CZ2002360A3

CZ2002360A3 - Farmaceutický prostředek pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou

Info

Publication number: CZ2002360A3
Application number: CZ2002360A
Authority: CZ
Inventors: Maxine Gowen; Larry J. Suva; John Fox; George B. Stroup; Edward F. Nemeth
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation; Nps Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1999-07-31
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2002-10-16
Also published as: EP1200076A1; BR0012921A; NO20020466L; WO2001008673A1; KR20020016928A; ZA200200784B; CO5180628A1; AU764716B2; MXPA02001204A; PL353318A1; AU6504100A; PE20010459A1; HK1046238A1; ECSP003590A; EP1200076A4; CA2380081A1; TR200200278T2; IL147875A0; NO20020466D0; CN1367687A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití kalcilytické sloučeniny ve spojení s anti-resorpčním prostředkem pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou.

Dosavadní stav techniky

U savců je extracelulární vápenatý ion pod důslednou homeostatickou kontrolou a řídí různé procesy jako je srážení krve, nervová a svalová dráždivost a buněčné funkce. Extracelulární vápenatý ion inhibuje sekreci parathormonu („PTH) z parathyroidních buněk, inhibuje kostní resorpci indukovanou osteoklasty a stimuluje sekreci kalcitoninu z thyroidních C-buněk. Proteiny receptoru vápenatého iontu umožňují určitým specializovaným buňkám rychle odpovídat na změny v extracelulární koncentraci vápenatého iontu.

Parathormon je základním endokrinním faktorem, který řídí homeostázu vápenatého iontu v krvi a v extracelulárních tekutinách. Parathormon zvyšuje hladinu vápenatého iontu v krvi působením na buňky kostí a ledvin. Zvýšení koncentrace extracelulárního vápenatého iontu působí jako signál negativní zpětné vazby, která sníží další sekreci parathormonu. Reciproční vztah mezi extracelulárním vápenatým iontem a sekrecí parathormonu vytváří důležitý ·· · · ί ·· ··

9 9 1 1 · 1 « • · · · · * ··· ······· ···· · · · » • · · 9 9 9 9 9 9 9

9 · Φ · * · <·«·«·· mechanismus udržující homeostázu vápenatého iontu v těle.

Při řízení sekrece parathormonu působí extracelulámí vápenatý ion přímo na parathyroidní buňky. Byla potvrzena existence povrchového proteinu parathyroidních buněk, který zaznamenává změny v množství extracelulárního vápenatého iontu. Viz Brown a kol., Nátuře, 3 66, 574 (1993) . Tento protein, kalciový receptor, působí u parathyroidních buněk jako receptor extracelulárního vápenatého iontu, zaznamenává změny v iontové koncentraci extracelulárního vápenatého iontu a spustí funkční buněčnou odpověď, tedy sekreci parathormonu.

Extracelulámí vápenatý ion ovlivňuje různé buněčné funkce, jak uvádí Nemeth a kol. v Cell Calcium, 11, 319 (1990). Například, extracelulámí vápenatý ion hraje roli u parafolikulárních (C-buněk) a parathyroidních buněk. Viz Nemeth, Cell Calcium, 11, 323 (1990) . Role extracelulárního vápenatého iontu u osteoklastů byla také studována. Viz Zaidi, Bioscience Reports, 10, 493 (1990) .

Je známo, že různé sloučeniny napodobují účinky extracelulárního vápenatého iontu na kalciových receptorech. Kalcilytika jsou sloučeniny schopné antagonizovat aktivitu kalciového receptoru, čímž působí pokles jedné nebo více aktivit kalciového receptoru, které jsou vyvolány extracelulárním vápenatým iontem. Kalcilytika jsou užitečná jako vedoucí molekuly v nacházení, vývoji, návrhu, úpravě a/nebo vytvoření modulátorů kalciového receptoru, které působí na receptorech vápenatého iontu. Tato kalcilytika jsou užitečná v léčbě různých chorobných stavů charakterizovaných abnormálními hodnotami jedné nebo více součástí, například polypeptidů jako jsou hormony, enzymy nebo růstové faktory, «·· ·· ·· ·♦··*·· * * · ·

- J - · · · · · · · * · · 9 • · · · · » ······· · · ··»· ·· · · · ·

I » · · 1 »»«··· jejichž exprese a/nebo sekrece je řízena nebo ovlivňována aktivitou jednoho nebo více receptorů vápenatého iontu.

Cílové choroby nebo poruchy pro kalcilytické sloučeniny zahrnují nemoci, týkající se abnormálního kostního či minerálního metabolismu.

Abnormální homeostáza vápníku je charakterizována jednou nebo více z následujících aktivit: abnormální vzestup či pokles sérového vápníku; abnormální vzestup či pokles vylučování vápníku močí; abnormální vzestup či pokles v hladinách vápníku v kostech (například hodnoty získané změřením hustoty kostních minerálů); abnormální vstřebávání vápníku z potravy; abnormální vzestup či pokles v produkci a/nebo uvolňování mediátorů, kteří ovlivňují hladiny vápníku v séru jako jsou parathormon a kalcitonin; a abnormální změny v odpovědi vyvolané mediátory, kteří ovlivňují hladiny vápníku v séru.

Antagonisté kalciových receptorů tudíž nabízejí jedinečný přístup k farmakoterapii chorob spojených s abnormální kostní nebo minerální homeostázou, jako je hypoparathyroidismus, osteosarkom, onemocnění periodontu, hojení zlomenin, osteoartritida, revmatoidní artritida, Pagetova choroba a osteoporóza.

Je dobře známo, že chronické zvýšení hladiny parathormonu, které se vyskytuje při hyperparathyroidismu, vede k ztrátě kosti způsobené osteoklasty a abnormální kostní histologii. Dobnig a Turner, Endocrinol., 138, 4607 až 4612 (1997) ukazuje, že subkutánní infuze vysokých dávek parathormonu (40 a 80 pg/kg/d) podávaných v rozmezí 2 hodin a více vedly k prudké ztrátě tělesné hmotnosti, hyperkalcemii a histologickým abnormalitám kostry v souladu se

-4• · · · φ φ «

φφφ φφ • φ φφφφ změnami pozorovanými při hyperparathyroidismu. Literatura uvádí, že zatímco přerušované podávání parathormonu je žádoucí při ovlivnění tvorby kosti, příliš dlouhý vzestup v hladině parathormonu vede k zvýšené resorpci kosti. Tato limitace trvání vzestupu hladiny parathormonu omezuje výběr sloučenin, které mohou být použity jako antagonisté kalciového receptoru.

Současné způsoby léčby zahrnují současné podávání orálně aktivních antagonistů kalciového receptoru s anti-resorpčním prostředkem pacientovi, který potřebuje léčbu. Současné kalcilytické prostředky zahrnují takové prostředky, které mohou způsobit prodloužený vzestup hladiny parathormonu. Je výhodné, pokud současné prostředky vyvolávají přechodný vzestup hladiny parathormonu.

V průmyslu tedy přetrvává potřeba terapie, která může využít antagonistů kalciových receptorů, jež mohou vyvolat přechodný vzestup hladiny parathormonu bez současných problémů s resorpci, jak jsou dokázány v literatuře.

