CZ20031301A3 - Izolovaná nukleová kyselina, polypeptid, expresní vektor a protilátka - Google Patents

Description

Dosavadní stav techniky

Proteázy a peptidázy jsou enzymy, které katalyzují hydrolýzu peptidových amidových vazeb. Proteázy mají důležitou úlohu při regulaci biologických procesů u téměř všech živých forem od bakterií přes viry až k savcům. Provádějí kritické funkce např. při trávení, srážení krve, apoptóze, aktivaci imunitních odpovědí, aktivaci zymogenů, zrání virů, sekreci proteinů a přemisťování proteinů. Mohou být klasifikovány podle řady kritérií, jako je místo působení, přednostní substrát a mechanismus účinku. Tak např. aminopeptidázy přednostně působí na N-koncové zbytky peptidu, zatímco karboxypeptidázy působí přednostně na C-konci a endopeptidázy působí na místech vzdálených od těchto dvou konců. Mezi karboxy- a aminopeptidázami štěpí peptidylpeptidázy jednotlivé aminokyselinové zbytky ze substrátu, dipeptidylpeptidázy štěpí dipeptidové jednotky (dvě aminokyseliny) ze substrátu a tripeptidázy odštěpují tři aminokyseliny ze substrátu. Substrátová preference se často vyjadřuje prostřednictvím aminokyselinového zbytku bezprostředně N-koncového vzhledem k místu štěpení. Například pepsidázy podobné trypsinu budou přednostně štěpit peptid vedle bazické aminokyseliny (arginin nebo lysin), kde hydrolyzovanou vazbou je vazba Arg/Lys-Xaa. Jako další příklad hydrolyzuje skupina peptidáz chymotrypsinového typu přednostně peptidy v blízkosti aromatického zbytku. Z hlediska mechanismu působení se peptidázy klasifikují jako serin-dependentní, cystein-dependentní, aspartát-dependentní nebo zinek-dependentní.

Protože peptidázy a proteázy se účastní při řízení mnoha fyziologických procesů, jsou přitažlivými cíli pro vývoj léčiv. Inhibitory proteáz a peptidáz se například používají při léčbě zvýšeného krevního tlaku, poruch koagulace a virových infekcí.

Proteolytické enzymy, které využívají při své katalytické aktivitě serin, jsou všudypřítomné, přičemž se nacházejí u virů, bakterií i eukaryot. Dosud bylo identifikováno před dvacet skupin (označovaných S1-S27) serinových proteáz; tyto proteázy se zařazují do šesti větví (SA, SB, SC, SE, SF a SG) na základě strukturní podobnosti nebo jiných funkčních znaků. Struktury jsou známy pro čtyři z těchto věví (SA, SB, SC a SE); zdá se, že jsou zcela nepříbuzné, což naznačuje, že existují alespoň čtyři evoluční počátky serinových peptidáz, a možná ještě více, viz Rawlings a Barrett, Meth. Enzymol. 244; 19 - 61 (1994).

Prolyloligopeptidázová skupina se skládá z řady evolučně příbuzných peptidáz, jejichž'katalytická aktivita patrně pochází ze systému přenosu nábojů (charge relay systém) podobného systému serinových proteáz trypsinové skupiny, ale který se patrně vyvinul nezávislou konvergentní evolucí. Experimentálně bylo ukázáno (v proteáze II E. coli stejně jako v prasečích a bakteriálních PE), že pro katalytický mechanismus je nezbytný konzervovaný serinový zbytek. Tento serin, který je součástí katalytické triády (Ser, His, Asp) je obecně umístěn ve vzdálenosti přibližně 150 zbytků od C-konce těchto enzymů (všechny patří mezi proteiny obsahující přibližně 700 až 800 aminokyselin). Jednou z nejintenzivněji studovaných prolyloligopeptidáz je dipeptidylpeptidáza IV (DPPIV, EC 3,414,5), což je glykoprotein II, přičemž tato peptidáza je jedinou dobře charakterizovanou dipeptidylaminopeptidázou, o které je známo, že je umístěna na vnější straně plasmatických membrán. Jak je uvedeno výše, dipeptidylaminopeptidázy jsou charakterizovány svou schopností odštěpovat N-koncové dipeptidy z různých malých peptidů. Dipeptidylaminopeptidázy vykazují různé substrátové specificity a buněčné lokalizace, což naznačuje různé funkce každé aktivity při zpracování (processingu) peptidů. DPPIV je charakterizována svou schopností odštěpovat N-koncové dipeptidy obsahující jako předposlední zbytek prolin nebo alanin. Gen pro DPPIV má velikost přibližně 70 kb a obsahuje 26 exonů o velikosti od 45 bp do 1,4 kb. Nukleotidová sekvence (3465 bp) cDNA obsahuje otevřený čtecí rámec kódující polypeptid obsahující 766 aminokyselin. Nukleotidy kódující sekvenci aktivního místa (G-W-S-Y-G) jsou rozštěpeny mezi 2 exony. To jasně rozlišuje genomickou organizaci prolyloligopeptidázové skupiny od skupiny klasických serinových proteáz.

DPPIV je v savčích tkáních velmi rozšířena a nalézá se ve velkém množství v ledvinách, střevním epitelu a placentě (Yaron, A. a Naider, F., Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol. 1993 [1], 31). V lidském imunitním systému je tento enzym exprimován téměř výlučně aktivovanými T-lymfocyty typu CD4⁺, přičemž bylo ukázáno, že tento enzym je synonymní s antigenem buněčného povrchu CD26.

I když přesná úloha DP-IV ve fyziologii člověka není dosud zcela jasná, nedávné výzkumy ukázaly, že tento enzym má zcela určitě hlavní úlohu ve fyziologii a patologické fyziologii člověka.

Na lidských T-buňkách se exprese DPPIV objevuje v pozdní fázi diferenciace ve thymu a je přednostně omezena na populaci CD4⁺ helperových/paměťových buněk, přičemž CD26 může působit kostimulačně na aktivační signál T-buněk. DPPIV, která je také známa jako aktivační antigen T-buněk CD26, proto má důležitou úlohu při • · · • · ···· ·» ··

- 4 imunitní odpovědi prostřednictvím asociace s CD45 tyrosinfosfatázou a prostřednictvím schopnosti vázat adenosindeaminázu (ADA) na povrch T-buněk chrání T-buňky před inhibicí proliferace způsobenou adenosinem. Navíc se zdá, že regulace funkce chemokinů prostřednictvím CD26/DPP1V je nezbytná pro přesun lymfocytů a infekčnost kmenů HIV. DPPIV byla spojována s řadou funkcí včetně účasti při aktivaci T-buněk, adheze buněk, štěpení peptidů obsahujících prolin v ledvinách a střevech, infekce HIV a apoptózy, a řízení tumorogenicity u některých melanomových buněk, viz Pethiyagoda a další, Clin. Exp. Metastasis 2000; 18(5): 391 - 400. Předpokládá se, že DPPIV se účastní endokrinní regulace a metabolické fyziologie. DPPIV odštěpuje zvláště aminokoncový dipeptid His-Ala GLP-1, za vytvoření antagonisty receptorů GLP-1, čímž zkracuje fyziologickou odpověď na GLP-1. Peptid-1 podobný glukagonu (glucagon-like peptide-1, GLP-1) indukuje sekreci inzulínu závislou na glukóze a je rychle degradován působením DPPIV, a protože poločas štěpení DPPIV je mnohem kratší než poločas odstraňování GLP-1 z krevního oběhu, předpokládá se, že inhibicí DPP-IV se dosáhne významného zvýšení biologické aktivity GLP-1 (5 až 10tinásobné zvýšení). Inhibitory DPP-IV se v současnosti klinicky studují jako možná léčiva pro diabetes typu II a nesprávnou toleranci glukózy.

V roce 1993 byly známy různé inhibitory DPPIV. Jeden z nich je sebezničující inhibitor N-Ala-Pro-O-(nitrobenzoyl-)hydroxylamin. Další je kompetitivní inhibitor e-(4-nitro)benzoxykarbonyl-Lys-Pro a další je polyklonální králičí ímmunoglobulin proti vepřovému ledvinovému DPPIV. Od té doby byly vyvinuty další inhibitory, které se podrobně popisují v US patentech No. 5,939,560, 6,110,949m, 6,011,155 a 5,462,928.

Navíc, ale nezávisle na své katalytické aktivitě serinového typu se DPPIV těsně váže na rozpustný extracelulární enzym adenosindeaminázu (ADA), který působí jako receptor a předpokládá • · · · • ·

- 5 se, že zprostředkuje přenos signálů. Struktura DPPIV je charakterizována dvěma extracelulárními doménami a hydrolázovou doménou v uspořádání α/β a doménou nazývanou 7-blade betapropeller složenou z opakujících se beta listů o velikosti přibližně 50 aminokyselin. Nedávno bylo ukázáno, že kromě volby substrátů podle velikosti přispívá doména beta-propelleru obsahující 10 z 12 vysoce konzervovaných cysteinových zbytků ke katalýze peptidové domény. Navíc je doména bohatá na cystein odpovědná za vazbu DPPIV na kolagen I a na extracelulární ADA. Uvádí se také, že DPPIV má úlohu při interakcích buněk s extracelulární matricí zprostředkovaných fibronectinem. Nedávné studie ukazují, že proteázová aktivita DPPIV není nutná pro její antiinvazivní aktivitu, protože mutanty DPPIV, které postrádají aktivitu extracelulární serinové proteázy, si antiinvazivní aktivitu zachovávají.

V literatuře byla popsána řada proteinů, které mají určitou podobnost s DPPIV. Několik těchto proteinů již bylo klonováno, včetně DPP-I, DPP-II, DPP-III, DPP-X a protein aktivace fibroblastů (FAP). Tyto proteiny byly identifikovány a charakterizovány buď molekuiárním klonováním a studiem funkce exprimovaných proteinů, nebo biochemickými aktivitami ve tkáňových extraktech. DPPIV-beta a jiné nové peptidázy s funkční podobností k DPPIV dosud klonovány nebyly. Identifikace, charakterizace a/nebo příslušná klasifikace dalších členů skupiny prolyloligopeptidáz, objasnění jejich fyziologické (a zvláště patofyziologické) úlohy a použití těchto znalostí pro vyvinutí nových léčiv, jsou významnou výzvou pro další výzkum.

Podstata vynálezugh

Předkládaný vynález poskytuje proteiny s prolyloligopeptidázovými (postprolinové štěpení) aktivity, které tvoří tři nové členy skupiny proteinů příbuzných s DPPIV, včetně úplných proteinů, • · • · · · alternativních sestřihaných forem (splice forms), podjednotek a mutantů, stejně jako nukleotidové sekvence kódující tyto molekuly. Předkládaný vynález také poskytuje způsoby screeningu substrátů, interakce proteinů, agonistů, antagonistů nebo inhibitorů výše uvedených proteinů a dále farmaceutické prostředky obsahující tyto proteiny a/nebo mutanty, jejich deriváty a/nebo analogy a/nebo jejich ligandy.

Tyto nové proteiny mají významnou sekvenční homologii s DPPIV a označují se jako dipeptidyl p_eptidase IV-related p_rotein-1, 2 a 3 (DPRP-1, DPRP-2 a DPRP-3). Aminokyselinové sekvence proteinů DPRP-1, DPRP-2 a DPRP-3 se uvádějí jako SEQ. ID NO: 1, 3 a 5. Dále se popisují sekvence nukleových kyselin kódujících tyto proteiny (SEQ. ID NO: 2, 4 a 6). Tabulka 1 ilustruje homologii (tj. podobnost) mezi novými proteiny DPRP-1, DPRP-2 a DPRP-3 a jinými známými serinovými proteázami.

• ·

Tabulka 1

Porovnání sekvencí tří nových proteinů s DPPIV a jinými členy větve

SC, skupiny S9 a podskupiny B

Skupina proteáz	Název proteázy	Počet amino- kyselin	Homologie s DPPIV	Oblast TM	Triáda Ser-Asp- His	Umístění genu	Optimální pH
Větev CA, Skupina C1	DPPI	463	N	N	N	11q14,1 - q14,3	-
	DPPII	500	N	Y	N	-	4,5 - 6,0
Větev SC,	QPP	492	N	N	N	-	4,5 - 7,5
Skupina S28	PCP	496	N	N	N	-	-
Nezařazeno	DPPIII	737	N	N	N	-	-
	DPPIV	766	100	Y	Y	2q24,3	7,5 - 8,0
	DPPVI	865	52	Y	Mutace	7	-
	FAP	760	70	Y	Y	2q23	7,5 - 8,0
Větev SC,	DPRP-1	882	41	N	Y	15q22,1 - 15q22,2	7,5 - 8,0
Skupina S9,	DPRP-2	864	39	N	Y	19p13,3	7,5 - 8,0
Podskupina B	DPRP-3	796	54	Y	Mutace	2q12,3 - 2q14,1	-

N = ne, Y = ano

Nejvyšší homologii mezi DPRP-1, DPRP-2 a DPPIV je možno vidět v C-koncových sekvencích. Na základě sekvenční homologie s DPPIV (viz obr. 1) by bylo možno předpokládat, že by proteiny DPRP mohly mít funkce zahrnující bez omezení funkce enzymů. Tato hypotéza byla potvrzena klonováním, expresí a biochemickou a molekulární charakterizací.

Vlastnosti exprese proteinů DPRP a lokalizace do specifických epiteliálních buněk a plasmatických buněk (Leydigovy buňky, epiteliální buňky prostaty, lymfocyty, B-buňky) je v souladu s úlohou při diferenciaci, proliferací a zánětu. Lokalizace genu DPRP-1 při • · rakovinách citlivých na hormony (mléčná žláza, prostata, varlata), tkáních regulovaných testosteronem a zvýšené expresi u málo diferenciovaných rakovin ukazuje, že molekuly aktivující nebo inhibující DPRP budou mít četné léčebné aplikace při léčení onemocnění charakterizovaných špatnou regulací růstu, diferenciace a syntézy a degradace steroidních nebo polypeptidových hormonů. Zde popisované údaje podporují hypotézu, že DPRP-1 a DPRP-2 se účastní při regulaci nebo proliferaci v modelech rakoviny prostaty a varlat in vitro dobře známých odborníkům v oboru.

Zde popisované aktivity DPRP-1 a DPRP-2 a jejich vlastnosti z hlediska exprese, jsou kompatibilní s jejich úlohami ve funkci fyziologických regulátorů imunitního a neuroendokrinního systému prostřednictvím enzymatické modifikace biochemických mediátorů jako jsou peptidy a chemokiny. Početné funkce dříve popsané pro DPPIV založené na použití inhibitorů mohou být způsobeny z části jejím působením a působením podobných proteinů jako jsou DPRP. Proto se považuje odhalení selektivních a účinných inhibitorů DPPIV, DPRP a jiných příbuzných proteáz jako FAP za klíčové pro dosažení účinného a bezpečného farmaceutického použití těchto sloučenin a jakýchkoli nově identifikovaných inhibitorů serinových proteáz stejně jako jiných aktivních sloučenin, které modifikují funkce těchto proteinů.

Předkládaný vynález - .tedy poskytuje nové proteiny nebo polypeptidy, nukleové kyseliny kódující tyto látky, buňky, které byly modifikovány takovou nukleovou kyselinou pro expresi těchto proteinů, protilátky proti těmto proteinům a způsob screeningu pro odhalování nových léčiv s inhibičními účinky na aktivitu těchto proteinů (nebo které jsou inhibitory DPPIV a nikoli těchto proteinů) a terapeutické prostředky odhalené těmito metodami screeningu. Nové proteiny a nukleové kyseliny kódující tyto látky se mohou používat pro odhalování nových léčiv pro léčení některých onemocnění, jako jsou například reprodukční, zánětlivé a metabolické poruchy, a také při přípravě protilátek s terapeutickou nebo diagnostickou hodnotou.

