CZ20032232A3 - Metronomic dosing of taxanes for inhibiting tumor growth - Google Patents

Description

Metronomické dávkování taxanů

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu metronomického dávkování taxanů.

Tato přihláška nárokuje přínos podle ustanovení § 35, 119(e) z US provizorní přihlášky č. 60/271 944, která byla podána dne 28. února 2001.

Dosavadní stav techniky

Chemoterapeutické lékové režimy pro terapii nádorových onemocnění byly tradičně projektovány tak, aby zničily co nejvíce nádorových buněk, jak jen bylo možné při léčbě „maximálními tolerovatelnými dávkami (MTD) těchto cytotoxických prostředků (Hanahan a kol., J. Clinical Invest., 105(8), 1045 až 1047 (2000)). Tento MTD dávkovači režim je běžně nazýván indukční terapií. Nicméně toxické vedlejší účinky související s poškozením proliferujících buněk ve zdravé tkáni vyplývající z podávání těchto MTD představují významné omezení používání těchto prostředků.

Za účelem vybalancování toxicity s účinností je v konvenčních dávkovačích režimech požadavek na epizodické podávání cytotoxických přípravků v dávkách MTD či blízko nim, následované klidovými intervaly, které mají umožnit regeneraci zdravé tkáně (Hanahan a kol., J. Clinical Invest., 105(8), 1045 až 1047 (2000)). Nicméně tento standardní MTD režim nejenže vážně omezuje kvalitu života pacienta, může však také vést k pouze krátkodobým remisím následovaným relapsy často agresivnějšími formami malignit resistentními na cytotoxické prostředky.

Proto se aktivně vyhledávají alternativní terapie. Jedním alternativním přístupem je cílení terapie na buňky • · · · • · · · · · • · · ·· · ···· • · · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· · cév, ze kterých se formují krevní cévy tumoru, namísto namíření léčby vůči buňkám tumoru jako takovým. Angíogeneze je proces tvorby krevních cév z preexistující vaskulatury, zahrnující nábor a expansi předem existujícího endothelu. Angíogeneze je fyziologický proces běžně se vyskytující v průběhu ženského reprodukčního cyklu a při hojení ran.

Nicméně angíogeneze se též vyskytuje u maligních nádorů, jelikož vytvoření funkční mikrovaskulatury je kritické pro růst tumoru a jeho disseminaci.

Nedávné preklinické studie demonstrují účinnost podávání cytotoxických prostředků cyklofosfamidu (Browder a kol., Cancer Res., 60, 1878 až 1886 (2000)) a vinblastinu v kombinaci s non-cytotoxickou protilátkou VEGF receptoru-2 (Klement a kol., J. Clinical Invest., 105(8), R5 až R24 (2000)) v kratších intervalech bez přerušení až 210 dnů terapie.

Browder a kol. popisuje podávání cyklofosfamidu myším s rezistentním Lewisovým typem plicního karcinomu, buď každodenně nebo každý 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8 den.

Při těchto experimentech se nalezlo, že cyklofosfamid v dávce 170 mg/kg podávaný každých 6 dnů je účinnější při kontrole růstu tumoru než ostatní testované cyklofosfamidové režimy včetně režimů s vyšší intenzitou dávky, například 135 mg/kg každé 4 dny (Browder a kol.,

Cancer Res., 60, 1878 až 1886 (2000)).

Klement a kol. podrobil xenografty ze 2 nezávislých buněčných linií neuroblastomu buď kontinuálnímu léčení nízkými dávkami vinblastinu, monoklonální neutralizační protilátky (DC101) cílené na flk-1/KDR (typ 2) receptor pro VEGF, nebo oběma prostředky společně. V těchto experimentech se vinblastin podává v dávce přibližně 1,5 mg/m² každé 3 dny, v dávce, která je přibližně 1/4 MTD tohoto léčiva pro člověka a 1/16 až 1/20 MTD pro myš (Klement a kol., J.

• · · · · · • · · · ·

Clinical Invest., 105(8), R15 až R24 (2000)).

Dokument WO 00/64436 popisuje způsob léčení chorob u jedince prostřednictvím podání farmakologicky účinného činidla v sub-terapeutické dávkové hladině během časového úseku dostatečného pro dosažení léčebného účinku. Nicméně nejsou poskytnuta žádná data zabývající se účinností této metody v jakékoliv ze 42 tříd farmaceuticky účinných činidel vyčtených na dalších stránkách 10 až 16 této přihlášky.

Podávání léčiv v dávkách nižších než maximální tolerovatelné dávky buď kontinuálně nebo v kratších intervalech bez přerušení se někdy nazývá jako chronické neboli „metronomické dávkování (Hanahan a kol., J. Clinical Invest., 105 (8), 1045 až 1047 (2000)).

Podstata vynálezu

Předmětem přítomného vynálezu je poskytnutí metronomického dávkovacího režimu taxanů.

Dalším předmětem přítomného vynálezu je poskytnutí způsobu inhibice nádorového růstu, který zahrnuje expozici tumoru taxanu cestou metronomického dávkovacího režimu. Tento metronomický dávkovači režim může být použit sám o sobě nebo v kombinaci s jinými zavedenými (ustanovenými) antitumorozními terapiemi.

Podrobný popis vynálezu

Polymerace tubulinu je obecně uznávána jako jeden z nejúčinnějších cílů pro nádorovou chemoterapií. Klinický úspěch na širokém spektru malignit byl demonstrován u obou komerčně dostupných taxanů, kterými jsou taxol (paklitaxel) • · • · · · • · · · ··

a taxoter (docitaxel). Účinnost těchto léčiv je závislá na rozvržení podávání, s tím, že příznivé výsledky se objevily v případě prodloužených dob podávání. Klinický užitek byl například demonstrován v případě opakovaných podávání taxolu jednou za týden.

Dále preklinické studie naznačují, že taxol může mít silný anti-angiogenní účinek (Dordunoo a kol., Cancer Chemother. Pharmacol., 36, 279 až 282 (1995); Buřt a kol., Cancer Letters, 88, 73 až 79 (1995); Oktaba a kol., Proč. Annu. Meet. Tím. Assoc. Cancer Res., 36, A2597 (1995); Belotti a kol., Proč. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res.,

37, A397 (1996); Belotti a kol., Clinical Cancer Res., 2_, 1843 až 1849 (1996); Klauber a kol., Cancer research, 57, až 86 (1997) a Velasco a kol., J. Invest. Dermatol.,

112, 655 (1999)). Protože cílovou populací pro antiangiogenní sloučeninu je endotel spíše než tumor jako takový, bylo navrženo, že účinné anti-angiogenní činidlo musí být podáváno chronicky. Bohužel perorální biologická dostupnost komerčné dostupných taxanů je velice nízká (méně než 1 % u krysy), čímž se chronické opakované podávání stává extrémně obtížné.

Perorálně účinné analogům paklitaxelu je 3'-terc-butyl-3'-N-terc-butoxykarbonyl-4-deacetyl-3'-defenyl-3'-N-debenzoyl-4-0-methoxykarbonylpaklitaxel. Struktura 3'-terc-butyl-3'-N-terc-butoxykarbonyl-4-deacetyl-3'-defenyl-3'-N-debenzoyl-4-0-methoxykarbobylpaklitaxelu je znázorněna obecným vzorcem I

o • · · • * ·

Následně tento perorálně biologicky dostupný taxan je zde dále zmiňován jako perorálně účinný taxan obecného vzorce I.

Perorálně účinný taxan obecného vzorce I vykazuje dobrou perorální biologickou dostupnost jak u krysy, tak u psa a má antitumorózní účinek na mnohé linie lidských buněk srovnatelný s účinkem paklitaxelu podaným intravenózně. Perorálně účinný taxan, uváděný jako IDN 5109, byl též popsán v publikacích Polizzi a kol., Clinical Cancer Res., 6(5), 2070 až 2074 (květen 2000) a Nicoletti a kol., Cencer Res., 60(4), 842 až 846 (15. únor 2000). Dokument WO 99/49848 navíc popisuje perorální prostředky obsahující taxany, jako je paklitaxel a dokataxel, a dokument WO 98/53811 popisuje dávkovači režim taxanů, kde se též podává perorální posilovač (enhancer).

