CZ20033409A3 - Immunoconjugates made of egg-yolk antibodies (igy), production and use thereof in diagnoses and therapy - Google Patents

Immunoconjugates made of egg-yolk antibodies (igy), production and use thereof in diagnoses and therapy Download PDF

Info

Publication number
CZ20033409A3
CZ20033409A3 CZ20033409A CZ20033409A CZ20033409A3 CZ 20033409 A3 CZ20033409 A3 CZ 20033409A3 CZ 20033409 A CZ20033409 A CZ 20033409A CZ 20033409 A CZ20033409 A CZ 20033409A CZ 20033409 A3 CZ20033409 A3 CZ 20033409A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
igy
antibodies
conjugates
spf
hens
Prior art date
Application number
CZ20033409A
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Bergter
Hartmut Kobilke
Joachim Sroka
Original Assignee
Wolfgang Bergter
Hartmut Kobilke
Joachim Sroka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wolfgang Bergter, Hartmut Kobilke, Joachim Sroka filed Critical Wolfgang Bergter
Publication of CZ20033409A3 publication Critical patent/CZ20033409A3/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6897—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies
    • A61K47/6898—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies using avidin- or biotin-conjugated antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1006—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being against or targeting material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A61K51/1036—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants against hormone receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Vynález se týká IgY-konjugátů z protilátek z vaječných žloutků (IgY) a jejich konfekčních sad pro diagnostiku a terapii podle nároků 1 a 13.
Pro lepší porozumění vynálezu jsou dále blíže definovány v přihlášce se nacházející odborné termíny, které nemají v rámci této přihlášky žádný jiný význam :
Specificky patogenních faktorů prosté slepice (ve zkratce
SPF-slepice):
Rozumějí se taková zvířata, která podle směrnic Evropské Pharmakopoe a DAB10 pocházejí od SPF-rodičů a od prvního dne života jsou chovány za SPF-podmínek. Tato zvířata jsou prosta pro lidi a drůbež patogenních zárodků a jejich protilátek.
IgY (angl.: immunoglobulin yolk):
Takto se zde označují imunooglobuliny, které jsou extrahovány ze žloutku drůbežích vajec a které odpovídají IgG v seru slepic. Tyto ptačí imunooglobuliny se od IgG savce odlišují strukturálně především jejich vyšší molekulovou hmotností v důsledku vyššího počtu konstantních domén v Fc-fragmentu.
Specifický IgY :
Je zde definován jako složka globálního IgY, který rozezná k imunizaci použitý antigen, zatímco nespecifickým IgY se rozumí složka globálního IgY, která se vytváří nezávisle na imunizaci stykem zvířete s antigenně působícími látkami nebo apatogenními a patogenními zárodky.
Intaktr.í protilátky :
Rozumějí se tím imunoglobuliny, které nejsou fragmentovány a které tudíž obsahují jeden Fc-fragment a dva Fab-fragmenty, přičemž Fc zahrnuje konstantní oblasti těžkých řetězců a Fab variabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců.
IgY-fragmenty :
IgY-fragmenty jsou zde míněny Fab-fragmenty ptačích imunoglobulinů, které neobsahují žádné nebo jen nepatrné zbytky Fc-fragmentů. V následujícím se pod pojmem Fab v zájmu zjednodušení rozumějí také fragmenty jako F(ab)2.
Fab-konstrukt :
Pojem Fab-konstrukt označuje syntetickou formaci ze dvou nebo více různých Fab-fragmentů (bi- nebo trivalentní konstrukty atd.), které rozeznají jednu nebo více různých antigenních determinant (mono-, bi- nebo trispecifické konstrukty atd.) a tím mohou plnit jednu nebo více funkcí, to jest působí mono-, binebo trifunkčně.
Antigenní determinanta :
Je taková molekulová struktura na antigenů, která je protilátkou specificky seznána (zvaná též epitop).
IgY-přípravek :
Rozumějí se tím z vaječného žloutku extrahované a případně vyčištěné protilátky (IgY), IgY-fragmenty, Fab-konstrukty nebo virtuální protilátky z vaječného žloutku.
I · · · · ·
Signální látka :
Pod tímto pcjmem se rozumějí všechny látky, které umožňují analytické, vizuální nebo obrazové stanovení patologického nebo fyziologického nálezu.
Účinná látka :
Takto se zde označují všechny látky, které jsou terapeuticky využitelné, například enzymy, antibiotika, virostatika a cílové jedy jako jsou toxiny nebo radionuklidy. Není přitom vyloučeno, že účinná látka současně plní funkci signální látky.
Prodrug :
Takto se zde označují všechny látky, které se z neaktivního předstupně v těle na místě změní v aktivní účinnou látku.
Boosterování a obnovovací imunizace :
obou těchto pojmech se hovoří v souvislosti s imunizací SPFslepic. Boosterování slouží k tomu, aby se dosáhlo maximálního IgY-titru. Pod obnovovací imunizací se rozumí se rozumí opakované vystavení antigenu, kterým se maximální IgY-titr udrží až do konce snůškového období.
Dosavadní stav techniky
Ze stavu techniky jsou známy imunokonjukáty na bázi monoklonálních protilátek z myši (myší MAK) nebo člověka (lidské MAK). Byla vyvinuta řada metod ke konjugování těchto protilátek se signálními látkami (barviva, fluorchrom, diagnostické radionuklidy) nebo účinnými látkami (například toxiny, terapeutické radionuklidy, fotosenzibilizátory, prodrugy). Takto lze provádět vyšetření jako je ELISA, RIA, fluorescenční mikroskopie, průtoková cytometrie, scintigrafie, SPÉCT (anglicky:
single photon emission computed tomography), PET (positronová emisní tomografie) a fotoimunodiagnostika, popřípadě terapie jako je radioimunoterapie, imunotoxinterapie nebo fotodynamická terapie.
K nevýhodám monoklonální protilátkové technologie náleží především monospefičnost protilátek, jakož i poměrně náročný a nákladný vývoj a výroba monoklonálních protilátek. Hromadná výroba musí obecně probíhat ve velkých fermentorech, protože příprava v ascitech myší byla mezitím v mnoha zemích do značné míry zakázána.
Polyklonální imunitní séra ze savců (ovce, koně, prasata a podobně) a imunizovaných/infikovaných dárců (například z krve osob infikovaných virem HIV s vysokým P24-protilátkovým titrem) hrají učitou úlohu v různých diagnostických metodách a pasivní imunoterapii. Polyklonalita těchto imunitních sér je účelná z hlediska lepšího zacílení komplexních antigenů. Imunoséra ze savců nebo běžných slepic však obsahují poměrně špatně definovanou polyspecifikou směs protilátek, přičemž požadované specifické protilátky v ní představují jen nepatrný podíl, zatímco hlavní část je tvořena nespecifickými a tudíž nežádoucími protilátkami. Získávání imunosér ze savců je z hlediska ochrany zvířat stěží obhajitelné a proto v mnoha zemích již do značné míry zakázané. Získávání imunosér z lidských dárců krve je nákladné, není bez rizika (přenos původců HIV, HCV a možná i prionů), eticky problematické a tudíž neproveditelné ve větším rozsahu.
Ze stavu techniky jsou rovněž známy polyklonální protilátky ptačího původu, mezi nimi protilátky (IgY) z vaječného žloutku. IgY jsou dnes různými výrobci nabízeny pro in vitro diagnostiku jako alternativa imunizace savců nebo monoklonálnich protilátek. V odborné literatuře se také naleznou příklady vázání protilátek z vaječného žloutku s biotinem, FITC nebo křenovou (Horše Radish) peroxidázou, aby se mohla použít v diagnostice in vitro (SCHADE et al., 2001 [1]) .
Je známa také orální aplikace ptačích protilátek z běžných slepic. Parenterální aplikace v humánní medicíně byla až dosud do značné míry vyloučena, na jedné straně protože IgY se u savců v důsledku fylogenetické vzdálenost neváže ani na komplementární faktor Cl ani na Fc-receptory a proto nemůže nastat efektivní interakce s obranným systémem savce, na druhé straně protože IgY může vyvolat alergické reakce. K tomu ještě přistupuje, že výroba IgY z vaječného žloutku běžných slepic je méně efektivní a vede ke kvalitativně méně hodnotným produktům, co se týká jejich čistoty a afinity. Příčinou toho je skutečnost, že běžné slepice vytvářejí četná nespecifické protilátky proti jiným choroplodným zárodkům a reakce na cílový imunogen tudíž vychází poměrně slabá a trvá jen krátce. Podíl specifického IgY na celkovém IgY při imunizaci běžných slepic je proto hluboko pod 10 % hmotn. (US4,550,019, HANSEN et al., 1998 [2]; BOUHOURS et al., 1998 [3]; GASSMANN et al., 1990 [4]).
