CZ25104U1 - Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru sviňútky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR - Google Patents
Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru sviňútky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR Download PDFInfo
- Publication number
- CZ25104U1 CZ25104U1 CZ201327393U CZ201327393U CZ25104U1 CZ 25104 U1 CZ25104 U1 CZ 25104U1 CZ 201327393 U CZ201327393 U CZ 201327393U CZ 201327393 U CZ201327393 U CZ 201327393U CZ 25104 U1 CZ25104 U1 CZ 25104U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pcr
- plrv
- reaction mixture
- quantitative
- qrt
- Prior art date
Links
Description
Úřad průmyslového vlastnictví v zápisném řízení nezjišťuje, zda předmět užitného vzoru splňuje podmínky způsobilosti k ochraně podle § 1 zák. č. 478/1992 Sb.
CZ 25104 Ul
Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR
Oblast techniky
Řešení se týká reakční směsi L3 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvan5 titativní RT-PCR, který je závažným karanténním viroidním onemocněním bramboru, pomocí molekulární detekce viroidní RNA molekulární metodou reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce v reálném čase (dále QRT-PCR).
Dosavadní stav techniky
Virová svinutka bramboru patří mezi závažná virová onemocnění bramboru způsobující snížení výnosu až o 80 %. Virus svinutky je přenášen pouze savým hmyzem a sadbou (Rasocha et ak, 2007). Virus svinutky (PLRV) způsobuje komoutovité stáčení listů, nejdříve ve spodním patru, později i ve vyšších patrech rostlin. Listy jsou kožovitě tuhé, pri dotyku šustí, pri zmáčknutí praskají. Rostliny jsou světlejší, chlorózní, obvykle nižšího vzrůstu se zkrácenými intemodiemi. Hlízy jsou většinou drobnější. Přítomnost viru svinutky bramboru se převážně zjišťuje laborator15 nimi metodami, nejdéle a nejčastěji imunoenzymatickou metodou ELISA (Clark a Adams, 1977).
Druhým postupem je použití specifických molekulárních sond. Tento test je založen na hybridizaci uměle připravené sondy DNA (pomocí metod genetického inženýrství) komplementární k RNA viroidu. PLRV se váže na pevnou podložku (nitrocelulóza, nylon) a je detekován hybrid
DNA - RNA. Protože PLRV cDNA je klonována, lze ji získat bez větších nákladů v dostatečném množství. Tato metoda je velmi citlivá, není třeba inokulovat mezihostitele a při přípravě vzorků zdlouhavě purifikovat RNA. Použití pouze částečně přečištěné šťávy z rostlin bramborů zjednodušuje, urychluje a zlevňuje přípravu vzorků. Diagnostické sondy DNA lze značit radioaktivně (32P) nebo nerad ioakti vně (biotin, digoxigenin). Hybridizační techniky detekce jsou nyní v mnoha obměnách užívány nejen pro detekci PLRV, ale i pro další viry.
Třetí možností jsou postupy využívající technik RT-PCR a RT-PCR v reálném čase. Metoda kvantitativní PCR je založena na stanovování fluorescence produktu PCR v jednotlivých vzorcích po každém cyklu PCR pomocí fluorescenčních sond a stanovování počtu cyklů potřebných pro dosažení prahové fluorescence. Stanovování se provádí na základě měřených změn fluores30 cence fluorescenční sondy. Používají se jednak nespecifická sonda využívající SybrGreen I, nebo fluorchromem značené sondy specifické pro amplífikovaný úsek dané nukleové kyseliny. Existuje více typů specifických sond, avšak nejčastěji používané sondy pro kvantifikaci jsou lineární hydrolyzační sondy tzv. TaqMan sondy (Ptáček a Dědič., 2009).
Metody a postupy založené na detekci virové nukleové kyseliny pomocí specifických primerů pro reverzní transkripci - polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) jsou řádově citlivější než metoda ELISA nebo hybridizační postupy a jsou v současnosti více používány. Metoda kvantitativní RT-PCR je jednou z nej citlivějších používaných diagnostických metod a nachází uplatnění v detekci širokého spektra patogenů bramboru. Metoda pro specifickou detekci PLRV pomocí kvantitativní RT-PCR nebyla do současnosti v ČR navržena.