Přítomný vynález se týká metronomického dávkovacího režimu pro taxany, s výhodou taxany, které jsou perorálně biologicky dostupné, jako je perorálně účinný taxan obecného vzorce I, IDN 5109 nebo perorálně podávaný prostředek taxolu, k inhibici nádorového růstu a za účelem léčení maligních nádorů. Pro účely přítomného vynálezu se „metronomickým dávkovacím režimem míní opakované podání léčiva v dávce nižší, než je ustanovená maximální tolerovatelná dávka léčiva, přičemž zmíněné léčivo při opakovaném podávání má požadovaný farmakologický účinek, za současné redukce toxických vedlejších účinků, při porovnání s výsledky pro totéž léčivo podávané v maximální tolerovatelné dávce tradičním způsobem s odpočinkovými periodami. Trvání odpočinkových period může být stejně dlouhé či delší než trvání léčení, které předcházelo klidovému období. V případě metronomického dávkování se nakonec může podat stejně velká kumulativní dávka, jaká by • · · ·

• · · · ·* ·· ·· byla podána standardním MTD režimem, což je zde též nazýváno indukční terapií. V některých případech může být toto dosaženo zvětšením časového rámce a/nebo frekvence, se kterou se dávkovači režim realizuje, přičemž se snižuje množství podané každou dávkou. Z toho vyplývá, že termín „opakovaný znamená chronický a/nebo kontinuální dávkovači režim. Nicméně výhoda metronomického dávkování nespočívá tolik ve frekvenci nebo trvání terapie, spíše znamená relativně bezpečné léčení schopné udržet užitek z léčiva pro pacienta při současném podávání prostřednictvím standardního MTD rozvrhu. Následně taxan podaný metronomickým dávkovacím režimem podle přítomného vynálezu je pacientem lépe tolerován. Metronomické dávkování lze též nazvat jako udržovacím dávkováním nebo chronickým dávkováním.

Pro účely přítomného vynálezu je požadovaným farmakologickým účinkem metronomického dávkování taxanů inhibice nádorového růstu. „Inhibice nádorového růstu znamená navození suprese nádorového růstu a/nebo zapříčinění regrese velikosti nádoru. I když metronomické podávání taxanů není spjato s konkrétním mechanismem, věří se, že může mířit na buňky vaskulatury, které formují krevní cévy tumoru, namísto míření na vlastní nádorové buňky jako takové. Proto inhibice nádorového růstu může vyplývat z neschopnosti nádorových buněk ustanovit funkční mikrovaskulaturu, která je kritická pro nádorový růst a disseminaci.

Toxické vedlejší účinky redukované dávkovacím režimem podle přítomného vynálezu zahrnují, avšak nejsou omezeny na, neurotoxicitu, poškození normálních proliferujících buněk a pokles tělesné hmotnosti.

Metronomické dávkování perorálně podávaného taxanů lze použít samo o sobě jako protinádorové léčení nebo • · · * • · · · v kombinaci či ve spojení s jinými ustanovenými protinádorovými terapiemi podávanými standardními MTD režimy. Příklady ustanovených protinádorových terapií, které mohou být použity v kombinaci či ve spojení s metronomickým dávkovacím režimem podle přítomného vynálezu, zahrnují, avšak nejsou na ně omezena, paklitaxel, docitaxel, cyklofosfamid, karboplatinu, etoposíd, doxorubicin, irinotekan, topotekan, vinblastin, gemcitabin, kombinace tegafuru a uracilu, kapecitabin, 5-fluorouracil, protilátky jako herceptin nebo cetuximab (a.k.a., ERBITUX™) , antihormonální léčby jako bikalutamid nebo flutamid a radioterapii. Výraz „v kombinaci nebo ve spojení s znamená, že metronomický dávkovači režim podle přítomného vynálezu probíhá buď ve stejném čase jako standardní MTD režim ustanovenými protinádorovými terapiemi, nebo s výhodou mezi průběhy indukční terapie za účelem udržení příznivého efektu pro pacienta navozeného indukčním terapeutickým režimem. Pokud se léčba podává mezi jednotlivými fázemi indukční terapie, účelem je pokračovat v inhibici nádorového růstu, aniž by docházelo k přílišnému omezování pacientova zdraví nebo jeho schopnosti snášet další fázi indukční terapie.

Anti-angiogenní aktivita perorálního taxanu obecného vzorce I byla hodnocena na endotheliálních buňkách in vitro a na in vivo modelu angiogeneze nezávislé na tumoru. Proliferační stanovení a stanovení formace tubulů byla použita pro stanovení aktivity endotheliálních buněk in vitro.

Pro stanovení aktivity in vitro se hodnotí účinek perorálně podáívaného taxanu obecného vzorce I v porovnání s taxolem (paklitaxelem) na buněčné funkce endothelií ve vztahu k procesu angiogeneze. Hodnocené funkce zahrnují proliferaci endotheliálních buněk formujících lumen expandující vaskulatury. Jak je znázorněno v tabulce 1, ve • · · « · · · · ······ 9 g ··♦····♦· *· · · ·· «· «· dvou samostatných experimentech je perorálně podávaný taxan obecného vzorce I téměř stejně účinný jako TAXOL v inhibici proliferace humánních endotheliálních buněk z umbilikální žíly (HUVEC). Inhibice se též pozoruje v případě nádorových buněk linie H3396, a to při přibližně stejných koncentracích jako v případě HUVEC, což značí, že tyto taxany vykazují cytotoxické účinky inhibující proliferaci jak endotheliálních, tak nádorových buněk.

Tabulka 1

Inhibice proliferace HUVEC a H3396 buněk

Sloučenina	IC50 pro buňky	[μΜ]
HUVEC		H3396	H3396/HUVEC
Obecného vzorce I	0,002; 0,002		0,002; 0,003	1,25
Taxol	0,003; 0,005		0,003; 0,004	0,88

Dále se hodnotí účinky na funkcí endotheliální buňky, které zahrnují diferenciaci těchto buněk do formace tubulů na Matrigelu. Jak je ukázáno v tabulce 2, nejnižší koncentrace těchto taxanů, která vede ke kompletní inhibici formace tubulů na Matrigelu je pro oba zmíněné taxany 0,0500 μΜ. Navíc další snížení koncentrace stále udržuje inhibiční efekt obou těchto taxanů.

9 9

9 9 9 9

9· «9

9 «9 ·

Tabulka 2

Inhibice formace tubulů HUVEC buněk na Matrigelu

Sloučenina	5,000 μΜ	0,500 μΜ	0,0500 μΜ	0,0050 μΜ	0,0005 μΜ
Obecného vzorce I	C	C	C	P	P
Taxol	C	C	C	P	P

Poznámka:

C - kompletní; P - parciální

Následně tyto taxany inhibují dva kritické procesy > angiogeneze, jmenovitě proliferaci a diferenciaci endotheliálních buněk. Proto jejich antitumorózní účinek není pouze důsledkem jejich antiproliferační aktivity, ale též důsledkem jejich aktivity na jiné funkce endotheliální buňky.

Jmenované taxany byly též hodnoceny in vivo za použití zátek z Matrigelu. V těchto experimentech se angiogenní odpověď měří stanovením počtu endotheliálních buněk vyskytujících se v zátkách z Matrigelu při různých terapeutických a subterapeutických dávkách. Pro taxol i pro perorálně podávaný taxan obecného vzorce I koreluje počet endotheliálních buněk vyskytující se v zátkách s testovanými dávkami způsobem na dávce závislým. Při maximální tolerovatelné dávce (MTD) taxolu, 24 mg/kg, se pozoruje více než 50% snížení počtu buněk při porovnání s kontrolními skupinami stejného režimu (každý druhý den po dobu 5 dnů, q2dx5). Pro perorálně podávaný taxan obecného vzorce I se pozoruje více než 50% snížení počtu buněk v zátkách při maximální tolerovatelné dávce (MTD) 60 « « · · ·· · · · «...

