CZ20021472A3 - Trojrozměrná struktura na bázi nukleových kyselin vysokého řádu - Google Patents

Description

Trojrozměrná struktura na bázi nukleových kyselin vysokého řádu

Oblast techniky

Vynález se týká struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu, které vážou molekuly jiné než jsou nukleové kyseliny samotné. Obzvlášť se vynález týká molekulových struktur na bázi nukleových kyselin s farmaceutickou aktivitou prostřednictvím vazby na specifické molekulární cíle a tedy ovlivňující chorobné stavy. Vynález se týká také molekulových struktur na bázi nukleových kyselin s diagnostickou využitelností.

Dosavadní stav techniky

Existuje velká potřeba prostředků schopných specificky měnit aktivitu určitých proteinů nebo měnit expresi určitých genových produktů. Zvláště jsou žádoucí molekuly schopné vytvářet specifické vazební interakce s ostatními molekulami a obzvláště molekuly vykazující specifické vazby v prostředí in vivo.

Vedle těchto snah byly vyvinuty metodologie k umožnění vytvářet knihovny tříd molekul, ze kterých se vybírají takové kompozice. Příkladem je výběr specifičnosti vazby nalezený v proti látkové molekule a existuje dnes řada významných technologií pro vývoj monoklonálníeh protilátek a jejich rekombinantních derivátů. Tyto technologie poskytly řadu terapeutických drog a mnoho diagnostických a vývojových prostředků. Všechny takové produkty jsou proteinové molekuly a jako takové jsou vyrobitelné pouze pomocí biologických systémů. Alternativně byly vyrobeny plně syntetické vazební molekuly. To jsou molekuly vybrané z různých knihoven podobných nebo variantních molekul téže chemické třídy a obecně vybrané skríningovým sys2 « · • 9 <

9 9 4 t-émem poskytujícím surogát požadovaného terapeutického cíle nebo aspektu jeho aktivity. Skrínování rozsáhlých chemických knihoven malých molekul je klasickou cestou při vývoji léčiv s malou molekulou, avšak knihovny syntetických peptidů a syntetických molekul nukleových kyselin se dnes také skrínují z hlediska potenciálně užitečných léčiv.

U knihoven nukleových kyselin se týkal technický přístup obecně použití molekul RNA nebo DNA s jediným řetězcem definované jednotkové délky. Vazba báze na cílovou molekulu není předem konfigurována a může být závislá na vytváření sekundárních struktur uvnitř molekuly DNA (nebo RNA) samotné, což usnadňuje vazbu na jinou molekulu (Bock L.C. a kol., Nátuře 355, str. 564 až 566, 1992; Kubrik M.F. a kol., Nucleic Acids Res. 22, str. 2619 až 2626, 19945. O vytváření molelkul nukleové kyseliny obsahujících předem konfigurované trakty struktury sekundární (nebo vyšších řádů) pro terapeutické a diagnostické využití jako podle vynálezu se nikdo dříve nepokusil.

Vynález se týká nových struktur’ nukleových kyselin vysokých řádů a nového použití takových struktur.

Z dosavadního stavu techniky jsou známy struktury nukleových kyselin vysokých řádů. Jeden typ takových nukleových kyselin se nazývá aptamery a liší se od molekul podle vynálezu svým rozměrem, výrobou a topologickou komplexností. Způsoby, zahrnující jejich vývoj in vitro nebo selekci z rozsáhlých náhodných fondů knihoven, byly aplikovány k vyvinutí aptamerů RNA a DNA. Molekuly DNA schopné usnadnit enzymatický proces, jako je aktivita polynukleotidové kinázy, byly vyvinuty selekcí iterativních cyklů (Lorsch J.R. a Szostak J.V. , Nátuře 371, str. 31 až 36, 1994) a byly vybrány molekuly DNA s krátkým jediným řetězcem schopné vysoce specifické inhibice lidské fosfolipázy A2 (Bennett C.F. a kol., Nucleic Acids Res. 22, str. 3202 až 3209, 1994). Jiní pracovníci v oboru vyvinuli ne3 ··· · » · · · · · · závisle aptamery na bázi DNA nebo RNA schopné vázat a inhibovat několik funkcí lidských trombů (Bock L.C. a kol., Nátuře

355, str. 564 až 566, 1992; Kubrik M.F. a kol., Nucleic Acids

Res. 22, str. 2619 až 2626, 1994).