Nejbližší stav techniky popisuje dokument DE-19504755, ve kterém se jedná o pasivní imunoterapii HlV-infekcí pomocí IgY, který se proti HlV-core-antigenu p24 a pl7 získává ze specificky patogenů prostých (SPF)-slepic. Je rovněž známa pasivní imunoterapie lidskými imunoséry. Ve srovnání s imunizací a monoklonálními protilátkami lze však IgY vyrábět poměrně snadno a levně. SPF-slepice snášejí po imunizaci a boosterování, jak je toto popsáno v příkladu 2, až do 16. měsíce svého života týdně 5 až 7 vajec. Ukázalo se přitom, že z 250 až 350 vajec SPF49 9 9
slepice se může získat kolem 15.000 mg specifického IgY, protože jeden vaječný žloutek podle zkušeností obsahuje nejméně 50 mg IgY s požadovanou specifičností. Kromě toho, nároky na SPF-slepice při jejich chovu jsou z hlediska předpisů pro tento chov podstatně menší než při běžném chovu slepic na výkrm a na vejce. Zásluhou toho odpadají obvyklé imunizace proti až 19 hospodářsky významným infekčním nemocem, které jsou dosud v chovu slepic běžné, a navíc i dvě povinná očkování. Tato jsou příčinou toho, že IgY-přípravky od běžných slepic jsou méněhodnotné a že se komplikuje a prodražuje izolace specifických IgY. Chov SPF-slepic se vede tak, aby byl prostý lidských i drůbežích choroboplodných zárodků. K vyloučení přítomnosti takových zárodků se pravidelně provádějí kontroly žrádla, vody a stavu imunity. Nepoužívají se ani antibiotika ve žrádle, aby se nenarušil SPF-stav zvířat.
Z medicínského hlediska spočívají výhody IgY obecně v rozeznání více antigenních determinant specifickými protilátkami, čímž je zajištěno lepší zacílení cílového antigenu, a ve skutečnosti, že se jedná o protilátky z drůbeže, jejíž imunitní systém se co se týká rozenání antigenů, liší od imunitního systému savců a člověka. Tímto se rovněž zlepšuje zacílení cílového antigenu, protože ptačí imunitní systém rozezná, což je podmíněno fylogeneticky, jiné antigenní determinanty než imunitní systém člověka. Ptačí protilátky si proto musí in vivo k tomu, aby rozeznala epitopy, konkurovat méně s přirozeně přítomnými protilátkami pacienta. Kromě toho, domnělá nevýhoda, že ptačí protilátky nereagují ani s lidským komplementárním systémem, ani s Fc-receptory, proteinem A nebo proteinem G, se mnoha případech ukazuje jako nevýznamná nebo dokonce naopak jako výhoda.
Úkolem vynálezu je tudíž vyvinutí a výroba alternativních přípravků k dosud běžným imunokonjugátům, které budou vhodné pro použití v diagnostice a terapii a které budou přitom co se týká čistoty a zacílení antigenu lepší než monoklonální protilátky a imunoséra ze savců, jakož i IgY-přípravky od běžných slepic. Má se takto navíc pokud možno vyloučit příprava lidských IgYprotilátek a imunokonjugáty se mají při zachování podmínek ochrany zvířat vyrábět levně a ve velkém množství.
Před vlastním popisem vynálezu jsou dále blíže definovány další pojmy, které se používají v následujícím popisu vynálezu a také v patentových nárocích. V rámci této přihlášky by tyto pojmy neměly mít žádný jiný význam :
radioimunokonjugát :
Pod tímto pojmem se v této přihlášce rozumějí sloučeniny z IgYpřípravků z SPF-slepic nebo transgenních'SPF-slepic, které jsou konjugovány s diagnostickými a/nebo terapeutickými radionuklidy a/nebo zesilovacími molekulami a používají se v oboru jaderné medicínské diagnostiky a/nebo radioimunoterapie.
imunotoxin :
Pod tímto pojmem se v této přihlášce rozumějí sloučeniny z IgYpřípravků, které jsou konjugovány s toxiny, jako jsou rostlinné toxiny, cytostatika, chemoterapeutika, antibiotika a podobně, a používají se v oboru imunotoxinterapie.
specifické cílení :
Pod tímto pojmem se v této přihlášce rozumí proces, při kterém je signální nebo účinná látka imunoglobulinem vázána na požadovaný cílový antigen.
pretargeting :
Pod tímto pojmem se v této přihlášce rozumí procesy, kterými se
posilují signály nebo účinky IgY-přípravků tak, že v některé fázi se mezi sloučeninu antigenu a signální nebo účinnou látku vřazují další protilátky nebo jiné látky či jiné vhodné molekuly, nazývané zde také souhrnným termínem zesilovací molekuly.
virtuální protilátky z vaječných žloutků:
Takto se zde označují:
i) humanizované imunoglobuliny, ve kterých byly Fabfragmenty od slepic biochemicky navzájem spojeny s Fcfragmenty lidského IgG, nebo ii) humanizované imunoglobuliny od transgenních SPF-slepic, ve kterých jsou genové úseky konstantních oblastí IgY více nebo méně úplně nahrazeny konstantními oblastmi lidského IgG.
IgY-konjugát :
Tento pojem zde zahrnuje sloučeniny z polyklonálních IgYpřípravků (imunologická složka) a signálních a/nebo účinných látek (diagnostická nebo terapeutická složka) a/nebo zesilovacích molekul.
Podstata vynálezu
Úkol vynálezu je vyřešen IgY-konjugáty pro výrobu diagnostika nebo terapeutika pro neinfekční záněty, infekční nemoci, poruchy srážlivosti krve, autoimunitní nemoci a onkologická onemocnění, sestávajícími z polyklonálního IgYpřípravku z vajec od specificky pathogenů prostých (SPF)-slepic podle Evropské Pharmakopoe und DAB10 nebo sestávající z polyklonálního IgY-přípravku z vajec od transgenních SPF-slepic, přičemž IgY-konjugáty obsahují polyklonální IgY s konstantními oblastmi lidského IgG a nejméně jednu signální a/nebo účinnou látku a/nebo zesilovací molekulu.
Vynález se týká IgY-konjugátů z protilátek (IgY) z vaječných žloutků a jejich konfekčních sad pro diagnostiku a terapii, jakož i experimentálních aplikací na zvířecích modelech, například myších, ovcích nebo primátech s výjimkou člověka. Aplikace se neomezují na parenterální metody, nýbrž zahrnují podle účelu aplikace také venkovní aplikace, například u melanomu, a enterální aplikace, například při karzinomu jícnu.
Vynález se kromě toho týká konfekciování IgY-konjugátů jako pro aplikaci připravených diagnostik nebo léčiv, buď ve formě jednotlivých složek jako značkovacích souprav nebo pro aplikaci hotových přípravků. Jako cílové antigeny přicházejí v úvahu všechny proteiny, peptidy, glykoproteiny, nukleové kyseliny, polysacharidy a lipopoteiny. Vynález se týká především IgYkon j ugátů proti nádorovým antigenům, hormonům, receptorovým proteinům a DNS-sekvencím, infekčním choroboplodným zárodkům, prionům nebo části antigenních determinant těchto cílových antigenů. IgY-konjugáty podle vynálezu mohou podle komplexnosti
k imunizaci použitého antigenu specifický IgY. obsahovat více nebo méně
Další aspekt předloženého vynálezu se týká metod
pretargetingu, přičemž buď
i) na cílový antigen se váže a-jako zprostředkovací látka
pro značkovaný avidin nebo streptavidin slouží biotinovaný
IgY, nebo ii) na cílový antigen se váže a jako zprostředkovací látka pro humánní nebo humanizované anti-IgY-konjugáty slouží nekonjugovaný IgY.
V případě i) se využívá silná vazba mezi biotinem a avidinem nebo streptavidinem, takže biotinová složka v IgY-konjugátu se také může označit za zesilovací molekulu.
• · · « · 4
Vynález se konečně týká také přípravy a aplikací IgYkonjugátů podle vynálezu, kterými lze zlepšit jejich diagnostické a/nebo terapeutické vlastnosti, jako jsou kombinace s chirurgickými zákroky, chemoterapeutiky, imunomodulátory a paraimutními transducery.
V následujícím popisu budou blíže charakterizovány složky v bezprostředním vztahu k vynálezu, jejich funkce, účinky a aplikace IgY-konjugátů podle vynálezu, jakož i podrobně popsána řešení.
a) imunologické složky
Imunologicky účinné složky sestávají podle vynálezu buď z (i) intaktních protilátek (IgY) z vaječných žloutků, IgYfragmentů, Fab-konstruktů, nebo (ii) virtuálních protilátek z vaječných žloutků, to jest biochemicky humanizovaného IgY, popřípadě s výhodou genovou technologií humanizovaného IgY z vajec transgenních SPFslepic.
Fab-konstrukty přitom mohou být mono-, bi- nebo trivalentní a působit mono-, bi- nebo trispecifíčky, to jest rozeznají jednu, dvě nebo více různých antigenních determinant. Fab-fragmenty lze připravit enzymatickým trávením. Virtuální protilátky lze získat spojením ptačího fragmentu s Fc-fragmentem jiného organismu, zde zejména s lidským Fc-fragmentem. Humanizovaný IgY, u kterého z IgY slepice pocházejí jen hypervariabilní oblasti a všechny konstantní oblasti pocházejí z IgG člověka, lze připravit z vajec transgenních slepic. Pomocí virtuálních antilátek lze nejen zredukovat nebo znemožnit tvorbu nežádoucích antilátek proti IgY, nýbrž lze také využít přirozených efektorových mechanismů konstantních oblastí lidského IgG.