Dále je také potřeba terapie, která způsobuje relativně nízký vzestup hladiny parathormonu, zatímco má stejně prospěšné účinky jako léčba dostupná v současnosti.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití účinného množství kalcilytické sloučeniny ve spojení s účinným množstvím antiresorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou.

-4a ·· ·· ·· • · · ♦ * .

···· · · · * * _a • · · · · · ’ • · · · · <

• · · · · · ·

Přítomný vynález tak nabízí nové způsoby léčby různých chorob spojených s abnormální kostní nebo minerální homeostázou, včetně hypoparathyroidismu, osteosarkomu, onemocnění periodontu, hojení zlomenin, osteoartritidy, revmatoidní artritidy, Pagetovy choroby a osteoporózy, přičemž tyto choroby nejsou omezeny na choroby zde citované.

4 • 4

-5 4 4 4 4

4 4 4 »4 4 ··

4 4 «

4 4 4 4 4

4·

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje hodnoty hustoty kostních minerálů proximální části hoienní kosti u osteopenických krys následně po léčbě kalcilytiky nebo parathormonem podle studie 1.

Krysám starým sedm měsíců byly odejmuty vaječníky a po dobu 2 měsíců byly ponechány, aby se u nich vyvinula osteopenie. Krysy, které byly slepě operované, byly léčeny vehikulem (<>) , krysy, u kterých bylo provedeno odnětí vaječníků, byly léčeny vehikulem (O), nebo NPS 2143 v dávce 100 pmol/kg perorálně (□), nebo krysím parathormonem 1-34 v dávce 5 pg/kg subkutánně (Δ). Hustota kostních minerálů byla měřena v uvedených časových bodech. Statistická významnost je určena: * znamená p<0,05; ** znamená p<0,01.

Obr. 2 znázorňuje hladiny parathormonu v plazmě u osteopenických krys léčených kalcilytiky nebo krysím parathormonem podle studie 1.

Vzorky plazmy odebírané v časových intervalech, byly odebírány v návaznosti na podání uvedeného prostředku, tedy následně po podání kalcilytik (vyplněný kruh) nebo parathormonu (prázdný kruh).

Obr. 3 znázorňuje hladiny kalcilytik v oběhu následně po podání kalcilytik podle studie 1.

Vzorky plazmy odebírané v časových intervalech, byly odebírány v návaznosti na podání uvedené sloučeniny.

Obr. 4 znázorňuje dynamickou histomorfometrii proxi- 6 • · *· 99 9

4 4 ♦ · · · » · ·· · · « · • ·· · · · ····· • φ · · * · · • · · · 4 · ♦ mální části holenní kosti u osteopenických krys následně po léčbě kalcilytiky nebo parathormonem. podle studie 1.

Obr. 4a znázorňuje procenta značeného perimetru (% L.Pm.)

Obr. 4b znázorňuje procenta erodovaného povrchu (% Er.P)

Obr. 4c znázorňuje procenta osteoidního perimetru (% Os.Pm)

Obr. 4d znázorňuje poměr kostní tvorby: referentu plochy kosti (BFR/B.Ar) v procentech za rok

Statistická významnost je určena: * znamená p<0,05;

★* znamená p<0,01.

Obr. 5 znázorňuje části holenní kosti obarvené barvivém Von Kossa u osteopenických krys, kterým bylo provedeno odnětí vaječníků, léčených estrogenem +/- kalcilytikem podle studie 2.

Representativní části kostí jsou ukázány ze zvířat léčených dalších 5 týdnů s:

Obr. 5a representuje vehikulum.

Obr. 5b representuje 17β estradiol (subkutánně peleta 0,01 mg/90 dní).

Obr. 5c representuje NSP 2143 (100 pmol/kg denně perorálně).

Obr. 6 znázorňuje histomorfometrii proximální části holenní kosti u osteopenických krys následně po léčbě kalcilytiky +/- 17β estradiolem podle studie 2.

Obr. 6a representuje procenta trabekulární kostní plochy (% Tb.Ar)

Obr. 6b representuje poměr kostní tvorby ku referentu plochy tkáně (BFR/T.Ar) v procentech za rok Statistická významnost je určena: * znamená p<0,05;

** znamená p<0,01.

9 * ·

• · 9 9 · · » » » · · · · • < · « · · « • · « · 9 9 · • ·····*· · >

• · · 1 · » • 9 · 9 9 9 999

Podrobný popis vynálezu

Kalcilytické sloučeniny přítomného vynálezu zahrnují všechny kalcilytické sloučeniny. Pojem „kalcilytické sloučeniny znamená, že sloučenina je schopna inhibovat aktivitu kalciového receptoru, tudíž způsobit pokles jedné nebo více aktivit kalciového receptoru vyvolaných extracelulárním vápenatým iontem. Tyto sloučeniny zahrnují, ale nejsou omezeny na, sloučeninu vybranou ze skupiny skládající se z:

N-[(2R-hydroxy-3-[ (3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin-hydrochlorid;

N-[(2R-hydroxy-3- [ (3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(4-methoxyfenyl)ethylamin-hydrochlorid;

N- [(2R-hydroxy-3-[(2,3-dichlor)fenoxypropyl]-1, l-dimethyl-2-(4 -methoxyfenyl)ethylamin-hydrochlorid;

N- [(R) -2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(6-(1,2, 3, 4-tetra hydronaftyl)ethylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(benzothien-3-yl) ethylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(benzothien-2-yl) ethylamin;

N- [ (R) -2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(dekahydronaftalen-2-yl)ethylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-4-fenylbutylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karbOxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-4-(2-methoxyfenyl)butylamin;

-8• 4 « 4 • 4 · ♦ 4 • 44« 4 • «4 4 « 4 •♦44 ♦ » » · ♦ * • · 4 * · 4

4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 « 4 4 4

44 44 «· «444

Ν- [2R-hydroxy-3- [ [2-kyan-4- [N-methyl-N- [4-ethylkarboxyfenyl) sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl) ethylamin;

N- [2R-hydroxy-3- [ [2-kyan-4- [N-methyl-N- [3-methylkarboxymethoxyfenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N- [[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N- [2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl] amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-(1,2,3,4-tetrahydronaft-6-yl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3- [ [2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl] amino] pyridyl] ethyl] amino] fenoxy] propyl] -1,1-dimethyl-2-(benzothien-3-yl)ethylamin;

N- [2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl] amino] pyridyl] ethyl] amino] fenoxy] propyl] -1,1-dimethyl-2-(benzothien-2-yl)ethylamin;

N- [2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2- (dekahydronaftalen-2-yl) ethylamin;

N- [2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl] amino]pyridyl] ethyl] amino] fenoxy]propyl] -1,1-dimethyl-4- (2-methoxyfenyl)butylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl] amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-4-fenylbutylamin;

N- [2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[N-benzyl-N-[4-methylfenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]1,l-dimethyl-2-[4-methoxyfenyl]ethylamin;

N- [2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[N-[4-benzyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]—1,l-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N- [2R-hydroxy-3-[[2-kyan-5-[4-karboxy]fenyl]fenoxy]propyl]• · • · • · • »

-1, l-dimethyl-2-[naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methyl-N-[3-karboxyl]fenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methyl-N-[3-methylkarboxyl]fenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1, l-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-(2-fenyl-2-R, S-karboxyl)fenoxy]propyl-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-(3-propoxykarbonyl)fenoxy]propyl-1,1-dimethy1-2-naftylethylamin ;

(N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-5-(3-propoxykarbonyl)fenoxy]propyl-1,l-dimethyl-2-naftylethylamin a (N-[2R-hydroxy-3-[2-[2-[6-aminomethyl]pyridyl]ethoxy]-1,1-dimethyl-2-naftylethylamin.