Mezi další typy struktur nukleových kyselin vysokých řádů patří rozvětvená DNA (Horn T. a Urdea M.S, Nucleic Acids Res. 17, str. 6959 až 6967, 1989), přičemž jedna nebo několik oblastí molekul DNA (sonda“) , která hybridizuje na komplementární molekulu nukleové kyseliny, může být sama předmětem hybridizace k jiné molekule DNA k zesílení množství DNA přidružené k sondě DNA. Avšak komplexy, které popsali Horn a Urdea, jsou lineárně rozšířené, čímž nově hybridizované molekuly nukleové kyseliny nejsou určeny k hybridizování na dříve hybridizované molekuly, ale na jiné přistupující nové molekuly k vytvoření rozvětvených struktur DNA. Takové komplexy jsou ve skutečnosti jednoduše určeny k vytváření co možno nejvíce větví k poskytnutí více míst pro teplotní hybridizaci signální sondy nukleové kyseliny.

Jiné geometrické struktury poskytované charakteristikami párování bází nukleových kyselin byly využívány v oblasti nauky o materiálu a nanotechnologie (Aliviatos A.P. a kol., Natua kol., Nátuře 407, str. Nature 406, str. 605 až technické způsoby výroby re 382, str. 609 až 611, 1996; Mao C.

493 až 496, 2000; Yurke B. a kol.,

608, 2000). Byly popsány elegantní a analýzy struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu, včetně quadrilaterálních, oktaedrových a trojúhelníkových motivů mnohonásobně propojených do mřížky (Chen J. a kol., J. Am. Chem. Soc. 111, str. 6402 až 6407, 1989; Zhank a kol., J. Am. Chem. Soc. 116, str. 1661 až 1669, 1994; americké patentové spisy číslo US 5 278051, 5 468851, 5 386020 a 6 072044).

Geometrické objekty jsou uzavřené struktury vyrobené iterativními způsoby zahrnujícími vazbu restrikčních enzymů a DNA. Nodální body v obrazcích mohou být fixovány příčným propojením • · »· ·· • 9 ·· «··· mezi pozicemi k vytvoření tuhé formy nebo méně flexibilní větve dosažené teplotní hybridizací nespárovaných pozic. Dosavadní stav techniky nezahrnuje geometrické struktury, které nejsou uzavřené (tedy koncově vázané). Dosavadní stav techniky neobsahuje geometrické struktury, které zahrnují oblasti modifikovaných nukleových kyselin a neobsahuje geometrické struktury nukleových kyselin napojené na jiné molekulární jednotky. Dosavadní stav techniky nezahrnuje použití knihoven nahodilých nebo polonahodilých struktur nukleových kyselin.

V souvislosti s novým použitím struktur nukleových kyselin vysokých řádů se má zato, že nukleové kyseliny nízkého řádu jako terapeutické a diagnostické molekuly, jsou v oboru jako takové známy. Obzvláště je mnoho příklaů molekul nukleových kyselin s možnou a nebo skutečnou terapeutickou aktivitou. Takové molekuly nukleových kyselin fungují buď jako antimediátorové buňky, triplexní reakční činidla nebo jako molekuly RNft s endoribonukleázovou aktivitou (ribozimy). Ve všech těchto případech působí modalita terapeutické nukleové kyseliny jako modulátor exprese proteinů mechanismem činnosti, která snižuje nebo blokuje translaci proteinů. Specifičností cílené vazby ve všech těchto případech je vazba nukleové kyseliny k nukleové kyselině- Tyto význaky (translace modulace, vzájemná vazba nukleových kyselin) jsou v kontrastu s modalitou vynálezu. Odlišným a inventivním význakem vynálezu je použití struktur nukleových kyselin vysokého řádu s vazebnou aktivitou na cílenou molekulu.

