsobem zaškrcení/reperfuse.

³ Zvířata kterým byl aplikován i.v.bolus 1 pg/kg a potom

i.v.infuse 0,1 pg/kg/min sloučeniny podle příkladu 39 a to 30 minut před 30 minutovým intervalem zaškrcení.

⁴ Zvířata kterým byl aplikován i.v.bolus 10 pg/kg a potom i.v.infuse 1 pg/kg/min sloučeniny podle příkladu 39 a to 30 minut před 30 minutovým intervalem zaškrcení do druhé hodiny po zahájení reperfuse.

Sloučeniny podle vzorce I vykazují aktivitu v testech používaných pro stanovení schopnosti sloučenin inhibovat lipolysu. Příkladné zkušební postupy vhodné pro stanovení lipolytické aktivity sloučenin vzorce I jsou uvedeny níže.

Stanovení anti 1ipolytické aktivity na krysích adipocytech • · • · ·· · » · flfl · • fl · · • · · · · • 9 · * fl « » » >

• · ♦ fl · • · » fl · · · » fl · • · fl • · · » » · · » · • * flfl ··

1. Izolace adipocytů z epididymálních tukových vrstev

Z anestezovaných krys se vyjme tuková tkáň a promyje se dvakrát inkubačním médiem (2,09 g hydrogenuhličitanu sodného a 0,04 g dvojsodné soli EDTA v 1 1 Krebsova pufru). Z každé krysy (300-350 g) se získají přibližně 4 ml tukové tkáně. Tuková tkáň (35 ml) se nastříhá nůžkami na malé kousky a promyje se inkubačním médiem (50 ml). Tato směs se vlije do nádoby 50 ml injekční stříkačkou která je s nádobou spojena krátkou záškrt ite1nou trubicí místo jehly. Vodná fáze se nechá vytéct. Druhé promytí inkubačním médiem se provede přes injekční stříkačku. Tato tkáň se přidá k 50 ml roztoku kolagenasy (kolagenasa (90 mg), hovězí sérový albumin (BSA) (500 mg) a 0,1 M roztok chloridu vápenatého (1 ml) v inkubačním médiu (50 ml)) v lahvi objemu 1 1. Tato směs se pak třepe za životních podmínek při 37 °C asi 60 minut v atmosféře 95% kyslíku/5% oxidu uhličitého aby proběhla digesce tkáně. Dispergované buňky se pak vlijí přes dvě vrstvy procezovacího plátna do 100 ml kádinky z plastické hmoty. Shluky na plátně, u kterých nedošlo k digesci se pak znovu promyjí inkubačním médiem (20 ml). Buňky v kádince se pak odstředují ve dvou zkumavkách z plastické hmoty 30 sekund při teplotě místnosti a 300 ot/min. Pod vrstvou obsahující volné plovoucí tukové buňky se pak odsaje vodná fáze, která se odstraní. Adipocyty se pak opatrně vlijí do kádinky z plastické hmoty objemu 250 ml obsahující 100 ml promývacího roztoku (1 g BSA na 100 ml inkubačního média). Po mírném promíchání se stupeň odstředění opakuje. Následuje další promytí promývacím roztokem. Pak se buňky spojí a stanoví se jejich objem v odměrném válci. Pak se adipocyty zředí na dvojnásobek jejich objemu pufrem pro stanovení obsahu (inkubační médium (120 ml), BSA (1,2 g) , kyselina pyrohroznová (13 mg)).

• · ft · · · · · · · • · · ·· · · · · · ··· ·· • Λ · · · · · * · *> · · rr · » ·· · ·

2. Stanovení lipolysy in vitro

Stanovení se provede v 20 ml scinti lačních nádobkách a při celkovém objemu pro stanovení 4,2 ml. Pufr pro stanovení obsahu (2,5 ml), zředěné adipocyty (1,5 ml), a roztok sloučeniny určené k testování (12,3 μΐ) adenosi nového agonisty (12,3 μΐ; různé koncentrace) se inkubují v třepačce s životním prostředím 15 minut, a pak se reakce zahájí pomocí roztoku norepinefri nu (41,2 μΐ) (10 nM, v nosném roztoku obsahujícím vodu (100 ml), BSA (4 mg), a 0,1 M PDTA (20 μΐ) a adenosindeaminasu (1 ng/ml, 41,2 μΐ). Po šedesáti minutách v třepačce se reakce ukončí vložením lahviček na led. Obsah každé lahvičky se pak převede do skleněné zkumavky 12x75 mm a provede se odstředění při teplotě 8-10 °C při 3600 ot/min po dobu 20 minut. Tuhá lipidová vrstva se odsaje a ve vodné vrstvě se provede stanovení obsahu glycerinu (400 μΐ vzorku). Pozitivní kontrola se provede pokusem v nepřítomnosti jakéhokoli adenosinového agonisty, s náhradou roztoku určeného k testování vodou.