• · · · ··· · · · · · · · ······ ·· · ·· ··

- 9 Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytují nové, zralé biologicky aktivní proteiny, hlavně lidského původu. Tyto proteiny mohou být izolovány v malých množstvích z tkáně vhodného savce (včetně člověka) nebo z biologických kapalin standardními technikami; větší množství se však pohodlněji připravují v kulturách buněk geneticky modifikovaných pro expresi proteinu.

Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytují izolované molekuly nukleových kyselin kódující polypeptidy podle předkládaného vynálezu včetně kyselin mRNA, DNA, cDNA, genomových DNA.

Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se také poskytují sondy založené na nukleových kyselinách obsahující molekuly nukleových kyselin s dostatečnou délkou pro specifickou hybridizaci k sekvenci nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu.

Podle ještě dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytují způsoby využití rekombinantních technik pro přípravu těchto polypeptidů použitelných pro vědecký výzkum in vitro, např. syntéza DNA a příprava vektorů DNA. Způsoby přípravy těchto polypeptidů zahrnují kultivaci rekombinantních prokaryotních a/nebo eukaryotních hostitelských buněk, které byly transfekovány vektory DNA obsahujícími sekvenci nukleové kyseliny kódující takový protein a/nebo zralý protein za podmínek podpory exprese takového proteinu a následnou izolaci takového proteinu nebo fragmentu exprimovaného produktu.

Podle ještě dalšího provedení poskytuje vynález způsoby použití polypeptidů a polynukleotidů DPRP, včetně léčení infekcí jako jsou bakteriální, houbové, protozoální a virové infekce, zvláště infekce způsobené HIV-1 nebo HIV-2, bolesti, onemocnění jako je diabetes, předčasná puberta, neplodnost, obezita, anorexie, bulimie, Parkinsonova nemoc, akutní selhání srdce, nízký krevní tlak, vysoký

- 10 • · · · krevní tlak, retence moči, osteoporóza, angína pektoris, infarkt myokardu, mrtvice, vředy, astma, alergie, benigní hypertrofie prostaty, rakoviny, včetně rakovin citlivých na hormony, a nezávislých na androgenech, migrény, zvracení, psychotické a neurologické obtíže včetně úzkosti, schizofrenie, manické deprese, deprese, demence a těžké mentální retardace, a dyskinezí, která se dále souhrnně označují jako „onemocnění“.

Podle ještě dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje způsob použití těchto polypeptidů nebo polynukleotidů kódujících tyto polypeptidy pro odhalování sloučenin, které inhibujř biologickou aktivitu jejich zralých proteinů, např. odštěpením Nkoncového dipeptidu, přičemž poskytují se také tyto inhibitory.

Podle konkrétnějšího provedení poskytuje vynález izolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje (a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci podle jedné ze sekvenci SEQ ID NO. 1, 3 a 5, nebo (b) polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která má alespoň 70% podobnost s těmito sekvencemi a vykazuje stejnou biologickou funkci, nebo která je alternativní sestřihanou variantou některé ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 a 6, nebo která je sondou obsahující alespoň 14 za sebou následujících nukleotidů z uvedené nukleové kyseliny kódující (a) nebo (b), nebo která je s kteroukoli z předcházejících sekvencí komplementární.

Podle dalšího specifického provedení poskytuje vynález polypeptid, který může být popřípadě glykosylován, a který (a) má aminokyselinovou sekvenci zralého proteinu uvedeného v kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO. 1, 3 a 5; (b) má aminokyselinovou sekvenci zralého proteinu obsahující alespoň přibližně 70% podobnost s jedním ze zralých proteinů ze skupiny (a), a který má stejnou biologickou funici; (c) který má aminokyselinovou sekvenci zralého proteinu obsahujícího alespoň přibližně 90% identitu se zralým proteinem kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO. 1, 3 a 5; nebo (d) který je • · • · « · ·

- 11 imunologicky reaktivní fragment polypeptidu uvedeného ve skupině (a).

Podle ještě dalšího výhodného provedení poskytuje vynález způsob screeningu sloučeniny schopné inhibovat enzymatickou aktivitu alespoň jednoho zralého proteinu podle vynálezu, kde tento způsob zahrnuje inkubaci uvedeného zralého proteinu a vhodný substrát pro tento zralý protein v přítomnosti jedné nebo více testovaných sloučenin nebo jejich solí, měření enzymatické aktivity uvedeného zralého proteinu, porovnání této aktivity se srovnatelnou aktivitou zjištěnou bez přítomnosti testované sloučeniny a selekci testované sloučeniny nebo sloučenin, které snižují enzymatickou aktivitu, a také poskytuje způsob screeningu na sloučeninu schopnou inhibovat enzymatickou aktivitu DPPIV, která neinhibuje enzymatickou aktivitu alespoň jednoho zralého proteinu a vhodný substrát v přítomnosti jednoho nebo více inhibitorů DPPIV nebo jejich solí, měření enzymatické aktivity uvedeného zralého proteinu, srovnání této aktivity s porovnatelnou aktivitou zjištěnou v nepřítomnosti inhibitoru DPPIV a volbu sloučeniny, která nesnižuje enzymatickou aktivitu uvedeného zralého proteinu.

Tato a další provedení předkládaného vynálezu by měla být odborníkovi v oboru zřejmá na základě podrobného popisu, který následuje.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A a 1B ukazují kolineární uspořádání sekvencí DPRP-1, DPRP2, DPRP-3 a DPPIV, přičemž stínování se používá pro označení stejných (černá) nebo podobných (šedá) aminokyselinových zbytků v jednotlivých polohách.

Obr. 2 je podobný jako obr. 1 a ukazuje kolineární uspořádání lidského a myšího DPRP-2.

• * · ·

Obr. 3 je graf ukazující vliv různých tetrapeptidamidových inhibitorů na enzymatickou aktivitu dipeptidylpeptidázy.

Obr. 4A - 4C ukazuje vliv tří inhibičních sloučenin na proliferaci buněčných linií rakoviny prostaty PC3 v různých dávkách.

Podrobný popis výhodných provedení

Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytují izolované sekvence nukleových kyselin (polynukleotidy), které kódují zralé peptidy s dedukovanými sekvencemi aminokyselin tří proteinů DPRP (SEQ ID NO. 1,3 a 5).

Polynukleotidy podle vynálezu byly objeveny s použitím knihovny cDNA lidských varlat (DPRP-1), knihovny lidského tlustého střeva (DPRP-2) a knihovny cDNA lidského hypothalamu (DPRP-3). Izolovaná nukleová kyselina pro DPRP-1 obsahuje otevřený čtecí rámec kódující protein o délce přibližně 882 aminokyselin, který je strukturně příbuzný s lidským DPPIV, přičemž vykazuje 26% identitu, a 41% podobnost po celé délce sekvence lidského proteinu DPPIV. Izolovaná nukleová kyselina pro DPRP-2 obsahuje otevřený čtecí rámec kódující protein o délce přibližně 864 aminokyselin, který má 39% podobnost s celkovou aminokyselinovou sekvencí DPPIV. Analýza primární aminokyselinové sekvence DPRP-1 a DPRP2 s použitím vynesení hydrofobicity předpovídá, že tyto dva proteiny neobsahují transmembránovou doménu. Přesto je možné, že tyto intracelulární serinové proteázy jsou po buněčné aktivaci sekrenovány. Klidová buněčná prolindipeptidáza (QPP) je serinová proteáza, která je směrována do intracelulárních váčků odlišných od lysosomů (Chiravuri M., a další, J. Immunol. 15. listopadu 2000; 165(10): 5695 702). Tato hypotéza arozšiřuje možná místa a rozsah účasti DPRP-1 a DPRP-2 při mechanismech posttranslační regulace chemokinů, cytokinů, peptidů a polypeptidů. Úplná sekvence DPRP-3 obsahuje 796 aminokyselin, signální peptid od polohy 1 až 48 a

- 13 transmembránovou doménu mezi polohami 34 a 56. Předpokládá se, že zralý protein je membránový protein typu II, který může být štěpen za vytvoření rozpustné formy. Aminokyselinová sekvence je uvedená v SEQ ID NO. 5, která byla odvozená od SEQ ID NO. 6, a má 54% podobnost s DPPIV.

Uspořádání aminokyselinové sekvence těchto polypeptidů s členy podskupiny S9B prolyloligopeptidázových enzymů ukazuje, že všechny tři proteiny DPRP mají celkovou sekvenční a strukturní homologii s DPPIV a FAP. Předpokládá se, že proteiny DPRP jsou členy větve enzymů SC (serinové nukleofilní) s katalytickými zbytky v pořadí Ser, Asp, His a sekvencí aktivního místa (G-W-S-Y-G).

Tabulka 2

Homologie (tj. podobnost) mezi DPRP-1, DPRP-2, DPRP-3 a členy skupiny prolyloligopeptidázových enzymů S9B

DPPIV

41	DPRP-1	DPRP-2
39	74
54	39	40	DPRP-3
70	41	39	52	FAP
52	40	42	68	54	DPPVI

DPRP-1, DPRP-2 a DPRP-3 nemají sekvenční podobnost s kterýmikoli členy klasických skupin serinových proteáz, chymotrypsinem a subtilisinem. Pořadí zbytků katalytické triády se liší ve třech hlavních příbuzých větvích SC: His-Asp-Ser u chymotrypsinu, Asp-His-Ser u subtilisinu a Ser-Asp-His u prolyloligopeptidáz.

• · · · • · ·« »· ··*« ·· ···· · · · · ·

Jak je ukázáno v tabulce 2, DPRP-3 má nejvyšší homologii s DPPVI (68% homologie a 51% identita). Wada a další izolovali klony cDNA DPPVI, protein příbuzný s DPPIV z knihoven mozků hovězího dobytka, krysy (Wada a další, Proč. Nat. Acad. Sci. 89: 197 - 201 (1992)) a člověka (Yokotani a další, Hum. Molec. Genet. 2: 1037 1039 (1993)). Tito autoři ukázali, že na rozdíl od DPPIV neobsahuje katalytická triáda v DPPVI první serinový zbytek. U DPRP-3 jsou dvě z aminokyselin katalytické triády charakteristické pro skupinu serinových proteáz konzervovány. Samotný serinový zbytek je však nahrazen glycinem. I když nepřítomnost serinového zbytku pravděpdobně způsobí ztrátu proteázové aktivity tohoto místa, je možné, že četné další funkce zprostředkované jinými funkčními doménami proteinu zůstávají intaktní.

Jak bylo stručně popsáno výše, DPPIV je multifunkční molekula, která vykonává důležité funkce v závislosti na exprimovaných buňkách a tkáních navíc k její katalytické aktivitě peptidázy. DPRP-3 a DPPVI si také pravděpodobně zachovávají větší množství funkcí bez ohledu na nepřítomnost intaktní katalytické triády. Například se předpokládá, že DPPVI se účastní řízení plasticity neuronů. DPPVI je vysoce exprimována v hipokampu, thalamu, hypothalamu a striatu. Navíc se předpokládá, že vývojová překážka a smrt embryí u embryí rump white Rw/Rw je způsobena přerušením genu DPPIV. Mutace Rw souvisí s inverzí chromosomu v rozpětí 30 cM od proximální části myšího chromosomu 5. Genomová analýza genu DPPVI na chromosomu Rw umístila inverzní zlom do kódující oblasti vedoucí ke ztrátě významné části C-koncové oblasti, viz Hough R. B. a další, Proč. Nat. Acad. Sci., 95, 13800 - 13805 (1998).

Lidský gen DPRP-1, s předpokládanou délkou 32668 bp, má alespoň 22 exonů a 8 transkriptů. Je mapován na chromosom 15 (NT_010265) v poloze 15q21.1-15q22.1. Délky předpovězených alternativních transkriptů sestřihaných variant se liší mezi 602 bp a 4523 bp (viz SEQ ID NO. 7 - 22). To je v souladu s větším počtem • · · ·

- 15 ·« ·* • » · · · · • · · · · • · · · · ♦ · • · · · · · φ · «« · · · · · transkriptů pozorovaným analýzou northernovým přenosem (viz příklad 2). V četných tkáních včetně senescentních fibroblastů, T-lymfocytů, germinálních center B-buněk, seminomu zárodečných buněk, varlat, melanocytů, dělohy, vaječníků, mléčné žlázy, poškození roztroušenou sklerózou, pankreatu a placenty, byly nalezeny EST reprezentující tyto transkripty. Lidský DPRP-2 náleží do genu s alespoň 27 exony a 9 sestřihanými variantami (viz SEQ ID NO. 23 - 40). Jeden SNP byl pozorován v 3' UTR. (88% (37) C vs. 12% (5) T). Gen DPRP-2 je mapován do oblasti 19pl3,3 chromosomu 19. Toto místo hostí řadu markérů onemocnění a souvisí s různými nemocemi včetně hypokalciurické hyperkalcemie, cerebrální ataxie typu II, svalové dystrofie, křečí, vnímavosti na aterosklerózu, lupénky, ektodermální dysplasie a akutní myeloidní leukemie. V souladu s všeobecnou přítomností mRNA pozorovanou analýzou northernovým přenosem (viz příklad 2), byl DPRP-2 exprimován v řadě tkání při vyšetřování pokrytí tágy EST (např. více než 64 EST exprimovaných v játrech, slezině, svalech, melanocytech, srdci, plících, placentě, kůži, pankreatu, žaludku, mozku a příštítných tělískách.

Lidský DPRP-3 patří do genu s alespoň 23 exony a dvěma sestřihanými variantami (viz SEQ ID NO. 41 - 44). Gen se mapuje na chromosom 2 (NT005445) v poloze 2ql2,3-2ql4,1. Transkripty pro DPRP-3 nevykazovaly tak širokou distribuci jako u DPRP-1 a DPRP-2. Jak je ukázáno analýzou northernovým přenosem v příkladu 2, exprese DPRP-3 je omezena na mozek a pankreas. EST reprezentující mRNA DPRP-3 byly v nadbytku ve tkáni odvozené od poškození roztroušenou sklerózou, hypothalamu, celého mozku a nervů, přičemž několik transkriptů bylo nalezeno v děloze a tlustém střevě.

Vztah mezi lidskými a hlodavčími proteázami ve větvi SC, včetně DPRP-1 DPRP-2 a DPRP-3 byly analyzovány metodou Neighbor Joining method (NJ), viz Saitou a Nei, Mol. Biol. Evol., 4, 406 - 525 (1987). Fylogenetická analýza ukazuje, že mezi proteázami S9 • · ·« « * · · · • a·# φ· · · ·

- 16 postrádají DPRP-1 i DPRP-2 transmembránovou doménu, jsou odlišné od DPPIV a s ní blízce příbuzných proteinů jako FAP. Ukazuje se však podobnost mezi DPPIV a FAP a mezi DPRP-3 a DPPVI, což jsou všechno membránové proteiny typu II.

Prohledávání databáze na další geny příbuzné s DPRP odhalilo přítomnost myší sekvence příbuzné s DPRP-1. Porovnání této myší sekvence s novými lidskými proteázami ukazuje, že mDPRP-1 vykazuje podstatnou homologii se svým lidským protějškem (obr. 2). Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že nový gen pro myší proteázu může být izolován pomocí zde popisované informace o sekvenci a může být snadno vložen do rutinně používaných expresních konstruktů, které jsou dobře známé v oboru. Použití této objevené sekvence odborníkem v oboru pro vytvoření modelu transgenní myši bude využívat vývoj vektorů směrovaných na gen, např. vedoucích k homologní rekombinaci v myších embryonálních kmenových buňkách. Použití myší knockout při další analýze funkce genů DPRP je tedy cenným nástrojem.

Polynukieotidy podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě RNA nebo ve formě DNA; je třeba rozumět, že DNA zahrnuje cDNA, genomickou DNA a syntetickou DNA. DNA může být dvojřetězcová nebo jednořetězcová a pokud je jednořetězcová, může jít o kódující řetězec nebo. nekódující (antisense) řetězec. Kódující sekvence, která kóduje zralý polypeptid, může být identická s kódující sekvencí ukázanou v SEQ ID NO. 2, 4 a 6, nebo může jít o rozdílnou kódující sekvenci kódující stejný zralý polypeptid jako důsledek degenerace nebo redundance genetického kódu nebo polymorfismus jednotlivých nukleotidů. Může se také např. jednat o transkript RNA, který zahrnuje celou délku kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 a 6.

