KR20100014173A

KR20100014173A - 벤즈아미딘 유도체 또는 그의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20100014173A
Application number: KR1020090070534A
Authority: KR
Inventors: 이진수; 황연하; 유제만; 박재훈; 정덕균
Original assignee: 동화약품주식회사
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2010-02-10
Also published as: EP2307015A4; CN102149380A; WO2010013969A3; CN102149380B; WO2010013969A2; JP2011529875A; EP2307015A2; CA2732863A1

Abstract

본 발명은 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘, 또는 그들의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 조성물은 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘 또는 그들의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 병용함으로써, 이들 물질을 단독으로 처리한 각각의 약리학적 효과에 비해 훨씬 강력하면서도 유의적인 파골세포 저해효과를 나타내어 골다공증의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.

N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘, 알렌드론산, 골다공증, 파골세포

Description

벤즈아미딘 유도체 또는 그의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 {A pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis comprising benzamidine derivatives or their salts, and alendronic acid or its salt}

본 발명은 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골(骨)조직은 신체의 물리적 지지체로서 필요한 골량과 구조를 보존하는 역할을 하며, 칼슘(Ca²⁺) 등의 보관고로서 칼슘 등의 혈중 농도 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 골조직은 매우 정교하고 복잡한 조절을 통해 끊임없이 골형성과 골흡수를 반복하는 '골 리모델링 (bone remodeling)'이라는 동적인 상태를 유지한다. 리모델링은 골형성을 주도하는 조골세포와 골의 흡수 및 분해작용 기능을 지닌 파골세포에 의해 미세하게 조정되며, 생리학적 및 대사적 측면에서 항상 평형상태를 유지하고 있다. 하지만, 여러 가지 요인 및 병변에 의해 골형성과 골흡수간의 평형관계가 파괴되면 골다공증(osteoporosis)이라는 골 질환이 야기된다.

골다공증은 골조직의 리모델링에 대한 균형이 깨져 골흡수가 골형성에 비해 상대적으로 과다하게 진행되어 발생한 골질환으로, 특히 중-노년층의 여성에게서 많이 발생하고 있다. 골다공증의 증상은 골조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지며, 골밀도 또는 골량의 감소를 야기시켜 골강도가 유지되지 못하는 상태를 보여준다. 결과적으로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 쉽게 골절이 발생된다.

이러한 골절 유발은 골다공증 환자의 병변율과 치사율을 증가시킬 뿐만 아니라, 삶의 질을 떨어뜨리는 매우 심각한 문제를 초래한다. 따라서 골밀도의 증가와 골절유발 가능성을 낮추기 위한 목적으로 여러 가지 기작의 다양한 골다공증 치료제 개발이 이루어지고 있다.

현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트 등), 호르몬 제제(랄록시펜), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제 및 칼슘 제제 등이 있고, 최근에 골생성 효능이 있는 부갑상선 호르몬 제제인 포르테오^TM 등이 시판되었다. 호르몬 제제는 평생 복용하여야 하며 장기 투 여할 경우 유방암, 자궁암, 담석 및 혈전증 등의 부작용이 나타나고, 비타민 D 제제는 고가이며 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 고가이며 투여방법이 어렵고, 칼슘제제는 부작용은 적지만 치료보다는 예방효과에 국한되는 단점이 있다. 최근 상용화된 부갑상선 호르몬 제제인 포르테오^TM 는 골생성 효능이 있어 골흡수 억제에 국한된 기존의 약물들의 단점을 보완 할 수 있는 장점이 있지만 장기간 매일 주사로 투여를 하여야 하며, 골과다생성의 부작용이 있으며, 매우 고가로 폭넓게 사용하는데 제한적이다.

골다공증 치료제 중에서 가장 많이 처방되는 치료제는 비스포스포네이트 계열의 약물로서 하기 구조식과 같은 알렌드로네이트는 강력한 골흡수 저해효과로 인한 골밀도 상승과 골절 예방효과가 증명되었고, 경구복용가능 및 비용효과적 경제성 등의 장점이 있어 현재 임상에서 골다공증을 비롯한 칼슘대사이상으로 인한 질환 치료제로서 널리 사용되고 있다.