Kost je složena z proteinové matrix, ve které jsou začleněny krystaly hydroxyapatitu ve tvaru vřeten nebo destiček. Hlavním strukturálním proteinem kosti je kolagen typu I zahrnující přibližně 90% strukturálních proteinů. Zbývajících 10% matrix je složeno z mnoha nekolagenních proteinů, jako je osteokalcin, proteoglykany, osteopontin, osteonektin, thrombospondin, fibronektin a kostní sialoprotein. V průběhu života probíhá v kostech skeletu remodelace na nesouvisejících částech kosti. Tato místa, neboli remodelující se jednotky, prochází cyklem, který sestává z fáze resorpce kosti následované fází kostní tvorby.

Resorpce kosti je způsobena osteoklasty, což jsou mnohojaderné buňky vycházející z buněk hematopoetické řady. Osteoklasty přilnou k povrchu kostí a vytvoří nepropustnou těsnící vrstvu, a poté extensivně zvlní membránu na svém • · · · • · · · · fl «

- 10♦ 4 · · apikálním (to je resorpčním) povrchu. Takto se vytvoří uzavřený extracelulární oddíl na povrchu kosti, který je okyselován protonovými pumpami zvlněné membrány a do kterého osteoklasty produkují proteolytické enzymy. Nízké pH tohoto oddílu rozpouští krystaly hydroxyapatitu na povrchu kosti, zatímco proteolytické enzymy naruší proteinovou matrix.

Tímto způsobem se vytvoří resorpční lakuna, nebo jamka. Na konci této fáze cyklu položí osteoblasty novou proteinovou matrix, která je následně mineralizována. U několika chorobných stavů, jako je osteoporóza a Pagetova choroba, je normální rovnováha mezi odbouráváním kosti a tvorbou kosti narušena a dochází k čisté ztrátě kosti v každém cyklu.

Tento stav v zásadě vede k oslabení kosti a může mít za následek zvýšené riziko zlomenin při minimálním traumatu.

Zde užívaný pojem „anti-resorpční znamená, že je prostředek schopen prevence, oddálení či zdržení odbourávání kosti. Anti-resorpční prostředky používané v přítomném vynálezu zahrnují estrogen; 1,25 (0H)₂ vitamin D3; kalcitonin; bisfosfonáty a inhibitory katepsinu K, přičemž tyto prostředky nejsou omezeny na prostředky zde citované.

Přítomné sloučeniny mohou být také formulovány jako jejich farmaceuticky přijatelné soli a komplexy. Farmaceuticky přijatelné soli jsou soli netoxické v množství a koncentracích, ve kterých jsou podávány.

Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují adiční soli s kyselinou, jako jsou soli zahrnující sulfát, hydrochlorid, fumarát, maleinát, fosfát, sulfamát, acetát, citrát, laktát, tartarát, methansulfonát, ethansulfonát, benzensulfonát, p-toluensulfonát, cyklohexylsulfamát a chinát. Farmaceuticky

- 11 ·« ·« ·* · ·* ·* ···· · ♦ · · * * t • · «· » · · · * · * • · · « · · ··»···· · · ···* ·· · ··*·· ·· ·· * *· ·*·· přijatelné soli mohou být získány z kyselin jako je kyselina chlorovodíková, kyselina maleinová, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina amidosulfonová, kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina mléčná, kyselina vinná, kyselina malonová, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina cyklohexylsulfamová, kyselina fumarová a kyselina chinová.

Farmaceuticky přijatelné soli také zahrnují adični soli s bází, jako jsou soli zahrnující benzathin, chlorprokain, cholin, diethanolamin, ethylendiamin, meglumin, prokain, hliník, vápník, lithium, hořčík, draslík, sodík, amoniak, alkylamin a zinek, když jsou přítomny kyselinotvorné funkční skupiny, jako je karboxylová kyselina nebo fenol.

Aby mohly být sloučeniny podle přítomného vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli užívány pro léčbu lidí nebo jiných savců, jsou obvykle formulovány jako farmaceutická kompozice v souladu se standardní farmaceutickou praxí.

Kalcilytické sloučeniny mohou být podávány různými způsoby včetně intravenózního, intraperitoneálního, subkutánního, intramuskulárního, perorálního, lokálního (transdermálního) nebo transmukosního podávání. V případě systémového podání je výhodné perorální podání. Například v případě perorálního podání, mohou být sloučeniny formulovány jako běžné perorální dávkové formy, jako jsou kapsle, tablety a tekuté přípravky, jako jsou sirupy, elixíry a koncentrované kapky.

Alternativně, může být použito injekční podání (parenterální podání), například intramuskulární, intra- 12*9 ·· «♦

9 9 9 9 »

9 9· 9 ·

9 9 9 9 9 9 • 99» 99« 999 «9 99 9 9999«· venózní, intraperitoneální a subkutánní injekce. V případě injekce, sloučeniny podle přítomného vynálezu jsou formulovány jako roztoky kapalin, je výhodné, pokud jsou formulovány jako fyziologicky slučitelné pufry nebo roztoky, jako je fyziologický roztok, Hankův roztok či Ringerův roztok. Sloučeniny mohou být dále formulovány jako pevné formy a opětovně rozpuštěny nebo suspendovány těsně před užitím. Rovněž mohou být vyrobeny lyofilizované formy.

Při systémovém podání může být využit transmukosní nebo transdermální způsob podání. V případě transmukosního nebo transdermálního podání, jsou ve formulaci použity látky pronikající přes příslušné bariéry. Tyto pronikající látky jsou v oboru všeobecně známy a zahrnují například při transmukosním podání, žlučové soli a deriváty kyseliny fusidové. Aby byla prostupnost usnadněna, jsou také používány detergenty. Transmukosní podání se může uskutečnit například pomocí nosních sprejů, rektálních čípků nebo vaginálních čípků.

V případě lokálního podání, mohou být sloučeniny přítomného vynálezu formulovány jako masti na pleť, masti na rány, gely nebo krémy, tedy jako formy v oboru všeobecně známé.

Množství různých kalcilytických sloučenin, které má být podáno, může být určeno standardními postupy, které berou v úvahu faktory jako je IC₅o sloučeniny, EC₅₀ sloučeniny, biologický poločas sloučeniny, věk, velikost a hmotnost pacienta, choroby a poruchy, kterými pacient trpí.

Významnost těchto a jiných faktorů, které musí být zváženy, je známa těm, kteří mají odbornou kvalifikaci v tomto oboru.

- 13 • · 9 · • · * · 9 · · · · • Φ ·· 0999 9«

99 999 9999999 9 ···· 9 · · · ·

9 99 99 9 99

Množství, které je určeno k podání, také závisí na způsobech podání a stupni perorální biologické dostupnosti. Například sloučeniny s nízkou perorální biologickou dostupností musí být podány v relativně vyšších dávkách.