• · · · · · · · . a ίο ϊ ί. ί * ϊ ί *; ;··;· ·· ·· ·< «· _tt mg/kg a dvou nižších dávkách 36 mg/kg a 18 mg/kg. Proto dávky tak nízké jako 30 % MTD stále vedou k více než 50% snížení počtu buněk. Dále, účinek těchto taxanů na počet endotheliálních buněk, i když je menší při nižších testovaných dávkách, stále vyústí v morfologické defekty, jak vyplývá ze schopnosti těchto buněk organizovat se do tubulárních struktur obsahujících červené krvinky, při porovnání s kontrolními zvířaty. Proto lze anti-angiogenní účinky in vivo stále pozorovat v dávkách perorálního taxanu obecného vzorce I přibližně 13-krát nižších než je maximální tolerovatelná dávka.

Ukázalo se, že perorálně podávaný taxan obecného vzorce 1 má také preklinickou protínádorovou účinnost srovnatelnou s intravenózně podaným paklitaxelem, pokud se podává jako udržovací terapie mezi fázemi indukční chemoterapie. V těchto experimentech obdrží myši s mammárními 16/C myšími tumory jeden ze dvou obecných terapeutických přístupů:

a) paklitaxel intravenózně podaný ve dvou následujících denních léčebných rozvrzích oddělených 18-denním klidovým intervalem, to jest qdx5, 10, 32; nebo

b) paklitaxel intravenózně podaný ve dvou následujících denních léčebných rozvrzích oddělených 18-denním klidovým intervalem, navíc s přídatnou qdx5 terapií sestávající z perorálního podání perorálně podávaného taxanu obecného vzorce I, přičemž tato přídatná terapie je zahájena jeden týden po ukončení prvého podání intravenózně podávaného paklitaxelu, to jest paklitaxel qdx5; 10, 32 + taxan obecného vzorce I qdx5; 21. Pro každou terapii se provedou titrace dávky v závislosti na odpovědi. Souhrn hodnot hrubé buněčné destrukce (log cell kill, LCK) získaných zvolenými terapeutickými režimy je znázorněn v tabulce 3.

·· ·«··

9 • · 9 · · * · · · · • · · · · 9 • · ·♦ « · • · 9

9 9 9

9 99999

9 9

Tabulka 3

Účinek zahrnutí udržovací terapie perorálním podáváním taxanu mezi fázemi intravenózního léčení paklitaxelem. u myší nesoucích značný subkutánní mammární 16/C karcinom

Léčení (mg/kg na injekci)	Účinek
Paklitaxel	Sloučenina	Paklitaxel	Hrubá LCK
qd 10-14,	obecného vzorce I,	qd 32-36,	(vyléčení/celkem*)
i. v.	Qd 21-25, p.o.	i. v.
30	—	30	10,1 (2/8)
30	-	20	9,5
20	—	30	4,7 (1/8)
20		20	4,5
30	20	30	Toxická
30	13	30	LD25
20	20	20	>13,8 (4/8)
20	13	20	9,0 (1/8)

* Vyléčení se zhodnotí 88. den po implantaci tumoru.

Z toho vyplývá, že optimální účinek dosažený samotným paklitaxelem, 10,1 LCK zahrnující 2 z 8 léčení, byl docílen režimem blízkým MTD, 30 mg/kg na injekci paklitaxelu v průběhu každé ze dvou fází terapie. Menší množství paklitaxelu v průběhu jedné či obou terapií mělo za následek snížení účinku. Pro porovnání, pokud se perorálně podávaný taxan obecného vzorce I přidá k určitým fázím intravenózní terapie paklitaxelem, pozoruje se zlepšení celkové účinnosti. Optimální kombinace chemoterapeutického režimu v těchto experimentech zahrnuje podání 20 mg/kg perorálně podávaného taxanu obecného vzorce I společně s 20 mg/kg intravenózního paklitaxelu v průběhu každé fáze terapie paklitaxelem. Dále, oproti léčení samotným paklitaxelem, kdy dochází k určitému znovuobnovení masy tumoru v intervalu mezi jednotlivými fázemi terapie, ···♦

9 99 9 9 «· 9 • 9 9 • · « · • · · · 9 9

9 9 podání perorálně podávaného taxanu obecného vzorce I mezi fázemi podávání paklitaxelu vede k potlačení a dokonce i mírnému zmenšení střední velikosti tumoru ve skupině léčené touto kombinační terapií.

V dalších experimentech se perorálně podávaný taxan podá jako udržovací léčba následující jedinou fázi indukční terapie intravenózně podávaným paklitaxelem. U myši léčené pouze intravenózně podávaným paklitaxelem vede MTD režim sestávající z podávání 45 mg/kg na injekci, qdx5, i.v., počínaje 10. den po implantaci nádoru, ke stejnému optimálnímu terapeutickému výsledku jako následující nižší dávka 30 mg/kg na injekci, 1,9 LCK. Naproti tomu další skupiny myší obdržely indukční chemoterapii za použití paklitaxelu, ale potom jeden či dva odlišné udržovací režimy za použití perorálně podávaného taxanu obecného vzorce I. Tabulka 4 uvádí souhrn různých léčení a výsledků tohoto experimentu.

• · · • · · · • · · · · · • · · ·· ····

•fc ····

Tabulka 4

Účinky udržovací terapie perorálně podávaným taxanem obecného vzorce I po indukční terapii intravenózním paklitaxelem u myší nesoucích značený subkutánní mammární 16/C karcinom

Terapie (mg/kg na	injekci)		Účinek
Paklitaxel qd	Sloučenina obecného vzorce	Hrubá LCK
10-14, i.v.	I, p.o.		(vyléčení/celkem) ★
	Q2dxll;d.21	q4dx6;d.21
45	-	—	1,9 (1/8)
30	—	-	1,9 (2/8)
45	30		Toxická
45	13		3,9 (2/8)
30	30	—	Toxická
30	20	—	Toxická
30	13	-	3,5 (2/8)
20	30	__	Toxická
20	20	—	4,0 (1/8)
20	13	—	2,5
45	-	45	LD25
45	—	30	5,5 (1/8)
45	-	20	2,8
30		45	4,6 (3/8)
30	-	30	4,4 (2/8)
30	-	20	3,7
20		45	2,4
20	—	30	2,3

* vyléčené případy se vyhodnotí 60. den po implantaci nádoru

Pozitivní účinky podávání perorálně podávaného taxanu po dobu přibližně dalších 4 týdnů jsou z výše uvedených výsledků jasně patrné. V maximálních tolerovatel·· ·*·· ·· ···· • · ♦ ·'·''♦ · · · • · · · · · · · · · i4 ···· • · 9 · ·· · · ·· « ných kombinačních režimech (paklitaxel + sloučenina obecného vzorce I) je nejlepší dosažená hodnota LCK 5,5 při příležitostných vyléčeních, jak se posoudí po ukončení experimentu (den 60). Účinnější z perorálních udržovacích terapií perorálním taxanem vedla k více než pouze prevenci progrese nádoru, vedla také k redukci nádorové masy.