그러나, 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 떨어지고 식도염을 유발시키기 때문에 아침 식사 전 충분한 물과 함께 복용 하여야 하고 복용 후 30분 이내 다른 음료, 음식 등을 섭취할 수 없을 뿐만 아니라 일정 시간 이상 누워있는 것이 금지되는 등 그 복용방법이 매우 까다롭고, 저칼슘혈증의 위험성이 증가시킨다고 보고되고 있다. 최근 연구에서 지나친 골흡수 억제로 인한 골전환율(bone turnover rate) 저하, 골의 생성속도에 영향을 주어 골형성을 억제, 위장장애 및 악골괴사 등이 문제점이 제기되고 있다. 최근 보고에 따르면 장기간 사용했을 때 오히려 골절위험 높이는 것으로 알려지고 있다 (Andrew S Neviaser 등, Journal of Othopaedic Trauma, 2008, 22(5), 346~350).

이상에서 볼 수 있듯이 현재 임상에서 사용되고 있는 치료제로는 골흡수와 골형성을 균형 있게 치료하는데 한계가 있다. 따라서 골다공증 근본적인 치료를 위해 균형 있는 골량의 증가와 골의 질을 개선시켜 실질적으로 골절위험을 낮출 수 있는 하는 약물 및 새로운 치료법의 개발이 필요하다.

상기와 같은 단점을 극복하고, 임상적인 치료효능을 증진시키기 위하여 다양한 연구가 진행되어 왔으며, 최근 들어 시판된 골형성을 촉진하는 것으로 알려진 부갑상선 호르몬 제제와 골흡수 저해제의 병용투여에 대한 보고가 있었다. 이들의 자세한 내용은 다음과 같다.

알렌드로네이트와 또 다른 골흡수 저해제 간의 병용투여 예로는, 알렌드로네이트와 에스트로겐 (문헌 - Lindsay 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 3073- 3081 (1999)), 알렌드로네이트와 랄록시펜 (문헌 - Johnell 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 985-992 (2002)), 알렌드로네이트와 HRT (hormone replacement therapy) (문헌 - Greenspan 등, JAMA, 289, 2525-2533 (2003)) 및 알렌드로네이트와 칼시트리올(calcitriol) (국제특허공개 WO 01/28564) 등이 있다. 이들 연구에 대한 일반적인 견해는 단독투여에 비해 골밀도가 더 증가되었음이 인정되나, 골절위험율을 저하시키는 효과는 확인되지 않았다. 또한, 기작은 다르지만 보다 강화된 골 흡수 저해효과로 인해 급격한 골전환율 및 골형성 억제와 같은 근본적인 문제점이 여전히 남아 있어 이들 치료법에 세심한 배려와 연구가 필요한 실정이다.

따라서 알렌드로네이트의 골형성 방해작용을 낮추고 부작용을 완화시키는 방안으로 골형성 촉진제와의 병용투여법이 시도되었다. 대표적인 예로는 부갑상선 호르몬 제제와의 병용치료이다. 폐경 후 여성 (문헌 - Black 등, N. Eng. J. Med. 349, 1207-1215, (2003))과 노인 남성 (문헌 - Finkelstein 등, N. Eng. J. Med. 349, 1216-1226, (2003))을 상대로 동시에 두 약물을 병용투여 하였으나, 단독투여와 비교하여 병용투여에 의한 골밀도 상승효과는 관찰되지 않았다. 따라서 몇몇 연구자들은 동시에 투여된 강력한 골흡수 저해제인 알렌드로네이트가 부갑상선 호른몬의 골형성 촉진효과를 상쇄시킬 가능성을 제기하고 있다. 이 후, 두 약물들 간의 순차적인 병용투여가 시도되고 있으나 정확한 임상적 소견을 결정하기에는 더 많은 연구가 요구되고 있는 시점이다.