Je výhodné, pokud je prostředek ve formě jednotkové dávky. Například v případě perorální aplikace mohou být podány tablety nebo kapsle, v případě nosní aplikace může být podána odměřená dávka aerosolu, v případě transdermální aplikace může být podán lokální přípravek nebo náplast a v případě transmukosního podání, může být aplikována tvářová náplast. V každém případě je dávkování takové, že si pacient může aplikovat jedinou dávku.

Každá dávková jednotka pro perorální podání obsahuje vhodně od 0,01 do 500 mg/kg, výhodně pak od 0,1 do 50 mg/kg sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli, počítáno jako volná báze. Denní dávka pro parenterální nebo nosní způsoby podání, ústní inhalaci, transmukosní nebo transdermální způsoby podání obsahuje vhodně od 0,01 mg do 100 mg/kg sloučeniny obecného vzorce I. Lokální formulace obsahuje vhodně od 0,01 do 5,0 % sloučeniny obecného vzorce I. Aktivní složka může být podávána jednou až šestkrát denně, výhodně jednou denně, dostatečně, aby prokázala požadovanou aktivitu, jak je zřejmé těm, kteří mají odbornou kvalifikaci v oboru.

Zde užívaný pojem „léčba chorob zahrnuje prevenci, zdržení a profylaxi chorob, přičemž tento pojem není omezen na zde citované možnosti.

Choroby a poruchy, které mohou být léčeny, nebo kterým je možno předcházet na základě postižených buněk, zahrnují

- 14• · · « 9 · 9 9 · · 9 • 9 *9 · 9 9 · 99 9

99 999 9 9999 999 9

9 9 9 9 · 9 999

99 99 9 999909 nemoci nebo poruchy spojené s kostmi nebo minerály;

hypoparathyroidismus; nemoci centrálního nervového systému jako jsou záchvaty, cévní mozkové příhody, úrazy hlavy, míšní poranění, poškození nervových buněk způsobené hypoxií, které se vyskytuje při srdeční zástavě nebo tísni novorozence po porodu, epilepsii, neurodegenerativních onemocněních jako je Alzheimerova nemoc, Huntingtonova nemoc, Parkinsonova nemoc, demence, při svalové tenzi, depresi, úzkosti, u panické poruchy, obsedativně-kompulsivní poruchy, posttraumatické stresové poruchy, schizofrenie, neuroleptického maligního syndromu a Tourettova syndromu; nemoci spojené s vysokou reabsorbcí vody ledvinami, jako je syndrom nepřiměřené sekrece ADH (SIADH), cirhóza, městnavé srdeční selhání a nefróza; hypertenze; prevence a/nebo snížení toxicity ledvin z kationtových antibiotik (tj. aminoglykosidových antibiotik); poruchy motility střev jako je průjem nebo dráždivý tračník; gastrointestinální vředové choroby; gastrointestinální onemocnění s vysokou absorpcí vápníku jako je sarkoidóza; autoimunitní onemocnění a rejekce transplantovaného orgánu; karcinom z dlaždicových buněk; zánět slinivky břišní.

Při výhodném provedení přítomného vynálezu, jsou přítomné sloučeniny používány k zvýšení hladiny parathormonu („PTH) v séru způsobem, který není pulzatilní. Zvýšení hladiny parathormonu v séru může pomoci v léčení chorob jako je hypoparathyroidismus, osteosarkom, onemocnění periodontu, zlomeniny, osteoartritida, revmatoidní artritida, Pagetova choroba a osteoporóza.

Normální rozmezí hodnot intaktního parathormonu u lidí je od přibližně 10 do asi 65 pg/ml. Zvýšení parathormonu v séru může také pomoci profylakticky oddálit nebo předcházet • · ♦ · • · · · · · «

- 15 vypuknutí choroby. Profylaktická léčba může být provedena například u pacienta s nízkou hodnotou parathormonu v séru nebo u pacienta, který sice nemá nízké hodnoty parathormonu v séru, ale u kterého má jeho zvýšení prospěšný kompenzující účinek. Je výhodné., pokud má pacient abnormálně nízké hodnoty parathormonu v séru. Zde užívaný pojem abnormálně nízké hodnoty parathormonu v séru znamená hladiny parathormonu v séru nižší než ty, které se vyskytují všeobecně v populaci a nejspíše jde o takové hodnoty, které jsou spojeny s chorobou nebo vypuknutím choroby.

Zvýšení hladin parathormonu v séru může být použito k léčbě různých chorob včetně chorob kostí a souvisejících s minerály.

Je výhodné, pokud zvýšení hladiny parathormonu trvá 12 hodin a déle, ještě výhodnější je, pokud toto zvýšení trvá 18 hodin a déle a v nej lepším případě 24 hodin a déle.

Je výhodné, pokud zvýšení hladiny parathormonu je trojnásobné nebo méně-násobné, než jsou normální hodnoty intaktního parathormonu u lidí. Ještě výhodnější je, pokud toto zvýšení je dvojnásobné nebo méně-násobné, než jsou normální hodnoty intaktního parathormonu u lidí.

Přítomný vynález také navrhuje prostředky zahrnující přítomné sloučeniny a jejich farmaceuticky přijatelné soli, které jsou aktivní, pokud jsou tyto podávány perorálně; tyto prostředky mohou být vyvinuty jako sirupy, tablety, kapsle a pastilky. Prostředek ve formě sirupu se všeobecně skládá ze suspenze nebo roztoku sloučeniny nebo soli v kapalném nosiči, například v etanolu, v podzemnicovém oleji, olivovém oleji, glycerinu nebo vodě s aromatickým nebo barvícím • φ

- 16 φφφφ φφφ φφφφ φφφφ φφφφ φφ · • φφ « φ φ φ φφφφ · φ φ · φφφφ φφφ φφφ

Φ· φφ φφ φ φ · φ φ φ φ činidlem. Pokud je prostředek ve formě tablety, může být použit jakýkoliv farmaceutický nosič běžně užívaný pro přípravu pevných formulací. Příkladem takového nosiče je například stearát hořečnatý, bílá hlinka, mastek, želatina, klovatina, kyselina stearová, škrob, laktóza a sacharóza. Pokud je přípravek ve formě kapsle, je vhodný jakýkoliv způsob opouzdření, například použití výše uvedených nosičů u kapsle s tvrdým želatinovým obalem. Pokud je přípravek ve formě kapsle s měkkým želatinovým obalem, může být použit jakýkoliv farmaceutický nosič běžně užívaný při přípravě disperzí nebo suspenzí, například vodná klovatina, celulóza, křemičitany nebo oleje, a začleněn do měkkého želatinového obalu.

Obvyklé parenterální prostředky se skládají z roztoku nebo suspenze sloučeniny nebo soli v sterilním vodném či nevodném nosiči, který může případně obsahovat parenterálně přijatelný olej, například polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, lecithin, podzemnicový olej nebo sezamový olej.

Obvyklé prostředky pro inhalaci jsou ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí, které mohou být podávány jako suchý prášek ve formě aerosolu za použití konvenčních hnacích plynů jako je dichlordifluormethan nebo trichlorfluormethan.’