• *
b) signální látky
IgY-konjugáty podle vynálezu obsahují jako diagnostickou složku signální látky, jako jsou radionuklidy, to jest gamazářiče jako je technecium-99m, indium-111, jod-123, jod-125, jod131, thalium-201, selen-75, gallium-67 či xenon-133, enzymy, jako jsou peroxidázy, alkalické fosfatázy a gaktosidázy, fotosezibilizátory, jako jsou deriváty porfyrinu, nebo barvicí látky, například flurochrom a koloidní zlato. Pro scintigrafíckou diagnostiku jsou v závislosti na stanoveném úkolu, způsobu aplikace, afinitě protilátek a radionuklidu zapotřebí aktivity v rozsahu 10 až 1850 MBq, to jest 0,27 až 50 mCi. Aktivity mohou být v jednotlivých případech následující:
jod-131 37 - 37 0 MBq, s výhodou 37 - 7 4 MBq (1-3 mCi) jod-123 185- 370 mBq (5 - 10 mCi) technecium-99m 74 - 1480 MBq (2 - 40 mCi) , s výhodou 74 - 740 MBq (2 - 20 mCi) indium-111 a gallium-67 selen-75
- 185 MBq (2-5 mCi) 10 Mbq (0,27 mCi).
c) Účinné látky
IgY-konjugáty podle vynálezu mohou alternativně nebo přídavně obsahovat jako terapeutickou složku radionuklidy, to jest beta-zářiče, alfa-zářiče nebo emitory elektronů s využitím Augerova jevu, například fosfor-32, stroncium-89, yttrium-90, jod-131, samarium-153, erbium-169, rhenium-186, rhenium-188, Kr85, holmium-166, astat-211, vizmut-212, vizmut-213, radium-224, aktinium-225. Podobně jako při diagnostice závisejí potřebné aktivity při radioimunoterapii na více faktorech, jako je druh onemocnění, citlivost nemocných buněk na záření, hmotnost ošetřovaných buněk, rozsah a rozložení onemocnění, antigenová exprese, způsob aplikace, afinita protilátek a energetické • ·
- 12 spektrum radronuklidu. Například u jodu-131 přicházejí v úvahu aktivity v širokém rozsahu 370 MBq až 11,1 GBq (10 - 300 mCi). Tato aktivita se zpravidla aplikuje najednou, může se však také rozdělit na interval několika týdnů až měsíců (s výhodou 3-6 týdnů), popřípadě při výskytu recidivy podat opakovaně až do celkové dávky 40 - 80 GBq (1- 2 Ci) . Konjugování pro nádor specifického IgY s cytostatiky může zmenšit nevýhody stávající chemoterapie. K největším problémům onkologie patří omezená spolelivost diagnostiky při staging-vyšetřeních, zejména absence technik, kterými by se mohla prokázat nebo vyloučit přítomnost metastází, jakož i malý terapeutický záběr cytostatik v důsledku jejich vysoké toxicity a současně malé specifičnosti. Tyto faktory vedou stále ke značné nejistotě při stanovení terapeutického postupu. Specifická cytostáze s menšími vedlejšími účinky, zprostředkovaná protilátkami, by' usnadnila rozhodnutí o chemoterapii a zásluhou toho by pomohla ušetřit náročné, nákladné a/nebo namáhavé staging-vyšetření. Ve smyslu vynálezu mohou být protilátky z vaječného žloutku konjugovány rovněž s různými cytostatiky, jako je například alkylantien, vinkaalkaloidy, antibiotika, antimetabolity, taxol. IgY-konjugáty podle vynálezu mohou také jako terapeuticky účinnou látku obsahovat toxiny, jako je ricin A, abrin, protilátky proti pseudomonas, záškrtový toxin, gelonin a podobně. Jako terapeutické složky v IgY-konjugátech podle vynálezu jsou vhodné také chemoterapeutika (cytostatika, antibiotika, antivirální látky), fibrinolytika (například strptokináza, urokináza, rt-PA) , enzymy k aktivaci prodrugů (například bakteriální karboxypeptidáza CPG2, která katalyzuje hydrolytické štěpení redukovaného a neredukovaného folátu) nebo prodrugy samotné. Konečně mohou IgY-konjugáty podle vynálezu obsahovat jako účinné složky také fotosenzitivní látky, které umožňují, aby nemocné buňky byly cíleně zničeny fotodynamickou terapií. Jako fotosenzibilátory se mohou použít například ·· 99·9
9 9
9 9
9 9 • 9 9 9
9 9 9 fotofrin, 5-aminolevulová kyselina nebo foscan.
d) Zesilovací molekuly
IgY-konjugáty podle vynálezu mohou pro diagnostické a terapeutické aplikace obsahovat biotin, aby se na základě vazeb avidin-biotin nebo streptavidin-biotin zesílil signál nebo účinek (tak zvaný pretargeting). Signál nebo účinek IgY-konjugátů mohou být kromě toho zesíleny dalšími složkami, které se konjugují na IgY-molekulu (například komplement).
e) Pomocné látky, komplementární opatření
IgY-konjugáty podle vynálezu mohou být k optimalizaci terapeutického cíle s výhodou kombinovány s jinými účinnými látkami. Vytváření lidských anti-IgY-protilátek mohou spustit ptačí protilátky. Při opakované aplikaci IgY-konjugátů dochází k neutralizaci diagnosticky nebo terapeuticky aplikovaných protilátek nebo dokonce k alergickým reakcím. Tomuto lze zabránit potlačením imunutního systému, například pomocí cyklosporinu. Použití radioaktivního jódu by jinak mohlo vést k nežádoucímu radioaktivnímu zatížení štítné žlázy. Proto je v těchto případech účelné, jestliže se funkce štítné žlázy před radioimunoterapií aplikací IgY-jod-131 blokuje dávkou jodidu draselného nebo chloristanu sodného. Při imunoterapii virálních infekcí by volné částice viru zachycovaly IgY-konjugáty, které by pak již nebyly k dispozici pro specifický targeting buněk, které replikují virus. Proto je účelné, brzdit virální replikaci předběžnou aplikací jednoho nebo více antivirálně nebo antiretrovirálně působícího chemoterapeutika a novou expresi antigenu případně spustit nebo indukovat přechodným vysazením medikace. Uvolňování částic viru by kromě toho bylo možno brzdit prostředky, které stabilizují buněčnou membránu, například interferonem alfa. Při latentních virových infekcích, například při HIV- nebo EBV-
• φ »·φ φ
φ φ infekci, může být také na druhé straně zapotřebí stimulovat expresi antigenu v infikovaných buňkách, například pomocí interleukin-2, nebo zvýšit účinnost IgY-konjugátů jinými antivirálně účinnými látkami, jako je například interferon-alfa a/nebo ribavirin při terapii hepatitis C. Podobně, při terapii bakteriálních infekcí může být účelné, jestliže se doplňkově použijí další účinné látky, například antibiotika. Analogicky k tomu může být u onkologických nemocí zapotřebí doplňovat radioimunoterapii dávkou cytostatika nebo imunotoxinovou terapií externím lokálním ozařováním. Zcela obecně mohou účinky radioimunoterapie, imunotoxinterapie nebo fotodynamické terapie příznivě ovlivnit také imunomodulátory nebo paraimunitní stransducéry.
f) Metody značkování
Pro radioktivní značkování myších nebo lidských monoklonálních protilátek jsou k dispozici již po dlouhá léta osvědčené metody, viz například Peters JH, Baumgarten H (Eds): Monoclonal Antibodies, Springer-verlag, Berlin 1992. Metalické radionuklidy, jako je technecium-99m, indium-111 nebo astat-211, se na protilátky stabilně váží většinou látkami vytvářejícími komplexy, jako je například diethylentriaminpenta-kyselina octová (DTPA) nebo deferoxamin (DFA), nebo parciální redukcí disulfidových můstků, například pomocí 2-merkaptoethanolu. Mnohé izotopy radioaktivního jodu se mohou na aktivované aromatické skupiny protilátek (v.a. fenolové jádro tyrosinu) konjugovat také přímou elektrofilní substitucí. Jako oxidační činidla pro vytváření jodových kationtů se zpravidla používá LIO3, rozpuštěný chloramin T popřípadě na nosič, například polystyrénové granule, vázaný chloramin T (Iodobeads) nebo iodogen (1,3,4,6-tetrachlor3a,βα-difenyl-glykouril). Každá jednotlivá protilátka může být označena nejméně jedním radioaktivním atomem. Aby se dosáhlo
4
4
vyšší specifické aktivity, aniž by byla ovlivněna specifická schopnost vazby protilátek, může se konjugace provádět za přítomnosti cílového antigenu, který se následně opět oddělí, čímž se zabrání vazbě radionuklidu v hypervariabilních oblastech. Flurochrom, fotosenzibilizátory, cytostatika a toxiny mohou být na protilátky konjugovány metodami, které jsou založeny na reakcích aminoskupin protilátek, zčásti také pomocí komerčně dostupných spacerů nebo zavedením SH-skupin do protilátek. Jiné metody spočívají ve štěpení protilátek a uvolnění SH-skupin, na které mohou být konjugovány signální nebo účinné látky. Kromě toho mohou být uhlovodíkové zbytky protilátek oxidovány peroxidátem, čímž vzniknou aldehydové skupiny, jejichž pomocí mohou být konjugovány signální nebo účinné látky. Konečně mohou být bi- a trifunkční Fab-konstrukty s účinnou látkou konjugovány na jeden nebo dva Fab-fragmenty molekuly a prostřednictvím volného Fab-fragmentu usazeny na cílový antigen.
