CZ2012300A3 - Reakcní smes pro molekulární detekci viroidu vretenovitosti hlíz bramboru pomocí kvantitativní RT-PCR - Google Patents

Abstract

Resení se týká reakcní smesi pro molekulární detekci viroidu vretenovitosti hlíz bramboru pomocí kvantitativní RT-PCR, která je charakterizována tím, ze obsahuje 1 .mi.l vzorku testované RNA, 12,5 .mi.l 2x master mixu obsahujícího smes pufru, DNA polymerázy, deoxyribonukleotidu, a chloridu horecnatého, 1,0 .mi.l smesi reverzní transkriptázy a inhibitoru RNáz, dále 9,3 .mi.l sterilní destilované vody doplnující reakcní smes do konecného objemu 25 .mi.l a 0,1 .mi.l kazdého primeru o koncentraci 100.mi.M a specifické nukleotidové sekvenci QRT R_PSTVd: CTT TCT TCg ggT gTC CTT CC, QPCR R_PSTVd: CTC ggg AgC TTC AgT TgT TTC, které amplifikují fragment o velikosti 101 bp, a 1 .mi.l sondy PSTVd o koncentraci 30.mi.M a specifické nukleotidové sekvenci TgCgCTgTCgCTTCggCTACT, pricemz tato sonda je znacena fluorescencním barvivem 6-karboxyfluoresceinem (FAM) a jako zhásec je pouzit tetramethylkarboxyrhodamin (TAMRA)..sub. .n.

Description

Reakční směs pro molekulární detekci viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru pomocí kvantitativní RT-PCR

Oblast techniky

Řešení se týká reakční směsi pro diagnostiku viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru (dále PSTVd) pomocí kvantitativní RT-PCR, který je závažným karanténím viroidním onemocněním bramboru, pomocí molekulární detekce viroidní RNA molekulární metodou reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce v reálném čase (dále QRT-PCR)

Dosavadní stav techniky

Viroid vřetenovitosti hlíz bramboru - Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd) je závažným karanténním onemocněním bramboru, které se v současné době u bramboru v České republice nevyskytuje, jeho sledování je však nezbytné při kontrole importu materiálu a také z hlediska možného přenosu z jiných rostlinných druhů. PSTVd je přenosný nejen sadbou, ale i semeny a byl již nalezen v několika genových bankách. PSTVd je jednovláknová cirkulární RNA o velikosti 359 nukleotidů (Diener, 1979).

Ze všech doposud známých chorob rostlin způsobovaných viroidy byla jako prvá rozpoznána a studována choroba označená jako vřetenovitost hlíz bramboru (PSTVd). Poprvé byla pozorována Martinem v USA již v roce 1922 a byla považována za virovou chorobu.

Postupně bylo prokázáno, že s ohledem na řadu odlišných vlastností, tato choroba do kategorie virových chorob nepatří (Diener, 1995). Teprve později byla správně zařazena mezi viroidy. Viroidy jsou doposud nejmenší známé infekční molekuly ribonukleové kyseliny (RNA), jež na rozdíl od rostlinných virů nemají bílkovinný obal. Počet nukleotidů, které tvoří sekvenci RNA viroidů, se pohybuje od 250 do 600. Molekuly viroidů mají jednovláknovou, cirkulární kovalentně uzavřenou formu. Sekundární struktura viroidů má tyčinkovitou formu a RNA viroidů netvoří strukturu vyššího řádu. Tato RNA není schopna kódovat vlastní bílkoviny.

V současnosti jsou využívány 3 typy detekčních technik (Jeffries a James, 2005).

První je v osmdesátých letech vyvinutá laboratorní metoda detekce nukleových kyselin pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE) a specifické barvení proužků nukleových kyselin. Infikované rostliny jsou charakterizovány přítomností specifického proužku RNA. Cirkulární formu viroidů lze snadno separovat a detekovat ve druhém běhu elektroforézy za denaturačních podmínek, kdy dochází ke zbrzdění cirkulární formy viroidní RNA.

Druhým je použití specifických molekulárních sond. Praktický diagnostický test pro detekci PSTVd, založený na hybridizaci nukleových kyselin, byl vyvinut Owensem a Dienerem (1981). Tento test je založen na hybridizaci uměle připravené sondy DNA (pomocí metod genetického inženýrství) komplementární k RNA viroidu. PSTVd se váže na pevnou podložku (nitrocelulosa, nylon) a je detekován hybrid DNA - RNA. Protože PSTVd cDNA je klonována, lze ji získat bez větších nákladů v dostatečném množství. Tato metoda je velmi citlivá, není třeba inokulovat mezihostitele a při přípravě vzorků zdlouhavě purifikovat RNA. Použití pouze částečně přečištěné šťávy z rostlin bramborů zjednodušuje, urychluje a zlevňuje přípravu vzorků. Diagnostické sondy DNA lze značit radioaktivně (^2p) nebo neradioaktivně (biotin, digoxigenin). Hybridizační techniky detekce jsou nyní v mnoha obměnách užívány ve velkém měřítku nejen pro detekci PSTVd, ale i pro další viroidy a viry.