Obvyklý prostředek ve formě čípku sestává ze sloučeniny přítomného vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelné soli, která je aktivní, pokud jsou podávány touto cestou, se spojovacím a/nebo lubrikačním přípravkem, jako jsou například polymemí glykoly, želatiny, kakaové máslo nebo rostlinné vosky nebo tuky s nízkou teplotou tání nebo jejich syntetická analoga.

• ·

- 17• · · · · · · 0 · 0 0 ·<·· 0000 ·· · • 00 440 0 0004 440 ·

000· ·· 4 404 • 0 ·· 04 0 ·· ·00·

Obvyklé dermální a transdermální formulace obsahují běžná vodná i nevodná vehikula, jako například krém, mast, pleťovou vodu nebo pastu, nebo jsou ve formě léčivého sádrového obvazu, náplasti nebo membrány.

Je výhodné, pokud je prostředek ve formě jednotkové dávky, například ve formě tablety, kapsle nebo odměřované dávky aerosolu, takže si pacient může podat jedinou dávku.

Nejsou očekávány žádné nepřijatelné toxologické účinky, pokud jsou sloučeniny podle přítomného vynálezu podávány v souladu s tímto vynálezem.

Příklady provedení vynálezu

Biologické testy

Byly provedeny následující testy.

Studie na krysách, kterým bylo provedeno odnětí vaječníků

Studie 1

Sedmiměsíční samičí dosud nepoužité krysy kmene Sprágue Dawley se podrobily bilaterální ovariektomii nebo slepé operaci a zvířata byla poté ponechána po dobu 3 měsíců, aby se u nich vyvinula osteopenie. V tomto okamžiku byla ve studii 1 skupina slepě operovaných zvířat (n = 10) a 3 skupiny zvířat, u kterých bylo provedeno odnětí vaječníků, dále též označováno jako ovx zvířata, (n = 10 až 14). Skupiny zvířat, u kterých bylo provedeno odnětí vaječníků, byly vybrány takovým způsobem, že mezi skupinami nebyl výrazný rozdíl v kostní minerální hustotě („BMD) bederní • · ·

- 18·· ··

I · · ι

Β · ··

Β · · « ·· páteře, proximální části holenní kosti nebo distální části stehenní kosti. Skupiny skládající se ze slepě operovaných zvířat a kontrolních ovx zvířat, byly léčeny dávkou vehikula (20% vodný enkapsin) a skupiny ovx zvířat, byly léčeny buď N-[(2R-hydroxy-3- [ (3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2- (2-naftyl)ethylamin-hydrochloridem (kalcilytikum podáno) (v dávce 100 pmol/kg tělesné hmotnosti denně, perorálně) nebo krysím PTH 1-34 (v dávce 5 pg/kg tělesné hmotnosti denně, subkutánně).

V průběhu studie byly odebírány vzorky krve pro určení hladiny cirkulujícího parathormonu a osteokalcinu. Kostní minerální hustota byla měřena pomocí DXA (QDR-4500 Hologic, Waltham, Mass) před léčbou a v týdnech 4 a 8. Na konci studie byly holenní kosti odebrány pro histologickou analýzu. Všechna zvířata dostala tetracyklin 10 dní a 3 dny před počátkem dávkování a kalcein (10 mg/kg) 10 dní a 3 dny před usmrcením.

Studie 2

Zvířata byla připravována a sledována, jak je popsáno výše. Skupiny skládající se ze slepě operovaných zvířat a ovx kontrolních zvířat, byly perorálně léčeny dávkou vehikula (20% vodný enkapsin) a 4 další skupiny ovx zvířat byly léčeny buď N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl] -1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin-hydrochloridem (v dávce 100 pmol/kg tělesné hmotnosti denně, perorálně) nebo 17β- estradiolem (subkutánně peleta 0,01 mg na 90 dní), nebo N- [(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin-hydrochloridem zároveň s estradiolem (oba přípravky v dávce uvedené výše). Dávkování trvalo 5 týdnů a poté byla zvířata usmrcena a byly odebrány holenní kosti pro histologickou analýzu.

-19• φ φφ φφ • φ * φ • φ · • φ · φφφ φ φφφφ φφφ φ φφφφ φφφ φφφ • ΦΦΦ φφ φ φφ φφφφ

Měření cirkulujících sloučenin a hladin parathormonu

Vzorky plazmy, odebírané v časových intervalech, byly odebírány v návaznosti na podání sloučenin nebo parathormonu. PTH 1-34 byl měřen radioimunoanalýzou - RIA (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA) . Koncentrace sloučenin v plazmě byly kvantifikovány pomocí LC/MS/MS (limit detekce = 10 ng/ml).

Histomorfometrické vyhodnocení

Vzorky kostí byly dehydratovány zvyšujícími se koncentracemi ethanolu, odmaštěny v acetonu a fixovány v methyl-methakrylátu (Polysciences, lne., Warrington, PA). Longitudinální odvápněné řezy (5 pm) proximální části holenní kosti byly řezány na Leica mikrotomu (SM 2500S); bloky tkáně byly předbarveny s barvivém Villanueva. Histomorfometrické analýzy byly provedeny za použití systému Osteomeasure (OsteoMetrics Incorporated) , bez znalosti zařazení vzorků do skupin. Měření uvnitř metafýzy holenní kosti byla omezena pouze na střední tkáňovou plochu v rozsahu přibližně 8 mm²počínajicí 1 mm pod růstovou destičkou. Primární měření zahrnovala plochu kosti a dřeně (mm²), plochu kosti (mm²), kostní perimetr (mm), jednoduše a dvojitě-značený perimetr (sL.Pm, dL.Pm, mm), osteoidní perimetr (O.Pm, mm) a erodovaný perimetr (Er.P, mm).

Odvozené indexy zahrnovaly trabekulární kostní objem (% Tb.Ar), trabekulární počet (Tb.N, mm^-1), trabekulární tloušťku (Tb.Th, pm), trabekulární separaci (Tb.Sp, pm), poměr kostní tvorby, referent povrchu (BFR/Tb.Pm, pm³/pnr/ /rok), BFR/Tb.Ar (referent kostní plochy, %/rok), BFR/B.Ar (referent tkáně, %/rok), poměr minerální apozice (MAR, pm/den) a procenta značeného perimetru (% Lp). Statistické analýzy byly provedeny za použití dvoustranného t-testu.

4« 44

4 4 4

4 4

4 4 4

44 4444 • 4

4 4 4

-20«4 4* ·» • · · 9 4 · • 4 »4 4 «

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 «4 44

Test kostní resorpce vyvolané lidskými osteoklasty

Podle metody uvedené Jamesem v J. Bone Min. Res., 11, 1453 až 1460, byla provedena izolace rozmělněných lidských osteoklastů z tkáně čerstvého osteoklastomu a in vitro resorpční test s lidskými osteoklasty. Stručně shrnuto, lidské osteoklasty byly uloženy do částic hovězí kortikální kosti se sloučeninou nebo vehikulem na dobu 24 hodin při teplotě 37 °C. Kultivační medium bylo poté odstraněno a množství peptidu s karboxylovou terminální částí al řetězce lidského kolagenu typu I bylo kvantifikováno jako biochemický výstup resorpce, za použití kompetitivního imunoabsorbčního testu s vazbou enzymů (ELISA) (19) (Osteometer A/S, Rodovre, Dánsko). Výsledky jsou vyjádřeny jako procentuální inhibice resorpce s porovnáním se supernatanty odvozenými z osteoklastů kultivovaných pouze v přítomnosti vehikula bez inhibitoru. Hodnoty IC₅₀ jsou určeny z výsledných křivek odpovědi na dávce.