Polynukieotidy kódující zralé proteiny se SEQ ID NO. 1, 3, 5 mohou obsahovat bez omezení kódující sekvenci samotného zralého proteinu; kódující sekvenci zralého polypeptidu plus další kódující

9« >··«

99 t 9 9 9 »99 9 9 9

- 17 t 9 9 9 9 9

9999 99 99 9 sekvenci, jako je vedoucí nebo sekreční sekvence nebo sekvence proproteinu; a kódující sekvenci zralého proteinu (a popř. další kódující sekvenci) plus nekódující sekvenci, jako jsou introny nebo nekódující sekvence na 5' a/nebo 3' konci kódující sekvence zralého proteinu.

Termín „polynukleotid kódující polypeptid“ nebo termín „nukleové kyselina kódující polypeptid“ by měl být chápán tak, že zahrnuje polynukleotid nebo nukleovou kyselinu, která obsahuje pouze kódující sekvenci zralého proteinu stejně jako sekvenci obsahující další kódující a/nebo nekódující sekvenci. Termíny polynukleotidy a nukleové kyselina se používají zaměnitelně.

Předkládaný vynález také zahrnuje polynukleotidy, ve kterých může být kódující sekvence zralého proteinu fúzována ve stejném čtecím rámci k polynukleotidové sekvenci, která napomáhá při expresi a sekreci polypeptidu z hostitelské buňky; například takovým způsobem může být fúzována vedoucí sekvence, která funguje jako sekreční sekvence pro řízení transportu polypeptidu z buňky. Polypeptid obsahující takovou vedoucí (leader) sekvenci se nazývá preprotein nebo preproprotein a vedoucí sekvence může být odštěpena hostitelskou buňkou za vytvoření zralé formy proteinu. Tyto polynukleotidy mohou obsahovat 5' prodlouženou oblast tak, že kóduje proprotein, což je zralý protein plus další aminokyselinové zbytky na N-konci. Expresní produkt s takovou prosekvencí se nazývá proprotein, což je inaktivní forma zralého proteinu; jakmile se však prosekvence odštěpí, zůstává aktivní zralý protein. Tak např. polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou kódovat zralé proteiny nebo proteiny obsahující prosekvenci nebo proteiny obsahující jak prosekvenci, tak i presekvenci (vedoucí sekvenci).

Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat kódující sekvenci fúzovanou ve čtecím rámci s markerovou sekvencí, která umožní čištění polypeptidů podle předkládaného ·· ·· ·· ···♦ ·· ··«· «<*·«· · · · · ··* · » · «·· » ·· ··· · · · · _ 18 -.......’ * ** ** vynálezu. Tato markerová sekvence může být např. polyhistidinový tag, hemaglutininový (HA) tag, c-myc tag nebo V5 tag, jestliže se jedná o savčího hostitele, např. jestliže se používají buňky COS-1. HA tag by měl odpovídat epitopu odvozenému z hemaglutininového proteinu chřipky (Wilson, I., a další, Cell, 37: 767 (1984)), a c-myc tag může být epitop z lidského proteinu Myc (Evans, G. I. a další, Mol. Cell. Biol. 5: 3610 - 3616 (1985)).

Termín „gen“ označuje úsek DNA, který se účastní produkce polypeptidového řetězce; obsahuje oblasti předcházející kódující sekvenci a následující za kódující sekvencí (leader a trailer) stejně jako vnořené sekvence (introny) mezi jednotlivými kódujícími úseky (exony). Termín „významná sekvenční homologie) má označovat, že konzervovaných je alespoň 25 %, s výhodou alespoň 40 % aminokyselinových zbytků, a že z nekonzervovaných zbytků jde alespoň ze 40 % o konzervativní substituce.

Fragmenty úplných genů podle předkládaného vynálezu se mohou používat jako hybridizační sonda pro knihovnu cDNA pro izolaci úplné cDNA stejně jako pro izolaci jiných cDNA, které mají významnou sekvenční homologii s genem a budou kódovat proteiny nebo polypeptidy s podobnou biologickou aktivitou nebo funkcí. Termínem podobná biologická aktivita nebo funkce se pro účely této přihlášky rozumí schopnost odštěpovat N-koncový dipeptid obsahující Ala nebo Pro jako předposlední zbytek, nebo jiné aminokyseliny. Taková sonda má alespoň 14 bází (alespoň 14 za sebou náseldujících nukleotidů z jedné ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 nebo 6), s výhodou alespoň 30 bází, a může obsahovat např. 50 nebo více bází. Taková sonda se může také používat pro identifikaci klonu cDNA odpovídajího transkriptu s úplnou délkou a/nebo genomickému klonu nebo klonům, které obsahují úplný gen včetně regulačních a promotorových oblastí, exonů a intronů. Značené oligonukleotidy obsahující sekvenci komplementární se sekvencí genu podle předkládaného vynálezu se používají pro screening knihovny lidské cDNA, genomické DNA nebo

- 19 mRNA pro lokalizaci členů knihovny, se kterými sonda hybridizuje. Jako příklad může být známá sekvence DNA použita pro syntézu oligonukleotidové sondy, která se potom použije při screeningu knihovny pro izolaci kódující oblasti sledovaného genu.

Předpokládá se, že předkládaný vynález dále poskytne polynukleotidy, které hybridizují s výše popsanými sekvencemi, přičemž existuje alespoň 70%, s výhodou alespoň 90% a výhodněji alespoň 95% identita nebo podobnost mezi sekvencemi, a kódují tedy proteiny s podobnou biologickou aktivitou. V oboru je navíc známo, že „podobnost“ mezi dvěma polypeptidy existuje, jestliže aminokyselinové sekvence obsahují stejné aminokyseliny nebo konzervované aminokyselinové substituce pro každý jednotlivý zbytek v sekvenci. Identita a podobnost může být měřena použitím softwaru pro analýzu sekvence (např. balík programů Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Předkládaný vynález poskytuje zvláště takové polynukleotidy, které hybridizují za stringentních podmínek s výše popsanými polynukleotidy. Jak se zde používá, termín „stringentní podmínky“ znamená podmínky, které umožňují hybridizaci mezi sledovanými polynukleotidovými sekvencemi a polynukleotidovými sekvencemi ze SEQ ID NO. 2, 4 a 6, kde existuje alespoň přibližně 70% identita. Vhodné stringentní podmínky mohou být definovány např. koncentracemi soli nebo formamidu v předhybridizačních a hybridizačních roztocích, nebo teplotou hybridizace a jsou dobře známé odborníkům v oboru. Stringentnost je možno zvýšit zvláště snížením koncentrace soli, zvýšením koncentrace formamidu a/nebo zvýšením teploty hybridizace.

Při hybridizaci za vysoce stringentních podmínek se může používat např. přibližně 50% formamid při přibližně 37 °C až 42 °C, zatímco při hybridizaci za podmínek se sníženou stringentností se může používat přibližně 35% až 25% formamid při teplotě přibližně • · • · • · · · • · • · · ·

- 20 - ···· ·· ·· · ·· ·· °C až 35 °C. Jeden konkrétní soubor podmínek pro hybridizaci za podmínek vysoké stringentnosti používá 42 °C, 50% formamid, 5 x SSPE, 0,3% SDS a 200 pg/ml střihem rozbité a denaturované DNA lososího spermatu. Například za podmínek snížené stringentnosti se může používat 35% formamidu při snížené teplotě 35 °C. Rozmezí teplot odpovídající konkrétní míře stringentnosti se může dále zúžit výpočtem poměru purinu k pyrimidinu ve sledované nukleové kyselině a příslušnou úpravou teploty. Variace výše popsaných rozmezí a podmínek jsou v oboru dobře známé. Hybridizace by měla probíhat s výhodou pouze v tom případě, jestliže mezi sekvencemi existuje alespoň 95%, výhodněji alespoň 97% identita. Polynukleotidy, které hybridizují s výše popsanými polynukleotidy kódují ve výhodném provedení polypeptidy s v podstatě stejnou biologickou funkcí nebo aktivitou jako má zralý protein kódovaný jednou ze sekvencí cDNA SEQ ID NO. 2, 4 a 6.

Jak bylo uvedeno výše, vhodná polynukleotidová sonda může obsahovat alespoň 14 bází, s výhodou 30 bází a výhodněji alespoň 50 bází, a bude hybridizovat s polynukleotidem podle předkládaného vynálezu, se kterým je identická, jak bylo popsáno výše, a který si může nebo nemusí zachovat aktivitu. Tyto polynukleotidy se mohou používat například jako sonda pro hybridizaci k polynukleotidům se SEQ ID NO. 2, 4 a 6, např. pro izolaci takového polynukleotidu, nebo jako diagnostická sonda, nebo jako primer PCR. Předkládaný vynález tedy zahrnuje polynukleotidy, které mají alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 90% identitu, a výhodněji alespoň 95% identitu s polynukleotidem kódujícím polypeptidy SEQ ID NO. 1, 3 a 5, stejně jako jejich fragmenty, kde tyto fragmenty obsahují s výhodou alespoň 30 bází a výhodněji alespoň 50 bází, a polypeptidy kódované těmito polynukleotidy.

Jak je v oboru známo, genetický kód je redundantní v tom, že určité aminokyseliny jsou kódovány více než jedním nukleotidovým tripletem (kodonem), a vynález zahrnuje tyto polynukleotidové • · · ·

- 21 • · • · sekvence kódující stejné aminokyselinové sekvence s použitím různých kodonů ze sekvencí, které se zde specificky uvádějí jako příklady, tato poiynukleotidová sekvence se zde označuje jako „ekvivalentní“ poiynukleotidová sekvence. Předkládaný vynález dále zahrnuje varianty výše popsaných polynukleotidů, které kódují fragmenty, jako je část nebo veškerý zralý protein, analogy a deriváty jednoho z polypeptidů obsahujících odvozenou aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5. Variantní formy těchto polynukleotidů mohou být v přírodě se vyskytující alelické varianty polynukleotidů nebo varianty polynukleotidů, které se v přírodě nevyskytují. Například varianta nukleové kyseliny může být jednoduše rozdíl v sekvenci kodonu pro aminokyselinu v důsledku degenerace genetického kódu, nebo může jít o deleční varianty, substituční varianty a adiční nebo inzerční varianty. Jak je v oboru známo, alelická varianta je alternativní forma polynukleotidové sekvence, která může obsahovat substituci, deieci nebo adici jednoho nebo více nukleotidů, které podstatně nemění biologickou funkci kódovaného polypeptidů.

Předkládaný vynález dále zahrnuje polypeptidy, které mají odvozenou aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5, stejně jako fragmenty, analogy a deriváty takových polypeptidů. Termíny „fragment“, „derivát“ a „analog“ znamenají v souvislosti s polypeptidy SEQ ID NO. 1, 3 a 5 polypeptidy, které si zachovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako tyto polypeptidy. Analog by mohl např. obsahovat proprotein, který může být aktivován odštěpením proproteinové části za vytvoření aktivního zralého proteinu. Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být rekombinantní polypeptidy, přirozené polypeptidy nebo syntetické polypeptidy; s výhodou však jde o rekombinantní polypeptidy, glykosylované nebo neglykosylované.

Fragment, derivát nebo analog polypeptidů SEQ ID NO. 1, 3 a 5 může být (i) takový, ve kterém je jeden nebo více aminokyselinových zbytků substituován konzervovaným nebo nekonzervovaným • · · · _ 22 -······ ·· · ·· ·· aminokyselinovým zbytkem (s výhodou konzervovaným aminokyselinovým zbytkem), a takový substituovaný aminokyselinový zbytek může nebo nemusí být kódován genetickým kódem, nebo (ii) takový, ve kterém obsahuje jeden nebo více aminokyselinových zbytků skupinu substituentu, nebo (iii) takový, ve kterém jsou další aminokyseliny fúzovány ke zralému proteinu, jako je vedoucí nebo sekreční sekvence nebo sekvence, která se používá pro čištění zralého polypeptidu nebo proproteinová sekvence. Tyto fragmenty, deriváty a analogy se považují za obsažené v rámci znalostí odborníka v oboru a na základě předkládané přihlášky.

Polypeptidy a polynukleotidy podle předkládaného vynálezu by měly být v izolované formě, a s výhodou se čistí do v podstatě homogenity nebo čistoty. V podstatě homogenitou se míní čistota alespoň přibližně 85 %.

Termín „izolovaný“ se používá v tom významu, že materiál byl odstraněn ze svého původního prostředí (např. přirozeného prostředí, jestliže se materiál vyskytuje v přírodě). Například v přírodě se vyskytující polynukleotid nebo polypeptid přítomný v živém organismu není považován za izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid, jestliže se oddělí v podstatě od všech koexistujících materiálů v přirozeném systému je považován za izolovaný. V případě DNA zahrnuje tento termín například rekombinantní DNA, která je vložená do vektoru, do autonomně se replikujícího plasmidu nebo viru nebo do genomické DNA prokaryotického nebo eukaryotického organismu; nebo která existuje jako oddělená molekula (např. jako cDNA nebo fragment genomické DNA nebo cDNA získaný polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) nebo Štěpením s restrikčními endonukleázami (nezávisle na dalších sekvencích. Zahrnuje také rekombinantní DNA, která je součástí hybridního genu kódujícího další polypeptidovou sekvenci, např. fuzní protein. Zahrnuta je dále rekombinantní DNA, která obsahuje část nukleotidů ukázaných v jedné ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 nebo 6, která kóduje alternativní sestřihanou variantu • · ··· · · · * · · · . 23 -......

proteinu DPRP. Další alternativní sestřihané varianty se uvádějí jako příklady v SEQ ID NO. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 a 46.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu obsahují kterýkoli z polypeptidů ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5 (zvláště zralý protein) stejně jako polypeptidy, které mají alespoň 70% podobnost (např. s výhodou alespoň 60% a výhodněji alespoň 70% identitu) s jedním z polypeptidů SEQ ID NO. 1, 3 a 5, výhodněji alespoň 90% podobnost (např. s výhodou alespoň 90% identitu) s jedním z polypeptidů se SEQ ID NO. 1, 3 a 5 a nejvýhodněji alespoň 95% podobnost (například alespoň 95% identitu) s jedním z polypeptidů ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5. Navíc by měly s výhodou obsahovat přesné části těchto polypeptidů sekvenci alespoň 30 aminokyselin a výhodněji alespoň 50 aminokyselin.

Fragmenty nebo části polypeptidů podle předkládaného vynálezu se mohou používat jako meziprodukty pro produkci odpovídajících úplných polypeptidů metodou peptidové syntézy. Fragmenty nebo části polynukleotidů podle předkládaného vynálezu se mohou také používat pro syntézu úplných polynukleotidů podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález zahrnuje také vektory, které obsahují tyto polynukleotidy, hostitelské buňky, které jsou upraveny genetickým inženýrstvím prostřednictvím těchto vektorů a produkty polypeptidů rekombinantními technikami s využitím předcházejících poznatků. Hostitelské buňky se upravují genetickým inženýrstvím (transdukcí nebo transformací nebo transfekcí) vektory, kterými může být např. klonovací vektor nebo expresní vektor. Tento vektor může být například ve formě plasmidu, virové částice, fága atd. Hostitelské buňky získané genetickým inženýrstvím mohou být kultivovány v obvyklém živném médiu modifikovaném podle potřeby pro aktivaci promotorů, selekci transformantů nebo amplifikaci genů podle

- 24 předkládaného vynálezu. Kultivační podmínky jako jsou teplota, pH apod. jsou podmínky běžně používané u hostitelské buňky vybrané pro expresi a jsou běžně známé odborníkům v oboru.

Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu se mohou používat pro produkci polypeptidů rekombinantními technikami. Tak např. polynukleotidy mohou být obsaženy v kterémkoli z řady expresních vektorů pro expresi polypeptidů. Mezi tyto vektory patří chromosomální, nechromosomální a syntetické sekvence DNA, např. deriváty viru SV40; bakteriální plasmidy; fágová DNA; bakulovirus; kvasinkové plasmidy; vektory odvozené od kombinací plasmidů a fágové DNA, virové DNA jako je vakcinie, adenovirus, virus drůbežích neštovic a pseudorabies. Může být ovšem použit jakýkoli jiný vektor, pokud se replikuje a je v hostiteli životaschopný.

Vhodná sekvence DNA může být do vektoru vložena kterýmkoli z řady postupů. Obecně se sekvence DNA vkládá do místa nebo míst štěpení restrikčními endonukleázami způsoby známými odborníkům v oboru, přičemž tyto způsoby jsou považovány za běžné znalosti odborníka v oboru.

Sekvence DNA v expresním vektoru je operativně navázána na vhodnou sekvenci nebo vhodné sekvence řídící expresi (promotor) pro řízení syntézy mRNA. Jako reprezentativní příklad takových promotorů je možno uvést promotor LTR nebo SV40, promotor E. coli lac nebo trp, promotor fágu lambda P. sub. L a jiné promotory známé pro řízení exprese genů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách nebo jejich virech. Expresní vektor by také měl obsahovat ribosomální vazební místo pro iniciaci translace a terminátor transkripce. Vektor může také obsahovat vhodné sekvence pro amplifikaci exprese. Expresní vektory navíc s výhodou obsahují jeden nebo více markerových genů umožňujících selekci pro poskytnutí fenotypického znaku pro selekci transformovaných hostitelských buněk, jako je dihydrofolátreduktáza nebo rezistence na neomycin pro kulturu • · _ 25 -...... ** eukaryotických buněk, nebo rezistence na tetracyklin nebo ampicilin v případě E. coli.

Vektor obsahující příslušnou sekvenci DNA jak bylo popsáno výše spolu s vhodným promotorem nebo řídící sekvencí může být použit pro transformaci vhodného hostitele, aby byla umožněna exprese proteinu v hostiteli. Jako reprezentativní příklady vhodných hostitelů je možno uvést bakteriální buňky, jako je E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; houbové buňky jako jsou kvasinky; hmyzí buňky jako je Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; živočišné buňky jako jsou buňky CHO, COS nebo buňky Bowesova melanomu; adenoviry; rostlinné buňky atd. Volba vhodného hostitele spadá do znalostí odborníků v oboru vyplývajících z předkládané přihlášky.

Syntetická produkce sekvencí nukleových kyselin je dobře známá v oboru, jak je zřejmé z katalogů CLONTECH 95/96, str. 215 216, CLONTECH, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, Calif. 94303. Předkládaný vynález tedy také zahrnuje expresní vektory použitelné pro produkci proteinů podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález dále zahrnuje rekombinantní konstrukty obsahující jednu nebo více ze sekvencí, které se zde v širším smyslu popisují. Konstrukty mohou obsahovat vektor, jako je plasmidový nebo virový vektor, do kterého byla vložena sekvence podle vynálezu, v dopředně nebo reverzní orientaci. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu obsahuje výše uvedený konstrukt dále regulační sekvence, včetně např. promotoru operativně navázaného na tuto sekvenci. Odborníkům v oboru je známa celá řada vhodných vektorů a promotorů, které jsou komerčně dostupné. Poskytují se např. následující vektory: bakteriální pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNHI8A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK2333, pDR540 a pRIT5 (Pharmacia); a eukaryotické pWLNEO, pSV2CAT, • ·

- 26 pOG44, pXTI, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, a pSVL (Pharmacia). Může však být použit i jakýkoli jiný vhodný plasmid nebo vektor, pokud se v hostiteli replikuje a je životaschopný.

Promotorové oblasti mohou být zvoleny z kteréhokoli genu s použitím vektorů CAT (chloramfenikolacetyltransferáza) nebo jiných vektorů obsahujících markéry umožňující selekci. Dva vhodné vektory jsou pKK232-8 a pCM7. Konkrétní uváděné bakteriální promotory zahrnují lad, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P. sub. R, P. sub. L a trp. Mezi eukaryotické promotory patří brzký raný promotor CMV, promotor HSV thymidinkinázy, raný a pozdní SV40, promotory LTR z retrovirů a myší metalothionein-l. Volba vhodného vektoru a promotoru opět spadá do běžných znalostí odborníka v oboru.

Složky expresního vektoru mohou obecně obsahovat: 1)jako selekční markér gen pro neomycinfosfotransferázu (G418), nebo hygromycin B fosfotransferázu (hyg), 2) počátek replikace E. coli,

3) sekvenci fágového promotoru T7 a SP6, 4) sekvence lac operátoru, 5) represorový gen laktózového operonu (laclq), a 6) propojovací oblast vícečetného klonovacího místa. Takový počátek relikace (oriC) může být odvozen z plasmidu pUCI9 (LTI, Gaithersburg, Md.).

Nukleotidová sekvence kódující jeden z polypeptidů SEQ ID NO. 2, 4 a 6 obsahující vhodná restrikční místa se vytvoří například na základě protokolu PCR popsaného v příkladu 1 dále, s použitím primeru PCR s obsahem restrikčních míst pro Kpnl (jako 5' primer) a Notl nebo Sací (jako 3' primer) pro DPRP-1, nebo míst pro Hindlll (jako 5' primer) a Notl nebo BamHI (jako 3' primer) pro DPRP-2. Inzerty PCR se čistí na gelu a štěpí kompatibilními restrikčními enzymy. Inzert a vektor se vkládají použitím standardních protokolů.

V dalších provedeních poskytuje předkládaný vynález hostitelské buňky obsahující výše popsané konstrukty. Hostitelskou buňkou může být vyšší eukaryotická buňka jako je savčí buňka nebo nižší eukaryotická buňka jako je kvasinková buňka, nebo může být . 27 -...... ·· * ** ** hostitelskou buňkou prokaryotická buňka jako je buňka bakteriální. Zavedení konstruktu do hostitelské buňky se může uskutečnit transfekcí s fosforečnanem vápenatým, transfekcí zprostředkovanou DEAE-dextranem, lipofekcí nebo elektroporací (Davis, L, Dibner, M, Battey, I, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Tyto konstrukty v hostitelských buňkách se s výhodou používají běžným způsobem pro produkci genového produktu kódovaného touto rekombinantní sekvencí. Alternativně mohou být polypeptidy podle předkládaného vynálezu produkovány synteticky na běžných syntezátorech peptidů nebo chemickou vazbou vhodných fragmentů připravených tímto způsobem.

Zralé proteiny mohou být exprimovány v savčích buňkách, kvasinkách, baktriích nebo jiných buňkách za řízení odpovídajících promotorů. Pro produkci těchto proteinů mohou být také použity bezbuněčné translační systémy s použitím RNA odvozených od konstruktů DNA podle předkládaného vynálezu, vhodné klonovací a expresní vektory pro použití v prokaryotických a eukaryotických hostitelích se popisují v publikaci Sambrook, a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor, NY, (1989).

Transkripce DNA kódující polypeptidy podle předkládaného vynálezu vyššími eukaryotíckými buňkami se zvyšuje vložením zesilující sekvence (enhancer) do vektoru. Zesilující sekvence zahrnují elementy DNA působící v cis-, obvykle o velikosti od 10 do 300 bp, které ovlivňují promotor směrem ke zvýšení jeho transkripce. Mezi příklady patří zesilující sekvence SV40 na pozdní straně počátku replikace bp 100 až 270, zesilující sekvence časného promotoru cytomegaloviru, polyomová zesilující sekvence na pozdní straně počátku replikace, a adenovirové zesilující sekvence.

Rekombinantní expresní vektory budou obecně obsahovat počátky replikace a selektovatelné markéry umožňující transformaci • · · · · · • · · · · · · ·· · • · · ··· ···

- 28 - ···· ” *** * *··* *··* hostitelské buňky, např. gen rezistence na ampicilin E. coli a gen TRP1 S. cerevisiae, a promotor odvozený od vysoce exprimovaného genu pro řízení transkripce strukturní sekvence uložené ve směru transkripce. Tyto promotory mohou být odvozené od operonů kódujících glykolytické enzymy, jako je mj. 3-fosfoglycerátkináza (PGK), alfa-faktor, kyselá fosfatáza nebo teplem indukovatelné (heat shock) proteiny. Heterologní strukturní sekvence se uspořádá ve vhodné fázi se sekvencemi iniciace a terminace translace a s výhodou s vedoucí sekvencí schopnou směrovat sekreci překládaného proteinu do periplasmatického prostoru nebo extracelulárního média. Heterologní sekvence může popřípadě kódovat fuzní protein obsahující N-koncový identifikační peptid propůjčující konstruktu požadované vlastnosti, např. stabilitu nebo zjednodušené čištění expresního rekombinantního produktu.

Vhodné expresní vektory pro použití v bakteriích se konstruují vložením strukturní sekvence DNA kódující požadovaný protein společně s vhodnými signály iniciace a terminace translace ve správné čtecí fázi s funkčním promotorem. Vektor bude obsahovat jeden nebo více fenotypových markérů umožňujících selekci a počátek replikace pro zajištění udržení vektoru v buňce a v případě potřeby pro poskytnutí amplifikace v hostiteli. Mezi vhodné prokaryotické hostitelské buňky pro transformaci patří E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy rodu Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, i když podle volby mohou být použity i jiné mikroorganismy.

Jako reprezentativní, ale neomezující příklad mohou použitelné expresní vektory pro bakterie obsahovat selektovateiný markér a bakteriální počátek replikace odvozený od komerčně dostupných plasmidů obsahujících genetické prvky dobře známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Tyto komerční vektory zahrnují například pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko) a GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis., USA). Úseky „kostry“ pBR322

- 29 »« < · ·«· • · · v * • · « · « • · · · * • > · · · se kombinují s vhodným promotorem a exprimovanou strukturní sekvencí.

Po transformaci vhodného hostitelského kmene a růstu hostitelského kmene na požadovanou hustotu buněk se vybraný promotor vhodně indukuje (např. změnou teploty nebo chemickou indukcí) a buňky se dále kultivují. Buňky se typicky sklízejí centrifugací a potom fyzikálně nebo chemicky rozbijí, přičemž získaný surový extrakt se zachová pro další čištění. Mikrobiální buňky použité při expresi proteinů mohou být rozbity jakýmkoli vhodným způsobem, včetně cyklů zmrazení/tání, sonikace, mechanického rozbíjení a použití lyzačních činidel; kde všechny tyto způsoby jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Pro expresi rekombinantních proteinů mohou být také použity různé kultivační systémy savčích buněk. Příklady savčích expresních systémů zahrnují linie ledvinových fibroblastů COS-7 opice popsané autorem Gluzman, Cell, 23; 175 (1981). Další buněčné linie schopné exprese kompatibilního vektoru zahrnují např. buněčné linie C127, 3T3, CHO, HeLa a BHK. Savčí expresní ektory budou obecně obsahovat počátek replikace, vhodný promotor a zesilující sekvenci a také nezbytná ribosomální vazebná místa, polyadenylační místo, místa donoru a akceptoru štěpení, sekvence terminace transkripce a 5' obklopující nepřepisované sekvence. Sekvence DNA odvozené od štěpu SV40 a polyadenylační místa mohou být použity pro poskytnutí požadovaných nepřepisovaných genetických prvků.

Polypeptidy mohou být izolovány a čištěny z rekombinantních buněčných kultur metodami zahrnujícími srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakci kyselinou, aniontovou nebo kationtovou iontoměničovou chromatografií, chromatografií na fosfocelulóze, chromatografií s hydrofobní interakcí, afinitní chromatografií, chromatografií na hydroxylapatitu a lektinovou chromatografií. Izolace se může usnadnit, jestliže se polypeptid exprimuje na povrchu buněk, ·<· Μ • · · * · ♦ ♦ · ale není to nezbytný požadavek. Může být také vhodná izolace štěpících produktů, které se odštěpí po expresi z delší formy polypeptidu. Mohou být použity kroky znovusložení proteinu známé v oboru, aby se podle potřeby dokončila konfigurace zralého proteinu. Pro krok konečného čištění může být použita kapalinová chromatografie s vysokou účinností (HPLC).

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být čištěné přirozené produkty, nebo mohou být vyrobené rekombinantními technikami z prokaryotických nebo eukaryotických buněk (např. bakteriálních, kvasinkových buněk, buněk vyšších rostlin, hmyzích nebo savčích buněk v kultuře. V závislosti na použitém hostiteli při postupu rekombinantní produkce mohou být polypeptidy podle předkládaného vynálezu glykosylované nebo mohou být neglykosylované. Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou také obsahovat počáteční aminokyselinový zbytek methioninu.

Ve výhodném provedení jsou proteiny podle vynálezu izolované a čištěné, takže jsou v podstatě prosté kontaminace jinými proteiny. Například proteiny podle vynálezu by měly tvořit alespoň 80 % hmotnostních z celkového proteinu přítomného ve vzorku, výhodněji alespoň 90 %, ještě výhodněji alespoň 95 % a nejvýhodněji alespoň 98 % hmotnostních z celkových proteinů.

Tyto proteiny mohou být ve formě roztoku ve vodě, dalším vhodném rozpouštědle jako je dimethylsulfoxid (DMSO) nebo ethanol, nebo směsi vhodných rozpouštědel.

Příklady směsí rozpouštědel zahrnují 10% (hmotnostní) ethanol ve vodě a 2% (hmotnostní) DMSO ve vodě. Roztok může dále obsahovat soli, pufrační látky, chaotropní látky, detergenty, ochranné látky apod. Proteiny mohou být alternativně ve formě pevné látky, jako je lyofilizovaný prášek nebo krystalická pevná látka, které také mohou obsahovat zbytkové rozpouštědlo, sůl apod.

• · · ···· »» » · a · ·· ·

- 31 Jak se zde používá, termín „protilátky“ zahrnuje polyklonální protilátky, afinitně čištěné polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a fragmenty vázající antigen, jako jsou proteolytické fragmenty F(ab')2 a Fab'. Zahrnuty jsou také intaktní protilátky nebo fragmenty získané genetickým inženýrstvím, jako jsou chimérní protilátky, fragmenty Fv, jednořetězcové protilátky apod., stejně jako syntetické peptidy a polypeptidy vázající antigen. Jiné než lidské protilátky mohou být humanizovány naroubováním jiných než lidských CDR do lidských obklopujících a konstantních oblastí, nebo inkorporací celé jiné než lidské variabilní domény (popřípadě jejich „oblečením“ povrchem podobným lidskému náhradou exponovaných zbytků, kdy se získá „obložená“ protilátka). V některých případech mohou být zachovány v humanizovaných protilátkách jiné než lidské zbytky v rámci domény lidské variabilní oblasti, čímž se dosáhne vhodných vazebných charakteristik. Humanizací protilátek se může dosáhnout zvýšení biologického poločasu a schopnost snížení nepříznivých imunitních reakcí po podání člověku.

Alternativní způsoby vytváření nebo selekce protilátek používané v předkládaném vynálezu zahrnují vystavení lymfocytů in vitro lidskému prohormonovému DPRP proteinu nebo z něj získanému peptidu a selekci knihoven protilátek přístupných na povrchu (antibody display) fágů nebo podobných vektorů (např. použitím imobilizovaného nebo značeného lidského proteinu nebo peptidu DPRP). Geny kódující polypeptidy obsahující potenciální vazebné domény na lidský polypeptid DPRP mohou být získány screeningem náhodných peptidových knihoven na fágu (phage display) nebo na bakterii, jako je E. coli. Nukleotidové sekvence kódující takové polypeptidy mohou být získány řadou způsobů známých v oboru.