Metronomický dávkovači režim taxanem samotným je též úspěšný v supresi růstu lidských nádorových buněk u myši. V těchto experimentech se prodloužený 30-denní léčebný režim používající dávky perorálního taxanu obecného vzorce I v dávkách nižších než MTD dobře vyrovná tradičně používanému MTD a konsolidačnímu přístupu dávkování při supresi růstu L2987 humánního plicního nádoru. L2987 humánní plicní nádory se implantují a nechají se dorůst objemu 50 až 100 mm³, poté se podá léčivo. Běžně používaný MTD a konsolidační přístup dávkování sestává z dávky 60 mg/kg na jedno podání podané perorálně při standardním režimu (q2dx5). Metronomický dávkovači režim při podávání stejné kumulativní dávky 300 mg/kg sestává z dávky 20 mg/kg podané perorálně při modifikovaném režimu (každý druhý den po dobu 15 dnů; q2dxl5). Zatímco v případě standardního režimu se pozoruje větší anti-tumorózní odpověď, dochází také k úbytku hmotnosti. Naproti tomu u metronomického dávkovacího režimu dochází také k supresi nádorového růstu a není pozorován žádný hmotnostní úbytek. Následně metronomické dávkování taxanů poskytuje bezpečné a přitom efektivní způsoby inhibice nádorového růstu.

Jak odborník v oboru porozumí při čtení tohoto popisu, metronomický dávkovači režim používaný ve zmíněných experimentech slouží pouze jako jeden příklad z možných změn v dávkovacím intervalu a jeho trvání, přičemž tyto změny se týkají standardního MTD režimu a dělají se pro to, aby se dostal optimální metronomický dávkovači režim.

Například pro perorálně podávaný taxan obecného vzorce I se • ft ftftftft • · · · ft · • ft. · ft · · ·· · ··· ♦ · · ftftft · · · ft tr ·· ftft·· ···· ··· «·········· ·· ·· «ft ·« ·· · očekává, že metronomické dávkovači režimy budou účinné v supresi nádorového růstu včetně, avšak bez omezeni na ně, dávkovaciho intervalu každý den, dávkovačích intervalů každý druhý den a dávkování jednou za týden. Tyto dávkovači režimy jsou rozloženy do různě dlouhých časových úseků pohybujících se délkou v rozmezí přibližně od jednoho měsíce do nejméně jednoho roku. Množství léčiva podávané v těchto exemplárních metronomických dávkovačích režimech se může pohybovat v rozmezí od přibližně 0,25 mg/M² do 120 mg/M², 0,50 mg/M² do 240 mg/M² a 1 mg/M² do 700 mg/M². Další in vitro a in vivo experimenty týkající se angiogenezy dokazují, že i kumulativní dávky nižší než 300 mg/kg budou též účinné v supresi nádorového růstu. Proto metronomické dávkovači režimy pro perorálně podávaný taxan obecného vzorce I mohou být též navrženy pro podání nižší kumulativní dávky, jako je například 225 mg/kg, 150 mg/kg, mg/kg, 37,5 mg/kg a též 18,75 mg/kg. Dále lze v souladu s poznatky poskytnutými v tomto popise pro perorálně podávaný taxan obecného vzorce I rutinně naplánovat metronomické dávkovači režimy pro jiné taxany, které jsou založeny na jejich individuálních standardních MTD režimech a z jejich aktivity v in vitro a in vivo stanoveních angiogeneze, jak je popsáno v následujících příkladech.

Přítomný vynález se též týká způsobů používání metronomických dávkovačích režimů pro taxany za účelem inhibice nádorového růstu u zvířat. Ve výhodném provedení bude taxan používaný ve zmíněných způsobech perorálně biologicky dostupný. Výhodný perorálně podávaný taxan je taxan obecného vzorce I. Nicméně lze použít i jiné taxany a jiné způsoby kontinuálního podávání nízkých dávek taxanů. Například jiné způsoby podání metronomických dávek podle přítomného vynálezu zahrnují způsob inhalační, intradermální, například transdermálními náplastmi, rektálně čípky, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní a subkutánní, avšak nejsou na ně omezeny.

·· ·«·· »9 ····

9 • · · • · · · • · ♦··· • · · ·· ·

Pro účely přítomného vynálezu se „živočichem rozumí jakýkoliv živočich, u kterého příslušné nádory rostou, zvláště člověk.

Následující příklady jsou poskytnuty pro další ilustraci přítomného vynálezu, ne pro jeho omezení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Proliferace HUVEC

Primární humánní endotheliální buňky umbilikální vény (HUVEC) se zakoupí od firmy CLONETIC lne. (San Diego, CA) a použijí se při pasážích 2 a 3. Proliferace se měří za použití inkorporace ³H-thymidinu do buněk pulzováním 24 hodin před sebráním buněčných kultur. Pro stanovení aktivity sloučeniny na nádorové buňky se použijí buňky humánního mammárního karcinomu linie H3396. Buňky (2 x 10³) se vynesou na plotny o 96 jamkách potažené kolagenem IV typu. Po 24 hodinách se přidají sloučeniny v různých koncentracích. Po 48 hodinách se přidá ³H-thymidin a buňky se nechají inkorporovat tuto značenou sloučeninu po dobu 24 hodin. Buněčné extrakty se seberou do skleněných filtrů a inkorporovaná radioaktivita se stanoví čítáním v beta scintilačním čítači. Hodnota IC₅o definovaná jako koncentrace léčiva, která zapříčiňuje 50% inhibici inkorporace ³H-thymidinu, se extrapoluje z vynesených dat. Buněčná selektivní inhibice pro endotheliální buňky pro konkrétní sloučeninu je definována alespoň desetkrát vyšší inhibici HUVEC primárních buněčných kultur při porovnání s H3396 nádorovou buněčnou linií.

• · ·*·· ·· ···· ·· ···· ·· ·

Příklad 2

Formace tubulů in vitro

Angiogeneze vede ke vzniku funkčních krevních cév obsahujících červené krvinky. Byla ustanovena in vitro stanovení, která částečně napodobují tento proces. Pokud se primární endotheliální buňky, jako jsou HUVEC buňky, naočkují na Matrigel (Collaborative Research, lne.), vytváří trojrozměrný systém dutých struktur - tubulů, které se uspořádají do vláken. V tomto systému stanovení se formace tubulů hodnotí na extracelulární proteinové matrici sestávající z Matrigelu naředěném v poměru 1:1 kultivačním médiem (EBM-2; Clonetics, lne.) a ponechané polymerovat po dobu 60 minut při teplotě 37 °C. HUVEC buňky v množství 3,5 x 10⁴ na jamku na plotně o 24 jamkách se distribuují v 0,5 ml média obsahujícím vehikulum nebo testovanou sloučeninu na polymerovaný Matrigel (0,3 ml). Po 18 hodinách po naočkování buněk se médium odstraní a kultury se fixují formalínem. Inhibice tubulů na Matrigelu se hodnotí inverzním mikroskopem za použití osvětlení s fázovým kontrastem.

Pro určení účinku sloučenin v tomto stanovení byl vyvinut deskriptivní přístup. Kompletní ztráta inhibice je definována jako stav, kdy exposice sloučeniny v dané koncentraci vede k tomu, že se méně než 1 % naočkovaných HUVEC buněk na desce vyskytuje jako samostatné buňky a zbytek buněk formuje systém elongovaných tubulárních struktur s nebo bez rozvětvení. Částečná inhibice je definována jako vytvoření nekompletního systému s velkým počtem samostatných buněk. Kompletní inhibice znamená stav, kdy se více než 99 % buněk vyskytuje jako samostatné buňky bez žádných elongovaných či rozvětvených struktur. Počet samostatných buněk vyskytujících se po ošetření vehikulem se odečte od celkového množství samostatných buněk • «r ·«·· ·· ···· ¹⁰ ·*········· ·· ·· ·· ·· ·* · vyskytujících se v léčených skupinách před stanovováním účinků testovaných sloučenin, pro stanovení efektů pozadí.

