CZ201369A3 - Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR - Google Patents

Abstract

Řešení se týká reakční směsi L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR, která je charakterizována tím, že obsahuje 1.mi.l vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCl.sub.2.n., sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 .mi.l a primery o specifické nukleotidové sekvenci L-4561F: GTT GGT GAA GCG GAT GGT GTC AAA, L-4691R: ATT GTA GCG TCC CGT TCA AGG AGT, amplifikující fragment o velikosti 130 bp, a sondu L-4595S: TA CGC AAC GAT AAC ACC TAC CGC CAA, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivem 6 – carboxyfluorescein (FAM) a jako zhášeč je použit tetra-metylkarboxyrhodamin (TAMRA).

Description

Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR

Oblast techniky

Řešení se týká reakční směsi L3 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR, který je závažným karanténím viroidním onemocněním bramboru, pomocí molekulární detekce viroidm RNA molekulární metodou reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce v reálném čase (dále QRT-PCR)

Dosavadní stav techniky

Virová svinutka bramboru patří mezi závažná virová onemocnění bramboru způsobující snížení výnosu až o 80 %. Virus svinutky je přenášen pouze savým hmyzem a sadbou (Rasocha et al„ 2007). Virus svinutky (PLRV) způsobuje kornoutovité stáčení listů, nejdříve ve spodním patru, později i ve vyšších patrech rostlin. Listy jsou kožovitě tuhé, při dotyku šustí, při zmáčknuti praskají. Rostliny jsou světlejší, chlorózní, obvykle nižšího vzrůstu se zkrácenými internodiemi. Hlízy jsou většinou drobnější. Přítomnost viru svinutky bramboru se převážně zjišťuje laboratorními metodami, nejdéle a nejčastěji imunoenzymatickou metodou ELISA (Clark a Adams, 1977).

Druhým postupem je použití specifických molekulárních sond. Tento test je založen na hybridizaci uměle připravené sondy DNA (pomocí metod genetického inženýrství) komplementární k RNA viroidu. PLRV se váze na pevnou podložku (nitrocelulosa, nylon) a je detekován hybrid DNA - RNA. Protože PLRV cDNA je klonována, lze ji získat bez větších nákladů v dostatečném množství. Tato metoda je velmi citlivá, není třeba inokulovat mezihostitele a při přípravě vzorků zdlouhavě purifikovat RNA. Použití pouze částečně přečištěné šťávy z rostlin bramborů zjednodušuje, urychluje a zlevňuje přípravu vzorků. Diagnostické sondy DNA lze značit radioaktivně (32p) nebo neradioaktivně (biotin, digoxigenin). Hybridizační techniky detekce jsou nyní v mnoha obměnách užívány nejen pro detekci PLRV, ale i pro další viry.

Třetí možností jsou postupy využívající technik RT-PCR a RT-PCR v reálném čase. Metoda kvantitativní PCR je založena na stanovování fluorescence produktu PCR v jednotlivých vzorcích po každém cyklu PCR pomocí fluorescenčních sond a stanovování počtu cyklů potřebných pro dosažení prahové fluorescence. Stanovování se provádí na základě měřených změn fluorescence fluorescenční sondy. Používají se jednak nespecifická sonda využívající SybrGreen I, nebo fluorchromem značené sondy specifické pro amplifikovaný úsek dané nukleové kyseliny. Existuje více typů specifických sond, avšak nejčastěji používané sondy pro kvantifikaci jsou lineární hydrolyzační sondy tzv. TaqMan sondy (Ptáček a Dědič., 2009).

Metody a postupy založené na detekci virové nukleové kyseliny pomocí specifických primerů pro reverzní transkripci - polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) jsou řádově citlivější než metoda ELISA nebo hybridizační postupy a jsou v současnosti více používány. Metoda kvantitativní RT-PCR je jednou z nejcitlivějších používaných diagnostických metod a nachází uplatnění v detekci širokého spektra patogenů bramboru. Metoda pro specifickou detekci PLRV pomocí kvantitativní RT-PCR nebyla do současnosti v ČR navržena.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky odstraňuje reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí reverzní transkripce polymerázová řetězová reakce v reálném čase (QRT-PCR), podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCh, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ a primery o specifické nukleotidové sekvenci

L-4561F: GTT GGT GAA GCG GAT GGT GTC AAA

L-4691R: ATT GTA GCG TCC CGT TCA AGG AGT, amplifikující fragment o velikosti 130 bp, a sondu

L-4595S: TA CGC AAC GAT AAC ACC TAC CGC CAA, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6 - carboxyfluorescein (FAM) a jako zhášeč je použit tetra-metylkarboxyrhodamin (TAMRA).

Primery a sondy pro detekci PLRV pomocí QRT-PCR (Ptáček a Dědič, 2009) byly navrženy na základě sekvence izolátu PLRV (Plchová et al, 2009), čísla v názvu značí umístění primerů a sondy v genomu PLRV).

Reakční směs L3 podle vynálezu se připravuje v mikrozkumavce a obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, jakékoli komerční činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs oligonukleotidů, pufr obsahující chlorid horečnatý MgCI₂, např. Brilliant II QRT-PCR 1-Step Master Mix, dále sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ.