Jak bude odborníkovi v oboru zřejmé, polyklonální protilátky mohou být vytvořeny zaočkováním řady teplokrevných zvířat, např. koní, krav, koz, ovcí, psů, kuřat, králíků, myší a krys lidským polypeptidem DPRP nebo jeho fragmentem. Imunogenicita lidského

- 32 ······ · · · »····· ·· · ·· · · prohormonálního polypeptidů DPRP může být zvýšena použitím adjuvans jako je alum (hydroxid hlinitý) nebo Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans, nebo povrchově aktivní látky jako je lysolecithin, pluronové polyoly, polyanionty, peptidy, olejové emulze, KLH nebo dinitrofenol. Jako adjuvans použitelná u člověka jsou zvláště výhodná BCG (bacily Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum. Polypeptidy použitelné pro imunizaci obsahují také fuzní polypeptidy, jako jsou fuzní polypeptidy obsahující DPRP nebo jeho část a imunoglobulinový polypeptid nebo protein vázající maltózu. Polypeptidový imunogen může být molekula s úplnou délkou nebo její část. Jestliže je polypeptidová část „podobná haptenu“, tato část může být s výhodou pro imunizaci spojena nebo navázána na makromolekulární nosič, jako je hemocyanin plže Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin, KLH), bovinní sérový albumin (BSA) nebo tetanový toxoid. Protilátky proti DPRP mohou být také vytvořeny použitím způsobů známých v oboru. Tyto protilátky mohou zahrnovat bez omezení polyklonální, monoklonální, chimérní a jednořetězcové protilátky, fragmenty Fab a fragmenty produkované expresní knihovnou Fab. Pro terapeutické použití jsou zvláště výhodné neutralizační protilátky (tj. protilátky, které blokují nebo modifikují interakce s aktivními místy).

Pro produkci protilátek může být proveden screening vazebných proteinů nebo peptidů, které se specificky vážou na DPRP, knihoven jednořetězcových protilátek, fragmentů Fab, jiných fragmentů protilátek, domén proteinů různých od protilátek nebo peptidů. Knihovny by mohly být vytvořeny použitím metody předkládání na povrchu fágů (phage display) jinými metodami rekombinantní DNA nebo syntézou peptidů (Vaughan, T. J. a další, Nátuře Biotechnology 14: 309 - 314 (1966)). Tyto knihovny by mohly být běžně prohledávány použitím způsobů dobře známých v oboru pro identifikaci sekvencí, které demonstrují specifickou vazbu na DPRP.

• · · · • · • · · ·

- 33 Je výhodné, jestliže oligopeptidy, peptidy nebo fragmenty používané pro indukování protilátek proti DPRP mají aminokyselinovou sekvenci obsahující alespoň přibližně 5 aminokyselin, zvláště alespoň přibližně 10 aminokyselin. Je také výhodné, jestliže tyto oligopeptidy, peptidy nebo fragmenty jsou identické s částí aminokyselinové sekvence přirozeného proteinu. Krátké úseky aminokyselin DPRP mohou být také fúzovány s úseky jiného proteinu jako je KLH a mohou být produkovány protilátky proti chimérní molekule.

Monoklonální protilátky proti DPRP mohou být připraveny použitím kterékoli dobře známé techniky, která poskytuje tvorbu molekul protilátky v kontinuálních kulturách buněčných linií. Patří sem bez omezení hybridomová technika, hybridomová technika lidských Bbuněk a hybridomová technika EBV, ačkoli výhodné mohou být protilátky produkované hybridomovými buňkami.

Navíc mohou být použity techniky vyvinuté pro produkci chimérních protilátek, jako je sestřih genů myší protilátky na geny lidské protilátky za získání molekuly s vhodnou specificitou antigenu a biologickou aktivitou, viz Neuberger, M. S. a dalším, Nátuře 312: 604 608 (1984). Alternativně mohou být upraveny techniky popisované pro produkci jednořetězcových protilátek s použitím způsobů známých v oboru pro produkci jednořetězcových protilátek specifických pro DPRP. Protilátky s příbuznou specificitou, ale s odlišným idiotypickým složením, mohou být vytvářeny mícháním řetězců z náhodných kombinačních knihoven imunoglobulinů (Burton D. R., Proč. Nati. Acad. Sci. 88: 11120 - 11123 (1991)).

Protilátky mohou být také produkovány indukcí produkce in vivo v populaci lymfocytů nebo screeningem imunoglobulinových knihoven nebo panelů vysoce specifických vazebných reakčních činidel, jak se popisuje v literatuře (Orlandi, R. a další, Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 3833 - 3837 (1989)).

• · · · • · • · · ·

- 34 Mohou být také vytvářeny fragmenty protilátek, které obsahují specifická vazebná místa pro DPRP. Tyto fragmenty například zahrnují bez omezení fragmenty F(ab')₂ produkované štěpením molekuly protilátky pepsinem a fragmenty Fab vytvářené redukcí disulfidických můstků fragmentů F(ab')₂. Alternativně mohou být zkonstruovány expresní knihovny Fab pro umožnění rychlé a snadné identifikace monoklonálních fragmentů Fab s požadovanou specificitou (Huse, W. D. a další, Science 254: 1275 - 1281 (1989)).

Pro identifikaci protilátek s požadovanou specificitou mohou být použity různé imunologické testy. V oboru jsou známé četné protokoly pro kompetitivní vazbu nebo imunoradiometrické testy s použitím buď polyklonálních nebo monoklonálních protilátek s vytvořenými specifícitami. Tyto imunologické testy zahrnují typicky měření tvorby komplexu mezi DPRP a pro něj specifickou protilátkou. Výhodný je dvoumístný imunologický test založený na monoklonálních protilátkách, který využívá monoklonálních protilátek reagujících s dvěma neinterferujícími epitopy DPRP, ale může být také použit kompetitivní vazebný test.

Jak již bylo uvedeno, proteiny DPRP mohou být použity při léčení onemocnění. Farmaceutické prostředky vhodné pro použití v tomto provedení vynálezu zahrnují prostředky, ve kterých jsou účinné složky obsaženy - v účinném množství pro dosažení zamýšleného účelu v souvislosti s některým z výše uvedených onemocnění. Určení terapeuticky účinné dávky je schopen provést odborník v oboru a odhad lze na počátku provést buď v testech buněčné kultivace, např. nádorových buněk, nebo ve zvířecích modelech, obvykle myší, krys, králíků, psů nebo vepřů. Živočišný model může být také použit pro určení rozmezí vhodné koncentrace a způsobu podávání, přičemž tyto informace se potom běžně používají pro určení použitelných dávek a způsobů podávání u lidí.

• · · · • ·

- 35 Terapeuticky účinná dávka označuje množství účinné látky, například DPRP nebo jejího fragmentu, protilátek proti DPRP nebo agonistů, antagonistů nebo inhibitorů DPRP, které odstraní konkrétní příznaky nebo stavy výše uvedených onemocnění, toto množství podávané pacientovi může být účinné pro rozštěpení požadovaného cílového substrátu při styku s ním. Terapeutická účinnost a toxicita může být podobně určena standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech, jako např. výpočtem ED50 (dávka terapeuticky účinná v 50 % populace) nebo LD50 (dávka letáiní pro 50 % populace). Poměr toxické k terapeutické dávce ovlivňuje terapeutický index látky, a ten může být vyjádřen jako poměr LD50/ED50. Farmaceutické prostředky, které mají vysoké terapeutické indexy, jsou výhodné. Údaje získané z testů na buněčných kulturách a studiích na zvířatech se používají pro nastavení rozmezí dávek pro použití u člověka. Dávky obsažené v těchto prostředcích spadají s výhodou do rozsahu koncentrací v krevním oběhu, které zahrnují ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Rozmezí dávek se liší v závislosti na použité dávkové formě, citlivosti pacienta a způsobu podávání. Přesné dávkování obvykle určí lékař podle faktorů souvisejících s pacientem, přičemž dávka a podávání se upraví tak, aby poskytly dostatečnou hladinu aktivní části nebo aby udržely požadovaný účinek. Přitom se berou v úvahu faktory včetně vážnosti stavu onemocnění, celkového zdraví pacienta, věku, hmotnosti a pohlaví pacienta, diety, doby a četnosti podávání, kombinace léčiv, citlivosti a tolerance nebo reakce na léčení. Farmaceutické prostředky s dlouhodobým působením mohou být podávány každé tři až čtyři dny, každý týden nebo dokonce jednou každé dva týdny v závislosti na poločase a rychlosti vylučování konkrétního prostředku.

Ještě další provedení vynálezu poskytuje molekuly polynukleotidu obsahující sekvence, které jsou v negativní (antisense) vzhledem k transkriptům mRNA pro polynukleotidy DPRP1, DPRP2 a DPRP-3. Podávání takové molekuly negativního polynukleotidu může « · · ·

- 36 blokovat produkci proteinu kódovaného DPRP-1, DPRP2 nebo DPRP3. Způsoby přípravy opačných molekul polynukleotidů a podávání těchto molekul jsou známé v oboru. Například negativní polynukleotidové molekuly mohou být zapouzdřeny do liposomů pro dosažení fúze s buňkami.

Konkrétně exprese DPRP-1, DPRP-2 a DPRP-3 ve specializovaných epiteliálních buňkách, imunitních buňkách (lymfocyty a B buňky), astrocytických tumorech a v různých rakovinách citlivých na hormonyy poskytuje důkaz potenciální úlohy při patofyziologii rakoviny, metaplasii a metastázách. Proto se další provedení vynálezu týká diagnostických testů pro detekci onemocnění souvisejících s nesprávnou aktivitou nebo hladinami exprese DPRP. Protilátky, které se specificky vážou na DPRP, mohou být použity pro diagnózu onemocnění charakterizovaných expresí DPRP nebo v testech monitorujících pacienty léčené DPRP nebo agonisty nebo antagonisty (inhibitory) DPRP. Protilátky použitelné pro diagnostické účely mohou být připravené stejným způsobem jako protilátky popisované výše pro léčebné účely. Diagnostické testy na DPRP zahrnují metody používající protilátku a značku pro detekci DPRP v tělesných tekutinách člověka nebo v extraktech buněk nebo tkání. Tyto protilátky mohou být použity s nebo bez modifikace, a mohou být označeny kovalentním nebo nekovalentním spojením s reportérovou molekulou. V oboru je známá široká škála reportérových molekul. Jako dominantní negativní inhibitory mohou být také použity rekombinantní proteiny DPRP, které byly modifikovány pro dosažení katalytické neaktivity. Tyto modifikace zahrnují například mutaci aktivního místa.

V oboru je známa celá řada protokolů pro měření DPRP včetně testů ELISA, RIA a FACS, které poskytují základ pro diagnostiku změněných nebo abnormálních hladin exprese DPRP. Normální nebo standardní hodnoty exprese DPRP se vytvářejí kombinací tělesných tekutin nebo buněčných extraktů odebíraných od normálních savců, s výhodou člověka, s protilátkou proti DPRP za podmínek vhodných

- 37 pro tvorbu komplexu. Způsob detekce DPRP v biologickém vzorku by zahrnoval kroky: a) poskytnutí biologického vzorku; b) kombinace biologického vzorku a protilátky proti DPRP za podmínek, které jsou vhodné pro tvorbu komplexu mezi DPRP a protilátkou; a c) detekci tvorby komplexu mezi DPRP a protilátkou, čímž se zjistí přítomnost DPRP v biologickém vzorku. Intenzita tvorby komplexu může být kvantifikována různými způsoby, s výhodou fotometricky. Množství DPRP exprimovaná u pacienta, kontrol a vzorků onemocnění z tkání získaných biopsií se porovnávají se standardními hodnotami. Odchylky mezi standardní a zjištěnou hodnotou vytvářejí parametry pro diagnostiku onemocnění.

V dalším provedení vynálezu se polynukleotidy kódující DPRP používají pro diagnostické účely, přičemž tyto polynukleotidy mohou zahrnovat oligonukleotidové sekvence, komplementární molekuly RNA a DNA a molekuly PNA. Tyto polynukleotidy mohou být použity pro detekci a kvantifikaci genové exprese u bioptických vzorků tkání, ve kterých může exprese DPRP korelovat s některým z výše uvedených onemocnění. Tento diagnostický test může být použit pro odlišení mezi nepřítomností, přítomností a zvýšením exprese DPRP a pro monitorování řízení hladin DPRP v průběhu terapeutického zásahu. Navíc může být použita analýza farmakogenomického, jednonukleotidového polymorfismusu (SNP) genů DPRP jako metoda pro screening mutací, které indikují predispozici na onemocnění nebo odlišnou reakci na léčiva.

Polynukleotidové a polypeptidové sekvence DPRP, jejich fragmenty, protilátky proti DPRP, a agonisté, antagonisté nebo inhibitory DPRP mohou být použity jako nástroje pro identifikaci molekulárních rozpoznávacích dějů a tedy proteinů, polypeptidů a peptidů, které interagují s proteiny DPRP. Specifickým příkladem jsou peptidové knihovny předkládané na povrchu fágů (panning), kde je možno v jediném cyklu testovat více než 10⁸ peptidových sekvencí. Tyto metody stejně jako další metody jsou v oboru známé a mohou být

- 38 použity pro identifikaci sloučenin, které inhibují nebo zesilují aktivitu DPRP-1, DPRP-2 nebo DPRP-3. Vazby v párech reprezentují funkční interakce jako jsou komplexy nebo biochemické cesty a proteiny interagující s proteiny DPRP mohou být identifikovány kvasinkovým dvouhybridním systémem, proteomicky (diferenciální dvourozměrná analýza gelu a hmotnostní spektrometrie) a genomicky (diferenciální exprese genu v mikrosouborech nebo sériová analýza genové exprese SAGE). Proteiny identifikované jako funkčně související s proteiny DPRP a způsob interakce tvoří základ způsobů screeningu na inhibitory, agonisty a antagonisty a modulátory těchto interakcí DPRPprotein.

Termín „antagonista“, jak se zde používá, označuje inhibitor molekuly, který při navázání na DPRP snižuje množství nebo trvání účinku biologické nebo imunologické aktivity DPRP, např. snižuje enzymatickou aktivitu peptidázy odštěpit N-koncový dipeptid. Mezi antagonisty mohou patřit proteiny, nukleové kyseliny, uhlohydráty, protilátky nebo jakékoli jiné molekuly, které snižují účinek DPRP; mohou sem např. patřit malé molekuly a organické sloučeniny, které se vážou na DPRP a inaktivují jej kompetitivním nebo nekompetitivním mechanismem. Specifické příklady tetrapeptidických inhibitorů enzymatické aktivity DPRP se popisují v příkladech 6 a 7. Inhibitory mohou být například inhibitory proteázové aktivity DPRP nebo alternativně inhibitory vazebné aktivity DPRP na proteiny, se kterým interaguje. Specifické příklady těchto inhibitorů mohou zahrnovat např. protilátky proti DPRP, peptidy, proteinové fragmenty nebo malé peptidylproteázové inhibitory nebo malé nepeptidové inhibiční organické molekuly, které jsou formulovány v prostředí, které umožní zavedení do požadovaného typu buněk. Tyto inhibitory mohou být alternativně navázány na směrovací ligandy pro zavádění endocytózou zprostředkovanou buňkami a jinými ději zprostředkovanými receptory. Tyto metody se budou dále popisovat a odborník v oboru je může • · · · provádět na základě nukleotidových a aminokyselinových sekvencí DPRP popisovaných v předkládané přihlášce.

Další použití DPRP je pro screening potenciálních antagonistů použitelný jako léčiva, např. pro inhibici vazby na DPRP stejně jako pro screening na agonisty. DPRP, jeho imunogenní fragmenty nebo jeho oligopeptidy mohou být použity pro screening knihoven sloučenin, které přicházejí v úvahu jako antagonisté nebo agonisté v různých technikách screeningu léčiv. Fragment používaný při takovém screeningu může být volný v roztoku, fixovaný na pevný nosič, může být nesen na povrchu buňky nebo lokalizován intracelulárně. Potom se měří tvorba vazebných komplexů mezi DPRP a testovaným prostředkem. Další testy zaměřené na odhalování antagonistů, které budou inhibovat DPRP, jsou zřejmé z US patentů No. 6,011,155, 6,107,317, 6,110,949, 6,124,305 a 6,166,063, které popisují inhibitory DPPIV. Další použití těchto proteinů DPRP, které přichází v úvahu, je pro screening inhibitorů DPPIV, kdy se má ukázat, že inhibitory nebudou mít nežádoucí vedlejší účinky současné inhibice jednoho nebo více proteinů DPRP.