g) Konfekciování
Ve smyslu vynálezu mohou být radioimunokonjugáty nabízeny ve značkovacích sadách s IgY-přípravky, takže tyto mohou být uživatelem označeny radionuklidem s krátkou životností na místě. Při dostatečně dlouhém poločasu rozpadu mohou být s radionuklidem konjugované IgY-přípravky, to jest hotové radioimunokonjugáty, dodávány uživateli přímo. IgY-přípravky nebo hotové radioimunokonjugáty se ve značkovacích sadách, popřípadě hotových přípravcích, nacházejí ve formě sterilních izotonických injekčních roztoků, popřípadě ve vhodném pufru (s výhodou PBS, pH 7,4) spolu s vhodnými přísadami (například stabilizátory) a ve vhodném obalu (plastové či skleněné ampule, propichovací láhve, olověné nádoby, chlazené případně na +4 až -20 °C) . Ve značkovacích sadách se IgY-přípravek nachází v první ampuli či propichovací láhvi, zatímco v druhé ampuli či propichovací láhvi ·· 4444
se nachází redukční činidlo (například při značkování techneciem99m), popřípadě oxidační činidlo (například při značkování jódem131). Pro čištění radioimunokonjugátu může každá značkovací sada obsahovat chromatografický válec a pro kontrolu kvality například sadu pro chromatografii na tenké vrstvě. Značkovací sady mohou podle potřeby obsahovat IgY-přípravky nebo hotové IgY-konjugáty pro jednu nebo zároveň více aplikací.
Pro aplikaci vynálezu připadají v úvahu následující obory použití a aplikace :
a) Obory použití obecně: IgY-konjugáty podle vynálezu mohou reagovat se řadou antigenů: s fyziologickými molekulami, s antigeny specifickými pro tumor, s infekčními choroboplodnými zárodky a jejich antigeny, s priony a rovněž s RNS- nebo DNS-řetězcí nebo s na nich asociovanými molekulami. IgY-konjugáty podle vynálezu mohou být v závislosti na signální nebo účinné látce (radionuklid, enzym, fibrinolytikum, barvivo, fotosenzibilizátor, toxin) použity pro in vitro a in vivo diagnostiku a/nebo terapii nádorů, infekcí, poruch srážlivosti a autoimunitních nemocí.
b) Fyziologické cílové antigeny: K fyziologickým molekulám, které připadají v úvahu jako cíl pro IgY-konjugáty podle vynálezu, patří leukocytenantigeny podle CD-klasifikace (antigeny NK-buněk, antigeny B-buněk, myeloické antigeny, progenitorantigeny, adhezní molekuly, cytokinreceptory), jakož i intracelulární molekuly (například cytokeratiny), receptory (androgen-, estrogen-, dopamin-D2- nebo somatostatinreceptory a podobně) nebo například také faktory srážlivosti, například fibrin nebo plasminogen.
c) Patologické cílové antigeny: K antigenům specifickým pro tumory, které připadají v úvahu jako cíl pro IgY-konjugáty podle ·* ·«··
• · · • · · • · · • · · · ·· ♦· vynálezu, pazří rovněž určité leukocytové antigeny (například CD20, CD22), androgen- nebo estrogen-receptory, kalcitonin a thyreoblobulin, v užším smyslu pak také tumorové markéry, jako je Egp 34, Ca 15-3, sialyl-lea-antigen, BCA 225, s melanomy asociované antigeny (MAA), CEA, 17-1A, PAP, enoláza specifická pro neurony (NSE), terminální desoxynukletidyl-transferáza (TdT), bromdesoxyyuridin (BrdU), Ki 67, PCNA, myeloperoxidáza (MPO) a mutovaný p53. K infekčním choroboplodným zárodkům, které mohou představovat cíl pro IgY-konjugáty podle vynálezu, patří bakterie (Bacillus anthracis, borélie, brucellen, mykobakterie, Pseudomonas aeroginosa, salmonely, stafylokoky, Toxoplasma gondii, Treponemen, Typanosomen), viry (HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2, HCV a jiné flavoviry, HBV, EBV, HSV, HHV-8, coxsack viry, polioviry, Cytomegalo-virus, Infuenza-viry, Rubellavirus, papilomové viry, dengue-viry, hanta-viry, arena-viry, bunya-viry, filo-viry), protozoen (Plasmodium, toxoplasmy, Acanthamoeba), mykoplazmy, houby (Candida, Aspergillus), paraziti (Ascaroidea, Echinococcus, leishmanie, Loa-Loa, Onchocerca volvulus, Mansonellla, Brugia-filáríe, Cysticercus, Schistosomy, Bancroftifilárie) a infekční částice (priony). Určitou roli mohou hrát při diagnostice a/nebo terapii tumorů jako cíle pro IgY-konjugáty podle vynálezu také antigenní determinanty infekčních choroboplodných zárodků, například u Burkitt-lymfonů, nasopharriyngeal-karcinomů, M. Hodgkin, T-Zell-lymfon a imunoblastických lymfonů, které se vyznačují expresí s EBV asociovaných antigenů (EBNA 1-3, LMP 1-2), u Kaposi- sarkomu a u s AIDS asociovaných lymfonů, které jsou oba asociovány s HHV-8, nebo u adultní T-cel-leukémie, která je asociována s HTLV-Iinfekcí, nebo u rakoviny genitálií, která může být asociována s HPV.
d) Formy aplikace: IgY-konjugáty podle vynálezu mohou být
podle potřeby aplikovány in vitro nebo in vivo. Aplikace in vivo se může provádět jak venkovně nebo enterálně, například v rámci fotodynamické terapie, tak i parenterálně, například při scintigrafii, SPÉCT, radioimunoterapii nebo imunotoxinterapii. Pojem parenterální zde zahrnuje intravenózní, intraarteriální, subkutánní, intrakutánní, intratekální, intersticiální, intrakavitáruí a intralasionální nebo intratumorální metody aplikace.
Vynález je dále blíže vysvětlen a popsán na základě podrobných příkladů provedení. Znaky patrné z výkresů a popisu mohou být samy o sobě nebo v libovolných kombinacích použity také v jiných příkladech provedení vynálezu. Následující aplikace a druhy provedení představují pouze příklady, které v žádném případě nemohou vyčerpávajícím způsobem popsat všechny možnosti IgY-konjugátú podle vynálezu na bázi vajec SPF-slepic. Odborník může odvodit další provedení a aplikace, které spadají do rámce dále následujících patentových nároků.
Přehled obrázků na výkresech
Podstata vynálezu je dále objasněna na neomezujících příkladech jeho provedení, které jsou popsány na základě připojených výkresů, které znázorňují:
- na obr. 1
- na obr. la
- na obr. lb imunoglobulin slepic ve srovnání s imunoglobulinem savců;
žloutkové protilátky (IgY) slepice;
žloutkové protilátky (IgY) savců včetně člověka;
• · * · · · radioimunokonjugát na bázi intaktní žloutkové protilátky (IgY);
- na obr. 2
- na obr. 3 radioimunokonjugát na bázi monovalentního IgYFab-fragmentu;
- na obr. 4 radioimunokonjugát na bázi bivalentního IgYF(ab')2-fragmentu;
- na obr. 5 radioimunokonjugát na bázi tří navzájem spojených IgY-Fab-fragmentů (trivalentní Fab-konstrukt);
- na obr. 6 radioimunokonjugát na bázi humanizovaného IgY (IgY-Fab + lidský Fc) ;
- na obr. 7 imunotoxin na bázi intaktního IgY.