한편 선행연구로부터 골다공증에 대한 효과적인 치료제로서, 본 발명자들은 대한민국 특허등록 제454767호를 통하여 벤즈아미딘 유도체인 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그들의 염이 골다공증의 예방 및 치료제로서 매우 유용함을 확인한 바 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

이에 본 발명자들은 골다공증 예방제 또는 치료제로서 유효한 상기 화학식 1과 화학식 2의 성분을 단일 제제로 이용할 수 있는 비스포스포네이트 계열의 알렌드로네이트, 호르몬 제제(랄록시펜), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제 및 칼슘 제제 등 기존의 여러 골흡수 억제 골다공증 치료제들을 비롯하여 골생성 촉진제 골다공 증 치료제와 병용투여함으로써 이들의 장점을 살리고 단점을 줄인 새로운 치료방법을 연구하여 왔다.

그 결과, 본 발명자들은 단일 제제로 이용할 수 있는 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그들의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 병용함으로써, 현저하게 효과가 우수한 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 골다공증 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기의 (a) 및 (b)를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다:

(a) 하기 화학식 1로 표시되는 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 하기 화학식 2로 표시되는 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 및 그들의 염으로부터 선택되는 화합물; 및

(b) 하기 화학식 3으로 표시되는 알렌드론산 또는 염.

본 발명에서 용어 '골다공증'은 남아 있는 뼈에는 구조상으로 아무런 이상이 없으면서 뼈를 형성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소되어 뼈에 스펀지 처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러지는 상태를 일컫으며, 골소공증이라고도 한다.

본 발명에서 사용하는 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 공지된 방법(이성은, Synthesis and Biological Activity of Natural Products and Designed New Hybrid Compounds for the Treatment of LTB ₄ Related Disease, 부산대학교 대학원 이학박사 학위논문, 1999. 8)에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다.

한편, N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘의 염은 당업계에서 약제학적으로 허용되는 염이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 이는 제한되지 않으나 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 산 부가염의 형태가 될 수 있다. 그러한 약제학적으로 허용되는 염으로는 무기산으로 염산, 브롬산, 황산 또는 인산 등이, 유기산으로 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 메탄설폰산, 말레인산벤조산, 글루콘산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 무기산으로 염산이 유기산으로 메탄설폰산이 사용될 수 있다.

N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그들의 염의 투여량은 골다공증 예방 또는 치료에 유효한 양이며, 환자의 연령, 체중, 병용요법의 종류, 치료의 빈도, 바람직한 효과의 종류 혹은 투여법 등에 의하기 때문에 일률적으로 결정할 수는 없지만, 일반적으로 치료제 또는 예방 제로서 사용되는 경우에는 각종의 투여 경로를 통하여 골다공증을 치료하는데 유효한 양으로 투여될 수 있으며, 그의 제형, 투여량 등은 투여목적, 투여경로 및 투여대상의 상태 및 체중 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그들의 염의 투여량은 약 1 내지 500 mg이고, 바람직하게는 5 내지 200mg 이다.

또한, 본 발명에서 사용되는 알렌드론산 역시, 공지의 제조방법에 의해서 제조가능하며, 그의 염 또한 약제학적으로 허용가능한 염은 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 나트륨염이다. 알렌드론산 또는 그의 염의 투여량은 골다공증의 예방 또는 치료에 유효한 양으로, 환자의 연령, 체중, 병용요법의 종류, 치료의 빈도, 바람직한 효과의 종류, 또는 투여법 등에 따라 일률적으로 결정할 수 없지만, 일반적으로 치료제 또는 예방제로서 사용되는 경우에는, 통상의 양을 투여하는 것이 가능하다. 구체적으로, 상기 알렌드론산 또는 그의 염의 일일 투여량은 5 내지 40mg 이다.

