CZ25103U1

CZ25103U1 - Reakční směs L2 pro molekulární detekci viru sviň útky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR

Info

Publication number: CZ25103U1
Application number: CZ201327391U
Authority: CZ
Inventors: Ptácek@Jirí
Original assignee: Výzkumný ústav bramborárský Havlíckuv Brod, s.r.o
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2013-03-18

Description

Oblast techniky

Řešení se týká reakční směsi L2 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR, který je závažným karanténním viroidním onemocněním bramboru, pomocí molekulární detekce viroidní RNA molekulární metodou reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce v reálném čase (dále QRT-PCR).

Dosavadní stav techniky

Virová svinutka bramboru patří mezi závažná virová onemocnění bramboru způsobující snížení výnosu až o 80%. Virus svinutky je přenášen pouze savým hmyzem a sadbou (Rasocha et al., 2007). Virus svinutky (PLRV) způsobuje komoutovité stáčení listů, nejdříve ve spodním patru, později i ve vyšších patrech rostlin. Listy jsou kožovitě tuhé, při dotyku šustí, při zmáčknutí praskají. Rostliny jsou světlejší, chlorózní, obvykle nižšího vzrůstu se zkrácenými intemodiemi. Hlízy jsou většinou drobnější. Přítomnost viru svinutky bramboru se převážně zjišťuje laboratorními metodami, nejdéle a nejčastěji imunoenzymatickou metodou ELISA (Clark a Adams, 1977).

Druhým postupem je použití specifických molekulárních sond. Tento test je založen na hybridizaci uměle připravené sondy DNA (pomocí metod genetického inženýrství) komplementární k RNA viroidu. PLRV se váže na pevnou podložku (nitrocelulóza, nylon) a je detekován hybrid DNA - RNA. Protože PLRV cDNA je klonována, lze ji získat bez větších nákladů v dostatečném množství. Tato metoda je velmi citlivá, není třeba inokulovat mezihostitele a při přípravě vzorků zdlouhavě purifikovat RNA. Použití pouze částečně přečištěné šťávy z rostlin bramborů zjednodušuje, urychluje a zlevňuje přípravu vzorků. Diagnostické sondy DNA lze značit radioaktivně (³²P) nebo neradioaktivně (biotin, digoxigenin). Hybridizační techniky detekce jsou nyní v mnoha obměnách užívány nejen pro detekci PLRV, ale i pro další viry.

Třetí možností jsou postupy využívající technik RT-PCR a RT-PCR v reálném čase. Metoda kvantitativní PCR je založena na stanovování fluorescence produktu PCR v jednotlivých vzorcích po každém cyklu PCR pomocí fluorescenčních sond a stanovování počtu cyklů potřebných pro dosažení prahové fluorescence. Stanovování se provádí na základě měřených změn fluorescence fluorescenční sondy. Používají se jednak nespecifická sonda využívající SybrGreen I, nebo fluorchromem značené sondy specifické pro amplifikovaný úsek dané nukleové kyseliny. Existuje více typů specifických sond, avšak nej častěji používané sondy pro kvantifikaci jsou lineární hydrolyzační sondy tzv. TaqMan sondy (Ptáček a Dědič., 2009).

Metody a postupy založené na detekci virové nukleové kyseliny pomocí specifických primerů pro reverzní transkripci - polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) jsou řádově citlivější než metoda ELISA nebo hybridizační postupy a jsou v současnosti více používány. Metoda kvantitativní RT-PCR je jednou z nej citlivějších používaných diagnostických metod a nachází uplatnění v detekci širokého spektra patogenů bramboru. Metoda pro specifickou detekci PLRV pomocí kvantitativní RT-PCR nebyla do současnosti v ČR navržena.

Podstata technického řešení

Uvedené nedostatky odstraňuje reakční směs L2 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí reverzní transkripce - polymerázové řetězové reakce v reálném čase (QRTPCR), podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že směs obsahuje 1 μΐ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid horečnatý MgCI₂, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΐ a příměry o specifické nukleotidové sekvenci

CZ 25103 Ul

L-3989F: AAT TCC AAA TTA CGA AGG GCG GCG

L-4098R: ATT TCC CTT CCA CAG TAT CCG GCA, amplifikující fragment o velikosti 109 bp, a sondu

L-4043S: GG GTA GAA TGG CAC GAT TCT TCT GAG GA, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6-karboxyfluoresceinem (FAM) a jako zhášeč je použit tetrametylkarboxyrhodamin (TAMRA).

Primery a sondy pro detekci PLRV pomocí QRT-PCR (Ptáček a Dědic, 2009) byly navrženy na základě sekvence izolátu PLRV (Plchová et al, 2009), čísla v názvu značí umístění primerů io a sondy v genomu PLRV.

Reakční směs L2 podle technického řešení se připravuje v mikrozkumavce a obsahuje 1 μΐ vzorku testované RNA, jakékoli komerční činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs oligonukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCl₂, např. Brilliant II QRT-PCR 1-Step Master Mix, dále sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΐ.