Způsob poskytovaný pro screening knihovny malých molekul pro identifikaci molekuly, která váže DPRP, obecně zahrnuje následující kroky: a) poskytnutí knihovny malých molekul; b) kombinaci knihovny malých molekul s polypeptidem kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO. 1, 3 nebo 5 nebo jejich fragmentem za podmínek, které jsou vhodné pro tvorbu komplexu; a c) detekci tvorby komplexu, přičemž přítomnost takového komplexu identifikuje malou molekulu vázající DPRP.

Další způsob identifikace antagonisty zahrnuje dodání malé molekuly, která váže DPRP na extrakty z buněk transformovaných vektorem exprimujícím DPRP spolu s chromogenním substrátem (např. Ala-Pro-AFC nebo Ala-Pro-AMC) za podmínek, kdy by normálně docházelo ke štěpení, a potom testování inhibice štěpení enzymem monitorováním změn fluorescence nebo absorpce UV záření,

- 40 spektrofotometricky apod. pro identifikaci molekul, které inhibují štěpení. Snížená reakční rychlost nebo celková intenzita fluorescence nebo absorpce UV záření v přítomnosti molekuly zaručuje, že malá molekula je antagonistou, který snižuje katalytickou/enzymatickou aktivitu DPRP. Jakmile jsou takové molekuly identifikovány, mohou být podávány pro snížení nebo inhibici štěpení prostřednictvím DPRP.

Termín „agonista“, jak se zde používá, označuje molekulu, která po navázání na DPRP sníží nebo prodlouží trvání účinku DPRP. Mezi agonisty mohou patřit proteiny, nukleové kyseliny, karbohydráty nebo jakékoli další molekuly, které se vážou na DPRP a modulují jeho účinky. I když je méně pravděpodobné, že se prokáže účinnost malých molekul jako agonistů DPRP, způsob identifikace takové malé molekuly, která se váže na DPRP jako agonista, zahrnuje dodání chromogenní formy malé molekuly vázající se na DPRP do buněk transformovaných vektorem exprimujícím DPRP a testování změn fluorescence nebo absorpce UV záření spektrofotometricky. Zvýšená intenzita UV absorpce nebo fluorescence by ukazovala, že malá molekula je agonistou zvyšujícím aktivitu DPRP.

Další způsob screeningu léčiv, který se může používat, poskytuje vysoce výkonný screening sloučenin s vhodnou vazebnou afinitou ke sledovanému proteinu, jak se popisuje ve zveřejněné přihlášce PCT WO 84/03564. Při tomto způsobu se syntetizují na pevném substrátu jako jsou hroty z plastické hmoty nebo jiný povrch, velká množství různých malých testovaných sloučenin. Testované sloučeniny se ponechají reagovat s DPRP nebo jeho fragmenty a potom se promyjí. Vazba DPRP se potom detekuje způsoby známými odborníkům v oboru. Čištěný DPRP může být také potažen přímo na destičky používané při výše popisovaných technikách screeningu léčiv, alternativně mohou být pro zachycení peptidu a imobilizaci na pevný nosič použity neneutralizující protilátky.

• · • · * · • · • · · ·

V dalším provedení se může používat kompetitivních testů screeningu léčiv, při kterých neutralizující protilátky schopné vázat DPRP specificky soutěží s testovanou sloučeninou o vazbu na DPRP. Takovým způsobem se mohou používat protilátky pro detekci přítomnosti jakéhokoli peptidu, který sdílí jednu nebo více antigenních determinant s DPRP.

Jak je uvedeno výše, výzkumem vazebných míst je možno navrhnout ligandy, které mají například větší počet interakcí s DPRP než se svými přirozenými ligandy. Takové antagonistické ligandy se budou na DPRP vázat s vyšší afinitou a budou tak fungovat jako kompetitivní ligandy. Alternativně je možno navrhnout syntetické nebo rekombinantní proteiny homologní nebo analogické s vazebným místem ligandu nativního DPRP, jako mnoho jiných molekul s vysokou afinitou DPRP. Tyto molekuly by také měly být schopné vytěsnit DPRP a poskytnout ochranný účinek.

Jak je uvedeno výše, znalost struktur DPRP umožňuje návrh homologů a analogů obsahujících syntetické vazebné místo. Tyto molekuly značně usnadní využití vazebných schopností pro směrování potenciálních terapeutických látek a mohou být také použity pro screening potenciálních terapeutických látek. Dále mohou být použity jako imunogeny při produkci monoklonálních protilátek, přičemž protilátky samotné mohou být- použity pro diagnózu a/nebo léčení, jak bylo popsáno výše.

Protože několik členů prolyloligopeptidázové skupiny S9B je všeobecně exprimováno, buněčné linie s cíleným rozbitím genu DPPIV, DPRP-1, DPRP-2, DPRP-3, FAP a DPPVI za vytvoření nulového fenotypu budou mít velký význam pro napomáhání při screeningu na selektivní a účinné sloučeniny. Předkládaný vynález tedy poskytuje takové buněčné linie upravené genetickým inženýrstvím s elementy DNA kazetou Lox-Neo IRES tk a kazetou GFP-IRES-Neo Knock-in/out pro konstrukci vektorů směrovaných na somatické geny.

«φ « ·

- 42 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování a exprese genů DPRP s použitím savčího expresního systému

Fragmenty DNA kódující úplný polypeptid DPRP-1 byly amplifikovány použitím oíigonukleotidových primerů PCR odpovídajících 5' a 3' sekvencím genu, tj. SEQ ID NO. 45 a No. 46. Navíc byly fragmenty DNA kódující úplný polypeptid DPRP-2 amplifikovány použitím oíigonukleotidových primerů PCR odpovídajících 5' a 3' sekvencím tohoto genu, tj. SEQ ID NO. 50 a No. 51. Dále byly amplifikovány fragmenty DNA kódující úplný polypeptid DPRP-3 použitím PCR oíigonukleotidových primerů odpovídajících 5' a 3' sekvencím tohoto genu, tj. SEQ ID NO. 55 a No. 56.

Tyto tři amplifikované sekvence byly izolovány z 0,7% agarózového gelu použitím komerčně dostupného kitu (GFX PCR DNA a Gel Band Purification Kit, Amersham Pharmacia Biotech lne., Piscataway NJ, USA). Fragmenty byly potom vloženy do klonovacího vektoru, pGEM-7Zf(-) (Promega Corporation, Madison Wl, USA) a sekvenovány. Odpovídající klonovací konstrukty byly označeny pGEM7-DPRP1, pGEM7-DPRP2 a pGEM7-DPRP3. Sekvence DNA kódující zkrácené formy DPRP-1 nebo DPRP-2 nebo DPRP-3 byly amplifikovány použitím pGEM7-DPRP1 nebo pGEM7-DPRP2 nebo pGEM7-DPRP3 jako templátu a PCR oíigonukleotidových primerů. SEQ ID NO. 45 a No. 47 byly použity pro DPRP-1; SEQ ID NO. 50 a No. 52 byly použity pro DPRP-2; a SEQ ID NO. 57 a No. 58 pro DPRP3. Amplifikované sekvence byly znovu izolovány z 0,7% agarózového gelu použitím stejných purifikačních kitů a subklonovány do pGEM7Zf(-). Získané konstrukty byly nazvány pGEM7-DPRP1f, pGEM7 DPRP2f a pGEM7-DPRP3f.

• ♦ 9 9 » * · • · » • ♦ • 9 · · 9 9 • 99 • · 9

- 43 Pro přípravu DPRP-1 savčího expresního konstruktu byl pGEM7DPRP1 štěpen restrikčními enzymy Kpnl a Notl pro uvolnění úplného genu DPRP-1. Fragment DNA nesoucí gen DPRP-1 byl čištěn jako pruh na gelu s použitím výše uvedeného kitu a potom vložen do expresního vektoru pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) pro přípravu nativního expresního konstruktu DPRP-1, který byl nazván pcDNADPRPI. pGEM7-DPRP1f byl štěpen restrikčními enzymy Xbal a Hindlll pro uvolnění zkráceného genu DPRP-1f. Fragment DNA nesoucí gen DPRP-1f byl čištěn jako pruh na gelu použitím výše popsaného a potom vložen do expresního vektoru pcDNA3,1(-)/mycHis A (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) pro přípravu označeného DPRP1 expresního konstruktu pcDNA-MycHis-DPRP1.

Pro přípravu savčího expresního konstruktu DPRP-2 byl pGEM7DPRP2 štěpen restrikčními enzymy Hindlll a BamHI pro uvolnění úplného genu DPRP-2. Fragment DNA nesoucí gen DPRP-2 byl čištěn jako pruh na gelu s použitím výše uvedeného kitu a potom vložen do expresního vektoru pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) pro přípravu nativního expresního konstruktu DPRP-2, který byl označen pcDNA-DPRP2. pGEM7-DPRP2f byl štěpen restrikčními enzymy EcoRI a BamHI pro uvolnění zkrácené formy genu DPRP-2f. Fragment DNA nesoucí gen DPRP-2f byl čištěn jako pruh na gelu použitím výše uvedeného kitu a potom vložen do expresního vektoru pcDNA3.1(-)/myc-His B (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) pro přípravu značeného expresního konstruktu DPRP-2 označeného jako pcDNAMycHis-DPRP2.

Pro přípravu savčího expresního konstruktu DPRP-3 byl pGEM7DPRP3 štěpen restrikčními enzymy EcoRI a Xhol pro uvolnění úplného genu DPRP-3. Fragment DNA nesoucí gen DPRP-3 byl čištěn jako pruh na gelu s použitím výše uvedeného kitu a potom vložen do expresního vektoru pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) pro přípravu nativního expresního konstruktu DPRP-3 nazvaného pcDNADPRP3. pGEM7-DPRP3f byl štěpen restrikčními enzymy Nhel a Apal ·« ··> » · · e pro uvolnění zkráceného genu DPRP-3f. Fragment DNA nesoucí gen DPRP-3f byl čištěn jako pruh na gelu použitím výše uvedeného kitu a potom vložen do expresního vektoru pcDNA3.1(-)/mycHis B (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) pro přípravu značeného expresního konstruktu DPRP-3 pcDNA-MycHis-DPRP3.

Příklad 2

Rozložení exprese genů DPRP v lidských tkáních

Pro zjištění míry exprese různých mRNA pro polypeptidy podle předkládaného vynálezu v lidských tkáních byla použita kvantitativní analýza PCR. Na řadě lidských buněčných linií včetně bez omezení buněk rakoviny prostaty (LNCaP, PC3, DU145), linie MLTC-1 (myší varlata) a buněk MDA-MB231 (rakovina mléčné žlázy) byla také prováděna RT PCR. Pruhy s očekávanými velikostmi pro DPRP-1, DPRP-2 a DPPIV byly všechny exprimovány v různých buněčných rakovinných liniích, přičemž s velmi nízkou hladinou byl také exprimován FAP.

Analýza northernovym přenosem

Analýza northernovým přenosem byla prováděna s 2 pg poly(A)⁺ RNA izolované z osmi různých tkání použitím sond DPRP. Konkrétně jako sonda pro lidský Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, Calif.) byl použit N-koncový fragment 1 kb, který byl radioaktivně značen tvorbou náhodných primerů v přítomnosti ³²PdCTP (A. P. Feinberg a další, Anal. Biochem, 132, 6 (1983)). Hybridizace byla prováděna při 68 °C přes noc v hybridizačním roztoku ExpressHyb™ (Clontech, Palo Alto, Calif.). Přenosy byly nejprve promyty při laboratorní teplotě ve 2 x SSC a 0,05% SDS a potom promyty při 60 °C (DPRP-1 & DPRP-2) a 50 °C (DPRP-3) v 0,1 x SSC a 0,1% SDS.

- 45 Analýza northernovým přenosem ukázala expresi DPRP-1 v několika tkáních, přičemž nejvýznamnější signál se ukázal ve varlatech, prostatě, svalech a mozku. Ve varlatech byly ukázány tři transkripty s přibližnou délkou 7,5, 4,5 a 2,5 kb. Kratší molekuly mRNA byly ve velkém nadbytku ve varlatech, ale v nepatrných stopách v jiných testovaných tkáních. DPRP-2 byl přítomen všude v každé tkáni, přičemž nejvyšší hladiny byly zjištěny v játrech a svalu a převžující transkript měl velikost 5kb. Exprese DPRP-3 byla omezena na mozek a pankreas. Další analýza byla prováděna pro tyto tři proteázy ve specifických oblastech mozku (cerebellum, cortex, medulla, mícha, okcipitální lalok, frontální lalok, temporální lalok a putamen). DPRP-1 byl exprimován ve všech oblastech s nízkou hladinou v míše, zatímco DPRP-2 byl exprimován ve všech testovaných oblastech mozku.

Oligonukleotidové primery SEQ ID NO. 48 a No. 49 byly použity pro kvantitativní PCR DPRP-1, zatímco oligonukleotidové primery SEQ ID NO. 53 a No. 54 byly použity pro kvantitativní PCR DPRP-2. Jako templáty pro normalizovanou cDNA byly použity systémy Human Multiple Tissue cDNA (MTC™) Panel I a Panel II (Clontech, Palo Alto CA, USA). 0,5 ng každé cDNA bylo použito v 25 pl reakce PCR s konečnou koncentrací každého primeru 300 nM. Reakce PCR byla prováděna použitím kitu SYBR Green PCR Core Reagents Kit (Applied Biosystems, Foster City CA, USA) a detekce byla prováděna systémem detekce sekvencí Applied Biosystems GeneAmp 5700. Byly použity parametry cyklování teploty doporučené výrobcem, např. 50 °C 2 min, 95 °C 10 min, potom 40 cyklů 95 °C 15 s a 60 °C 1 min. Získané údaje ukazují relativně vysoké hladiny exprese pro DPRP-1 i DPRP-2 v pankreatu, vaječnících a varlatech, a zvláště vysokou hladinu DPRP-2 v játrech.

• ·

- · · · · · ·

Příklad 3

Produkce polyklonálních protilátek proti DPRP a westernový přenos

Aminokyselinová sekvence odvozená od cDNA kódující DPRP-1 byla analyzována použitím softwaru DNASTAR (DNASTAR, lne.) pro zjištění oblastí s vysokou imunogenicitou a odpovídající oligopeptid byl syntetizován a použit pro indukci protilátek proti DPRP-1. Postup byl opakován pro DPRP-2 a DPRP-3. Volba vhodných peptidových sekvencí a způsoby produkce protilátek jsou dobře známé odborníkům v oboru. V oboru je také dobře známá volba vhodných epitopů, jako jsou epitopy v blízkosti C-konce nebo v hydrofilních oblastech.

Typicky byly syntetizovány oligopeptidy o délce přibližně 15 až 20 zbytků, např. SEQ ID NO. 59 pro DPRP-1, SEQ ID NO. 60 pro DPRP-2 a SEQ ID NO. 61 pro DPRP-3, použitím syntezátoru Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431 A. Byly použity chemické reakce s Fmoc a peptidy o délce 19 nebo 15 zbytků byly vázány na hemocyanin plže Megathura crenulata (KLH, Sigma, St. Louis, Mo.) reakcí s N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidesterem (MBS). Králíci byli imunizováni komplexem oligopeptid-KLH v kompletním Freundovu adjuvans. Získaná antiséra byla testována na protipeptidovou aktivitu, např. vazbou peptidu na plastickou hmotu, blokováním 1% BSA, reakcí s králičím antisérem, promytím a reakcí s kozím protikráličím IgG značeným radioaktivním jodem.