본 발명에서, 상기 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그들의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염은 임의의 비 율로 병용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그들의 염과, 알렌드론산 또는 그의 염은 혼합하여 동시에 투여하는 것도 가능하지만, 각각을 별개로 동시 또는 연쇄적으로, 혹은 시간을 두고 별개로 투여하는 것도 가능하다. 동시에 투여하는 것이 아닌 경우는, 예를 들면 두 유효성분을 교대로 번갈아 투여하거나 혹은 하나를 계속해서 투여한 후 다른 하나를 투여하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서 약제는 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그들의 염 및 알렌드론산 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하고 있으면 되며, 어떤 형태의 약제여도 가능하다. 예를 들면, 두 유효성분을 포함한 합제를 구성해도 좋고, 각각 단제로서 구성되어도 좋다. 여기에서 합제란, 하나의 제제에 2가지 이상의 유효성분을 배합한 것을 말하며, 단제란 하나의 제제에 하나의 유효성분을 함유한 것을 말하며, 이때 상기 유효성분들은 각각의 약리, 약동학적 특성에 따라 각기 다른 제형(예를 들어 속방 또는 서방형)으로 제조되어 합쳐질 수도 있다. 또한 이들 합체는 다층정, 코팅정 등과 같이 각 층 또는 코팅 및 코어에 각기 다른 유효성분들을 각각 포함하는 형태로 제제화 될 수도 있다. 본 발명에 있어서 두 유효성분이 단제인 경우의 치료제 및 예방제는, 각각 단일로 이용이 가능한 단제를 조합하여 이용하는 약제 또는 방법을 의미한다. 따라서 두 유효성분을 함유한 약제가 각각 다른 제형이어도 상관없다. 두 유효성분이 단제인 경우는, 두 성분을 한 번에 갖춘 형태인 키트의 형태여도 좋다.

또 본 발명의 골다공증 예방제 또는 치료제는, 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다.

본 발명의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그의 염 및 알렌드론산 또는 그의 염은, 그들만 혹은 이하에서 설명하는 것과 같은 적당한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 공지의 방법으로 제제화 할 수 있다. 이와 같은 제형의 구체적인 예로서는, 연질캡슐제, 경질캡슐제, 정제, 시럽제 등의 경구제, 주사제 또는 외용제를 들 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체에는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용되는 표준의 제약학적 담체 중 어느 것이든 포함된다. 전형적으로 이러한 담체는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트린, 전분, 밀크, 당, 특정 종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 (예를 들면 식용유, 면실유, 코코넛유, 아몬드유, 낙화생유를 들 수 있다) 중성지방산 글리세라이드 등의 유상 에스테르, 광물유, 바세린, 동물유지, 셀룰로오스 유도체(예를 들면 결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스를 들 수 있다) 등의 부형제, 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 또한 산화방지제, 습윤제, 점도안정제, 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다. 이러한 담체를 함유하는 조성물은 주지된 방법에 의해 제형화 될 수 있다.

본 발명의 골다공증 예방제 및 치료제는, N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘 또는 그들의 염과 알렌드론산 또는 그의 염이라고 하는 서로 다른 작용기전을 가진 2종류를 유효성분으로서 병용하는 것이며, 종래 단일 약물로서 사용되는 경우에 비해 골밀도 및 골강도의 현저한 향상효과를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘 또는 그들의 염, 및 알렌드론산 또는 그의 염을 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

앞서 언급한 바와 같이, 상기 물질들의 투여량은 다양한 요소에 의해 달라질 수 있으며, 그 투여 경로 또한 환자의 연령, 투여기간, 체중, 질환의 중증도, 환자의 의식 여부, 병용 약물의 종류 등과 같은 다양한 요소에 의해 경구 또는 비경구의 다양한 투여 경로를 사용할 수 있다. 또한, 각각을 별개로 동시 또는 연쇄적으 로, 혹은 시간을 두고 별개로 투여하는 것도 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 자세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘과 알렌드론산을 동시에 병행처리 하였을 때, 단독처리한 각각의 실험결과의 합들보다 훨씬 강력하면서도 유의적인 파골세포 저해효과가 관찰되었다. 즉 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘 또는 그들의 염, 및 알렌드론산 또는 염을 병용하여 투여하는 것이 각각을 단독 투여한 결과에 비해 월등히 우수한 골흡수 억제작용을 나타내어 보다 우수한 골다공증 예방효과 및 치료효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 그의 염 및 알렌드론산 또는 염을 병용하여 투여하는 것과 각각을 단제로 사용하는 경우의 골다공증 치료효과를 평가하였다.