Vlastní QRT-PCR probíhá v real-time termocykleru v 0,2 ml PCR zkumavkách (stripech, destičkách) 30 min při 48 °C, následuje desetiminutová denaturace při 95 °C a 40 cyklů, obsahujících 2 kroky: 15 sekund při 95 °C a 1 minuta při 60 °C.

Reakční směs L3 podle vynálezu umožňuje exaktní stanovení Viru svinutky bramboru (PLRV), což má velký význam při produkci sadbových brambor na území České republiky.

Následující příklady provedení reakční směs L3 podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ji jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

U 55 sbírkových izolátů tohoto viru byly ověřeny možnosti jeho detekce v postupech RT-PCR a QRT-PCR. Pro vlastní zkoušení byly používány jak metody izolace celkové nukleové kyseliny (NA), tak imunovazebné techniky (IC). U RT-PCR byly získány optimální výsledky pomocí primerů dle Solimana, kterými byly detekovány všechny zkoušené izoláty. Pro detekci PLRV metodou QRT-PCR byly na základě sekvenční analýzy českého izolátu (Plchová et al, 2009) navrženy sady primerů a sondy TaqMan. Kvizualizaci amplifikátů virové NA v postupech dvoukrokové QRT-PCR bylo používáno jak nespecifické značení pomocí SYBR Green, tak za použití vlastní specifické TaqMan sondy. Detekce PLRV pomocí QRT-PCR byla možná a spolehlivá při obou postupech značení DNA. Dosažené výsledky byly z hlediska citlivosti a spolehlivosti porovnány s metodou ELISA.

Pro vlastní experimenty byly používány izoláty jednotlivých virů ze sbírkové kolekce mikroorganizmů (http://www.vurv.cz/collections/) udržované ve VÚB Havlíčkův Brod, CZ, v podmínkách in vitro. Celkově bylo testováno 59 vzorků, z toho 4 negativní kontroly.

Pro izolaci celkové RNA lze použít mnoho různých postupů, z hlediska časové náročnosti, kvality získané RNA a reprodukovatelnosti izolačního procesu je optimální použít některý z široké škály komerčních souprav (Invitek, Roche, atd.). Původci doporučují postup extrakce RNA pomocí RNeasy Plant Total RNA Kit (QIAGEN).

QRT-PCR probíhala v 0,2 ml PCR zkumavkách (destičkách, stripech), nejdříve 30 min při 48 °C, poté 10 min úvodní denaturace 95 °C, 40 cyklů (15 s 95°C, 60 s 60 °C v real-time termocykleru, Brilliant II QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step, 600809 Stratagene, objem reakce 25 μΙ, 12,5 μΙ 2x master mix, 1,0 pl RT/RNase block enzyme (směs reverzní transkriptázy a RNasin), 0,1 μΙ primer L-4561F 100 μΜ, 0,1 μΙ primer L-4691R 100 μΜ, 1 μΙ sonda 30 μΜ, 9,3 μΙ voda, 1 μΙ RNA.

Výsledek QRT-PCR byl analyzován pomocí měření fluorescence dR, jak je zobrazeno na Obr. 1, kde je QRT-PCR - ukázka amplifikačních křivek detekce PLRV.

Průmyslová využitelnost

Reakční směs L2 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR je možno dodávat laboratořím zabývajícím se detekcí rostlinných patogenů jako detekční soupravu k jednoduchému okamžitému použití, kdy na uživateli je pouze přidat svůj vzorek testované RNA a provést QRT-PCR reakci dle přesně stanovených podmínek.

Seznam publikací původců

PTÁČEK, J. - DĚDIČ, P. Detekce a identifikace izolátů viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí molekulárních technik RT-PCR a QRT-PCR, Vědecké práce - Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 2009, 17, 25-35.

Použitá literatura

PEIMAN, M. - XIE, C. (2006): Sensitive detection of potato viruses, PVX, PLRV, and PVS in potato leaf and tuber. Australasian Plant Diseases Notes 1(1):41-46

PLCHOVÁ, H. - ČEŘOVSKÁ, N. - MORAVEC, T. - DĚDIČ P. (2009): Molecular analysis of Potato leafroll virus isolates from the Czech Republic. VIRUS GENES 39, 1, 153-155.

RASOCHA, V. - HAUSVATER, E. - DOLEŽAL, P. Mšice - významní přenašeči virových chorob brambor, jejich výskyt, škodlivost a možnosti ochrany, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. 2007

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí metody kvantitativní RT-PCR (QRT-PCR), vyznačující se t í m, že obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCI₂, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ a primery o specifické nukleotidové sekvenci

   L-4561F: GTT GGT GAA GCG GAT GGT GTC AAA

   L-4691R: ATT GTA GCG TCC CGT TCA AGG AGT, amplifikující fragment o velikosti 130 bp, a sondu

   L-4595S: TA CGC AAC GAT AAC ACC TAC CGC CAA, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6 - carboxyfluorescein (FAM) a jako zhášeč je použit tetra-metylkarboxyrhodamin (TAMRA).