Test resorpce dlouhých kostí krysích plodů

Test byl proveden v podstatě jak popsal Votta v Bone,

15, 533 až 538 (1994). Časovaně gravidním krysám kmene Sprague-Dawley (Taconic Farms, Germantown, NY) bylo subkutánně injekčně podáno 7,4 Bq ⁴⁵CaCL· osmnáctý den gestace, krysy byly přes noc uzavřeny, poté byla podána anestezie Innovar-Vet (Pittman-Moore, Mundelein, IL) a krysy byly usmrceny krční dislokací. Plody byly asepticky odstraněny a jejich vřetenní a loketní kosti byly odděleny od okolní měkké tkáně a chrupavčitých konců kostí. Kostní rudimenty (n = 4) byly následovně kultivovány po dobu 18 až 24 hodin v mediu BGJ_b (Sigma, St. Louis, MO) obsahujícím 1 mg/ml BSA, poté přeneseny do čerstvého media a kultivovány

4« •

• 4 • 4

-21 • 4 « 4 · • <

• · »

4 4 • 4 » 4 4

44 44 4 4

4 4

4 «4

444* *

dalších 48 hodin v nepřítomnosti nebo přítomnosti PTH (lidského parathormonu [1-34], Bachem, Torrence, CA) a požadovaného inhibitoru. Kapalinovým scintilačním spektrometrem bylo kvantifikováno ⁴⁵Ca uvolněné do media a zbytkové ⁴⁵Ca v kostech (k uvolnění došlo následkem solubilizace v 5% TCA po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti) . Údaje jsou vyjádřeny jako procentuální podíl ⁴⁵Ca uvolněného z léčených kostí v porovnání s odpovídajícími kontrolními kostmi. Statistické rozdíly byly zhodnoceny jednocestnou variační analýzou (ANOVA). Hodnoty Ido byly založeny na údajích z dvou nezávislých experimentů.

Osteoblastická produkce cAMP a aktivita alkalické fosfatázy

Hromadění cAMP bylo měřeno jednak u lidských osteoblastických buněk TF274 (získaných immortalizací lidských stromálních buněk kostní dřeně) viz James, viz výše, jednak primárních lidských osteoblastů odvozených z explantátů trabekulární kosti, jak je popsáno v Beresford, Biochim. Biophys. Acta, 801, 58 až 65 (1984). Hladiny cAMP v buněčných vzorcích byly změřeny použitím neradioaktivního protokolu (Amersham kit). Aktivita alkalické fosfatázy byla určena použitím standardních kolorimetrických metod, jak bylo dříve popsáno v Gowen, Arth. Rheum., 31, 1500 až 1507 (1988). N-[(2R-Hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan) fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin-hydrochlorid byl testován při 0,1; 1 a 10 μΜ. Jako positivní kontrola byl použit parathormon v množství 40 ng/ml.

Výsledky získané z testů popsaných ve studii 1 ukazují, že malé, ale trvalé zvýšení hladiny parathormonu způsobuje zvýšenou kostní přeměnu bez čistého zisku nebo ztráty kosti.

• ·

-22• · · · · · * ♦ « · · • · · · · e · · · * ?

• · · · · · · ···· o · · · • · · · ·· · ···

9· · * ·· 9 ·····«

Kostní minerální hustota (BMD) byla in vivo měřena na bederní páteři, distální části stehenní kosti a proximální části holenní kosti těsně před nasazením léčby a po 8 týdnech dávkování. Zvířata, kterým bylo 3 měsíce před léčbou provedeno odnětí vaječníků, vykazovala výraznou ztrátu kostní hmoty ve všech 3 místech kostry: 15% v bederní páteři a proximální části holenní kosti, 24% v distální části stehenní kosti. V průběhu léčby N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl) ethylamin-hydrochloridem zůstala kostní hmota neovlivněna, ale po 8-týdenní léčbě parathormonem v dávce 5 pg/kg denně, došlo u proximální části holenní kosti k navrácení hodnot na hodnoty před odnětím vaječníků (obr.l). Měření plasmatických hladin parathormonu v závěru experimentu ukázalo, že u zvířat, která dostala N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxy-propyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl) ethylamin došlo ke zvýšení hladiny parathormonu (>100 pg/ml), ve 4 hodině po podání léčiva (obr. 2). Není známo, jak dlouho toto zvýšení trvalo, ačkoliv hladiny parathormonu se vrátily k výchozí hodnotě po 24 hodinách (těsně před další dávkou). Hladiny parathormonu u zvířat léčených parathormonem v dávce 5 pg/kg byly ve stejném rozmezí hodnot jako u zvířat léčených N-[(2R-hydroxy-3- [ (3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminem, ale vrátily se k výchozí hodnotě za 2 až 4 hodiny po podání (obr. 2). Rozdíly v trvání odpovědi parathormonu mohou být vysvětleny trvalým vystavením N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxy-propyl]-1, l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminu, u něhož bylo zjištěno, že jeho hladina byla zvýšena na dobu až 8 hodin (obr.. 3) .

Rozdíl v profilu parathormonu, získaného v těchto dvou dávkovačích situacích, nám umožnil přímo stanovit účinek trvání expozice parathormonu na kostní přeměnu. Dynamická • φ φ φ φφ φφ · · φ «φ φφφ» Φ·· φ «

2' φφφφ φφφφφφ

7. φφφ φφφ φφφφφφφ φ φφφφφφ·, φφ «φ · Φ ·φ Φ φφ histomorfometrie proximální části holenní kosti ukázala, že kostní tvorba (% L.Pm., % Os.Pm) byla zvýšena nad hodnoty u kontrolních ovx zvířat při podání parathormonu i N-[(2R-hydroxy-3-[ ( 3-chlor-2-kyan)fenoxvpropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminu (obr. 4a,b). Poměr minerální apozice zůstal nezměněn jakoukoliv léčbou. V každém případě, kostní resorpce, měřená procenty erodovaného perimetru, byla významně vyšší u skupiny léčené N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminem než u skupiny léčené parathormonem nebo kontrolní ovx skupiny (obr. 4a). Toto je možno dále doložit příkladem prudkého zvýšení kostní přeměny znázorněné BFR/B.Ar ve skupině léčené N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl ]-1, l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminem v porovnání s ostatními dvěma skupinami (obr. 4d). Tudíž mírné, ale prodloužené zvýšení parathormonu dosažené podáním kalcilytika mělo za následek významný vzestup jak v kostní tvorbě, tak v resorpci, bez čistého zisku nebo ztráty kosti. Parathormon podávaný exogenně také zvýšil jak kostní resorpci, tak tvorbu, ale kostní tvorba převýšila resorpci, čímž došlo k navýšení kostní hmoty.

Výsledky studie 2 ukazují, že malé, ale trvalé zvýšení hladiny parathormonu v přítomnosti anti-resorpčního prostředku působí zvýšenou kostní přestavbu s čistým ziskem kosti.