Třetím jsou postupy využívající technik RT-PCR a RT-PCR v reálném čase. Metoda kvantitativní PCR je založena na stanovování fluorescence produktu PCR v jednotlivých vzorcích po každém cyklu PCR pomocí fluorescenčních sond a stanovování počtu cyklu potřebných pro dosažení prahové fluorescence. Stanovování se provádí na základě měřených změn fluorescence fluorescenční sondy. Používají se jednak nespecifická sonda využívající SybrGreen I, nebo fluoféhromem značené sondy specifické pro amplifikovaný úsek dané nukleové kyseliny. Existuje více typů specifických ···· · · ··· · a sond, avšak nejčastěji používané sondy pro kvantifikaci jsou lineární hydrolyzační sondy, tzv. TaqMan sondy (Matoušek a kol., 2004, Ptáček a Dědič, 2006, Matoušek a kol., 2007).

Metody a postupy založené na detekci viroidní nukleové kyseliny pomocí specifických primerů pro reverzní transkripci - polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) jsou řádově citlivější než metody elektroforetické nebo hybridizační a jsou v současnosti více používány. Metoda kvantitativní RT-PCR je jednou z nejcitlivějších používaných diagnostických metod a nachází uplatnění v detekci širokého spektra patogenů bramboru. Primery (Matoušek et al. 2007), jsou pro detekci minus řetězců, a to je důležité pro prevenci kontaminací například klonovanými viroidy, plus viroidní cDNA, inokulem a podobně, protože minus řetězce jsou navíc mnohem méně stabilnější. Vzorky, které tímto způsobem vyjdou jako pozitivní, jsou opravdu pozitivní, a detekují replikaci viroidu. Metoda pro specifickou detekci PSTVd pomocí kvantitativní RT-PCR nebyla do současnosti navržena a tím ohrožuje trh s brambory v ČR.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky odstraňuje reakční směs pro molekulární detekci Viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru pomocí kvantitativní RT-PCR, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, 12,5 μί 2x master mixu obsahujícího směs pufru, DNA polymerázy, deoxyribonukleotidů, a chloridu hořečnatého, 1,0 μΙ směsi reverzní transkriptázy a inhibitoru RNáz, dále 9,3 μΙ sterilní destilované vody doplňující reakcm směs do konečného objemu 25 μΙ a 0,1 μΙ každého primery o koncentraci 100jiM a specifické nukleotidové sekvenci

QRT R_PSTVd: CTT TCT TCg ggT gTC CTT CC

QPCR R.PSTVd: CTC ggg AgC TTC AgT TgT TTC, které amplifikují fragment o velikosti 101 bp, a μΙ sondy PSTVd o koncentraci 30^μΜ a specifické nukleotidové sekvenci TgCgCTgTCgCTTCggCTACT,

-4·^· ·..· * .:..:1.

přičemž tato sonda je značena fluorescenčním barvivém 6 iv

- karboxyfluorescein^FAM) a jako zhášeč je použit tetramnetýlkarboxyrhodamin (TAMRA).

Reakční směs podle vynálezu se připravuje v mikrozkumavce a obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, jakékoli komerční činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs pftgdnukleotidů, pufr obsahující MgCI₂, např. Brilliant II QRT-PCR 1-Step Master Mix, dále sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ. Vlastní QRT-PCR probíhá v real-time termocykleru v 0,2^ml PCR zkumavkách (stripech, destičkách) 30 min při 48 °C, následuje desetiminutová denaturace při 95 °C a 40 cyklů, obsahujících 2 kroky: 15 sekund při 95 °C a 1 minuta při 60 °C.

Molekulární detekce probíhá pomocí kvantitativní RT-PCR, což je reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce v reálném čase (QRT- PCR) za běžných podmínek.

Reakční směs podle vynálezu umožňuje exaktní jednoduché stanovení viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru, což má velký význam pro ochranu ne jen území České republiky před zavlečením tohoto závažného karanténního onemocnění bramboru.

Následující příklady provedení reakční směs podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ji jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

Biolistický přenos populací viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru (PSTVd) do plevelných rostlin vyskytujících se na bramborovýqpolích a patogeneze PSTVd na Chamomilla reculita

Plevelné rostliny běžně se vyskytující na bramborových polích nebyly doposud pokládány za hostitelské rostliny, tj. rostliny umožňující přenos PSTVd na brambory. Biolistický byly inokulovány vybrané plevelné rostliny populacemi viroidů, jak RNA, tak cDNA, variantami PSTVd. Byli nalezeni noví potenciální hostitelé PSTVd z oblasti střední Evropy. Z 12 druhů plevelných rostlin přítomných na bramborových polích, vysoké hladiny PSTVd, detekovatelné i molekulární hybridizací, byly udržovány v rostlinách Chammomilla reculita a Anthemis arvensis po RNA i cDNA přenosu PSTVd. Nízká hladina viroidu, detekovatelná pouze RT-PCR, byla udržována ve Veronica argensis a Amarantus retroflexus po inokulaci rostlin cDNA PSTVd. V těchto dvou plevelích byla koncentrace 105 event. 103_krát nižší než v rajčatech (zjištěno pomocí kvantitativní RT-PCR).