파골세포 분화는 골수세포(bone marrow cells)와 두개골 유래 골아세 포(calvarial cells)의 공존배양법(co-culture system)으로 유도되었고, 단제 혹은 합제의 처리에 의해 파골세포의 분화가 저해된 정도를 측정함으로써 약물의 효과를 평가하였다.

실시예 1: 골수세포와 골아세포의 준비

골수세포는 6-8 주령된 수컷 ddY 마우스로부터 대퇴골 및 경골을 적출하여 주사기를 이용한 일반적인 방법으로 회수하였다. 골수 내 적혈구를 제거한 후, 원심분리를 통해 회수한 골수세포를 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 α-MEM 배지에서 넣어 유핵 세포수를 확인하고, 공존배양을 위해 바로 사용하였다.

마우스 두개골을 생후 1-2일 된 ICR 마우스로부터 적출하고, 두개골 세포(calvarial cell), 즉 1차 골아세포(osteoblast)를 0.2% 콜라게네즈 효소용액과의 연속적인 반응을 통해 분리하였다. 분리한 두개골세포는 원심하여 10% 우태아혈청이 첨가된 α-MEM배지에서 일정한 기간 동안 배양시켰다. 이후, 원하는 세포수가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다.

실시예 2: 공존배양에 의한 파골세포 분화실험

상기에서 준비한 골수세포와 골아세포를 96웰 당 각각 1×10⁵ 세포수와 3,000 세포수가 되도록 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 α-MEM 배지에 희석하였다. 이때 사용되는 배양액은 분화인자인 1α,25-디히드록시비타민 D3 (10^-8M, 이하 비타 민 D3)와 덱사메타손(10^-8M)이 첨가된 파골분화배지로 파골세포의 분화를 유도하였다. 세포들은 매 2-3일마다 분화인자가 포함된 신선한 배지로 교환되었다.

배양개시 7일 후에 다핵을 지닌 파골세포가 형성되었는지 확인한 후, 배지를 제거하고 10% 포르말린이 포함된 인산완충용액으로 세포를 고정하였다. 성숙한 파골세포의 형성정도는 주석산저항성산성포스파타제(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase: 이하 TRAP)-양성반응을 지닌 다핵 파골세포 (TRAP-positive multinucleated osteoclasts: 이하 TRAP(+) MNCs)의 수를 측정하는 걸로 결정하였다. TRAP 염색액은 기질인 나프톨 AS-MX 포스페이트(pH 5.0), 색소인 Fast Red Violet LB 및 50 mM 타르타르산을 넣어 제조하였고, 사용 전까지 냉장보관 하였다. 6-7개 이상의 핵을 지닌 TRAP(+) MNCs의 숫자를 광학현미경 관찰 하에서 측정하였다.

실시예 3: 실험물질이 파골세포 분화에 미치는 영향

가. 시료의 준비

본 발명의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘 및 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘은 공지된 방법(이성은, Synthesis and Biological Activity of Natural Products and Designed New Hybrid Compounds for the Treatment of LTB ₄ Related Disease, 부산대학교 대학원 이학박사 학위논문, 1999. 8)에 따라 제조될 수 있으며, 또한 알렌드론산 나트륨은 공지된 방법(USP 4,407.761, 4,621,077, 4,705,651, 5,039,819, 5,159,108)에 따라 제조될 수 있다.

N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시} 벤즈이미딘 디메탄술폰산염의 단독처리, 알렌드론산 나트륨의 단독처리 및 N-히드록시-4-{5-[4-(5 -이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 알렌드론산 나트륨의 동시처리 시에 파골세포 분화에 미치는 영향을 상기의 실험을 통해 평가하였다. 모든 실험은 비타민 D₃와 덱사메타손이 존재하는 파골분화배지를 이용하였다.

N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시} 벤즈아미딘 디메탄술폰산염은 DMSO를 사용하여 0.1 mM, 0.3 mM 및 0.5 mM의 농도로 용해시킨 후, 파골분화배지로 1,000배 희석하여 최종 0.1μM, 0.3μM 및 0.5μM이 되도록 하였다. 알렌드론산 나트륨 수화물은 정제수를 사용하여 0.2 mM의 농도로 용해한 후, 파골분화배지 내에 1,000배 희석하여 최종 0.2μM의 농도가 되도록 하였다. 이때, 대조군은 0.1% DMSO가 포함된 상태를 유지하였다. 각 실험은 아래와 같은 설정을 통해 각각 단독처리 혹은 동시처리 하였다.