Výsledky testování sloučenin vzorce I jsou uvedeny níže v tabulce IV, kde jsou uvedeny formou % inhibice tvorby glycerinu účinky 1 μΜ a/nebo 0,1 μΜ testované sloučeniny vůči pozitivní kontrole a formou hodnot EC50, t.j. koncentrací testované sloučeniny vyvolávající 50% inhibici tvorby glycerinu. Za účelem srovnání jsou uvedeny i výsledky sloučenin známých z literatury, jako je N-ethyIkarboxamidoadenosin (NECA), R-fenylisopropylidenadenosin (R-PIA) a 2[[2-[4-[-(2-karboxethyl)fenyl]ethyl]amino]-N-e thy1karboxami doadenosin (CGS21680).

• · · · • > · · • · · · · · • ·

Tabulka IV
sloučenina příklad č.	% inhibice
1 μΜ	0,1 μΜ	EC5 0
6			0,76 nM
26	96		89 nM
31			0,26 pM
39			5,4 nM
41		88
46			4 nM
47		94	0,63 nM
48		88	1 ,86
49		85	18,6 nM
CPA	100	97	0,31 nM
NECA			2,5 nM
R-PIA			1 nM
CGS21680	0
Vazba	na receptor	adenosinu Ai a A2	a vasore1axační

aktivita uvedených sloučenin známých z literatury se stanoví výše uvedenými způsoby a výsledky jsou uvedeny v níže uvedené tabulce V.

Tabulka V

vazba na adenosinový receptor (IC50)	vasorelaxace (IC50)
sloučenina Ai (nM)	A 2 (nM)
CPA	0,72	1584	3,18
NECA	12	17	0,017
R-PIA	2,4	300	0,76
CGS21680	30000	70	0,08

• · • · • · • · v

• · t · · · ·

Tato anti 1 ipo1ytická aktivita adenosinu je zprostředkována aktivací subtypu Ai receptoru. Selektivní agonisté subtypu A2 receptoru, jako je CGS21680, nevykazují anti 1 i po 1ytickou aktivitu. Z toho vyplývá, že určité sloučeniny se selektivní agonistickou aktivitou vůči Ai nemusí mít žádoucí anti hypertensivní aktivitu a sloučeniny mající A2 agonistickou aktivitu nemusí být účinnými anti 1 i po 1ytickými prostředky, přičemž sloučeniny podle vynálezu, mající směsnou agonistickou aktivitu jsou jedinečně vhodné k účinné léčbě obou rizikových faktorů diskutovaných výše, t.j. hypertense a hyperlipidemie.

Tyto sloučeniny vzorce I lze obvykle podávat orálně nebo parenterálně při léčení pacientů trpících hypertensí, myokardiální ischemii, nebo pacientů u kterých je zapotřebí kardioprotektivní terapie nebo anti1ipolytická terapie. Výraz pacienti použitý v tomto textu zahrnuje zahrnuje lidi a jiné savce.

Sloučeniny vzorce I, výhodně ve formě soli, lze zpracovat pro podání jakýmkoli vhodným způsobem, a v rozsahu vynálezu jsou zahrnuty farmaceutické kompozice obsahující nejméně jednu sloučeninu vzorce I, přizpůsobené pro použití v humánní nebo veterinární medicíně. Tyto sloučeniny lze formulovat obvyklým způsobem za použití jednoho nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů nebo ředidel. Vhodné nosiče zahrnují ředidla nebo plniva, sterilní vodná média a různá netoxická organická rozpouštědla. Uvedené kompozice mohou být zpracovány do formy tablet, tobolek, pastilek, pilulek, tvrdých bonbonů, prášků, vodných suspenzí, nebo roztoků, injekčních roztoků, tinktur, sirupů a podobně a mohou obsahovat jeden nebo více prostředků zahrnujících sladidla, látky korigující čich a chuť, barviva a konzervační látky tak aby byl připraven farmaceuticky přijatelný přípravek.

Konkrétní nosič a poměr adenosinových agonistú k tomuto nosiči je určen rozpustností a chemickými vlastnostmi těchto sloučenin, určeným způsobem podávání a standardní farmaceutickou praxí. Například k přípravě tablet lze použít přísady jako je laktosa, citrát sodný, uhličitan vápenatý, a dikalciumfosfat a různé prostředky usnadňující rozpadavost jako je škrob, kyselina alginóvá a určité komplexní silikáty, společně s kluznými prostředky jako je stearan hořečnatý, laurylsíran sodný a talek. Mezi výhodné farmaceuticky přijatelné nosiče pro přípravu tobolek patří laktosa a polyethylenglykoly o vysoké molekulové hmotnosti. Při přípravě vodných suspenzí pro orální použití může nosičem být emulgační nebo suspendační prostředek. Použity mohou být ředidla jako ethanol, propylenglykol, glycerin a chloroform a jejich kombinace rovněž jako další prostředky.