Podstata technického řešení
Uvedené nedostatky odstraňuje reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí reverzní transkripce polymerázové řetězové reakce v reálném čase (QRT-PCR), podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že směs obsahuje 1 μΐ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCh, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΐ a příměry o specifické nukleotidové sekvenci
- 1 CZ 25104 Ul
L-4561 F: GTT GGT GAA GCG GAT GGT GTC AAA
L-4691 R: ATT GTA GCG TCC CGT TCA AGG AGT, amplifikující fragment o velikosti 130 bp, a SOndli
L-4595S: TA CGC AAC GAT AAC ACC TAC CGC CAA, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6-karboxyfluoresceinem (FAM) a jako zhášečje použit tetramethylkarboxyrhodamin (TAMRA).
Příměry a sondy pro detekci PLRV pomocí QRT-PCR (Ptáček a Dědic, 2009) byly navrženy na základě sekvence ízolátu PLRV (Plchová et al, 2009), Čísla v názvu značí umístění primerů io a sondy v genomu PLRV).
Reakční směs L3 podle technického řešení se připravuje v mikrozkumavce a obsahuje 1 μΐ vzorku testované RNA, jakékoli komerční činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs olígonukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCl2, např. Brilliant II QRT-PCR 1-Step Master Mix, dále sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ.
Vlastní QRT-PCR probíhá v real-time termocykleru v 0,2ml PCR zkumavkách (stripech, destičkách) 30 min při 48 °C, následuje desetiminutová denaturace při 95 °C a 40 cyklů, obsahujících 2 kroky: 15 sekund při 95 °C a 1 minuta při 60 °C.
Reakční směs L3 podle technického řešení umožňuje exaktní stanovení viru svinutky bramboru (PLRV), což má velký význam při produkci sadbových brambor na území České republiky.
Následující příklady provedení reakční směs L3 podle technického řešení pouze dokládají, aniž by ji jakkoliv omezovaly.
Příklady provedení
Příklad 1
U 55 sbírkových izolátů tohoto viru byly ověřeny možnosti jeho detekce v postupech RT-PCR a QRT-PCR. Pro vlastní zkoušení byly používány jak metody izolace celkové nukleové kyseliny (NA), tak imunovazebné techniky (IC). U RT-PCR byly získány optimální výsledky pomocí primerů dle Solimana, kterými byly detekovány všechny zkoušené izoláty. Pro detekci PLRV metodou QRT-PCR byly na základě sekvenční analýzy českého izolátu (Plchová et al, 2009) navrženy sady primerů a sondy TaqMan. K vizualizaci amplifikátů virové NA v postupech dvoukrokové QRT-PCR bylo používáno jak nespecifické značení pomocí SYBR Green, tak za použití vlastní specifické TaqMan sondy. Detekce PLRV pomocí QRT-PCR byla možná a spolehlivá při obou postupech značení DNA. Dosažené výsledky byly z hlediska citlivosti a spolehlivosti porovnány s metodou ELISA.
Pro vlastní experimenty byly používány izoláty jednotlivých virů ze sbírkové kolekce mikroorganizmů (http://www.vurv.cz/collections/) udržované ve VÚB Havlíčkův Brod, CZ, v podmínkách in vitro. Celkově bylo testováno 59 vzorků, z toho 4 negativní kontroly.
Pro izolaci celkové RNA lze použít mnoho různých postupů, z hlediska Časové náročnosti, kvality získané RNA a reprodukovatelnosti izolačního procesu je optimální použit některou z široké škály komerčních souprav (Obvitek, Roche, atd.). Původci doporučují postup extrakce RNA pomocí RNeasy Plant Total RNA Kit (Q1AGEN).
QRT-PCR probíhala v 0,2ml PCR zkumavkách (destičkách, stripech), nejdříve 30 min při 48 °C, poté 10 min úvodní denaturace 95 °C, 40 cyklů (15 s 95 °C, 60 s 60 °C v real-time termocykleru. Brilliant II QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step, 600809 Stratagene, objem reakce 25 μΐ, 12,5 μΐ
-2 CZ 25104 Ul
2x master mix, 1,0 μΐ RT/RNase block enzyme (směs reverzní transkriptázy a RNasin), 0,1 μΐ primer L-4561 F ΙΟΟμΜ, 0,1 μΐ primer L-4691 R ΙΟΟμΜ, 1 μΐ sonda 30μΜ, 9,3 μΐ voda, 1 μΐ RNA.