실험예 1: 0.1μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 0.2μM의 알렌드론산 나트륨의 단독 혹은 병용투여가 파골세포 분화에 미치는 영향

가. 대조군 (0.1% DMSO 용매)

나. N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시} 벤즈아미딘 디메탄술폰산염(0.1μM) 단독처리군

다. 알렌드론산 나트륨(0.2μM) 단독처리군

라. N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시} 벤즈아미딘 디메탄술폰산염 (0.1μM)과 알렌드론산 나트륨(0.2μM)의 동시처리군

상기 공존배양법에서 준비된 세포들을 각 웰에 깔고, 시료물질들 혹은 용매를 첨가하여 세포배양을 개시하였다. 배양 3일과 5일째에 시료물질들이 포함된 신선한 분화배지로 교환하였다. 실험 7일째에 세포를 고정하고 TRAP 염색을 실시하였다. 6개 이상의 핵을 가진 TRAP(+) 파골세포를 현미경하에서 관찰하여 그 수를 세었다. 실험결과는 용매만을 사용한 대조군의 파골세포 수를 100%로 놓고, 각 실험군에서 관찰된 파골세포의 수를 대조군에 비교하여 상대적 백분율(%)로 표시하였다. 각 실험군 당 4개 웰의 개체수 (n=4)로 실험하였고, 결과는 평균값± 표준편차로 나타내었다. 또한, 상기 실시예는 적어도 2회 이상의 반복실험을 실시하였고, 각 실험군에 대한 상호 유의성 검증은 Student t-test를 통해 적용하였다. 각 실시예에 대한 결과는 도 1에 나타내었다.

그 결과, 0.1μM 농도의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염을 단독처리 하였을 때, 용매 대조군에 비해 TRAP-양성반응을 보이는 다핵 파골세포의 상대적 수가 유의적으로 감소시켜 의미 있는 저해효과를 보였다. 또한, 단독처리 한 알렌드론산 나트륨 실험군 (0.2μM)에서도 80.6%의 상대적 수치를 보여 파골세포 분화가 유의적으로 억제됨을 나타내었다. 개별적으로 처리 되었던 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 알렌드론산 나트륨을 상기와 동일한 농도로 동시에 병행처리 하였을 경우, 파골세포의 상대적 수치는 눈에 띄게 유의적으로 감소하여 36.4%의 수치로 내려갔다. 이러한 수치는 각각을 단독처리 한 결과의 합보다 훨씬 낮은 수치로 강력한 파골세포 분화저해 현상을 나타내고 있다. 상기 결과를 통해 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 알렌드론산 나트륨을 동시처리 즉, 병용투여한 경우에는 단일물질 개별효과의 합으로부터 예상할 수 있는 효과보다 훨씬 높은 약효를 유도할 수 있음을 입증하였다.

실험예 2: 0.3μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 0.2μM의 알렌드론산 나트륨의 단독처리 혹은 동시처리가 파골세포 분화에 미치는 영향

가. 대조군 (0.1% DMSO 용매)

나. N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시} 벤즈아미딘 디메탄술폰산염 (0.3μM) 단독처리군

다. 알렌드론산 (0.2μM) 나트륨 단독처리군

라. N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시} 벤즈아미딘 디메탄술폰산염(0.3μM)과 알렌드론산 나트륨(0.2μM)의 동시처리군

상세 실험은 실시예 1과 동일하게 적용하였다.

그 결과, 도 2의 파골세포 분화에 대한 실험결과에서 보여진 바와 같이, 단독으로 처리된 0.3μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염은 0.1μM의 실험군에 비해 낮은 수치의 상대적 파골세포 비율 (52.4%)이 관찰됨으로써 보다 향상된 파골분화 저해효과를 유의적으로 보여 주었다. 알렌드론산 나트륨 성분의 단독처리는 상기 실시예 1에서 언급한 바대로 유의적으로 파골세포의 상대적 수를 감소시켰다. 두 가지 시료물질을 동시에 병행투여 했을 시, 파골세포의 형성이 저해되어 20.1%의 매우 낮은 상대적 파골세포 수치가 관찰되었다. 이러한 결과는 두 물질의 동시처리가 개별적인 처리의 합으로부터 기대되는 것보다 훨씬 강력한 저해효과가 있음을 나타내는 것이다.