Pro parenterální použití lze použít roztoky nebo suspenze těchto sloučenin v sezamovém nebo arašídovém oleji nebo vodně propylenglykolové roztoky a rovněž sterilní vodné roztoky výše popsaných farmaceuticky přijatelných solí. Roztoky solí těchto sloučenin jsou zvláště vhodné pro intramuskulární a subkutánní injekční podání. Vodné roztoky, zahrnující roztoky těchto solí rozpuštěné v čisté destilované vodě, jsou vhodné pro podání intravenósní injekcí za předpokladu jejich správné úpravy hodnoty pH, jejich správného pufrování a isotonisace dostatečným přídavkem soli nebo glukosy a sterilizace teplem nebo mikrofi 1trací.

Oblast dávek je v rozmezí dávek zajišťujících maximální terapeutickou odezvu až do zlepšení stavu a potom minimálních • · účinných udržovacích dávek. Obecně jsou tedy tyto dávky v rozmezí účinném při snižování krevního tlaku při léčení hypertense, při zvyšování koronárního průtoku při léčení myokardiální ischemie, při vyvolání kardioprotektivního účinku, t.j. pro zlepšení ischemického poškození nebo ovlivnění velikosti infarktu myokardu následkem myokardiální ischemie, nebo pro vyvolání anti 1 i po 1ytického účinku. Obecně, orální dávky mohou být mezi asi 0,1 až asi 100 (výhodně v rozmezí 1 až 10 mg/kg), a i.v.dávky v rozmezí asi 0,01 až asi 10 mg/kg (výhodně v rozmezí od 0,1 do 5 mg/kg), samozřejmě s tím vědomím, že při volbě příslušné dávky je v každém specifickém případě nutné vzít v úvahu pacientovu hmotnost, všeobecný zdravotní stav, věk a další faktory, které mohou ovlivnit odezvu na léčivo.

Sloučeniny vzorce I lze podávat tak často, jak je to nutné k dosažení a udržení požadované terapeutické odezvy, Někteří pacienti mohou reagovat rychle na relativně velké nebo malé dávky a bude u nich zapotřebí jen malá nebo žádná udržovací dávka. Na druhé straně jiní pacienti mohou vyžadovat trvalé dávkování v rozmezí asi 1 krát až asi 4 krát denně v závislosti na fyziologických potřebách konkrétního pacienta. Obvykle může léčivo být podáváno orálně asi 1 krát až 4 krát denně. Lze však očekávat, že mnoho pacientů nebude potřebovat více než jednu nebo dvě dávky denně.

Také lze předpokládat, že sloučeniny vzorce I lze vhodně využít v injekční formě k podávání v nebezpečných stavech, pacientovi trpícímu akutní hypertensí nebo myokardiální ischemií, nebo pacientovi jehož stav vyžaduje kardioprotektivní nebo anti 1 i po 1ytickou terapii. Tuto léčbu lze provést intravenosní infusí účinné sloučeniny a množství sloučeniny podané pacientovi infusí by mělo být účinné k ^dosaz_ení ^Pož^d_ov?lné ^ter^Peuti ^lcké °dez vy.

'''i PČNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VSfJECKA ZElfciMY CVC^iO>'VK KALENSKÝ A PARTNER; i řC) 00 Praha 2. Haikova 2 CcSká í'ťpUbÍ!K3

Claims (10)

1. Způsob přípravy 2,4-dihydroxypyridinu vyznačuj í se t í m , že zahrnuje zahřívání sloučeniny vzorce A kde P znamená H, alkylovou něho aralkylovou skupinu s kyselinou fosforečnou, přičemž poměr kyseliny fosforečné k vodě není menší než asi 27 % k 1 % hmotnostnímu.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se t í m , že uvedený poměr ze získá odstraněním vody.

3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se t í m , že toto odstranění se provede destilací.

4. Způsob podle nároku 1 vyznačující se t í m , že kyselina fosforečná a sloučenina vzorce A se zahřeje na asi 210 °C.

5. Způsob přípravy 2,4-dihydroxy-3-nitropyridi nu vyznačující se tím, že zahrnuje reakci 2,4-dihydroxypyridi nu s kyselinou dusičnou.

6. Způsob přípravy 2,4-dihydroxy-3-nitropyridi nu vyznačující se tím, že zahrnuje další reakci s • · · kyselinou dusičnou bez izolace produktu podle nároku 1.

7. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že před reakcí s kyselinou dusičnou se přidá organická kyselina.

8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že organickou kyselinou je kyselina octová.

9. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že před reakcí s kyselinou dusičnou se přidá organická kyselina.

10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že organickou kyselinou je kyselina octová.