Příklad 3

Modely a studie in vivo

Fragmenty humánního plicního tumoru LX1 udržované sériovou subkutánní pasáží na athymické (nu/nu) Balb/c myši se implantují subkutánně jako malé fragmenty o velikosti přibližně 0,1 mm³. Čas, během kterého se objem tohoto tumoru zdvojnásobí, je 2,8 dne. Když tumory dosáhnou velikosti v rozmezí 150 až 200 mm³, se do strany kontralaterálně k tumoru subkutánně injikuje tekutý Matrigel. Terapie je v různých dávkách a režimech zahájena o 24 hodin později.

Před implantací se Matrigel připraví tak, že se solidifikovaný Matrigel umístí na led přes noc při teplotě 4 °C v souladu s metodou popsanou v publikaci Passiniti a kol., Lab. Invest., 67, 519 až 528 (1992). Do kapalné fáze se ještě během přítomnosti na ledu do Matrigelu přidá VEGF a bFGF (Peprotech, lne. Rocky Hill, NJ) v konečných koncentracích 75 ng/ml a 300 ng/ml. Zásobní roztoky těchto růstových faktorů se připraví čerstvé v koncentraci 10 mg/ml v PBS. Po 24 hodinách po konečné terapii se zvířata usmrtí cervikální dislokací, Matrigelové zátky z léčených a kontrolních zvířat se excidují a fixují alespoň 48 hodin v 10% neutrálním pufrovaném formalínu.

Tyto zátky se poté zalijí parafínem, nařežou na plátky 5 pm silné a potom se před kvantitativní analýzou nabarví hematoxylinem a eosinem. Počet endotheliálních buněk v zátkách se kvantifikuje za použití IMAGEPRO PLUS softwaru (Media Cybernetics, lne., Silver Spring, MD) při zvětšení 20x. Padesát políček pohledu z každé zátky se použije pro stanovení počtu endotheliálních buněk. Počet buněk se sumarizuje a statisticky se porovná s kontrolami.

···· ·· ···· • · · · ·

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99

9

9 9 9 • 9 9 9 9

999 9 9999 • 9 9 9 9

99 9

Angiogeneze v těchto zátkách se hodnotí jako počet endotheliálních buněk migrujících do zátek ze sloučeninou léčených skupin ve vztahu k vehikulem ošetřené skupině. Tumory se implantují za účelem monitorování antitumorózních efektů těchto sloučenin v průběhu těchto studií pro potvrzení účinnosti sloučeniny v terapeutických dávkách.

Pro dávkování se taxol a perorálně podávaný taxan obecného vzorce I suspendují v roztoku cremoforu a ethanolu v poměru 1:1 a dodají se v konečné koncentraci 10% cremoforu a 10% ethanolu obsahující konkrétní sloučeninu. Pro taxol se jako ředidlo použije běžný fyziologický roztok a podání je učiněno intravenózně. Pro perorálně podávaný taxan obecného vzorce I se jako ředidlo použije sterilizovaná voda a podání se děje cestou perorální gaváže.

Příklad 4

Preklinické studie používající metronomické dávkování v kombinaci s ustanovenou terapií paklitaxelem

Paklitaxel a perorálně podávaný taxan obecného vzorce I se rozpustí ve směsi cremoforu a ethanolu v poměru 50/50 a poté se zředí vodou (sloučenina obecného vzorce I) nebo fyziologickým roztokem (paklitaxel) přibližně jednu hodinu před použitím. Konečné koncentrace každé složky vehikula je následující: cremofor 10 %; ethanol 10 %; vodná složka 80 %.

Běžná myš C3H se zakoupí od firmy Harlan-Sprague Dawley (Indianapolis, In) a krmí se potravou pro myši a vodou ad libitum.

Metastatický mammární 16/C myší karcinom se na C3H myši propaguje dvakrát za týden. Experimenty se zahájí ·· ···· ·· ···· ·· · • · - · · · · ··· ~_n ······.···» zU ·· ···» ······· • · · · · · · · · · · • · · · · · ·· ·· · subkutánním zavedením trokaru s fragmenty tumoru.

Pro testování tumoru in vivo se C3H myším subkutánně implantují fragmenty mammárního 16/C tumoru.

Všechna léčení se zahájí v 10. den po implantaci nádoru mimo neléčenou kontrolní skupinu. Všechny skupiny obsahují 8 myší. Nádory se měří jednou nebo dvakrát za týden a rozměry se převedou na hmotnosti za použití rovnice hmotnost (miligramy) = a x b² kde a = délka a b = šířka v milimetrech. V rámci každé skupiny myší se stanoví střední čas pro nádory potřebný pro dosažení 1 gramu a stanoví se opoždění ve středním času pro dosažení cílové hmotnosti nádoru 1 gram pro léčené (treated, T) a kontrolní (control, C) skupiny. Tato opoždění v růstu nádoru (T-C hodnota ve dnech) se dále převede na hodnoty „hrubé buněčné destrukce (LCK) za použití vzorce

T-C/(čas potřebný ke zdvojnásobení objemu tumoru, TVDT, kontrolní skupiny) x 3,32.

Hodnota LCK vyšší nebo rovna 1 se považuje za aktivní výsledek. Vyléčení se stanoví na konci každého experimentu a definují se jako absence nádorové masy větší než 35 miligramů. Experimenty se ukončí v čase 10 x TVDT po ukončení všech léčení.

Příklad 5

Fáze I - bezpečnost, farmakokinetická a dávku stanovující studie pro perorálně podávaný taxan obecného vzorce I podaný kontinuálním metronomickým režimem pacientům s maligními nádory v pokročilých fázích

Pro fázi I byla navržena otevřená jednoramenná eskalační studie, ve které statistické skupiny pacientů s pokročilým či metastatickým nádorovým bujením dostávají eskalační dávky perorálně podávaného taxanu obecného vzorce I denně, perorální cestou, ambulantním způsobem, za účelem určení bezpečnosti, dávku limitujících toxicit a optimální bioaktivní dávky perorálně podávaného taxanu obecného vzorce I. Provede se také farmakokinetická a farmakodynamická studie. Studie bude provedena na přibližně 45 až 65 pacientech. Zahajovací dávková hladina perorálního taxanu bude fixní dávka 2 mg podávaná jednou za den nalačno, kontinuálně. Dávky se eskalují následujícím způsobem:

Dávková hladina	Dávka sloučeniny obecného vzorce I	Minimální počet pacientů ve statistické skupině
1	2 mg za den	6
2	4 mg za den	6
3	4 mg/rrč za den	6
4	6 mg/mz za den	6
5	9 mg/ird za den	6
6	12 mg/mz za den	6
7	16 mg/rrč za den	6
8 a vyšší	Zvyšuje se o přírůstek 33 % předchozí dávky	6

Všichni zařazení pacienti budou sledováni alespoň 28 dnů před zahájením podávání další dávkové hladiny.

V průběhu studie mohou být pacienti simultánně zahrnuti do otevřené dávkové hladiny. Eskalace do takové další dávkové hladiny bude umožněna, pokud všech 6 pacientů ve stávající dávkové hladině dokončilo jejich prvý průběh léčení a s podmínkou, že se u méně než 1 pacienta v průběhu prvého běhu vyskytla toxicita omezující dávku.

• · • · · · · · • · · · · • · · · · • · · · · · • · · • · · • · · · • · · · · • · · • · ·

Od všech pacientů budou shromážděny krevní vzorky pro farmakokinetická a farmakodynamická stanovení, stejně tak jako pro ohodnocení náhražkového markéru. Stejně tak budou vyhodnoceny plazmatické markéry endotheliální buněčné aktivace zahrnující markéry sICAM-l, sVCAM-1, sET-l, sE-Selectin a sMCP-1. U pacientů, kteří k tomu podají informovaný souhlas, budou též odebrány krevní a/nebo nádorové vzorky pro farmakogenomiku.