Příklad 1
K výrobě IgY-konjugátů se SPF-slepice nebo transgenní SPFslepice, s výhodou ve čtrnáctém týdnu života, imunizují pomocí 50 - 1000 pg, s výhodou pomocí 50 - 200 pg, cílového antigenu, popřípadě jeho fragmentu a Freundova adjuvans s.c. nebo s výhodou
i.m. Poté následují rozloženě po téměř celé době snůšky tři boosterování až do dosažení maximálního IgY-titru a tři regenerace pomocí vždy 50 - 1000 pg, s výhodou 50 - 200 pg, téhož antigenu a nekompletního Freundova adjuvans pro udržení maximálního IgY-titru. Injekční roztok obsahuje například vždy 1 ml suspenze antigenu a 0,5 ml Freundova adjuvans. Výhodné schéma imunizace pro slepice s SPF-statutem má tudíž přibližně následující časový průběh:
·· 19 19
- 20 1111 19 11 1 • · · · ·
den 0* 1. imunizace (základní imunizace) i.m.-injekce
den 28 = 2. imunizace (1. bostrování) i.m.-injekce
den 56 = 3. imunizace (2. bostrování) i.m.-injekce získáváni IgY
den 84 = 4 . imuni zace (3. bostrování) i.m.-injekce získávání IgY
den 168 = 5. imunizace (1. regenerace) i.m.-injekce získávání IgY
den 252 = 6. imuni zace (2. regenerace) i.m.-injekce získávání IgY
den 336 = 7. imunizace (3. regenerace) i.m.-injekce získávání IgY
den 490 = konec využití pro získávání IgY
* = 14. týden živcza
V průběhu období 12 - 14 měsíců lze vejce v SPF-podmínkách držených slepic sbírat a zpracovávat. Vaječný žloutek se nejdříve oddělí od vaječného bílku a může se upravovat standardními metodami podle Schade et al. (Chicken Egg Yolk Antibodies, Production and Application, Springer-Verlag, Berlin 2001 [1]). Podstatnou výhodou SPF-slepic je, že tato zvířata nejsou zásluhou svého původu od SPF-slepic a chovu za SPF-podmínek předem imunologicky zatížena ani imunizacemi, ani specifickými infekčními nemocemi. Zásluhou toho reagují tato zvířata na antigen, kterým byla imunizována, mimořádně intenzivní imunizační reakcí, takže podíl specifických protilátek je několikanásobně vyšší (50 - 90 % specifického IgY) , než při imunizací běžných slepic. Kromě toho lze u těchto zvířat po boosterování několikanásobnou regenerační imunizací udržet vysoký titr specifických protilátek stabilní až do 16. měsíce života. Toto má pro IgY-konjugáty podle vynálezu značný význam, protože je dobře doloženo, že populace lymfocytů se opakovanou stimulací imunologické paměti mění tak, že vznikají mimořádně vysoce afinní protilátky. Zásluhou toho se IgY-preparáty z vajec od SPF-slepic liší od IgY-preparátů od běžných slepic také co se týká afinity ke specifickému antigenu. V molekulární rovině je vysoká afinita podmíněna strukturou hypervariabilní oblasti těchto protilátek, která je antigenu přizpůsobena lépe než struktura hypervariabilní oblasti méně afinních protilátek. IgY-konjugáty od SPF-slepic se
·· ···»
- 21 • · * · · • 949
9 4 9 » • · · · · ··*· 44 ·· tedy od IgY-konjugátů od běžných slepic reprodukovatelně odlišují také v molekulární rovině, a to speciální strukturou jejich hypervariabilních oblastí.
Příklad 2
V tomto příkladu je popsána výroba humanizovaného IgY z transgenních slepic. Transfekce se může provést o sobě známým způsobem, jak je tento popsán v dokumentech US-5,162,215, US6,020,465 a WO-00/75300. Může se provést také mikroinjekcemi do spermií kohouta. Umělým oplodněním je pak tento znak vnesen do zárodečné buňky a předán dále potomkům. Alternativně lze transfekci provést také retrovirální infekcí spermií. Replifikačně deficientní retrovirus přitom nese lidský gen pro Fc-fragment. Integrace genového úseku konstantních lidských IgGdomén do genové oblasti imunoglobulinu SPF-slepice se provede homologenní rekombinací. Lidský knock-in Gene Targeting Vektor obsahuje mimo jiné sekvence, které jsou homologenní k exonům nahrazovaného genu, selekční markér (například rezistenci vůči neomycinu), exony konstantních lidských IgG-oblastí a promotory. Zásluhou transientní exprese Cre-rekombinační báze může proběhnout odstranění neomycinové a thymidinkinázové kazety a konstantní ptačí IgY-oblasti. Takto vzniknou transgenní slepice, které své geny pro humanizovaný IgY předají zárodečnou cestou svým potomkům. Selekce transgenních slepic se může provést průkazem IgY s lidskými konstantními oblastmi v krvi nebo ve vejcích těchto slepic. K detekci humanizovaných protilátek jsou vhodné přípravky ELISA, Western-Blot nebo PCR.
Příklad 3
Intaktní protilátky vyžadují v důsledku jejich pomalé
·· ··*·
- 22 eliminace z krve (KZW: 1-3 dny) při imunoscintigrafii často dlouhé doby vyšetřování až do dosažení optimálního kontrastu mezi zobrazovanou poruchou a pozadím. Při terapeutických aplikacích spočívá problém spíše v tom, že intaktní protilátky se obtížně dostávají do pevných tumorů nebo na druhou stranu bariéry krevmozek. Z tohoto důvodu nabízejí v určitých situacích významné přednosti konjugáty na bázi Fab-fragmentů. Za účelem výroby Fabkonjugátů se SPF-slepice nebo transgenní SPF-slepice imunizují podle příkladu 1 pomocí 50 - 1000 pg, s výhodou pomocí 50 - 200 pg, cílového antigenů, popřípadě jeho fragmentu. Vejce se upravují jak bylo uvedeno výše a IgY se na specifický antigen (cílový antigen) izoluje pomocí afinitní chromatografie. Intaktní protilátky se pak enzymaticky, například pepsiny, štěpí v oblasti závěsu, takže vzniknou Fab- a Fc-fragmenty. Specifické Fabfragmenty mohou být na specifickém antigěnu oděleny a izolovány od Fc-fragmentů a nespecifických Fab-fragmentů pomocí afinitní chromatorafie. Takto získané specifické Fab-fragmenty se sterilně filtrují. Pro klinické aplikace mohou být nabízeny ve značkovací sadě, která v druhé propichovací láhvi obsahuje redukční prostředek pro značkování, pro konjugaci s diagnostickým radionuklidem s krátkou dobou rozkladu, například techneciem-99m. Radioimunokonjugáty mohou být také u výrobce centrálně značkovány diagnostickými nebo terapeutickými radionuklidy s delší dobou rozkladu, například jodem-131, a pak distribuovány. V tomto případě se dodávka uživateli provede v souladu s platnými směrnicemi o ochraně proti záření ještě v den označkování, aby se minimalizovaly ztráty produktu rozpadem radionuklidu a disociací protilátek. Centrální značkování je možné také v případě, jestliže je IgY-přípravek konjugován s chemoterapeutikem, toxinem, fluorochromem, fibrinolytikem, enzymem nebo prodrugem.
• 4 • · · ··
- 23 Příklad 4:
Radiologická ložiska nejasné dignity lze dnes diferenciálně diagnostikovat pomocí granulocytové scintigrafie. V současné době používané myší monoklonální protilátky umožňují seznat na promyelocytech, myelocytech a granulocytech exprimovaný nonspecific-cross-reacting-antigen, buď NCA-95 ( = CD66b) nebo NCA-90 (= CD66c). Označují se diagnostickými radionuklidy (gama-zářiči) a aplikují intravenózně. V krvi a v zánětlivém ložisku se váží na granulocyty. Tímto způsobem lze scintigraficky prokázat zánětlivé procesy, například osteomyelitis. K výrobě radioimunokonjugátů podle vynálezu se podle příkladu 1 pomocí NCA-90 nebo NCA-95 či jejich fragmentů imunizují a boosterují SPF-slepice. Pro NCA-90, popřípadě NCA-95 specifický IgY se opět afinitní chromatografii izoluje na NCA-90 nebo NCA-95. Sterilní IgY se pak může dodávat ve značkovací sadě, například s 1 mg IgY v izotonním roztoku NaCl a s druhou propichovací láhví s redukčním činidlem, pro značkování pomocí technecia-99m. Uživatelem na místě připravený roztok anti-NCA-IgY-Tc-99m se pak může po oddělení nenavázaných radionukidů pomocí společně dodané odměrky a po následující kontrole kvality co se týká radiochemické čistoty konečného produktu pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie (HPLC) nebo s výhodou chromatografie na tenké vrstvě (DC) aplikovat intravenózně. Na rozdíl od dosavadních monoklonálních protilátek, které jsou schopny seznat a vázat pouze jednu antigenní determinantu, lze pomocí polyklonálních protilátek z vaječných žloutků současně seznat různé antigenní determinanty NCA-95 nebo NCA-90, výsledkem čehož je lepší zobrazení s vyšším specifickým kontrastem vůči pozadí.