Jiné struktury nukleových kyselin (“nízkého řádu), obzvláště ňptamery, byly testovány jako terapeutické a diagnostické molekuly. Zjistilo se, že některé jiné molekuly nukleových kyselin, obzvláště ribozymů, mají enzymatické účinky možného farmaceutického významu. Farmaceutické využití uzavřených geometrických struktur nebylo bráno v úvahu, ačkoli americký patentový spis Číslo US 5 278051 naznačuje možné využití jako

9 · ·

99999 · · ♦ · · • 99 9

99

9 rozpouštědel nebo řízených uvolňovacích nosičů pro maloraolekulární léčiva.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny sestávající z mnoha propojených řetězců molekul nukleové kyseliny nebo jejich segmentů specifickou pérovací interakcí bází dvou nebo několika molekul, přičemž struktury nejsou kovalentně uzavřené.

První význak vynálezu se týká nových struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu, obzvláště otevřených geometrických struktur. Kromě toho se vynález týká využitelnosti takových struktur jako farmaceutických a/nebo diagnostických činidel . Vynález se týká také struktur na bázi nukleových kyseliny vysokého řádu včetně nukleotidů s modifikacemi. Vynález se týká také struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu včetně oblastí náhodných nebo polonáhodných nukleotidů. Vynález se týká také struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu napojených na jiné molekulární jednotky jako jsou proteiny.

Struktury podle vynálezu využívají Vatson-Crickových pravidel párování bází v oboru konstruování dvouřetězcových struktur. Molekuly jednořetězcových nukleových kyselin mají schopnost hybridizace k jiným jednořetězcovým molekulám komplementárním působením mezi bázemi. Zatímco taková hybridizace dvou jednořetězcových struktur vede obvykle k lineární dvouřetězcové molekule, jiné struktury mohou být produkovány vlásečnicovými smyčkami, kde jedna molekula má interní komplementaritu páru bází a kruhy kde oba konce každé jednořetězcové molekuly mají vzájemnou komplementaritu. Při strategické konstrukci sekvencí jednořetězcových nukleových kyselin, mohou být zkonstruovány individuální molekuly, které mohou současně hybti · • tititi ti ti • ti * • ti

ti • ti titititi ridizovat na dvě nebo na několik jiných molekul a naopak se mohou tyto jiné molekuly hybridizovat na další molekuly včetně molekul již začleněných do hybridizace, pak se mohou vytvořit komplexy nukleových kyselin.

Celkové rozměry a topologie dvouret-ězcových molekul DNA jsou dobře známé. Dvouřetězcová DNA je dosti flexibilní a šroubovice je schopna zaujmout řadu konformací lišících se v úhlu rotace mezi sousedními páry bází podél šroubovice. V přírodě se vyskytující jednořetězcové molekuly nukleových kyselin, jako je RNA, zaujmou výhodné konformace v roztoku. Konformace je diktována interakcemi párování bází uvnitř téže molekuly a vede k produkci stabilizované struktury sestávající z dvouřetězcových kmenů a jednoretězcových smyček. Molekuly zaujmou konformací nejnižší energie a jejich struktura pro známou sekvenci RNA může být předpověděna výpočetními pochody (Jaeger J.A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, str. 7706 až 7710, 1989). Byly snahy o vytvoření předpovědního softveru pro ohýbání DNA a dosáhly určitého úspěchu (Nielsen D.A. a kol., Nucleic Acids Res. 23, str. 2287 až 2291, 1995)). Porovnání rozměrů mezi nukleovou kyselinou a molekulami proteinů ukazuje velmi výrazné rozdíly ve strukturním uspořádání těchto dvou tříd molekul, podporuje však také pojetí, jež je podkladem vynálezu. Typický globulární protein, jako je myoglobin s molekulovou hmotností 17 kDa, má velikost ve svém nejdelším rozměru 3 nm. Velký globulární protein, jako je albumin hovězího séra s molekulovou hmotností 68 kDa, je ve svém největším rozměru dlouhý 5 nm CCohen C. ve Volstenholme G.E.V & 0Cormor M. (vydavatelé) Ciba Foundation Symposium, Londýn, J & A Churchill, 1966). Průměr dvouřetězcové šroubovice je jako takový 2 nm a řetězec DNA s malým počtem párů bází, asi 100, by dosahoval délky obvodu přibližně 30 nm. Proto ačkoli je hustota DNA nebo kterékoli jiné molekuly nukleové kyseliny značně menší než hustota typického proteinu, topologie molekuly DNA i v nejvíce strukturované nativní formě, jako je dvojitá šroubo9·9· ··· ···· 9