Aby měla studie všechny náležitosti, musí pacienti splňovat všechna kritéria určující, že daným účelům vyhovují, přičemž tato kritéria zahrnují, avšak nejsou omezena na

1) histologicky a cytologicky potvrzenou diagnózu nonhematologické malignity, která při standardní terapii progreduje nebo pro kterou není známa žádná standardní terapie;

2) měřitelná nebo neměřitelná nemoc;

3) adekvátní krevní dřeň, jaterní a ledvinné funkce;

4) čtyři týdny uplynulé od poslední dávky imunoterapie, radioterapie nebo chemoterapie včetně taxanů (6 týdnů pro nitrosomočoviny nebo mitomycin-C);

5) pacienti se musí zregenerovat z toxicit základního či 1 stupně, které byly zapříčiněny předchozími terapiemi; a

6) stav provedení 0 až 1 dle Eastern Cooperative Oncology Group.

Toxicita bude zhodnocena podle National Institute of Cancer's Common Toxicity Criteria Version 2,0.

Plazmatické farmakokinetické vzorky perorálně podávaného taxanů obecného vzorce I budou odebrány od všech pacientů v den 1, 8, 15, 22, 29 a 56 a limitující odebírání vzorků bude získáno každé 4 týdny poté u • · • · · · v 9 9

9 9 9 '9 9 999

999« 9999 9

99 99 99 «9 9 pacientů pokračujících v léčení.

Příklad 6

Syntéza perorálně podávaného taxanu obecného vzorce I 3'-terc-butyl-3'-N-terc-butoxykarbonyl-4-deacetyl-3'-defenyl-3'-N-debenzoyl-4-0-methoxykarbonylpaklitaxelu

Příprava ( + )-cis-4-terc-butyl-l-terc-butoxykarbonyl-3-triethylsilyloxyazetidin-2-onu

20,3 ml (1,25 ekvivalentu) trimethylacetaldehydu se při teplotě místnosti přidá do míchané suspenze 18,4 g (0,150 mol) para-anizidinu a 150 g bezvodého Na₂SO₄ v 250 ml bezvodého dichlormethanu. Po 2 hodinách se reakční směs přefiltruje a pevná látka se promyje dalším bezvodým dichlormethanem. Rozpouštědlo se odpaří z filtrátu, krystalický odparek se rozpustí v 750 ml bezvodého dichlormethanu a umístí se do atmosféry dusíku. Přidá se 48 ml (2,3 ekvivalentů) triethylaminu a reakční směs se ochladí na teplotu -78 °C. Poté se po kapkách přidá 27,2 ml (1,15 ekvivalentu) benzyloxyacetylchloridu a reakční směs se potom nechá ohřát na teplotu místnosti.

Po 24 hodinách se směs dvakrát promyje 0,5M HC1, nasyceným vodným roztokem NaHCCb, vodným roztokem chloridu sodného a vysuší se Na₂SO₄. Rozpouštědlo se odpaří a odparek se chromatografuje na sloupci silikagelu (gradientově eluování 20% dichlormethanem v hexanu obsahujícím 0 až 20 % EtOAc), čímž se dostane (±)-cis-4terc-butyl-3-benzyloxy-l-p-methoxybenzylazetidinon j ako krystalická pevná látka o hmotnosti 46,9 g (92%).

• · ·· ·· · · ·· »

NMR (CDC1₃) 1,09 (s, 9H), 3,81 (s, 3H) , 4,15 (d, 1H, J = 5,5 Hz), 4,77 (d, 1H, J = 11,9 Hz), 4,81 (d, 1H, J =

5,5 Hz), 5,03 (d, 1H, J = 11,9 Hz), 6,87 až 7,43 (m, 9H) ;

LRMS (ESI) 340 ([Μ + H])⁺.

Roztok 60,4 g (3,6 ekvivalentů) dusičnanu amonnoceričitého v 900 ml vody se v průběhu 1 hodiny přidá do dobře míchaného roztoku 10,38 g (30,6 mmol) azetidinonu v 600 ml acetonitrilu v ledové lázni. Reakční směs se potom dvakrát extrahuje EtOAc a spojené organické extrakty se dvakrát promyj i nasyceným vodným roztokem NaHCC>3, 20% vodným roztoken NaHSO₃, nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ a vodným roztokem chloridu sodného. Po vysušení Na₂SO₄ se rozpouštědla odpaří a odparek se chromatografuje na sloupci ze silikagelu (za gradientového eluování podíly hexanu obsahujícími 10 až 40 % EtOAc), čímž se dostane 5,64 g lehce nečistého (±)-cis-3-benzyloxy-4-terc-butylazetidin-2-onu.

XH NMR	(CDCI3) 1,04	(s, 9H), 3,51	(d, 1H, J = 5,2 Hz),
4,71 (	m, 2H), 4,96	(d, 1H,	J = 11	,9 Hz), 6,10 (široký s,
1H), 7	, 35 (m, 5H) .

Suspenze 5,54 g (23,8 mmol) této látky a 2,5 g 10% palladia na aktivním uhlí ve 100 ml absolutního EtOH se hydrogenuje při tlaku 233,58 kPa H₂ v Parrově přístroji po dobu 23 hodin. Přidají se další 2 g palladiového katalyzátoru a v hydrogenaci se pokračuje po dobu dalších 17 hodin při tlaku 343,5 kPa H₂. Katalyzátor se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odpaří z filtrátu, čímž se dostane surový (±)-cis-3-hydroxy-4-terc-butylazetidin-2-on.

^XH NMR (CDCI3 + 1 kapka D₂0) 1,05 (s, 9H), 3,48 (d, 1H, J ·· = 5,0 Hz), 4,98 (d, 1H, J = 5,0 Hz).

Tato látka se rozpustí ve 40 ml suchého Ν,Ν-dimethylformamidu a přidá se 3,24 g (2 ekvivalenty) imidazolu a 4,0 ml (1 ekvivalent) triethylsilylchloridu. Po 10 minutách se reakční směs rozdělí mezi vodu a směs EtOAc a hexanu v poměru 1:1. Organická fáze se dvakrát promyje vodou, vodným roztokem chloridu sodného a potom se vysuší Na2SO4. Rozpouštědla se odpaří a odparek se chromatografuje na sloupci ze silikagelu (gradientově eluování 20 a 25% EtOAc v hexanu), čímž se dostane 3,86 g (+)-cis-3-4-terc-butyl-3-triethylsilyloxyazetidin-2-onu.

^XH NMR (CDC1₃) 0,70 (m, 6H) , 0,98 (m, 18H) , 3,39 (d, 1H, J = 5,0 Hz), 4,88 (dvojitý d, 1H, J = 2,1, 5,0 Hz), 6,08 (široký s, 1H).

Roztok 2,04 g (7,92 mmol) tohoto azetidinonu,

1,66 ml (1,2 ekvivalentu) diisopropylethylaminu, 1,90 g (1,1 ekvivalentu) di-terc-butyldikarbonátu a 194 mg (0,2 ekvivalentu) para-dimethylaminopyridinu ve 24 ml suchého dichlormethanu se míchá při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Reakční směs se zředí dichlormethanem, promyje vodným roztokem chloridu sodného a vysuší se Na2SO₄. Odstraněním rozpouštědla a následnou chromatogra-fií na sloupci ze silikagelu (gradientově eluování 0 až 20% EtOAc v hexanu) se dostane 2,71 g (96%) sloučeniny pojmenované v nadpisu jako olej.

^XH NMR (CDC1₃) 0,70 (m, 6H) , 1,00 (m, 9H) , 1,09 (s, 9H> , 1,53 (s, 9H), 3,90 (d, 1H, J = 6,5 Hz), 4,93 (d, 1H, J = 6,5 Hz) .