실험예 3: 0.5μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 0.2μM의 알렌드론산 나트륨의 단독처리 혹은 동시처리가 파골세포 분화에 미치는 영향

가. 대조군 (0.1% DMSO 용매)

나.N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염 (0.5μM) 단독처리군

다. 알렌드론산 나트륨(0.2μM) 단독처리군

라. N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시} 벤즈아미딘 디메탄술폰산염 (0.5μM)과 알렌드론산 나트륨(0.2μM)의 동시처리군

상세 실험은 실시예 1과 동일하게 적용하였다.

그 결과 예상한 바와 같이 0.5μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸 -1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염은 강력하게 파골세포 의 분화를 억제하여 34.5%의 상대적 파골세포 수치가 측정되었다. 이와 함께 0.2μM의 알렌드론산 나트륨을 병행처리 하였을 때, 대조군에 비해 9.7%라는 매우 낮은 수치의 파골세포 비율이 관찰되었다. 이는 N-히드록시-4-{5-[4-(5 -이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 알렌드론 산 나트륨의 단독처리 결과의 합보다 유의적으로 낮은 수치로 파골세포 분화에 대한 강력한 병행처리 효과를 시사하고 있다.

도 1은 0.1μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 0.2μM의 알렌드론산의 단독처리 혹은 동시처리가 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인한 그래프로서, 골수세포와 골아세포의 공존배양을 통해 파골세포의 분화를 유도하고, 각 시료물질을 단독 혹은 동시에 처리하여 7일간 배양하였고, 이후 TRAP염색으로 핵이 6개 이상 지닌 파골세포의 수를 세고, 대조군과의 비교를 통해 백분율로 나타내었다.

도 2는 0.3μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 0.2μM의 알렌드론산의 단독처리 혹은 동시처리가 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인한 그래프로서, 골수세포와 골아세포의 공존배양을 통해 파골세포의 분화를 유도하고, 각 시료물질을 단독 혹은 동시에 처리하여 7일간 배양하였고, 이후 TRAP염색으로 핵이 6개 이상 지닌 파골세포의 수를 세고, 대조군과의 비교를 통해 백분율로 나타내었다.

도 3은 0.5μM의 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일) 페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 디메탄술폰산염과 0.2μM의 알렌드론산의 단독처리 혹은 동시처리가 파골세포 분화에 미치는 영향을 나타낸 그래프로서, 골수세포와 골아세포의 공존배양을 통해 파골세포의 분화를 유도하고, 각 시료물질을 단독 혹은 동시에 처리하여 7일간 배양하고, 이후 TRAP염색으로 핵이 6개 이상 지닌 파골 세포의 수를 세고, 대조군과의 비교를 통해 백분율로 나타내었다.

Claims

하기의 (a) 및 (b)를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위해 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 하기 화학식 1로 표시되는 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘, 하기 화학식 2로 표시되는 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 및 그들의 염으로부터 선택되는 화합물; 및

(b) 하기 화학식 3으로 표시되는 알렌드론산 또는 염,

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

.
제1항에 있어서, 상기 N-히드록시-4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}벤즈아미딘 또는 4-{5-[4-(5-이소프로필-2-메틸-1,3-티아졸-4-일)페녹시]펜톡시}-벤즈아미딘의 염은 염산염 또는 메탄술폰산 염인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알렌드론산의 염은 나트륨염인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 (a) 및 (b)를 포함하는 합제의 형태로 제형화된 것임을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 (a) 및 (b)를 각각 포함하는 독립한 단제의 형태로 제형화 된 것임을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은 (a) 및 (b) 를 각각 포함하는 독립한 단제 두 개가 키트 형태로 구성된 것임을 특징으로 하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.