Westernový přenos byl prováděn použitím normálních lidských proteinových vzorků (Protein Medley) (získaných od firmy Clontech (přibližně 36 pg celkových proteinů). Proteiny byly frakcionovány na 10% SDS-polyalrylamidových gelech a převedeny na 0,45 pm nitrocelulózové membrány. Membrány byly blokovány ve fyziologickém roztoku s Tris-pufrem (TBS) s 0,05% Tween 20 a 1% BSA. Protilátky specifické proti DPRP-1 nebo DPRP-2 byly použity jako primární protilátky zředěné 1 : 5000 ve fyziologickém roztoku s Tris-pufrem s 0,05% Tween 20 (TBST) a kozí protikráličí IgG konjugovaný • ·

-47^-···· ·· ·· · ··'*..* s alkalickou fosfatázou (AP) (Promega) byl zředěn ve stejném pufru před použitím 1 : 5000. Pozitivní reakce byla zviditelněna inkubací membrány se substrátem Western Blue Stabilized Substráte (Promega) pro AP, dokud se neukázaly požadované pruhy s vhodnou intenzitou. Proteiny DPRP-1 a DPRP-2 byly detekovány v mozku, svalech, ledvině, prostatě, varlatech a vaječnících. DPRP-1 a DPRP-2 byly syntetizovány ve formě o velikosti přibližně 101 kDa (101 000) a 100 kDa (100 000), což je v dobré shodě s molekulovými hmotnostmi odhadnutými pro příslušné primární struktury, jak je ukázáno v tabulce

3.

Tabulka 3

Předpovězená molekulová hmotnost, počet potenciálních Nvázaných glykosylačních míst (zbytky Asn) a předpovězené hodnoty pl pro DPRP-1, DPRP-2 a DPRP-3, získané na základě analýzy sekvence použitím metody vyvinuté autory Hopp a Woods, Proč. Nat. Acad. Sci. 78: 3824 - 3828 (1981).

	Mh (Da)	Počet Asn	Pl
DPRP1	101 422	26	5,39
DPRP2	98 263	27	6,01
DPRP3	90 914-	33	6,11

Bylo pozorováno několik dalších pruhů s podobnou molekulovou hmotností. Tyto pruhy jsou patrně způsobeny přítomností posttranslační glykosylace proteinů. Tabulka 3 také ukazuje počet potenciálních N-glykosylačních míst pro proteiny DPRP. Přítomnost glykosylovaných a neglykosylovaných forem proteinů byla vyhodnocována použitím tunikamycinu, inhibitoru syntézy oligosacharidů. Je zřejmé, že menší formy byly neglykosylované • · ·

- 48 formy. Korelace mezi mRNA (northernův přenos) a množstvím proteinů (westernův penos) pro DPRP-1 je ukázána v tabulce 4.

Tabulka 4

Korelace množství mRNA a expresí proteinů DPRP-1 v lidských tkáních

	Srdce	Mozek	Placenta	Svaly	Ledvina	Prostata	Varle	Vaječník
Northern	++	+++	+	+++	++	+++	++++	+
Western	-	++++	-	+	++	+	+++	+++

Příklad 4

Imunohistochemická lokalizace proteinů DPRP v lidských tkáních

Z různých formaldehydem fixovaných a v parafinu zalitých lidských tkání byly připraveny řezy 4 pm. Řezy tkání byly zbaveny parafinu čtyřnásobným ponořením ve směsi xylenů po dobu 5 min a potom převedeny odstupňovanou řadou alkoholových roztoků do destilované vody. Byla použita metoda Steam heat induced epitope recovery (SHIER) s několika různými roztoky SHIER s a bez enzymatického štěpení tkáně při dvou různých koncentracích (Ladner a další, Cancer Res., 60, str. 3493 - 3503, 2000). Kroky zpracování a ředění protilátek jsou uvedeny dále.

1. Blokovací činidlo 15 min (normální kozí sérum)

2. Primární protilátka s inkubací 25, 60 min nebo přes noc

3. Sekundární protilátka 25 min (biotinylovaná kozí protilátka proti králičímu IgG)

4. Blokování endogenní peroxidázou 3 x 1,5 min

5. ABC (komplex avidin-biotin)/křenová peroxidáza 25 min

6. DAB chromogen 3x5 min (hnědý reakčni produkt)

7. Barvení Light Hematoxylin Counter Stain 1 min • · • · • · • ·

- 49 • · · · · ·

Pro zajištění správných chemických reakcí pro detekci a reakcí s antigenem byly prováděny pozitivní kontroly. Králičí IgG byl použit jako negativní kontrola. Pro detekci protilátky proti DPRP-1 byl použit systém barvení tkání na bázi avidinu-biotinu. Jako reporterový enzym byla použita křenová peroxidáza s DAB jako chromogenem. Po barvení byly řezy dehydratovány převedením řadou alkoholových roztoků do absolutního ethanolu a potom opláchnuty xylenem. Byly připraveny trvalé preparáty použitím krycích sklíček a materiálu permount. Digitální obrázky příslušného barvení, kde pozitivní vybarvení bylo ukázáno tmavě hnědým chromogenem (reakční produkt DAB-HRP) byly pořízeny videokamerou firmy Olympus. Barvení hematoxylinem poskytne modré zbarvení jádra pro zjištění morfologie buňky a tkáně.

Polyklonální králičí protilátka proti DPRP-1 značí formaldehydem fixované, do parafinu zalité lidské tkáně včetně normálních varlat, prostaty, endometriálních žláz, mandlí a pankreatu. Přítomnost se také ukazuje v endoteliálních buňkách normálních vaječníků, močového měchýře a ledvin. Zbarvení bylo lokalizováno v cytoplasmě, v epiteliálních a některých stromálních buňkách jako jsou fibroblasty, endoteliální buňky a lymfocyty. Je zajímavé, že v normálních varlatech testovaných protilátkami proti DPRP-1 byla zjištěna rozdílná exprese v Leydigových buňkách a vícejaderných makrofázích nalezených v intersticiální tkáni, což je prostor obklopující semenotvorné tubuly. Bbuňky byly barveny protilátkou proti DPRP-1.

Příklad 5

Exprese proteinů DPRP a jejich čištění v savčích a hmyzích buňkách

Plasmidová DNA pcDNA-DPRP1, pcDNA-MycHis-DPRP1, pcDNA-DPRP-2 nebo pcDNA-MycHis-DPRP2 byla transfekována do buněk PEAK (EdgeBioSystems, Gaithersburg MD, USA) nebo COS-1 (ATCC CRL-1650) použitím činidla LipofectAmin (Life Technologies, • · • · · · • · · · · · ······· ·« • · · · « · » ·····» ·· · ,· » ,

- 50 Gaithersburg MD, USA) způsobem doporučeným výrobcem. Transfekované buňky byly udržovány v médiu DMEM s 5% FBS při 37 °C v 5% CO₂ 48 hod. Buňky byly potom odděleny a použity pro extrakci rekombinantního proteinu. Buňky byly sklizeny 48 hod po transfekci, homogenizovány a centrifugovány při 18 000 x g 40 min. Supernatanty byly odděleny jako cytosolové frakce. Tato frakce byla nanesena na kolonu TALON spin column (Clontech), a proteiny značené His byly eluovány 50 mM PBS, 150 mM imidazol, pH 7. Rekombinantní proteiny potom byly detekovány westernovým přenosem protilátkou anti-myc a zviditelněny systémem ProtoBlot II AP systém (Promega). Rekombinantní afinitně čištěné fúzní produkty DPRP-1 a DPRP-2 byly detekovány westernovým přenosem a DPRP-1 a DPRP-2 byly syntetizovány podle předpovědi ve formách o velikosti 112 kDa (112 000) a 109 kDa (109 000).

Přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní proteiny DPRP byly v podstatě vyčištěny imunoafinitní chromatografií použitím protilátek specifických pro DPRP-1, DPRP-2 nebo DPRP-3. Imunoafinitní kolona byla vytvořena kovalentním navázáním protilátek proti DPRP na aktivovanou chromatografickou pryskyřici, jako je CNBr-aktivovaný materiál Sepharose (Pharmacia & Upjohn). Po navázání byla pryskyřice blokována a promyta podle doporučení výrobce.

Média nebo buněčné extrakty obsahující proteiny DPRP byly převedeny přes imunoafinitní kolonu a kolona byla promyta za podmínek umožňujících přednostní absorpci proteinů DPRP (například pufry s vysokou iontovou sílou v přítomnosti detergentu). Kolona byla eluována za podmínek rozrušujících vazbu protilátka/DPRP (např. pufr s pH 2 až 3 nebo vysoká koncentrace chaotropního činidla, jako je močovina nebo thiokyanátový iont) a vyčištěný DPRP byl izolován.

- 51 Příklad 6

Enzymatická aktivita proteinů DPRP a způsoby screeningu na inhibitory

Kinetické vlastnosti rekombinantních proteinů DPRP-1 a DPRP2 byly zjišťovány kontinuálním fluorimetrickým testem, optimalizace pufru, pH a teploty vedly k následujícím podmínkám testů: enzymatické testy byly prováděny v 50 mM PBS, pH 7,4, přičemž 50 pl (50 pg/ml) vyčištěných enzymů bylo smíseno s 1 pl různé koncentrace Ala-Pro-AMC (Enzyme Systems). Destičky byly potom inkubovány při 37 °C 30 min a fluorescence byla detekována fluorimetrem Wallac 1420 s λ excitace 40355 a λ emise 535. Hodnoty K_m pro DPRP-1 a DPRP-2 byly podobné (208, popř. 161 μΜ).

Další biochemické charakterizace ukazují, že DPRP-1 a DPRP-2 mají podobné profily jako DPPIV. Tyto dvě vyčištěné proteázy a DPPIV byly předinkubovány s inhibitory při laboratorní teplotě 30 min. Potom byl přidán substrát, Ala-Pro-AMC (100 μΜ), a intenzita fluorescence byla zaznamenávána jako 60 měření v průběhu 60 min. Ireverzibilní inhibitor serinové proteázy AEBSF, byl jediný testovaný inhibitor, který prokázal silnou inhibici všech tří enzymů (tabulka 5). To potvrzuje předpověď strukturní a doménové analýzy, že tyto proteiny náležejí do vyšší skupiny serinových proteáz.

• ·

- 52 Tabulka 5

Inhibice DPRP-1 a DPRP-2 inhibitory proteáz

Inhibitor	Vladnost inhibitoru	Koncentrace	Zbytková aktivita (% kontroly)
DPRP-1	DPRP-2	DPPIV
AEBSF	serinový, ireverzibilní	5 mM	29,6	23,9	21,1
Aprotinin	serinový, reverzibilní	5 pg/ml	77,5	63,2	80,2
Pepstatin	aspartátový, reverzibilní	2 pg/ml	97,3	95,0	93,5
DTT	cysteinový	2 mM	100,1	94,8	98,3
B-Merkapto- ethonal	cysteinový	100 mM	93,2	84,0	98,0
EDTA	metalický, reverzibilní	2 mM	91,5	86,0	93,5
Leupeptin	serinový, reverzibilní	50 pg/ml	91,1	90,4	90,7

Navíc k Ala-Pro-AMC prokázaly také další testované substráty, že DPRP-1 a DPRP-2 jsou dipeptidylpeptidázy. Údaje byly odvozeny ze zjištění změny fluorescence po 30 minutové inkubaci substrátů (125 μΜ) s enzymy jako procenta naměřené fluorescence na Ala-ProAMC a Gly Pro-AMC, což byly jediné dobré substráty mezi testovanými.

« · • ·

CQ · · · ··« ·.· “ DO -···· ·· ·· · «»

Tabulka 6

Údaje prokazující, že DPRP-1 a DPRP-2 jsou dipeptidylpeptidázy

Substrát	% změny fluorescence ve 30 min
	DPRP-1	DPRP-2	DPPIV
Ala-Pro-AMC	239,0	127,5	379,0
Gly-Pro-AMC	341,5	205,0	444,0
Ala-Pro-pNA	45,5	44,0	29,5
Pro-pNA	-1	-2,5	0,0
Gly-Arg-pNA	-4,5	-0,5	0,0
Lys-Ala-pNA	2,5	0,5	0,5
Ala-Fe-Pro-pNA	-4	-0,5	2,0

Dále byly testovány di-, tri- a tetrapeptidy s přirozenými a nepřirozenými aminokyselinami s cílem nalézt optimální substrát pro testování každého z proteinů DPRP, který by také ukázal sníženou aktivitu při inkubaci s DPPIV.

Metoda enzymatického testu popisovaná níže je jednou z řady metod, které mohou být použity pro screening peptidových a nepeptidových inhibitorů enzymů DPRP. Pro nalezení inhibitorů enzymatické aktivity byly testovány knihovny tetrapeptidových inhibitorů. Inhibitory, které připadaly v úvahu, byly připraveny ve formě 10 až 20 mM zásobních roztoků v DMSO a byly uchovávány při -20 °C. Byla prováděna ředění v testovacím pufru. Inhibice byla zjišťována srovnáváním změn fluorescene inhibovaného enzymu se změnami fluorescence kontrolního enzymu (vehikula). Hodnotu inhibice v procentech je možno zjistit podle rovnice 100-(fluorescenční jednotky vzorku/fluorescenční jednotky kontroly x 100). Procenta inhibice a koncentrace inhibitoru, při které docházelo k 50% inhibici (IC₅₀) byly zjišťovány vynesením závislosti inhibice v procentech na • · ·····► ·· · ·e

- 54 koncentraci inhibitoru v logaritmickém měřítku. Jak je ukázáno na obr. 3, několik tetrapeptidových amidů inhibovalo enzymatickou aktivitu, přičemž údaje jsou vyjádřeny jako procenta aktivity v přítomnosti samotného vehikula (0,02% DMSO). Sloučeniny byly přidávány v koncentraci 1 mM. Nejzajímavější byla zřejmá rozdílná aktivita některých tetrapeptidů pro DPRP-1 a DPRP-2 ve srovnání s DPPIV. Zatímco všechny tři enzymy byly inhibovány peptidem-1, pouze DPRP1 a DPRP-2 byly výrazně inhibovány peptidem-4 a peptidem-5. To ukazuje, že je možno dosáhnout selektivní inhibice čištěných enzymů.

Test popsaný v tomto příkladu může být také použit pro screening dalších knihoven syntetických nebo v přírodě se vyskytujících sloučenin včetně makromolekul na látky, které buď inhibují nebo zesilují aktivitu DPRP. Polypeptidy DPRP-1 a DPRP-2 pro použití při testu mohou být získány např. translací in vitro, rekombinantní expresí (viz příklad 5) nebo biochemickými postupy. Pro screening a identifikaci sloučenin, které inhibují DPRP-1, DPRP-2 nebo DPRP-3 mohou být také použity jiné metody, než které se zde popisují, např. vazebné testy jako je ELISA a RIA.

Příklad 7

Vliv inhibitorů DPRP na proliferaci lidských rakovinných buněk in vitro

Při pokusu o zjištění vlivu, které může mít několik inhibitorů aktivity DPRP-1 a DPRP-2 na proliferaci lidských rakovinných buněk, byly LNCap, PC3 a Du145, buněčná linie myších varlat MLTC-1 a buňky rakoviny mléčné žlázy MDA-MB231 vysety (10⁴ na jamku) do 96-jamkových destiček pro tkáňovou kultivaci a ponechány růst a přichytit se na 24 hod při 37 °C v inkubátoru CO2. Sloučeniny s různými ředěními (konečná ředění 0,1 nM až 10 μΜ) byly potom přidány do jamek na různé doby inkubace od 24 hod do 96 hod, přičemž každý den byly nahrazovány čerstvé sloučeniny. Přidání samotného diluentu DMSO sloužilo pro kontrolu. Po inkubaci s těmito • · · · * · • ·

- 55 sloučeninami při trojnásobných paralelních stanoveních byla zjišťována proliferace těchto buněk použitím testu buněčné proliferace XTT (Roche 1- 465-015). Destičky byly odečítány při 490 a 650 nm 5 hod po přidání směsi XTT. Zvýšení proliferace buněk bylo pozorováno u tří inhibitorů při koncentracích 0,1, 1, 10 a 100 x IC₅₀, a výsledky jsou ukázány v obr. 4A, 4B a 4C pro buňky PC3.