Příprava derivátu bakcatinu A • · · «

♦ · · ··

MeOCi-PrbSiO

MeO(i-Pij₂SiO'

OSi(i-Pij₂OMe

K roztoku 47,4 g (87 mmol) 10-desacetylbakcatinu v

500 ml bezvodého dimethylformamidu (DMF) se při teplotě místnosti přidá 47 g (691 mmol) imidazolu. Roztok se míchá po dobu 10 až 15 minut, až je roztok čirý. Po kapkách se do reakční směsí přidá 58 ml (322 mmol) diisopropyldichlorsilanu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 16 hodin. Do roztoku se přidá dalších 6 ml diisopropyldichlorsilanu a reakční směs se míchá po dobu 60 minut. HPLC v tomto okamžiku indikuje ukončení reakce. K reakční směsi se přidá 36 ml methanolu a roztok se míchá po dobu 60 minut. Reakce se přeruší a reakční směs se zředí směsí 500 ml terc-butyl(methyl)ketonu (TBME) a 200 ml vody. Vrstvy se oddělí, organická fáze se promyje 250 ml roztoku chloridu sodného, vysuší se síranem sodným a odpaří se, čímž se dostane trisilylovaný derivát bakcatinu A v množství 91 g (výtěžek > 100 %) jako bílá amorfní sloučenina, která se použije v dalším kroku bez dalšího čištění.

LRMS (ESI) M⁺:

vypočítáno pro C50H84O13SÍ3: 977, nalezeno: 977.

Příprava derivátu bakcatinu B

AcO • · · · • · · » ' · · ··· *·» · · · «··· • · · · * · · · · ·····

K roztoku 90 g (92 mmol) derivátu bakcatinu A v 500 ml DMF se při teplotě 0 °C přidá 22 g (320 mmol) imidazolu. Do reakční směsi se po kapkách při teplotě 0 °C přidá 35 ml (320 mmol) dimethylchlorsilanu. V tomto okamžiku se pozoruje srážení sloučeniny. Reakční směs (suspenze) se míchá při teplotě 0 °C po dobu 0,5 hodiny. Pevná látka se odfiltruje a promyje se třikrát 150 ml studeného DMF. Po vysušení na vzduchu se pevná látka znovu rozpustí v 700 ml TBME a roztok se promyje třikrát 200 ml vody, 250 ml roztoku chloridu sodného a vysuší se síranem sodným. Roztok se přefiltruje přes tenkou silikagelovou vložku. Odpařením rozpouštědla ve vakuu se dostane derivát bakcatinu B o hmotnosti 70 g (výtěžek 77%) .

LRMS (ESI) M⁺:

vypočítáno pro C50H90O13SÍ4: 1035, nalezeno: 1035.

Příprava derivátu bakcatinu C

Me₂HSiO

MeO(i-Pr)₂SiO q

MeO(i-Pr)₂SiO'

^Bz°HO °

OSi(i-Pr)₂OMe

K míchanému roztoku 66,3 g (64 mmol) derivátu bakcatinu B v 680 ml toluenu se při teplotě -34 °C po kapkách v průběhu 10 minut přidá 50 ml (160 mmol) látky Red-Al® (hmotnostně 65% roztok natrium-bis(2-methoxyethoxy)aluminiumhydridu v toluenu). Reakční směs se ohřeje na teplotu -25 °C a míchá se po dobu 1,5 hodiny.

Do reakční směsi se po kapkách se přidá 62 ml methanolu, přičemž vnitřní teplota se udržuje v rozmezí -20 až -25 °C. Roztok se zředí 500 ml TBME a potom se přidá 60 ml IN ·· · • · · · · · ···· • · · · · · ··· ····« • · · · ···· · · · ·♦ · · · φ · · · · * roztoku hydroxidu sodného a 60 ml vodného roztoku chloridu sodného. Roztok se míchá po dobu 30 minut. Do reakční směsi se přidá se 12 g rozsivkové zeminy, míchá se po dobu 10 minut a přefiltruje se přes vložku z rozsivkové zeminy. Vrstvy se oddělí. Organická vrstva se promyje vodou, vodným roztokem chloridu sodného a vysuší se síranem sodným. Potom se roztok nechá projít skrz tenkou vložku z rozsivkové zeminy a rozpouštědlo se odpaří. Tak se dostane derivát bakcatinu C v množství 62 g (výtěžek 97%) jako pevná látka bílé barvy.

LRMS (ESI) M⁺:

vypočítáno pro C50H88O12SÍ4: 993, nalezeno: 993.

Příprava derivátu bakcatinu D

K roztoku 62 g (62 mmol) derivátu bakcatinu C v 600 ml bezvodého tetrahydrofuranu (THF) se pod argonovou atmosférou při teplotě -60 °C po kapkách přidá 125 ml (125 mmol) ÍM roztoku lithium-bis (trimethylsilyl) amidu, v THF. Roztok se míchá po dobu 15 minut, potom se přidá 9 ml (116 mmol) methyl-chlorformiátu, přičemž vnitřní teplota roztoku se udržuje na hodnotě -60 °C. Reakční směs se pomalu ohřeje na teplotu 0 °C a směs se míchá po dobu 3 hodin. Po ukončení reakce se přidá 300 ml nasyceného chloridu amonného. Reakční směs se extrahuje 100 ml TBME. Organická vrstva se promyje 200 ml nasyceného chloridu amonného, 200 ml vody, 200 ml vodného roztoku chloridu sodného, vysuší se síranem sodným a • · 9 · 9 9 · · · • · · · · · · · · · • 9 · · · · * · · · ···· ··« · · ·» · · · · · · 9 9 9· 9 9 9 odpaří se, čímž se dostane derivát bakcatinu D o hmotnosti 67 g (výtěžek > 100%) jako olej. Surový materiál se použije v příštím kroku bez dalšího čištění.

LRMS (ESI) M⁺:

vypočítáno pro C52H90O14SÍ4: 1051, nalezeno: 1051.

Příprava derivátu bakcatinu E

K roztoku 62 g (59 mmol) derivátu bakcatinu D ve 260 ml suchého THF se při teplotě místnosti přidá 56 mi (344 mmol) komplexu kyseliny fluorovodíkové a triethylaminu. Reakční směs se míchá po dobu 3 hodin. Reakční směs se zředí 350 ml ethyl-acetátu a promyje se 200 ml vody, 200 ml vodného roztoku chloridu sodného, vysuší se síranem sodným a odpaří se, čímž se dostane derivát bakcatinu E v množství 43 g (výtěžek surového materiálu > 100%) . Opětovným suspendováním surové sloučeniny ve 350 ml horkého ethyl-acetátu a 50 ml hexanů se dostane čistý derivát bakcatinu E ve výtěžku 90%.

LRMS (ESI) M⁺:

vypočítáno pro C29H36O11: 560, nalezeno: 560.

Příprava derivátu bakcatinu F

K míchanému roztoku 32 g (57 mmol) derivátu bakcatinu E a 11,7 g (172 mmol) imidazolu ve 220 ml DMF se při teplotě -65 °C pod argonem přidá 26,8 ml diisopropyldichlorsilanu. Teplota reakční směsi se udržuje na hodnotě -60 °C a směs se míchá po dobu 2 hodin. Po ukončení reakce podle HPLC se přidá roztok 11,7 g imidazolu v 35 ml methanolu a vzniklý roztok se míchá při teplotě 0 °C po dobu 30 minut. Reakční směs se extrahuje 500 ml TBME. Organická vrstva se promyje čtyřikrát 150 ml vody, vysuší se síranem sodným a odpaří se, čímž se dostane surový derivát bakcatinu F v množství 45 g. Surový materiál se dále rozpustí ve 150 ml acetonitrilu a roztok se promyje třikrát 100 ml hexanů. Odpařením acetonitrilu se dostane čistý derivát bakcatinu F o hmotnosti 34 g (výtěžek 84%).

LRMS (ESI) M⁺:

vypočítáno pro C36H52O12SÍ: 704, nalezeno: 704.