• ·
- 24 Příklad 5 :
IgY-konjugáty se mohou použít také k průkazu lymfatických uzlin. Rozsáhlé lambdatenektomie, které nastávají při maligních melanomech a karcinomech prsu nebo prostaty, jsou obecně spojeny s vysokou úmrtností. Proto je průkaz metastází v lymfatických uzlinách, které se nacházejí ve směru proudění za nádorem, nanejvýš důležitá informace pro terapeutické procedury. Až dosud se to provádí pomocí koloidního lidského albuminu nebo nanakoloidem, značkovaným radioizotopem Tc-99m. Průměr částic je v rozsahu 100 až 1000 nm. Po injekci radiokoloidu v blízkosti tumoru se pomocí gamakamery obvykle v rozmezí 15 minut až šest hodin provedou tři rovinné snímky. Nevýhoda této metody spočívá ve velikosti částic a chybějící specifičnosti k tumoru. Na jedné straně, velká část radioaktivity zůstane v místě injekce a v důsledku přezáření zhoršuje zobrazení lymfatických uzlin. Na druhé straně, lymfatické uzliny jsou zobrazeny, aniž by tím bylo prokázáno jejich napadení. Jestliže se naproti tomu analogickým způsobem aplikují radioimunokonjugáty specifické pro lymfocyty nebo tumory, pak se těmto nevýhodám zčásti nebo zcela předejde. Rozpuštěné IgY- nebo Fab-konjugáty putují lymfatickými dráhami rychleji než koloidní albumin, takže v místě injekce zůstane méně zbytkové radioaktivity a lymfatické uzliny se zásluhou toho zobrazí výrazněji. Ke specifickému zobrazení přispívá navíc to, že protilátky se v lymfatických uzlinách specificky vážou na lymfocyty, popřípadě na metastázované nádorové buňky. Tyto lymfatické uzliny lze také v průběhu operace pomocí vhodné gamasondy cíleně vyhledat a poté operativně odstranit. Alternativně nebo přídavně k zobrazení lymfatických uzlin se může provést do značné míry selektivní ozařování nebo chemoterapie těchto lymfatických uzlin, popřípadě metastáz těchto lymfatických uzlin, jestliže diagnosticky použitý IgY-konjugát nebo další IgY
- 25 konjugát obsahuje terapeutický radionuklid, například J-131, nebo toxin, například taxol. Prokázání metastází lymfatických uzlin z melanomu se může provést radioimunokonjugáty proti přípravku p210, antigenu (MMA) asociovanému s melanomem. Za účelem výroby radioimunokonjugátů podle vynálezu se SPF-slepice imunizují pomocí 50 - 1000 pg, s výhodou pomocí 50 - 200 pg, přípravku p210 podle příkladu 1. Z vaječného žloutku se izoluje IgY. Vyčištěný IgY se pak může sterilně filtrovat a hydrofilizovat nebo suspendovat ve sterilním isotonickém PBS (pH 7,4). Komerčně použitá přípravková sada obsahuje například v první propichovací láhvi 100 mg specifického IgY a v druhé propichovací láhvi redukční činidlo pro značkování radioizotopem Tc-99m. Bezprostředně před plánovaným vyšetřením se IgY přípravek konjuguje s 10 - 1000 MBq, s výhodou 20 - 100 MBq, radioizotopu Tc-99m. Po injekci radioimunokonjugátu podle vynálezu v blízkosti tumoru se po dobu až 24 hodin, s výhodou 3-6 hodin, provádějí pomocí gamakamery rovinné snímky ve třech rovinách a popřípadě dodatečný SPÉCT příslušné oblasti. Kromě toho lze zasažené lymfatické uzliny následně při operaci detekovat vhodným ručním přístrojem a cíleně odstranit.
Příklad 6:
Diagnostikování neuroendokrinálních tumorů se provádí scintigraficky pomocí radioimunokonjugátů. Feochromytomy, neuroblastomy, karcinoidy a paragangliony vznikají z buněk neuroendokrinálního (APUD-) systému, které jsou jsou rozloženy v celém organismu. Obsahují tudíž obecně somastatinové receptory, kterými mohou být za pomoci octreotidu, somastatinového analogu, označeného radioizotopem Indium-111, scintigraficky zobrazeny. Somastatinové analogy se však na receptory vážou pouze v poměru 1:1. Polyklonální IgY rozezná naproti tomu více antigenních
- 26 determinant receptoru. Z toho vyplývá přesnější zacílení a citlivější zobrazovací diagnostika. Pro výrobu IgY přípravků proti somastatinovým receptorům se SPF- slepice opět imunizují podle příkladu 1. Specifický IgY se opět může nabízet v sadě se značkovacím přípravkem podle příkladů 3, 4 nebo 5. Může být pak uživatelem na místě označen gama-zářičem, například techneciem99m. Po uplynutí 1-24 hodin po aplikaci 100 mg specifického IgY (10 - 1000 MBq, s výhodou 50 - 200 MBq) se provedou rovinné snímky ve třech rovinách a případně také SPÉCT. Neuroendokrinologické tumory, které se za operace většinou obtížně vyhledávají, mohou být snadno lokalizovány vhodnou sondou a pak operativně odstraněny.
Příklad 7:
Dalším použitím radioimmunkonjugátů je ošetření Non-Hodgkinlymfonů. Mírně maligní Non-Hodgkin-lymfony reagují špatně na chemoterapii. Jako zvláště účinná se v těchto případech ukázala radioimunoterapie. Ve většině studií byla proti CD20 použity myší monoklonální protilátky, antigen, který je exprimován na povrchu buněk 95 % všech B-cell-lymfonů. Monoklonální protilátky však rozeznají pouze jednu antigenní determinantu tohoto antigenu. Vazební poměr činí tudíž pouze 1:1. Lepšího cílení lze naproti tomu dosáhnout pomocí IgY specifického k CD20, který současně na antigenu rozezná více epitopů. Zásluhou toho se také sníží zatížení kostní dřeně zářením a mohou se aplikovat vyšší dávky záření, aniž by byla zapotřebí transplantace kostní dřeně. Snížení dávky záření lze dosáhnout také pomocí pretargeting-metod s monoklonálními protilátkami značkovanými avidinem nebo streptavidinem a s radioaktivně značkovaným biotinem. Pomocí pretargetingu, pro který se rovněž nárokuje ochrana, lze ovšem také ještě dále zvýšit terapeutický účinek radioimunoterapie
- 27 s IgY. SPF-slepice se zatím účelem imunizují pomocí 50 - 1000 pg (s výhodou 50 - 200 pg) CD20 jako v příkladu 1. Po dobu snůšky cca 12 - 14 měsíců se získávají vejce, ze kterých se izoluje globální IgY, který se afinitní chromatografii čistí na CD20. Pro pretargeting se specifický IgY sterilně filtruje, konjuguje s avidinem nebo streptavidinem a lyofílizuje nebo případně s dalšími pomocnými látkami rozpouští v izotonním roztoku NaCl (popřípadě PBS, pH 7,4) . Značkovací sada obsahuje v tomto případě s výhodou první propichovací láhev s IgY-avidin-konjugátem (100 pg - 5 mg, s výhodou 1 mg) , druhou propichovací láhev s biotinem v hydrof ylizované nebo rozpuštěné formě (1 - 1000 pg) a třetí propichovací láhev s oxidačním činidlem (například Iodogen) pro značkování jodem J-131 (1-4 GBq), a další pomůcky, jako je chromatografický válec a DC-souprava. Biotin může být alternativně značkován centrálně již výrobcem a dodáván společně s IgY-avidin-konjugátem. Nejdříve se intravenózně aplikují IgYavidin-kon j ugáty, aby se označkovaly lymfocyty. O jeden nebo více dní později se intravenózně aplikuje biotin, značkovaný pomocí jodu J-131. Alternativně lze provést radioimunoterapii pomocí alfa-zářiče, jako je astat-211.
Příklad 8 :
Přibližně jedna polovina karcinomů prsu obsahuje receptory estrogenu a je nezávislá na hormonech. Protilátky z vaječného žloutku mohou tudíž kompetitivně brzdit nejen vazby estrogenu na receptory. Jako radioimunokonjugát jsou vhodné také pro zobrazení metastáz a k interní terapii ozařováním. Pro imunizaci SPF-slepic se použijí peptidy s extracelulárním antigenními determinantami estrogenového receptorů. Imunizace SPF-slepic, jakož i úprava vajec a čištění IgY se mohou provést podle příkladu 1, konfekciování pak podle některého z předchozích příkladů.
• · • · • · o
- 28 Příklad 9 :
Komerčně dostupné protilátky, jako UR07, rozeznají karcinomy ledvinových buněk a nevážou se na zdravou tkáň ledvin. Karcinomy ledvinových buněk a jejich metastázy lze tedy cíleně prokázat a/nebo ošetřovat pomocí radioimunokonjugátů. Aby se identifikoval vhodný antigen, elektroforeticky se oddělí a izolují proteiny od homogenizovaných buněk karcinomu ledvin. Těmito antigeny se imunizují SPF-slepice a zkoumá se specifičnost a křížová reaktivita takto získaných protilátek z vaječného žloutku vůči karcinomu ledvinových buněk a fyziologickým tkáním. Vyselektované protilátky, které rozeznají výlučně maligní buňky, se konjugují a terapeuticky aplikuji spolu s terapeutickým radionuklidem, jako je jod J-131, nebo buněčným jedem, jako je Ricin A.