Pro izolaci celkové RNA lze použít mnoho různých postupů, z hlediska časové náročnosti, kvality získané RNA a reprodukovatelnosti izolačního procesu je optimální použít některý z široké škály komerčních souprav (Invitek, Roche, atd.). Původci doporučují postup extrakce RNA pomocí RNeasy Plant Total RNA Kit (QIAGEN).

QRT-PCR probíhala v 0,2 ml PCR zkumavkách (destičkách, stripech), nejdříve 30 min při 48 °C, poté 10 min úvodní denaturace 95 °C, 40 cyklů (15 s 95 °C·, 60 s 60 °C)v real-time termocykleru. Byl použit Brilliant II QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step, 600809 Stratagene, objem reakce 25 μ|. Detekce probíhala za podmínek: 12,5 μΙ 2x master mi)^ 1,0 μΙ směsi reverzní transkriptázy a inhibitoru RNáz (RT/RNase block enzyme), 0,1 μΙ primeííQRT z*/ γ

R_PSTVd 100μΜ, 0,1 μ| primenOPCR R_PSTVd 100μΜ, 1 μΙ sonda 30μΜ, 9,3 μΙ vodaí 1 μΙ RNA.

Výsledek QRT-PCR byl analyzován pomocí měření fluorescence dR, kdy velikost produktu byla 101 bp, jak zobrazuje přiložený Graf 1.

Průmyslová využitelnost

Reakční směs pro diagnostiku viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru (PSTVd) pomocí kvantitativní RT-PCR je možno dodávat laboratořím zabývajícím se detekcí rostlinných patogenů jako detekční soupravu k jednoduchému, okamžitému použití, kdy na uživateli je pouze přidat svůj vzorek testované RNA a provést QRT-PCR reakci dle přesně stanovených podmíněna tak efektivně chránit bramborový trh před nebezpečnou infekcí.

• · · · « » · · · · · • · · · · · ·· · · · ·

Použitá literatura

DIENER, T. O. (ed.). (1979): Viroids and viroid diseases. Wiley, New York, NY.

DIENER, T. O. (1995): Origin and evolution of viroids and viroid-like satellite RNAs. Virus Genes 11:119-131.

JEFFRIES, C. - JAMES C. Development of an EU protocol for the detection and diagnosis of Potato spindle tuber popsiviroid. Bulletin OEPP/EPPO, 2005, 35, s. 125-132

MATOUŠEK, J. - ORCTOVÁ, L. - STEGER, G. - RIESNER, D. (2004): Biolistic inoculation of plants with viroid nucleic acids. J. Virol. Methods 122:153 -164.

MATOUŠEK J„ ORCTOVÁ L„ PTÁČEK J., PATZAK J., DĚDIČ P., STEGER G., RIESNER D.: Experimental transmission of Pospiviroid population to weed species characteristic for potato and hop fields. J. Virol, 81, 2007, 11891-11899

PTÁČEK J. - DĚDIČ P. Diagnóza viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru molekulárně genetickými technikami (RT-PCR a RT-PCR v reálném čase). Sborník abstraktů XVII. České a slovenské konference o ochraně roslin, ČR, 2006, s. 37-39

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   X Reakční směs pro molekulární detekci viroidu vřetenovitosti hlíz bramboru pomocí kvantitativní RT-PCR, vyznačující se tím, že obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, 12,5 μί 2x master mixu obsahujícího směs pufru, DNA polymerázy, deoxyribonukleotidů, a chloridu horečnatého, 1,0 pl směsi reverzní transkriptázy a inhibitoru RNáz, dále 9,3 μΙ sterilní destilované vody doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μί a 0,1 μί Λλ/ každého primery o koncentraci 100jj,M a specifické nukleotidové sekvenci QRT R_PSTVd: CTT TCT TCg ggT gTC CTT CC

   QPCR R_PSTVd: CTC ggg AgC TTC AgT TgT TTC, které amplifikují fragment o velikosti 101 bp, a

   1 μΙ sondy PSTVd o koncentraci 30jj.M a specifické nukleotidové sekvenci TgCgCTgTCgCTTCggCTACT, přičemž tato sonda je značena fluorescenčním barvivém 6 - karboxyfluorescein^FAM) a jako zhášeč je použit tetra^meťýlkarboxyrhodamin (TAMRA).