9 ·

9·· · · 9 * 4 • · ·

99 ·· vice, by mohla snadno pokrýt velké části vystaveného povrchu téměř každé molekuly proteinu. Obzvláště, nebyla-li topologie obvykle jednovláknové DNA tak změněna, mohla by DNA zaujímat velkou část prostoru způsobem více se blížícím k molekulám proteinu se značně vyšší hustotou. Je možno konstatovat, že sestava struktur nukleových kyselin, sestávajících z řady propojených řetězců, z nichž Je každý pouze krátký (<50), nukleotidových traktů může snadno vést ke strukturám s celkovými rozměry řádově 10 až 500 nm. Je zvláštním záměrem vynálezu poskytnout takovou formulaci molekuly nukleové kyseliny.

Struktury podle vynálezu jsou založeny na vytváření molekul DNA nebo RNA se sekundárními strukturami vytvořenými jako výsledek interakce dvou nebo několika molelul nukleové kyseliny, nebo alternativně jako výsledek interakce různě definovaných segmentů uvnitř jednotlivých molekul nukleové kyseliny. V tomto vynálezu je informačního obsahu DNA nebo RNA využito nikoli jako kódující jednotky pro expresi terapeutického proteinu ani jako blokující jednotky pro metabolismus nukleové kyseliny a genovou expresi (pozitivní), nýbrž k přímému sestavení trojrozměrné molekulové struktury zvláštního tvaru.

Vynález zahrnuje molekuly nukleových kyselin, obzvláště syntetické molekuly DNA, které vytvářejí trojrozměrné (nerovinné) molekulové struktury párováním specifických bází uvnitř molekul v souboru. Specificky jsou molekuly DNA konstruovány tak, aby měly jednu nebo několik sekvenčních domén, které se mohou hybridizovat s jinými molekulami v souboru k vytvoření kompozitové trojrozměrné strukury nukleové kyseliny. Tímto schématem se může vytvářet přibližná krychlová struktura hybridizací šesti syntetických molekul DNA, z nichž každá obsahuje čtyři domény komplementarity, přičemž každá molekula je v interakci se čtyřmi jinými molekulami a přičemž každá molekula působí účinně jako jednotlivá hrana šestiboké krychle. Struktura je otevřená (nikoli koválentně uzavřená), flexibilní »0 000« ·

• » ♦ ·

0·00 »000 0·* .

0 0 obzvláště pro další útvary pozměnitelné k modifikaci přidáním dalších funkčních nebo strukturních skupin.

V jedné struktuře na bázi nukleové kyseliny vysokého řádu podle vynálezu jsou molekuly nukleové kyseliny, z nichž každá zaujímá dvě nebo více domén samokomplementární sekvence umožňující molekule nukleové kyseliny tvořit záhyby kolem sebe sáné a vytvářet vzájemné interakce k vytváření zvláštní trojrozměrné molekulární struktury cestou specifického párování bází. U některých aplikací se zjistilo, že chemická nestabilita molekul nemodifikované DNA byla specifickým problémem pro použití takových strukur jako léčiva. Dnes je k disposici několik způsobů jak chránit molekuly DNA před odbouráním enzymatickým napadením. Patří k nim použití modifikovaných fosfodiesterových koster Cmethylfosfonát, fosforothioát, peptidové nukleové kyseliny) nebo úprava čepičkou 5 a 3 konců použitím vazeb fosforameditu, fosforothioátu nebo fosforodithioátu. Podle vynálezu je obzvlášť výhodné použít modifikovaných nebo neprírodních nukleových kyselin ve strukturách na bázi nukleových kyselin vysokého řádu. Nadto je obzvláště žádoucím význakem zvýšená flexibilita specifičnosti vázání dosahovaná použitím kombinace chemie a alternativních koster nepřírodních nukleových kyselin.