Příklad 10 :
Další použití radioimunokonjugátů lze spatřovat v ošetřování HIV-infekcí. Při HlV-infekci se do chromozomů hostitelské buňky zabuduje retrovirální genom. Pomocí současných přípravků pro brzdění replikace nelze HlV-infekci léčit. Hostitelská buňka, která replikuje HIV, pak na svém povrchu exprimuje proteiny se strukturou HIV (p24, gpl20 a gp41). Protilátky proti těmto strukturovaným proteinům rozeznají tyto buňky a vážou se na ně. Jsou-li konjugovány s radionuklidem nebo jiným buněčným jedem, mohou cíleně zničit tyto buňky a tím i místa produkce HIV. Předpokladem pro efektivní zacílení buněk je, že se například pomocí komplementárního brzdění replikace antiretrovirálními léky sníží počet volných virů v krvi. Takto se otevírají nové možnosti účinného léčení HlV-infekce. Z důvodů zmíněných v úvodu nabízí použití polyklonálních konjugátů ze specifického IgY od SPFslepic výhody oproti monoklonálním protilátkám, jak je toto
- 29 ·· ····
• · popsáno v dokumentu DE-19809785. Pro výrobu protilátek se SPFslepice imunizují látkami HIV p24, HIV-lgpl20 nebo HIV-1 gp41 jako v příkladu 1. Po dobu snůšky přibližně 12 - 14 měsíců se sbírají vejce SPF-slepic, chovaných v definovaných podmínkách. Vaječný žloutek se oddělí od vaječného bílku a standardním způsobem se izoluje IgY. HlV-specifické protilátky se vyčistí afinitní chromatografii na specifický antigen, takže se oddělí nespecifický IgY. Sterilní IgY-přípravky se konjugují s terapeutickým radionuklidem (napřílad jod-131 nebo astat-211). Pro terapeutické použití se například se 100 pg specifického IgY obyvykle označkuje 1-4 GBq jodu-131. V případě HlV-infekce se s ohledem mimo jiné na poměrně malý počet infikovaných buněk (ve srovnání s počtem maligně degenerovaných buněk v případě lymfonů) prokázaly jako terapeuticky účinné již podstatně nižší aktivity. Značkování se může provést různými vyzkoušenými metodami. IgYjod-131 se může vyrobit s výhodou metodou Iodogen. Jak výtěžnost po konjugaci radioimunokonjugátu, tak i čistotu radioimunokonjugátu po oddělení nenavázaných radionuklidu lze kontrolovat pomocí HPLC nebo DC. Za sterilních podmínek vyrobený a/nebo sterilně filtrovaný radiokonjugát může být infundován jako izotonní roztok.
Příklad 11 :
Dále, IgY-konjugáty se mají použít k ošetřování autoimunitních nemocí. V patogenezi autoimunitních nemocí a odmítavých imunitních reakcí po transplantaci orgánů hrají významnou roli CD4-positivní T-buňky. Monoklonální protilátky proti CD4-receptoru vykazují u M. Crohn, Lupus Erythematodes, Rheumatoider Arthritis a po transplantaci kůže u myší klinicky jen nepatrné účinky. Aby se dosáhlo efektivního odstranění CDpozitivních buněk, mohou být protilátky konjugovány
- 30 s terapeutickým radionuklidem, cytostatikem nebo toxinem. SPFslepice se podle příkladu 1 imunizují proti CD4 nebo CD4fragmentům, globální IgY se izoluje od vaječného žloutku a pro CD4-specifický IgY se může vyčistit afinitní chromatografii na CD4 . Protilátky se alternativně mohou enzymaticky štěpit a ptačí Fc-fragmenty se mohou nahradit lidskými Fc-fragmenty. IgYpřípravek pak může být pro s výhodou intravenózní klinickou aplikaci dodáván nekonjugovaný nebo jako IgY-konjugát podle vynálezu, označkovaný radionuklidem.
Příklad 12 :
Další možností je použití IgY-konjugátů k léčení trombóz. Trombózy se obecně ošetřují systémově aplikovanými fibrinolytiky (streptokináza, urokináza nebo rt-PA). Streptokináza je rychle odbourávána v těle přítomnými proteázami. Urokináza a rt-PA jsou naproti tomu rychle metabolizovány v játrech. Je tudíž žádoucí, aby se fibrinolytikum fixovalo na trombus (Bode et al., J Biol Chem 1989;264(2);944-8; Lijnen et al. Thromb Res 1990;57(3);33342). SPF-slepice nebo transgenní SPF-slepice se způsobem podle příkladu 1 imunizují proti lidskému fibrinu. Specifický IgY se izoluje a vyčistí. Protilátky se případně enzymaticky štěpí a oddělí se Fc-fragmenty. Intaktní protilátky nebo Fab-fragmenty (5 - 50 mg) se pak konjugují s rt-PA (5-50 mg), s výhodou v poměru 1:1. Tyto IgY-konjugáty mohou pak být pro ošetření hlubokých trombóz cév dolních končetin, plicních embolií, cerebrovaskulárních příhod nebo infarktu myokardu dodávány ve vhodných baleních lyofilizovány nebo ve sterilním roztoku pro injekční aplikaci. Alternativně může být druhá skupina SPF-slepic, nacházející se daleko od první skupiny, imunizována proti rt-PA. Fab-fragmenty první skupiny mohou být hybridizovány s Fabfragmenty druhé skupiny. Tímto způsobem lze získat pro fibrin
- 31 • · ·· specifické bifunkční Fab-konstrukty, na jejichž jednom ramenu je konjugován rt-PA.
Přiklad 13 :
Pro fotodynamickou diagnostiku nebo terapii se IgY-přípravky konjugují s fotosenzibilátory. Fotodynamická terapie představuje minimálně invazivní metodu, mimo jiné pro ošetření povrchových karcinomů kůže a sliznic, Kaposi-sarkomů a melanomů. Spočívá v selektivním obohacením tumoru na světlo citlivými látkami, které zásluhou absorpce světla rozvinou svoje fotodynamické účinky (flucroscence popřípadě vytváření pro buňky škodlivých radikálů a ničení vaskularizace tumoru). Úspěšnost fotodynamické terapie závisí rozhodující měrou na relativním rozložení fotosenzibilátoru v maligní a ve zdravé tkáni. Fixování fotosenzibilátoru na nádorové buňky může být například u karcinomů jícnu nebo maligních melanomů podstatně zlepšeno pro nádor specifickými protilátkami. Za pomoci vhodného světelného zdroje se pak může provádět diagnostika nebo terapie. Při diagnostickém použití dochází v ultrafialovém světle ke specifické fluorescenci maligně zvrhlých buněk. Při fotodynamické terapii se působením červeného světla dosahuje nekrózy maligně zvrhlých buněk.
Literatura:
[1] Schade et al·.: Chicken Egg Yolk Antibodies, Prouction and
Application, Springer Lab Manual, Berlin 2001;
[2] Hansen et al., J Immunol Methods 1998, 215(1-2); 1-7;
[3] Bouhours et al., Glycoconj J 1998, 15(l):93-9;
[4] Gassmann et al., FASEB J 1990, 4(8):2528-32
Zastupuj e:
12.12.2003
Ing.J.Chlustina ££>O2>
• · · 4 '
- 32 S5103/03 CZ·

Claims (15)

1. IgY-konjugáty pro výrobu diagnostika nebo terapeutika pro neinfekční záněty, infekční nemoci, poruchy srážlivosti krve, autoimunitní nemoci a onkologická onemocnění, sestávající z polyklonálního IgY-přípravku z vajec od specificky pathogenů prostých (SPF)-slepic podle Evropské Pharmakopoe und DAB10 nebo sestávající z polyklonálního IgY-přípravku z vajec od transgenních SPF-slepic, přičemž IgY-konjugáty obsahují polyklonální IgY s konstantními oblastmi lidského IgG a nejméně jednu signální a/nebo účinnou látku a/nebo zesilovací molekulu.
2. IgY-konjugáty podle nároku 1, vyznačující se tím, že polyklonálním IgY přípravkem jsou vyčištěné protilátky (IgY) z vaječných žloutků, IgY-fragmenty, Fabkonstrukty nebo virtuální protilátky z vaječných žloutků.
3. IgY-konjugáty podle nároku 1, vyznačující se t i m, že pro přípravu použité IgY-přípravky obsahují humanizované protilátky z vaječných žloutků, které se vyrábějí chemickým spojením různých oblastí ptačích protilátek s konstantními oblastmi lidského IgG.
4. IgY-konjugáty podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že IgY-přípravek sestává z mono- nebo bivalentních fragmentů protilátek, zejména Fab nebo F(ab)2.
5. IgY-konjugáty podle nároku 1 a 2, vyznačující se tím, že IgY-přípravek sestává z bi-, tri- nebo polyspecifických Fab-konstruktů.
• 9
6. IgY-konjugáty podle nároku 1, vyznačující se tím, že signální látkou je diagnostický radionuklid, enzym, barvivo a/nebo fotosenzibilátor.