Příprava 4-deacetyl-7-[bis-isopropyl(methoxy)]silyloxy-4— methoxykarbonyl-bakcatinu

K roztoku 33,2 g (47 mmol) derivátu bakcatinu F ve ·· ···· ·· ···· ·· · • ft · · · · ftftft

200 ml DMF se při teplotě -43 °C po kapkách přidá 61,2 ml (61,2 mmol) 1M roztoku lithium-bis(trimethylsilyl)amidu v

THF. Reakční směs se míchá po dobu 15 minut a potom se přidá 5,8 ml (63 mmol) acetanhydridu. Reakční směs se míchá při teplotě -40 °C po dobu 30 minut. Přidá se 3,6 ml kyseliny octové a chladící lázeň se odstraní. Reakční směs se extrahuje 300 ml TBME. Organická vrstva se oddělí a promyje se třikrát 150 ml vody, 150 ml vodného roztoku chloridu sodného, vysuší se síranem sodným a odpaří se, čímž se dostane surový produkt. Čištění tohoto surového produktu se provede krystalizací ze směsi THF a heptanu v poměru 1:6. Čištěním 40 g surového produktu se dostane 21 g krystalické sloučeniny pojmenované v nadpisu (výtěžek 60%).

LRMS (ESI) M⁺ :

vypočítáno pro C38H54O13SÍ: 746, nalezeno: 746.

Příprava 3'-terc-butyl-3'-N-terc-butoxykarbonyl-4-deacetyl-3'-defenyl-3'-N-debenzoyl-4-O-methoxykarbonyl-paklitaxelu (perorálně podávaný taxan obecného vzorce I)

Roztok 2,71 g (5 ekvivalentů) (+)-cis-4-terc-butyl-1-terc-butoxykarbonyl-3-triethylsilyloxyazetidin-2-onu a 1,13 g (1,52 mmol) 4-deacetyl-7-[bis-isopropyl(methoxy)]silyloxy-4-methoxykarbonyl-bakcatinu ve 100 ml suchého THF se pod atmosférou dusíku ochladí na teplotu • fc fcfcfcfc

• fcfc • fc··

-50 °C a přidá se 1,97 ml (1,3 ekvivalentu) l,0M roztoku lithium(bis(trimethylsilyl)amidu. Po 5 minutách se reakční směs přenese do lázně, jejíž teplota se udržuje v rozmezí -35 až -30 °C, kde se nechá po dobu 20 hodin, a poté se teplota udržuje na -25 °C po dobu 24 hodin. Reakce se poté přeruší přidáním nasyceného vodného roztoku NH₄C1 a extrahuje se směsí EtOAc a hexanu v poměru 1:1. Organické extrakty se promyjí vodným roztokem chloridu sodného a vysuší se Na₂SO₄. Rozpouštědla se odpaří a odparek se chromatografuje (radiální chromatografie na 6 mm silné plotně ze silikagelu; gradientově eluování 5 až 20% EtOAc v hexanu), čímž se dostane 1,55 g 3'-terc-butyl-3'-N-terc-butoxykarbonyl-7-[bis-isopropyl(methoxy)]silyloxy-4-deacetyl-3'-defenyl-3'-N-debenzoyl-4-0-methoxykarbonyl-2'-triethylsilyloxypaklitaxelu jako směs 2'3'-diastereomerů. Tato směs se rozpustí v 60 ml suchého THF a přidá se 0,92 ml (4 ekvivalenty) triethylamin-trihydrofluoridu. Po 22 hodinách při teplotě místnosti se reakční směs neutralizuje nasyceným vodným roztokem NaHC0₃ a potom se extrahuje EtOAc. Organické extrakty se promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší se Na₂SO₄ a rozpouštědla se odpaří. Odparek se chromatografuje (radiální chromatografie na 2 mm silné plotně ze silikagelu; gradientově eluování 10 až 50% EtOAc v hexanu), čímž se dostane (v pořadí podle vymývání) 210 mg (18%) 2'S,3'R3'-terc-butyl-3'-N-terc-butoxykarbonyl-4-deacetyl-3'-defenyl-3'-N-debenzoyl-4-O-methoxykarbonylpaklitaxelu:

H NMR (CDCI3)	1,04 (s, 9H), 1,13	(s,	3H) ,	1,20 (s, 3H) ,
1,37 (s, 9H),	1,65 (s, 1H), 1,66	(s,	3H) ,	1,84 až 1,93
(m, 2H), 2,17	(s, 3H), 2,25 (s, 3H),	2,55	(m, 3H) , 3,00
(d, 1H, J = 6,	5 Hz), 3,74 (d, 1H,	J	= 10,8	Hz), 3,79 (d

1H, J = 6,9 Hz), 3,92 (s, 3H) , 4,16 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 4,33 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 4,42 (m, 1H), 4,54 (d, 1H, J =

4444

4 44 4 4

4

4 4 44 4 444

4 44 4 4444

JJ 4444444··· 444 « ·· 4 · 44 4 · 4 4

44 44 44 44 4

6,5	Hz), 4,87	(d, 1H, J =	10,6 Hz), 5,01 (d, 1H	, J = 7,7
Hz) ,	5, 68 (d,	1H, J = 7,0	Hz), 5,76 (m, 1H), 6,	32 (s,
1H) ,	7,44 až 8	, 05 (m, 5H) ;
LRMS	(ESI) 846	([M + H])+;
a 66	8 mg (56%)	sloučeniny	pojmenované v nadpisu
1H NMR (CDC13)	1,07 (s, 9H)	, 1,14 (s, 3H), 1,24	(s, 3H>,
1,33	(s, 9H),	1,66 (s, 4H)	, 2,23 (s, 3H), 2,38	až 2,59
(m,	4H), 3,11	(d, 1H, J =	5,8 Hz), 3,77 (d, 1H,	J = 11,1
Hz) ,	3,82 (d,	1H, J = 7,0	Hz) , 3,96 (s, 3H) , 4,	20 (d, 1H,
J =	8,6 Hz), 4	,33 (d, 1H,	J = 8,6 Hz), 4,39 (m,	1H), 4,53
(d,	1H, J = 5,	4 Hz), 4,88	(d, 1H, J = 10,6 Hz),	4,98 (d,
1H,	J = 7,9 Hz	), 5,69 (d,	1H, J = 7,1 Hz), 6,03	(m, 1H),
6,28	(s, 1H),	7,40 až 8,11	(m, 5H);

LRMS (ESI) 846 ( [Μ + H] )⁺.

Claims (8)

1. Metronomický dávkovači režim taxanů, vyznačující se tím, že zahrnuje podání taxanů v dávce nižší, než je ustanovená maximální tolerovatelná dávka tohoto taxanů, a která při opakovaném podání inhibuje růst nádoru a produkuje méně toxických vedlejších účinků než podání maximální tolerovatelné dávky tohoto taxanů.

2. Metronomický dávkovači režim podle nároku 1, vyznačující se tím, že taxan je perorálně biologicky dostupný.

3. Metronomický dávkovači režim podle nároku 2, vyznačující se tím, že taxanem je perorálně podávaný taxan obecného vzorce I.

4. Způsob inhibice růstu nádorových buněk, v yznačující se tím, že zahrnuje vystavení nádorových buněk taxanů metronomickým dávkovacím režimem.

5. Způsob inhibice nádorového růstu u živočicha, vyznačující se tím, že se tomuto živočichovi podává taxan metronomickým dávkovacím režimem.

6. Způsob inhibice nádorového růstu u živočicha, vyznačující se tím, že se tomuto živočichovi podává ustanovená protinádorová terapie cestou standardního maximálního tolerovatelného dávkového režimu v kombinaci s taxanem podaným metronomickým dávkovacím režimem.

7. Způsob podle nároků 4, 5 nebo 6, vyznačující se tím, že taxan je perorálně biologicky

99 ···· ·· ··♦·

99 9

9 9 · 9

9 9 9 9 9

9 9 · 9 1999

9 9 9 9 dostupný.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačuj ící se t í m, že taxanem je perorálně podávaný taxan obecného vzorce I.