Struktura podjednotek nukleových kyselin vysokého řádu podle vynálezu může být svou povahou homotypická nebo heterologová, například DNA obsahující trakty RNA. Je známo, že trakty RNA uvnitř šroubovice DNA mění smyčkování v roztoku CVang A. a kol., Nátuře 299, str. 601 až 604, 1982). Schopnost poskytovat konformační rozmanitost uvnitř lokalizovaného traktu nukleové kyseliny může být významná měněním specifičnosti cílového proteinu a tento jev je v oboru znám, přičemž vazební specifičnost trombinového aptameru je závislá na krátkém traktu výše uspořádané terciární struktury (Griffin L. a kol.,Gene 137, str. 25 až 31, 1993). Kromě toho může být analogů nepři·· ·4· · » 4 4

4 44 « ♦ • · ♦ 4

4 4

4444

4« • » 4··4 rodní fosfátové kostry využito ke zlepšení stability a také k pozměnění vazební specifičnosti žádaného cílového proteinu. Lathan a kol. (Lathan J.A. a kol., Mucleic Acids Res. 22, str. 2817 až 2822, 1994) uvádí příklad, ve kterém bylo použito modifikovaného nukleotidu 5-Cl-pentinyl)-2 -deoxyuridinu místo thyamidinu ve skupině náhodných oligonukleotidů. Vynález zahrnuje molekuly sestávající z traktů jednořetězcové nukleové kyseliny proložených trakty dvouretězcové struktury a ostatní syntetizované ehimerní molekuly, aby obsahovaly různé chemické substruktury, avšak spojené s využitím konvenčních pravidel párování bází. Takové struktury mohou také kombinovat molekuly DNA a RNA.

Molekulové struktury vyššího řádu podle vynálezu sestávají z jednotlivých nebo z několikanásobných molekul nukleových kyselin podle jakéhokoli schématu v oboru a mohou zahrnovat druhy syntetických nukleových kyselin nebo fragmenty z daleko větších molekul, jako jsou rekombinantní plasmidy. Struktury mohou být stavěny samočinným vinutím (samosestavováním) nebo usnadněným vinutím jednotlivých lineárních molekul DNA. Usnadněné vinutí může být zprostředkováno proteinovými jednotkami (enzymy jako je ligáza, topoisomeráza, endonukleáza, polyraeráza) nebo cestou interakce s neproteinovými fyziochemickými podmínkami (hodnota pH, teplota, iontové podmínky). Alternativně nebo v kombinaci s uvedeným, se mohou molekuly spojovat interakcí s molekulami vázanými na pevné matrice, nebo pokud je DNA podrobena vinutí do struktury vyššího řádu spletena nebo zakotvena v prostoru, během všech sdružovacích procesů nebo jako jejich část.

Druhým význakem vynálezu je poskytnutí knihoven molekul nukleových kyselin vytvořených tak, že obsahují polonahodilé molekuly, z nichž některé mohou mít žádoucí topologii schopnou interakce specifickým způsobem s cílovou molekulou. Jde podle vynálezu o knihovny molekul nukleových kyselin vykazujících • · ·»· * • · · • ftftft • * • · • ftftft ftftft β

ft • ft ft • · ♦ • · · ♦

999··

9 9 vedoucí rámec k usnadnění sestavy známé strukturní podjednoť ky. V každé subjednotce uvnitř náhodného traktu sekvence je začleněna maximalizující rozmanitost knihovny a potenciální funkční užitečnost s ohledem na aktivitu v selektivní vazební zkoušce- Ve druhém význaku vynálezu je zahrnuto provedení, při kterém je knihovna vytvořena ze směsí n-jednot1ivých populací (soubor) syntetických molekul DNA Csubjednotek). Z tohoto hlediska je rozměr populace subjednotek syntetických nukleových kyselin velký a je diktován stupněm nahodilosti uvnitř proměnného segmentu podjednotky. Dále je rozmanitost subjednotek začleněných do jiných provedení variací umístění variabilní domény variací v počtu variabilních domén Cinterspersí s trakty pevné sekvence) a variací v délce každé dané varabilní domény. Je výhodné, že n-jednotíivá subjednotková populace je smíšena do jednoho cyklu teplotní hybridižací k vytvoření knihovny řady struktur nukleových kyselin a individuální sekvenční rozmanitosti. Je zřejmé, že jiná provedení mohou zahrnovat mnohonásobné cykly teplotní hybridizace a mnohočetné hodnoty celých čísel n. Zvláštním význakem knihovny podle tohoto schématu je schopnost modulovat stupeň komplexity interpodjednotkové interakce rozumnou konstrukcí a umístěním komplementárního nebo vůdčího sekvenčního traktu.