Byla provedena další studie, ve které byl sedmiměsíčním krysám, kterým bylo provedeno odnětí vaječníků před 3 měsíci, denně podáván N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin-hydrochlorid po dobu 4 týdnů, v přítomnosti nebo nepřítomnosti estrogenu. Obr. 5 ukazuje representativní části *'·

-24«· · · · flfl ··

9 9 991 (t · · fl • · · · « · « · · · » • * · 9 · · «····*· · fl ···· 9 9 1 ··« * · *·· · · · «··<·· holenní kosti obarvené barvivém Von Kossa ze zvířat, kterým, po odnětí vaječníků nebyla podávána žádná léčba (obr. 5a), ze zvířat léčených pouze estrogenem (obr. 5b), nebo léčených estrogenem a zároveň N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl) ethylaminem (5c) .

Bylo jasně prokázáno, že současné podávání N-[(2R-hydroxy-3- [(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminu a estrogenu (obr. 5c) způsobilo zvýšenou kostní přestavbu a to nad hodnoty kostní přestavby, pokud je podáván pouze estrogen. Statická histomorfometrie proximální části holenní kosti (tab. 1) ukázala, že procentuální trabekulární plocha (1 Tb.Ar.) byla o 72% nižší u ovx zvířat, v porovnání se slepě operovanou skupinou (p<0,0001).

Tato kostní ztráta nebyla významně obnovena estradiolem.

N-[(2R-Hydroxy-3-[ (3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin, podávaný samostatně, neměl významný vliv na osteopenii způsobenou odnětím vaječníků.

Nicméně, podávání N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl] -1, l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminu společně s estrogenem způsobilo dvojnásobný vzestup v % Tb. Ar. nad hodnoty u ovx skupiny (obr. 6a). Zdá se, že toto bylo důsledkem vzestupu trabekulární tloušťky způsobeném N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminem plus estrogenem (tab. 1). Poměr kostní tvorby/plocha tkáně byl významně zvýšen u skupiny, které byl podáván N-[(2R-hydroxv-3-[(3-chlor-2-kyan) fenoxypropyl] -1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin plus estrogen (obr. 6b).

Zvýšení poměru kostní tvorby/plocha tkáně ukazuje, že kostní hmota se v měřené ploše zvyšuje a odráží skutečnost, že nově vytvořená kostní hmota na površích kostí není remodelována (modelování), což je klasickým znakem účinku parathormonu.

Toto se jeví být důsledkem poklesu resorpce (pravděpodobně následkem současné estrogenní léčby) vzhledem ke skupině

-25 « · ·· 9999 99 9 · · 0·· 0 0····· · * ···· ·· 0 0·· ·· «0 ·0 o 0· 0000 zvířat léčených N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl] -1, l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminem, navzdory udržovanému zvýšení kostní tvorby.

Přímé účinky N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl ] -1, l-dimethyl-2- (2-naftyl) ethylaminu na osteoblasty a osteoklasty in vitro

Vzhledem k tomu, že receptory vápenatého iontu byly zjištěny jak u osteoblastů, tak u osteoklastů, studovali jsme přímé účinky N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl] -1, l-dimethyl-2- (2-naftyl) ethylaminu in vitro u obou, tj. u osteoblastů i osteoklastů.

Osteoblastická aktivita

Zatímco parathormon způsobil dvojnásobný vzestup v hladině cAMP u obou typu zkoumaných buněk, N-[(2R-hydroxy-3- [(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin neměl žádný účinek na základní nebo parathormonem zvýšenou hladinu cAMP. Léčba buněk TF274 s N-[(2R-hydroxy-3- [ (3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminem neměla za následek jakoukoliv změnu v aktivitě alkalické fosfatázy a rovněž neovlivnila aktivitu alkalické fosfatázy zvýšenou parathormonem. N-[(2R-Hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin vykázal určitou toxicitu při testech in vitro při koncentraci 10 μΜ.

Osteoklastická aktivita

N-[(2R-Hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin neměl žádný účinek na kostní

-26β · * * 19

9, 1 9 ♦ Φ « φ · φ 1111 11 1

Φ Φ Φ Φ φ Β Φ ΦΦΦΦ · · Φ • ΦΦΦ φφ φ φφφ

ΦΦ * * 1 Φ · ΦΦΦΦΦΦ resorpci zprostředkovanou lidskými osteoklasty při koncentracích do 3 μΜ, zatímco inhibitor katepsinu K; 3,11-bis(2-methylpropvl)-4,7,10-trioxo-2,5,6,3,9,12-hexaazatridekandioát inhiboval resorpci při koncentraci 0,9 μΜ s IC₅₀.

Tento test je limitován svou citlivostí k dimethylsulfoxidu, takže koncentrace N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl] -1, l-dimethyl-2- (2-naftyl) ethylaminu nad 3 μΜ nemohly být testovány. V testu dlouhých kostí u krysích plodů inhiboval N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin resorpci s IC₅₀ při koncentraci 11,3 ± 3 μΜ. Mechanismus této inhibice není objasněn a zatímco tento účinek se vyskytuje při koncentracích přibližně 300 x vyšších než je IC₅₃ pro mobilizaci vápenatého iontu zprostředkovanou receptorem vápenatého iontu, nemusí být ve vztahu s jakýmkoliv efektem na receptoru vápenatého iontu. Možnost, že tento jev by mohl souviset s toxicitou, nemůže být vyloučena.

Výše zmíněné pokusy ukazují, že malá perorálně aktivní sloučenina může být navržena k tomu, aby zvýšila endogenní sekreci parathormonu dostatečně tak, aby stimulovala kostní přeměnu. Farmakokinetické parametry této molekuly jsou takové, že způsobují prodloužení vzestupu hladiny parathormonu (>4 hodiny). Toto nám umožnilo zkoumat vliv trvání vzestupu hladiny parathormonu při nízkých hodnotách cirkulujícího parathormonu. Jestliže hladina parathormonu byla zvýšena déle než 4 hodiny, byla kostní přeměna dále zvýšena, ale zůstala v rovnováze, takže nedocházelo ani k čisté ztrátě ani k zisku kosti. Dále byl proveden pokus s současnou léčbou estrogenem a antagonistou této současné léčby, výsledkem byl vzestup kostní formace měřený histomorfometričky.

-279 · · * *00 · · · » • 0 00 0000 ·0 0 0 0 0 4 0 0 0 0000 Λ 0 0 0

0000 00 * 00* «0 00 0* * 000*0*

Je dobře známo, že chronické zvýšení parathormonu, jaké je přítomno u hyperparathyroidismu, vede ke ztrátě kosti a abnormální kostní histologii. Dobnig a kol., viz výše, ukázal, že subkutánní infuze vysokých dávek parathormonu (40 a 80 ug/kg/d) podávaná v průběhu 2 hodin nebo více, vede k rychlé ztrátě tělesné hmotnosti, hyperkalcemii a histologickým abnormalitám v kostře shodným se změnami, které se vyskytují při hyperparathyroidismu. V naší studii byl použit mnohem menší vzestup v hladině parathormonu, a ačkoliv byl trvalý, nevedl k nežádoucím účinkům. Avšak anabolický účinek parathormonu byl stále nepřítomen při trvalé expozici. Z toho vyplývá, že stav mírného hyperparathyroidismu, ať přirozeného, nebo farmakologicky vyvolaného, může být bezpříznakový.