Vlastní QRT-PCR probíhá v real-time termocykleru v 0,2ml PCR zkumavkách (stripech, destičkách) 30 min při 48 °C, následuje desetiminutová denaturace při 95 °C a 40 cyklů, obsahujících 2 kroky: 15 sekund pří 95 °C a 1 minuta při 60 °C.

Reakční směs L2 podle technického řešení umožňuje exaktní stanovení viru svinutky bramboru (PLRV), což má velký význam při produkci sadbových brambor na území České republiky.

Následující příklady provedení reakční směs L2 podle technického řešení pouze dokládají, aniž by ji jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

U 55 sbírkových izolátů tohoto viru byly ověřeny možnosti jeho detekce v postupech RT-PCR a QRT-PCR. Pro vlastní zkoušení byly používány jak metody izolace celkové nukleové kyseliny (NA), tak imunovazebné techniky (IC). U RT-PCR byly získány optimální výsledky pomocí primerů dle Solimana, kterými byly detekovány všechny zkoušené izoláty. Pro detekci PLRV metodou QRT-PCR byly na základě sekvenční analýzy českého izolátu (Plchová et al, 2009) navrženy sady primerů a sondy TaqMan. K vizualizaci amplifikátů virové NA v postupech dvoukrokové QRT-PCR bylo používáno jak nespecifické značení pomocí SYBR Green, tak za použití vlastní specifické TaqMan sondy. Detekce PLRV pomocí QRT-PCR byla možná a spolehlivá pří obou postupech značení DNA. Dosažené výsledky byly z hlediska citlivosti a spolehlivosti porovnány s metodou ELISA.

Pro vlastní experimenty byly používány izoláty jednotlivých virů ze sbírkové kolekce mikroorganizmů (http://www.vurv.cz/collections/) udržované ve VÚB Havlíčkův Brod, CZ, v podmínkách in vitro. Celkově bylo testováno 59 vzorků, z toho 4 negativní kontroly.

Pro izolaci celkové RNA lze použít mnoho různých postupů, z hlediska časové náročnosti, kvality získané RNA a reprodukovatelnosti izolačního procesu je optimální použít některou z široké škály komerčních souprav (Obvitek, Roche, atd.). Původci doporučují postup extrakce RNA pomocí RNeasy Plant Total RNA Kit (QIAGEN).

QRT-PCR probíhala v 0,2ml PCR zkumavkách (destičkách, stripech), nejdříve 30 min při 48 °C, poté 10 min úvodní denaturace 95 °C, 40 cyklů (15 s 95 °C, 60 s 60 °C v real-time termocykleru, Brilliant 11 QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step, 600809 Stratagene, objem reakce 25 μΐ, 12,5 μΐ

CZ 25103 Ul

2x master mix, 1,0 μΐ RT/RNase block enzyme (směs reverzní transkriptázy a RNasin), 0,1 μΐ primer L-3989F ΙΟΟμΜ, 0,1 μΐ primer L-4098R ΙΟΟμΜ, 1 μΐ sonda 30μΜ, 9,3 μΐ voda, 1 μΐ RNA.

Výsledek QRT-PCR byl analyzován pomocí měření fluorescence dR, jak je zobrazeno na Obr. 1, kde je QRT-PCR - ukázka amplifikačních křivek detekce PLRV.

Průmyslová využitelnost

Reakční směs L2 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR je možno dodávat laboratořím zabývajícím se detekcí rostlinných patogenů jako detekční soupravu k jednoduchému okamžitému použití, kdy na uživateli je pouze přidat svůj vzorek testované io RNA a provést QRT-PCR reakci dle přesně stanovených podmínek.

Seznam publikaci původců

PTÁČEK, J. - DĚDIČ, P. Detekce a identifikace izolátů viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí molekulárních technik RT-PCR a QRT-PCR, Vědecké práce - Výzkumný ústav bramborárský Havlíčkův Brod, 2009, 17, 25-35.

Použitá literatura

PEIMAN, M. - XIE, C. (2006): Sensitive detection of potato viruses, PVX, PLRV, and PVS in potato leaf and tuber. Australasian Plant Diseases Notes 1(1): 41-46.

PLCHOVÁ, H. - ČEŘOVSKÁ, N. - MORAVEC, T. - DĚDIČ P. (2009): Molecular analysis of Potato leafroll virus isolates from the Czech Republic. VIRUS GENES 39, 1, 153-155.

RASOCHA, V. - HAUSVATER, E. - DOLEŽAL, P. Mšice - významní přenašeči virových chorob brambor, jejich výskyt, škodlivost a možnosti ochrany, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. 2007.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Reakční směs L2 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí metody 25 kvantitativní RT-PCR (QRT-PCR), vyznačující se tím, že obsahuje 1 μΐ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid horečnatý MgCb, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ a primery o specifické nukleotidové sekvenci

L-3989F: AAT TCC AAA TTA CGA AGG GCG GCG

30 L-4098R: ATT TCC CTT CCA CAG TAT CCG GCA, amplifikující fragment o velikosti 109 bp, a sondu

L-4043S: GG GTA GAA TGG CAC GAT TCT TCT GAG GA, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6-karboxyfluoresceinem (FAM) a jako zhá35 šeč je použit tetramethylkarboxyrhodamin (TAMRA).