Třetím význakem vynálezu je nová užitkovost struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu, zejména pro farmaceutické a diagnostické použití. Z tohoto hlediska jsou tyto struktury schopny vazby na specifickou cílovou molekulu jak proteinu tak proteinové cílové nolekuly. Zahrnuje-li výhodné provedení jediný proteinový cíl, počítá se s dalšími provedeními, přičemž cílem je komplex proteinů sestávající z řady proteinových podjednotek, jako je buněčný povrchový receptor, kolektivně vázaný molekulou prvního význaku vynálezu. Jiné provedení třetího význaku zahrnuje vazbu na buněčný cíl nebo na buněčné druhy identifikované schopností vázat molekulu prvního význaku. K dalším provedením patří vazba na cíl nebo cí11 • 4 4444 • 4 · • 4 44 4 ♦ · • · ♦ 444 444 ·

··

4 4 4 · 4*·*

4 4

<· · • 4 · *

4 4

4 44 4 4 lovy komplex obsahující neproteinové složky například uhlohydráty nebo lipidové sloučeniny buňky a zejména buněčného povrchu. Protein, uhlovodík a lipidové jednotky a nebo jejich komplexy mohou být jednotkami specifickými pro chorobu nebo mohou být přítomny jako normální složky tkáně nebo buňky. Cíl nebo cílový komplex by obsahoval virové částice nebo složky od viru odvozené, jako jsou capsidové proteiny nebo od hostitele odvozené složky virového povlaku. Cíl nebo cílové komplexy mohou ve svém složení obsahovat kovové ionty nebo jiné organické chemikálie nebo chemické skupiny a mohou se vyskytovat přírodně nebo mohou být zavedeny zpracováním s exogenními činidly. Cílové receptory mohou zahrnovat například IL-2 receptor nebo jiné cytokinové receptory, jako jsou receptory například pro IL-3, M-CSF, GM-CSF. Rovněž povrchové molekuly, jako receptor IgE, přičemž blokáda IgE vázaná spolu s blokádou zesítovací aktivace u receptorů by byl vysoce žádoucí výsledek. Jiné povrchové molekuly včetně seríe členů shlukové diferenciace (CD antigeny) jsou žádoucími cíli pro modulaci chorob a zejména pokud jde o nemoci autoimunitní složky.

Vynález je orientován tak, aby měl obzvláště rozšířenou použitelnost v oblasti terapeutických molekul. Molekulové struktury podle vynálezu mají agonizovat nebo antagonizovat zvláštní receptory nebo enzymatické procesy pro léčebné přednosti, aniž přispějí k žádné z nevýhod konvenční proteinové léčby jako je imunogenicita. Vynález proto zasahuje do způsobů léčení nemocí nebo chorobných stavů a jejich prevenci a spočívá v podávání jedincům účinného množství molekulové struktury. Vynález také zasahuje do používání takových struktur diagnóz in vivo a in vitro.

Čtvrtý význak vynálezu se týká struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu s modifikovanými nukleotidy začleněnými do těchto struktur. Odděleně od odlišnosti dané shora uvedeným druhým význakem nebo přídavně, je obzvlášť žádoucí uplatnit