Přítomné údaje také ukazují, že vzhledem k množství parathormonu produkovaného jako odpověď N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylaminu, krátké trvání a nízkonásobný vzestup v hladině parathormonu má výrazný účinek na kostní přestavbu. Při většině publikovaných studií týkajících se účinků parathormonu, krysy požívaly dávky 80 pg/kg. Tato dávka vede k hladině parathormonu v cirkulaci přibližně 5 000 až 14 000 pg/ml, v porovnání s 150 až 200 pg/ml v našich studiích. Toto dokazuje, že velmi nízké dávky parathormonu účinně modulují kostní přestavbu. Toto je také ilustrováno mnohem nižšími dávkami užitými v dříve provedených klinických studiích, ve kterých přibližné dávky 0,4 až 0,8 pg/kg tělesné hmotnosti vedly k zvýšení kostní hmoty (8,24) . Dávka 0,4 pg/kg vedla k hladině PTH 1-34 v cirkulaci přibližně 90 pmol/1 po 30 minutách po podání (25). Toto je přibližně trojnásobný vzestup v hladinách parathormonu v cirkulaci. Ukazuje se tedy, že množství parathormonu

-28 9··· · · · « · 9 9 • 9 99 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 · 9 9999 »99 9 • 999 99 · 999

1 · 9 99 9 ······ uskladněného v parathyroidní žláze bude dostatečné, aby způsobilo anabolický účinek, pokud je uvolněno v odpovědi na antagonisty receptoru vápenatého iontu.

Výše zmíněné údaje zaprvé dokazují, že stimulace endogenní sekrece parathormonu za použití antagonistů receptoru vápenatého iontu parathyroidních buněk mají za následek zvýšenou kostní tvorbu a resorpci. V přítomnosti anti-resorpčního prostředku, N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin způsobil vzestup kostní hmoty. Toto je základem vývoje nové třídy anabolických léčiv pro léčbu osteoporózy.

Všechny publikace, včetně patentů a patentových přihlášek citovaných v tomto popise, jsou zde zahrnuty tímto odkazem, jako kdyby každá jednotlivá publikace byla specificky a jednotlivě uvedena k včlenění odkazem jako kdyby byla uvedena ve svém celku, přičemž tyto publikace nejsou omezeny pouze na patenty a patentové přihlášky zde citované.

• ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití účinného množství kalcilytické sloučeniny ve spojení s účinným množstvím anti-resorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou.
2. Použití účinného množství kalcilytické sloučeniny ve spojení s účinným množstvím anti-resorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou, kde kalcilytické sloučenina je vybrána ze souboru, který tvoří:

N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin-hydrochlorid;

N-[(2R-hydroxy-3-[(3-chlor-2-kyan)fenoxypropyl]-1,1-dimethyl-2-(4-methoxyfenyl)ethylamin-hydrochlorid;

N-[(2R-hydroxy-3-[(2,3-díchlor)fenoxypropyl]-1,l-dimethyl-2(4—methoxyfenyl)ethylamin-hydrochlorid;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(6-(1,2,3,4- 0

-tetrahydronaftyl)ethylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(benzothien-3yl)ethylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(benzothien-2-yl)ethylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(dekahydronaftalen-2-yl)ethylamin;

♦ ·

-3G

Ν-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-4-fenylbutylamin;

N-[(R)-2-hydroxy-3-[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-karboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-4-(2-methoxyfenyl)butylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[N-methyl-N-[4-ethylkarboxyfenyl)sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[N-methyl-N-[3-methylkarboxymethoxyfenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2- (2-naftyl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-(1,2,3,4-tetrahydronaft-6-yl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-(benzothien-3-yl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-(benzothien-2-yl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-2-(dekahydronaftalen-2-yl)ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-4-(2-methoxyfenyl)butylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methylsulfonyl]-N-[[[1-[2-[6-methyl]amino]pyridyl]ethyl]amino]fenoxy]propyl]-1,1-dimethyl-4-fenylbutylamin;

-31N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[N-benzyl-N-[4-methylfenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]1,l-dimethyl-2-[4-methoxyfenyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[N-[4-benzyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-5-[4-karboxy]fenyl]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-[naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-[[N-methyl-N-[3-karboxyl]fenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2kyan-4-[[N-methyl-N-[3-methylkarboxyl]fenyl]sulfonyl]amino]fenoxy]propyl]-1,l-dimethyl-2-[2-naftyl]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-(2-fenyl-2-R,S-karboxyl)fenoxy]propyl-1,l-dimethyl-2-(2-naftyl)]ethylamin;

N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-4-(3-propoxykarbonyl)fenoxy]propyl-1,l-dimethyl-2-naftylethylamin;

(N-[2R-hydroxy-3-[[2-kyan-5-(3-propoxykarbonyl)fenoxy]propyl-1,l-dimethyl-2-naftylethylamin a (N-[2R-hydroxy-3-[2-[2-[6-aminomethyl]pyridyl]ethoxy]-1,1-dimethyl-2-naftylethylamin.
3. Použití účinného množství kalcilytické sloučeniny ve spojení s účinným množstvím anti-resorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou, kde anti-resorpční prostředek je vybrán ze souboru, který tvoří estrogen; 1,25(OH)₂ vitamin D3, kalcitonin, selektivní modulátor estrogenového receptorů, antagonisty receptorů vitronektinu, inhibitory V-HH—ATPázy, antagonisty src SH2, bisfosfonáty a inhibitory katepsinu K.
4. Použití účinného množství kalcilytické sloučeniny ve spojení s účinným množstvím anti-resorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou, kde kostní nebo minerální onemocnění nebo porucha je vybrána ze souboru zahrnujícího onemocnění periodontu, hojení zlomenin, osteoartritidu, revmatoidní artritidu, Pagetovu chorobu, humorální hyperkalcémii u malignit, metastatické postižení kostí, náhrady kloubů a osteoporózu.
5. Použití účinného množství kalcilytické sloučeniny ve spojení s účinným množstvím anti-resorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení osteoporózy jako choroby charakterizované abnormální kostní nebo minerální homeostázou, kde anti-resorpční prostředek je vybrán ze souboru, který tvoří estrogen; 1,25(OH)2 vitamin D3, kalcitonin, selektivní modulátor estrogenového receptoru, antagonisty receptoru vitronektinu, inhibitory VH+-ATPázy, antagonisty src SH2, bisfosfonáty a inhibitory katepsinu K.
6. Použití účinného množství kalcilytické sloučeniny, způsobujícího 3- nebo vícenásobný vzestup hladiny parathormonu v séru, ve spojení s účinným množstvím antiresorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou.
7. Použití účinného množství kalcilytické sloučeniny, způsobujícího 2- nebo vícenásobný vzestup hladiny parathormonu v séru, ve spojení s účinným množstvím antiresorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku • · · ·9· · *· • · · · pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou.
8. Použití účinného množství anabolické sloučeniny ve spojení s účinným množstvím anti-resorpčního prostředku pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch charakterizovaných abnormální kostní nebo minerální homeostázou.

• 9 9 99 99
9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 · • *999999 · ·

9 9 9 9 9

9 «9 9999

4lf