7. IgY-konjugáty podle nároku 1, vyznačující se tím, že účinnou látkou je terapeutický radionuklid, cytostatikum, toxin, chemoterapeutikum, prodrug, enzym, fotosenzibilátor a/nebo fibrinolytikum.
8. IgY-konjugáty podle nároku 1, vyznačující se tím, že IgY-přípravek je konjugován se zesilovací molekulou, zejména biotinem nebo proteinem komplementárního systému.
9. IgY-konjugáty podle některého nebo více z předchozích nároků, vyznačující se tím, že signální nebo účinná látka je na IgY-přípravek navázána kovalentní vazbou nebo pomocí pomocné látky, jako je látka vytvářející chelát, zesilovací molekula a/nebo pro zesilovací molekulu vysoce afinní molekula, nebo přes různé oblasti jednoho nebo více ramen bi-, tri- nebo polyspecif ického IgYkonstruktu.
10. IgY-konjugáty podle některého nebo více z předchozích nároků, vyznačující se tím, že IgYpřípravek je specifický pro nádorové antigeny, pro hormony, pro úseky RNA nebo DNA, pro iniciátory infekce nebo jejich povrchové antigeny, pro leukocytové antigeny, pro intracelulární molekuly, pro molekuly receptorů nebo pro faktory srážlivosti.
11. IgY-konjugáty podle některého nebo více z předchozích • ·
- 34 ·· ·· nároků, vyznačující se tím, že imunokonjugáty jsou ve smyslu pretargetingu nejdříve in vivo po navázání na specifický antigen, s výhodou prostřednictvím biotinu/avidinu nebo biotinu/streptavidinu, konjugovány se signální nebo účinnou látkou.
12. IgY-konjugáty podle některého nebo více z předchozích nároků, vyznačující se tím, že imunokonjugáty jsou ve smyslu pretargetingu nejdříve in vivo po navázání na specifický antigen prostřednictvím sekundárního lidského anti-IgY-protilátek konjugovány se signální nebo účinnou látkou, popřípadě zesilovací molekulou.
13. Konfekční sada IgY)-konjugátů popsariých v nárocích 1 až 12, obsahující nejméně jednu soupravu pro kontrolu jakosti chromatografii na tenké vrstvě, oddělovací válec, stojan pro aparaturu a prací a vymývací pufer.
14. Konfekční sada podle nároku 13, vyznačuj ic i se tím, že IgY-přípravek je v lyof ilizované formě nebo suspenzi ve spojeni s přídavnými látkami, jako jsou stabilizátory, nastaven na' optimální hodnotu pH.
15. Konfekční sada IgY-konjugátů podle v nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje aplikační
CZ20033409A 2001-05-15 2002-05-03 Immunoconjugates made of egg-yolk antibodies (igy), production and use thereof in diagnoses and therapy CZ20033409A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10123505A DE10123505A1 (de) 2001-05-15 2001-05-15 Immunkonjugate aus Eidotter-Antikörpern (lgY), deren Konfektionierung und Anwendung in Diagnostik und Therapie

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20033409A3 true CZ20033409A3 (en) 2004-04-14

Family

ID=7684793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033409A CZ20033409A3 (en) 2001-05-15 2002-05-03 Immunoconjugates made of egg-yolk antibodies (igy), production and use thereof in diagnoses and therapy

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20040236076A1 (cs)
EP (1) EP1387701B1 (cs)
JP (1) JP2004534752A (cs)
CN (1) CN1509188A (cs)
AT (1) ATE280591T1 (cs)
AU (1) AU2002310996A1 (cs)
BR (1) BR0216002A (cs)
CA (1) CA2447287A1 (cs)
CZ (1) CZ20033409A3 (cs)
DE (2) DE10123505A1 (cs)
RU (1) RU2003136069A (cs)
WO (1) WO2002092136A2 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL148598A (en) * 2002-03-10 2008-04-13 Ely Morag Multifunctional complex for targeting specific phagocytosis of a target agent and a composition comprising it
CA2606022C (en) * 2005-03-07 2011-08-23 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Methods of applying ionization radiation for therapy of hiv infection
CN1818651B (zh) * 2006-03-13 2010-07-21 东北农业大学 兔抗鹅IgY+IgY(△Fc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体
JPWO2008078809A1 (ja) * 2006-12-27 2010-04-30 独立行政法人科学技術振興機構 鳥類抗体を使用する免疫学的検出方法
WO2012072515A2 (en) * 2010-11-29 2012-06-07 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Lmp1 a diagnostic and prognostic marker for epstein-barr virus (ebv)-associated lymphoma
US20140315283A1 (en) 2012-05-09 2014-10-23 David A. Calderwood Sample cartridge and sample stage
PH12013000059A1 (en) * 2013-02-15 2016-12-12 Yu Gracia Fe Diagnosis and detection of dengue virus infection using chicken egg antibodies
CN104288769B (zh) * 2014-09-17 2017-09-29 陕西建华生物制药有限公司 一种西药外用膏剂及其制备方法
CN108840929A (zh) * 2018-06-20 2018-11-20 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用
CN110873711B (zh) * 2018-09-04 2022-02-22 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒
CN111228481A (zh) * 2018-11-28 2020-06-05 万华普曼生物工程有限公司 一种用于治疗幽门螺旋杆菌的鸡IgY双功能抗体
WO2021112174A1 (ja) * 2019-12-03 2021-06-10 国立大学法人東海国立大学機構 光抗菌療法
EP3919073B1 (en) * 2020-06-05 2024-05-15 Schweitzer Biotech Company Ltd. Composition for preventing infestation and infection of sea lice on salmon

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE6902707U (de) * 1969-04-30 1969-09-25 Gustav Blecher Kg Restwaermeanzeige an speicherheizgeraeten
US4433997A (en) * 1979-04-20 1984-02-28 Stauffer Chemical Co N-Acylsulfonamide herbicidal antidotes
US4495365A (en) * 1980-11-21 1985-01-22 Stauffer Chemical Co. N-Acylsulfonamide herbicidal antidotes
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
CN1085910A (zh) * 1992-10-22 1994-04-27 中国科学院遗传研究所 抗胃癌生物导向药-免疫球蛋白y-植物毒蛋白a
EP0710252A1 (en) * 1993-03-03 1996-05-08 Spectral Diagnostics Inc. Monoclonal antibodies to egg yolk immunoglobulins (igy)
US5420253A (en) * 1993-09-09 1995-05-30 Willmar Poultry Company, Inc. Method for purifying egg yolk immunoglobulins
US6143559A (en) * 1996-11-18 2000-11-07 Arch Development Corporation Methods for the production of chicken monoclonal antibodies
DE19737453A1 (de) * 1997-08-25 1999-03-04 Biolog Chemisches I Hoppegarte Aviäre, vitelline, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtete Antikörper
JP2000080027A (ja) * 1998-09-02 2000-03-21 Taiyo Kagaku Co Ltd 徐放性製剤

Also Published As

Publication number Publication date
EP1387701B1 (de) 2004-10-27
CA2447287A1 (en) 2002-11-21
CN1509188A (zh) 2004-06-30
ATE280591T1 (de) 2004-11-15
DE10123505A1 (de) 2002-11-28
BR0216002A (pt) 2006-08-29
JP2004534752A (ja) 2004-11-18
RU2003136069A (ru) 2005-03-27
DE50201410D1 (de) 2004-12-02
AU2002310996A1 (en) 2002-11-25
EP1387701A2 (de) 2004-02-11
WO2002092136A3 (de) 2003-09-18
US20040236076A1 (en) 2004-11-25
WO2002092136A2 (de) 2002-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5855209B2 (ja) 放射免疫コンジュゲートおよびその使用
ES2350477T5 (es) Internalización de anticuerpos anti-CD74 y métodos de uso
KR0162259B1 (ko) 감염성 병변 및 염증성 병변을 검출 및 치료하기 위한 키메라 항체
US4348376A (en) Tumor localization and therapy with labeled anti-CEA antibody
HU230516B1 (hu) Radioaktív jelölő készlet és kötési mérőeljárás
PL174721B1 (pl) Przeciwciało monoklonalne anty-CD20
JPH03500419A (ja) 多特異抗白血球結合体及び哺乳動物用非経口的注射剤
ES2364811T3 (es) Conjugados de unión con un re.
CZ20033409A3 (en) Immunoconjugates made of egg-yolk antibodies (igy), production and use thereof in diagnoses and therapy
JPH0684315B2 (ja) ヒト腫瘍治療用注射組成物
CA2987628A1 (en) Radio-imaging and radio-therapy of cancer using antibodies to haah
US20240207464A1 (en) Radioactive complex of anti-cd20 antibody, and radiopharmaceutical
WO2012032043A1 (en) 212 pb imaging
EP4327831A1 (en) Radioactive complex of anti-cd20 antibody, and radiopharmaceutical
US20230390425A1 (en) Radioactive complexes of anti-her2 antibody, and radiopharmaceutical
WO2023033022A1 (ja) 脱グリコシル化抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
CN117769440A (zh) 抗cd20抗体的放射性复合物和放射性药物