Celkově je možno říci, že proteiny DPRP se exprimují v široké řadě tkání, jak již bylo ukázáno amplifikaci mRNA, westernovým přenosem i imunohistochemicky. DPRP-1 byl v největším nadbytku zjištěn ve varlatech, přičemž měření se prováděla northernovým a westernovým přenosem. Velký počet expresních míst s adresou (EST) ze zdrojů cDNA z varlat, které jsou homologní s DPRP-1, také potvrzují zvýšenou expresi DPRP-1 ve varlatech. Příklad 4 popisuje imunohistochemickou lokalizaci proteinu DPRP-1 v lidském varleti s použitím specifické protilátky proti DPRP-1. DPRP-1 je silně exprimován v epiteloidních Leydigových buňkách, přičemž Leydigovy buňky jsou primárním zdrojem testikulárních androgenů (samčí steroidní hormony) u samců savců. V intersticiální tkáni varlat jsou Leydigovy buňky a makrofágy v těsné asociaci s procesem „digitace“ Leydigových buněk do struktury makrofágů. Vícejaderné buňky v těsné blízkosti Leydigových buněk byly také barveny protilátkou proti DPRP1, což ukazuje, že tato proteáza je také exprimována v makrofázích, a makrofágy a varlata mají důležitou úlohu při parakrinní regulaci Leydigových buněk. Cytokiny sekrenované testikulárními makrofágy jsou pro Leydigovy buňky mitogenní a mají důležitou úlohu při diferenciaci mesenchymálních prekurzorových buněk na zralé Leydigovy buňky. Jasnější porozumění proteinům a biochemické cesty účastnící se zrání varlat jsou důležité pro objevování nových způsobů léčení předčasné puberty. Navíc způsobují Leydigovy buňky tumory jako stromální tumory prostřednictvím produkce pohlavních steroidů (převážně testosteronu). Testosteron souvisí s několika druhy nádorů a onemocnění, jako je karcinom mléčné žlázy a rakoviny dělohy, • · ·« ··

- 56 karcinom vaječníků a androgenní alopecie (ztráta vlasů). Další vyšetření lokalizace proteinů DPRP v jiných žlázách v těle (např. nadledvinách), které produkují testosteron a jiné androgenní hormony, se v současnosti provádí. Možná asociace DPRP-1 s funkcemi biosyntetických biochemických cest steroidních a polypeptidových hormonů se v současnosti zkoumá a příklad 7 napomáhá pochopení úlohy proteinů DPRP v buněčných modelech prostaty, varlat a mléčné žlázy in vitro.

Imunohistochemická analýza také lokalizovala DPRP-1 do endometriálních žláz v děloze (viz příklad 4), pankreatických lalocích, glomerulách ledvin, plasmatických buňkách v močovém měchýři a sloupcových epiteliálních buňkách prostaty a málo diferenciované skvamózní metaplasii prostaty, karcinomu prostaty zařazeného do stupně 4 podle Gleasona a u benigní hyperplasie prostaty. Pozitivní barvení u karcinomu mléčné žlázy stejně jako u seminomu a skvamózní metaplasie prostaty ukazuje na obecnou souvislost DPRP1 s tkáněmi citlivými na hormony, zvláště u buněk, které se špatně diferencovaly. Přítomnost DPRP-1 ve specializovaných epiteliálních buňkách a zánětlivých plasmatických buňkách (lymfocyty) je také zajímavá. Zánětlivý karcinom mléčné žlázy obsahuje velké množství infiltrujících lymfocytů a má celkově špatnou prognózu. DPRP-1 a další proteiny DPRP se objevují v medulárních karcinomech, které typicky mají konstantní infiltrující lymfoplasmacytickou složku na periferii tumoru, o které se předpokládá, že představuje reakci tkání hostitele na nádor. Většina lymfocytů jsou T-buňky a většina plasmatických buněk jsou buňky produkující IgG. Několik antigenů je přítomno ve velkém množství na B-buňkách, podskupině buněk rakoviny mléčné žlázy a jiných epiteliálních rakovinných buňkách, přičemý tyto antigeny jsou cíle pro novou skupinu terapeutických monoklonálních protilátek, a již bylo dosaženo některých významných úspěchů s humanizovanou monoklonální protilátkou proti antigenu CD20 specifickému pro B-buňky. Je tedy zřejmé, že monoklonální • ·

- 57 protilátky proti proteinům DPRP jsou použitelné pro diagnostické a léčebné účely onemocnění, kterých se proteiny DPRP účastní, včetně rakoviny.

Exprese DPRP-1 ve specializovaných epiteliálních buňkách řady tkání ukazuje, že proteiny DPRP-1 a jiné proteiny DPRP se mohou účastnit jejich růstu a diferenciace. Testování s použitím inhibitorů popsaných v příkladu 6 v modelech rakoviny prostaty a varlat in vitro (příklad 7) ukázalo, že inhibitory DPRP-1/DPRP-2 způsobily 50 až 60% zvýšení proliferace buněk PC3 v nanomolárních koncentracích, jak je ukázáno na obr. 4A - 4C.

I když byl vynález popsán na výhodných provedeních, která tvoří nejlepší způsoby provedení známé autorům vynálezu, rozumí se, že je možno provádět změny a modifikace, které budou zřejmé odborníkům v oboru, aniž by došlo k odchýlení od rozsahu vynálezu, který je definován v přiložených nárocích. Tak např. i když se popis zaměřuje v některých případech na DPRP-1 a DPRP-2, předpokládá se podobná použitelnost DPRP-3 a jeho fragmentů stejně jako nukleových kyselin kódujících tyto molekuly. Konkrétní znaky vynálezu jsou uvedeny v následujících nárocích.

Zastupuje:

• · · • * • · • · · ·

Claims (61)

1. - 58 \s

   PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná nukleová kyselina, která kóduje (a) polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5, nebo (b) polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která s ním má alespoň přibližně 70% podobnost a vykonává stejnou biologickou funkci; nebo která je alternativní sestřihanou variantou jedné ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 a 6; nebo která je sondou obsahující alespoň 14 za sebou následujících nukleotidů z uvedené nukleové kyseliny kódující (a) nebo (b); nebo která je s jakoukoli výše uvedenou nukleovou kyselinou komplementární.
2. 2. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kterou je DNA nebo RNA.
3. 3. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kterou je transkript DNA obsahující celou délku některé ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 a 6, nebo která je komplementární s celou kódující oblastí některé ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 a 6.
4. 4. Nekódující oligonukleotid zaměřený proti DNA podle nároku 3.

   - 59 5. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kterou je transkript RNA obsahující celou délku kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO. 2, 4 a 6.

   6. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, která je alternativní sestřihanou variantou některé ze SEQ ID NO. 2, 4 a 6.

   7. Polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podle nároku 6.

   8. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, která kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která má alespoň přibližně 90% podobnost s některou ze sekvencí No. 1, 3 a 5.

   9. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, která kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která má alespoň přibližně 95% podobnost s některou ze sekvencí No. 1, 3 a 5.

   10. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, která kóduje polypeptid, který má alespoň přibližně 90% identitu s některou ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5.

   11. Sonda nukleové kyseliny podle nároku 1, obsahující alespoň 14 za sebou následujících nukleotidů z některé ze SEQ ID NO. 2, 4 a 6.

   12. Izolovaná molekula rekombinantního polynukleotidu, která obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1, plus prvky řídící » · · I » · · · 9 · k · » · I

   60 -......

   expresi operativně spojené s uvedenou nukleovou kyselinou pro řízení její exprese.

   13. Expresní vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 1 kódující polypeptid, který má úplnou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v některé ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5, operativně navázanou na promotor, přičemž tento expresní vektor je přítomen v kompatibilní hostitelské buňce.

   14. Savčí, hmyzí nebo bakteriální hostitelská buňka, upravená genetickým inženýrstvím vložením nukleové kyseliny podle nároku 1, která kóduje alespoň část zralého proteinu aminokyselinové sekvence SEQ ID NO. 1, 3 nebo 5.

   15. Způsob produkce polypeptidu, který obsahuje část zralého proteinu některé ze SEQ ID NO. 1,3a 5, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka podle nároku 11 kultivuje za podmínek dostačujících pro produkci uvedeného polypeptidu.

   16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e polypeptid se exprimuje na povrchu buňky, a dále se provádí krok izolace polypeptidu nebo jeho fragmentu z kultury.

   17. Polypeptid, který může být popřípadě glykosylovaný, a který (a) má aminokyselinovou sekvenci zralého proteinu uvedenou v kterékoli ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5;

   « · • · * · • · · · · · · «. ..

   • · · ·· » ·· »·« C« · a , • · · ··« · * » ·*··«· · · · · · * ·

   - 61 (b) má aminokyselinovou sekvenci zralého proteinu s alespoň přibližně 70% podobností s některým ze zralých proteinů z odstavce (a), a vykonává stejnou biologickou funkci;

   (c) má aminokyselinovou sekvenci zralého proteinu s alespoň přibližně 90% identitou se zralým proteinem z některé ze sekvencí SEQ ID NO. 1, 3 a 5; nebo (d) je imunologicky reaktivní fragment polypeptidu z odstavce (a).

   18. Polypeptid podle nároku 14, kterým je zralý protein s alespoň přibližně 90% podobností se zralým proteinem z odstavce (a).

   19. Polypeptid podle nároku 14, kterým je zralý protein s alespoň přibližně 95% podobností se zralým proteinem z odstavce (a).

   20. Polypeptid podle nároku 14, který má aminokyselinovou sekvenci zralého proteinu některé ze SEQ ID NO. 1, 3 a 5, nebo je jeho část, která vykonává stejnou biologickou funkci jako odpovídající zralý protein.

   21. Antagonista DPRP, který inhibuje biologickou funkci některého z uvedených zralých proteinů podle nároku 17, 18 a 19.

   22. Protilátka rozpoznávající polypeptid nebo fragment podle nároku 17.

   23. Protilátka podle nároku 22, která rozpoznává polypeptid s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO. 1, 3 nebo 5.

   • · · • « 4 « • · • · · • C

   24. Způsob screeningu sloučeniny schopné inhibovat enzymatickou aktivitu alespoň jednoho zralého proteinu podle nároku 17, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky: uvedený zralý protein se inkubuje spolu s vhodným substrátem pro uvedený zralý protein v přítomnosti jedné nebo více testovaných sloučenin nebo jejich solí, změří se enzymatická aktivita uvedeného zralého proteinu, naměřená aktivita se porovná se srovnatelnou aktivitou zjištěnou v nepřítomnosti testované sloučeniny, a vybere se testovaná sloučenina nebo sloučeniny, které snižují enzymatickou aktivitu.

   25. Způsob screeningu sloučeniny schopné inhibovat enzymatickou aktivitu DPPIV, která neinhibuje enzymatickou aktivitu alespoň jednoho ze zralých proteinů podle nároku 20, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky: uvedený zralý protein se inkubuje spolu s vhodným substrátem pro uvedený zralý protein v přítomnosti jednoho nebo více inhibitorů DPPIV nebo jeho solí, změří se enzymatická aktivita uvedeného zralého proteinu, naměřená aktivita se porovná se srovnatelnou aktivitou zjištěnou v nepřítomnosti inhibitoru DPPIV a vybere se sloučenina, která nesnižuje enzymatickou aktivitu uvedeného zralého proteinu.

   Zastupuje:

   • ♦ 1 · · » · · » ♦ · 4 4 9 * * · ·

   49 4 9 ·· 4 ·

   Souhrn výpisu sekvencí

   SEQ ID NO.

   1. Aminokyselinová sekvence DPRP-1

   2. Sekvence DNA DPRP-1

   3. Aminokyselinová sekvence DPRP-2

   4. Sekvence DNA DPRP-2
5. 5. Aminokyselinová sekvence DPRP-3
6. 6. Sekvence DNA DPRP-3
7. 7. Aminokyselinová sekvence transkriptu 0 DPRP-1
8. 8. Sekvence DNA transkriptu 0 DPRP-1
9. 9. Aminokyselinová sekvence transkriptu 1 DPRP-1
10. 10. Sekvence DNA transkriptu 1 DPRP-1
11. 11. Aminokyselinová sekvence transkriptu 2 DPRP-1
12. 12. Sekvence DNA transkriptu 2 DPRP-1
13. 13. Aminokyselinová sekvence transkriptu 3 DPRP-1
14. 14. Sekvence DNA transkriptu 3 DPRP-1
15. 15. Aminokyselinová sekvence transkriptu 4 DPRP-1
16. 16. Sekvence DNA transkriptu 4 DPRP-1
17. 17. Aminokyselinová sekvence transkriptu 5 DPRP-1
18. 18. Sekvence DNA transkriptu 5 DPRP-1
19. 19. Aminokyselinová sekvence transkriptu 6 DPRP-1
20. 20. Sekvence DNA transkriptu'6 DPRP-1
21. 21. Aminokyselinová sekvence transkriptu 7 DPRP-1
22. 22. Sekvence DNA transkriptu 7 DPRP-1
23. 23. Aminokyselinová sekvence transkriptu 0 DPRP-2
24. 24. Sekvence DNA transkriptu 0 DPRP-2
25. 25. Aminokyselinová sekvence transkriptu 1 DPRP-2
26. 26. Sekvence DNA transkriptu 1 DPRP-2
27. 27. Aminokyselinová sekvence transkriptu 2 DPRP-2
28. 28. Sekvence DNA transkriptu 2 DPRP-2
29. 29. Aminokyselinová sekvence transkriptu 3 DPRP-2 i

    «4

    4 · · r · * _β • 4 · « »; fc ♦ · · 4 4 4 f 4 4 *• 4 4 4 « ·

    4444 44 4« 4
30. 30. Sekvence DNA transkriptu 3 DPRP-2
31. 31. Aminokyselinová sekvence transkriptu 4 DPRP-2
32. 32 Sekvence DNA transkriptu 4 DPRP-2
33. 33. Aminokyselinová sekvence transkriptu 5 DPRP-2
34. 34. Sekvence DNA transkriptu 5 DPRP-2
35. 35. Aminokyselinová sekvence transkriptu 6 DPRP-2
36. 36. Sekvence DNA transkriptu 6 DPRP-2
37. 37. Aminokyselinová sekvence transkriptu 7 DPRP-2
38. 38. Sekvence DNA transkriptu 7 DPRP-2
39. 39. Aminokyselinová sekvence transkriptu 8 DPRP-2
40. 40. Sekvence DNA transkriptu 8 DPRP-2
41. 41. Aminokyselinová sekvence transkriptu 0 DPRP-3
42. 42. Sekvence DNA transkriptu 0 DPRP-3
43. 43. Aminokyselinová sekvence transkriptu 1 DPRP-3
44. 44. Sekvence DNA transkriptu 1 DPRP-3
45. 45. Dopředný primer DPRP-1 použitý pro klonování
46. 46. Reverzní primer DPRP-1 použitý pro klonování úplného genu
47. 47. Reverzní primer DPRP-1 použitý pro klonování fuzního genu
48. 48. Dopředný primer DPRP-1 použitý pro profilování exprese
49. 49. Reverzní primer DPRP-1 použitý pro profilování exprese
50. 50. Dopředný primer DPRP-2 použitý pro klonování
51. 51. Reverzní primer DPRP-2 použitý pro klonování úplného genu
52. 52. Reverzní primer DPRP-2 použitý pro klonování fuzního genu
53. 53. Dopředný primer DPRP-2 použitý pro profilování exprese
54. 54. Reverzní primer DPRP-2 použitý pro profilování exprese
55. 55. Dopředný primer DPRP-3 použitý pro klonování
56. 56. Reverzní primer DPRP-3 použitý pro klonování úplného genu
57. 57. Dopředný primer DPRP-3 použitý pro klonování fuzního genu
58. 58. Reverzní primer DPRP-3 použitý pro klonování fuzního genu
59. 59. Sekvence peptidového antigenu DPRP-1
60. 60. Sekvence peptidového antigenu DPRP-2
61. 61. Sekvence peptidového antigenu DPRP-3 • ·

    Výpis sekvencí <110> Qi, Steve

    Akinsanya, Karen Rivieře, Pierre Junien, Jean-Louis