Výsledek QRT-PCR byl analyzován pomocí měření fluorescence dR, jak je zobrazeno na Obr. 1, kde je QRT-PCR - ukázka amplifikaěních křivek - detekce PLRV.
Průmyslová využitelnost
Reakční směs L3 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR je možno dodávat laboratořím zabývajícím se detekcí rostlinných patogenů jako detekční soupravu k jednoduchému okamžitému použití, kdy na uživateli je pouze přidat svůj vzorek testované RNA a provést QRT-PCR reakci dle přesně stanovených podmínek.
Seznam publikací původců
PTÁČEK, J. - DĚDIČ, P. Detekce a identifikace izolátů viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí molekulárních technik RT-PCR a QRT-PCR, Vědecké práce - Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 2009, 17, 25-35.
Použitá literatura
PEIMAN, Μ. - XIE, C. (2006): Sensitive detection of potato viruses, PVX, PLRV, and PVS in potato leaf and tuber. Australasian Plant Diseases Notes 1(1): 41-46.
PLCHOVÁ, H. - ČEŘOVSKÁ, N. - MORAVEC, T. - DĚDIČ P. (2009): Molecular analysis of Potato leafroll virus isolates from theCzech Republic. VIRUS GENES 39, 1, 153-155.
RASOCHA, V. - HAUS VATER, E. - DOLEŽAL, P. Mšice - významní přenašeči virových chorob brambor, jejich výskyt, škodlivost a možnosti ochrany, Výzkumný ústav bramborářský
Claims (1)
- NÁROKY NA OCHRANU1. Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí metody kvantitativní RT-PCR (QRT-PCR), vyznačující se tím, že obsahuje 1 μΐ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid hořeěnatý MgCl2, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΐ a primery o specifické nukleotidové sekvenciL-4561 F: GTT GGT GAA GCG GAT GGT GTC AAAL-4691 R; ATT GTA GCG TCC CGT TCA AGG AGT, amplifikující fragment o velikosti 130 bp, a sonduL-4595S: TA CGC AAC GAT AAC ACC TAC CGC CAA, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6-karboxyfluoresceinem (FAM) a jako zhášeč je použit tetramethylkarboxyrhodamin (TAMRA).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ201327393U CZ25104U1 (cs) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru sviňútky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ201327393U CZ25104U1 (cs) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru sviňútky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ25104U1 true CZ25104U1 (cs) | 2013-03-18 |
Family
ID=47901709
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ201327393U CZ25104U1 (cs) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru sviňútky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ25104U1 (cs) |
-
2013
- 2013-02-01 CZ CZ201327393U patent/CZ25104U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1898395B (zh) | 基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒 | |
Mohamed et al. | A sensitive and quantitative single-tube real-time reverse transcriptase-PCR for detection of enteroviral RNA | |
JP2014511177A (ja) | 呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キット | |
WO2018035860A1 (zh) | 同时检测及定量分析四种血源性病毒的多重Taqman探针qPCR的试剂盒及方法 | |
Papayiannis | Diagnostic real-time RT-PCR for the simultaneous detection of Citrus exocortis viroid and Hop stunt viroid | |
Park et al. | Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChMVd) | |
US20180265936A1 (en) | Compositions and methods for detection and discrimination of influenza viruses | |
WO2009061640A3 (en) | Hepatitis b virus (hbv) specific oligonucleotide sequences | |
JP2018007694A (ja) | ターゲット核酸検出のための二重プローブアッセイ | |
CN102286639A (zh) | 甲型h1n1/甲型流感病毒核酸双重荧光pcr检测试剂盒 | |
Matsuda et al. | A novel high-speed droplet-polymerase chain reaction can detect human influenza virus in less than 30 min | |
CZ201369A3 (cs) | Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
CN106471135B (zh) | 肠道病毒和双埃柯病毒的分子检测 | |
CZ25104U1 (cs) | Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru sviňútky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
CN114032337A (zh) | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
Olmos et al. | Molecular diagnostic methods for plant viruses | |
CN106939356B (zh) | 一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
CN106011308A (zh) | 丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒、寡核苷酸及其应用 | |
RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
CZ25101U1 (cs) | Reakční směs Ll pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
CZ201361A3 (cs) | Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
RU2795016C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 | |
CZ201366A3 (cs) | Reakční směs L2 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
CZ25103U1 (cs) | Reakční směs L2 pro molekulární detekci viru sviň útky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
RU2795017C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20130318 |
|
ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20170123 |
|
MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20200201 |