• φ ··»· • · ·· • · ·<··

·· ···· ·«>· odlišnost derivatizaci subjednotek knihovny a nebo začleněním modifikovaných bází během jejich syntesy Cthiolované báze, biotinylované báze a epsilon-amino derivatizované báze). Získá se tedy vysoce odlišná knihovna s odlišností v obou úrovních, jak složení sekvence, tak její délky. Takové parametry mohou být fixovány v definovaných mezích pro různé knihovny a různé cílové aplikace. Struktury nukleových kyselin vysokého řádu budou také obsahovat modifikované nukleotidy schopné propůjčovat struktuře obzvlášť žádoucí vlastnosti spolu s význaky zajišťujícími stabilitu nebo vazební modulace jako shora uvedeno. Takové přídavné žádoucí modifikace mohou být začleněny v prvním nebo ve druhém význaku vynálezu a zahrnují použití hydrofóbních traktů, zavedení psoralenových nebo akridinových skupin, vazební haptenické skupiny, jako je biotin nebo vazbu na různé přidané vedlejší řetězce, jako jsou arainoskupiny nebo karboxylové skupiny, k zajištění snazší vazby na příslušnou cílovou molekulu. V dalším výhodném provedení mohou takové skupiny působit jako místa pro připojení jiných molekul jako dalších molekul nukleových kyselin nebo proteinů, jako je protilátka nebo enzym.

Požadovanou charakteristikou molekul podle vynálezu je vysoká stabilita in vitro a in vivo. Chemické složení struktur nukleových kyselin je vysoce ovlivnitelné a také fyzická velikost molekuly vyžaduje řízení k minimalizaci nebezpečí smyku v roztoku a k maximalizaci funkční užitečnosti in vivo. Z toho důvodu je podle vynálezu dávána přednost multiřetězcovým strukturám nukleové kyseliny konstruovaným z obecně malých <<80 mer) subjednotek. Alternativně může být žádoucí využití struktury složené z velkých subjednotek 080 mer), což rovněž spadá do rozsahu vynálezu.

Pátý význak vynálezu se týká struktur na bázi nukleových kyselin vysokého řádu spojených s jinými molekulovými jednotkami- Obzvlášť tento význak zahrnuje nukleové kyseliny připo-

·« 44·· • · *

4··

jene k jednomu místu nebo k několika specifickým místům k jednomu nebo k několika specifickým místům jiné molekulové jednotky, přičemž specifické připojení k nukleové kyselině je usnadněno modifikovanými nukleotidy jako u čtvrtého význaku vynálezu. Tento význak obzvláště znamená struktury na bázi nukleové kyseliny vysokého řádu připojené k farmaceuticky nebo diagnosticky významným molekulovým jednotkám, přičemž nukleová kyselina se váže na specifické molekulové cíle související s nemocí a připojené molekulové jednotky se pak použije k léčení nemoci nebo k jejímu zjištění.

Mezi farmaceuticky významné jednotky se počítají cytokiny, Fc část protilátek, jiné z protilátek odvozené jednotky, toxiny, enzymy, drogy a prodrogy, agonisty a antagonisty receptorů, samotné molekuly receptorů (obzvláště domény vázající ligandy), radioisotopy, farmaceuticky aktivní nukleové kyseliny, transportní nusiče drog jako jsou liposomy, živé nebo zesílené mikroorganismy, světlem aktivované podíly, a jiné molekulové jednotky, které vyvolávají vakcinační účinek. Diagnosticky významné jednotky obsahují radioisotopy, světlem aktivované podíly, například vytvářející chemiluminiscenční signál, fluorochromy, enzymy a signální transportní nosiče, jako jsou perly.

V souhrnu jsou přemetem vynálezu:

- Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny sestávající z mnoha propojených řetězců molekul nukleové kyseliny nebo z jejich segmentů specifickou párovací interakcí bází dvou nebo několika molekul, přičemž struktura není kovalentně uzavřená.

- Odpovídající struktura polynukleové kyseliny tvořená dvěma nebo několika řetězci molekuly nukleové kyseliny.

- Odpovídající struktura polynukleové kyseliny tvořená třemi nebo několika řetězci molekuly nukleové kyseliny.

- Odpovídající struktura polynukleové kyseliny krychlové nebo >· • ·· • · • · • * ·« ··* • » ♦ • · ·<

···· ··· «

t ♦ ♦ *

···♦ v podstatě krychlové formy.

Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž krychlová struktura sestává ze šesti molekulových řetězců nukleové kyseliny, přičemž každý molekulový řetězec působí jako samostatná hrana šestiboké krychle.

Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž každá nukleová sekvence obsahuje dvě nebo několik domén, které mohou hybridizovat k jiným molekulám souboru.

Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž každá nukleová sekvence obsahuje čtyři domény.

Odpovídající struktura polynukleové kyseliny zahrnující molekuly nukleové kyseliny, které sestávají z traktů jednořetězcové nukleové kyseliny, proložené trakty dvouřetězcové struktury.

Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, podle nároku 1 až 8, přičemž každý řetězec nukleové kyseliny má méně než 80, s výhodou méně než 50 nukleotidů.

Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž struktura má sestavu (Aí + BI +· Cl) + CA2 + B2 + C2), jak je vyznačeno na obr- 1.

Shora definovaná struktura polynukleové kyseliny, přičemž tato struktura obsahuje podjednotky sestávající z rozmanitě náhodných sekvenčních traktů k vytvoření jejich polonáhodných molekul nebo segmentů schopných interakce s cílovou mo1eku1ou.

Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny obsahující podjednotky sestávající z řady navzájem spojených řetězců molekul nukleové kyseliny nebo z jejich segmentů specifickou pérovací interakcí bází dvou nebo několika molekul, přičemž každá struktura je kovalentně uzavřená a obsahuje podjednotky, které jsou složeny z rozmanitě nahodilých sekvenčních traktů k získání jejich polonáhodných molekul nebo jejich segmentů v interakci s cílovou molekulou.

Shora definovaná struktura polynukleové kyseliny, přičemž složení a délka sekvence je proměnlivá.

• · 999 to • · · • to to • · · • to· » 9 ·«· ·· • to*

to « to toto toto··

- Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž složení proměnlivé sekvence se dosahuje jednou nebo několika modifikacemi nukleotidů uvnitř sekvence.

- Shora definovaná struktura polynukleové kyseliny, přičemž struktura obsahuje místa nebo skupiny nukleových kyselin, které se mohou vázat nebo připojovat k jiné molekule nebo k pevné matrici.

- Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž uvedenou druhou molekulou je protein, enzym, lipoprotein, glykosylováný protein, immunoglobulin nebo jeho fragment.

- Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž uvedenou druhou molekulou je nukleová kyselina.

- Odpovídající struktura polynukleové kyseliny, přičemž druhá molekula je farmaceuticky aktivní.

- Farmaceutický prostředek zahrnující shora uvedenou strukturu polynukleové kyseliny případně s vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly a/nebo s jinými farmaceuticky účinnými sloučeninami - Použití odpovídající struktury polynukleové kyseliny jako diagnostického činidla.

- Použití shora definované struktury polynukleové kyseliny k pořízení knihovny pro ovlivfíování rozmanitosti specieficky nahodilých topologií k získání různých funkčností a/nebo činností.

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1

Popis postupného sestavování krychlové struktury nukleové kyseliny ze šesti jednotlivých jednořetězcových molekul označených fli, ňz , Bi, E>2 , Ci a C2 . Sestavování postupuje cestou běžného párování antiparalelních bází mezi molekulami nukleových kyselin. Jsou znázorněny dimerické meziprodukty vytvořené mezi molekulami Bi a Ci a také B2 a C2- Znázorněny jsou trimerické struktury vytvořené mezi molekulami Ai, Bi a Ci také Az,

Β2 a C2- Sestavení krychlové struktury je dosaženo spojením dvou trimerických podílů označených jako molekula (Al + B1 + Cl) + CA2 + B2 + C2).

♦♦ »««* • · *

0 00 • · • * 0000 00» · · » 0 0 0 • ₉ « 000 0 » 0 *

• · < 0 • 0 ·

•

000«

Obr. 2

Sekvence subjednotek o1igonukleotidfl IL2R-1 a IL2R-2 obsahující strukturu DNA s vazebnou aktivitou na receptor IL-2.

Obr. 3

Sekvence subjednotek oligonukleotidfl TBR-1 a TBR-2 obsahující strukturu DNA s vazebnou aktivitou na lidský trombin.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsob inhibice buněčné linie závislé na IL-2 pomocí struktury DNA vybrané z knihovny DNA.

Připraví se knihovny syntetických molekul DNA, z nichž každá obsahuje oblast náhodné sekvence.

Knihovna A sestává z molekul o struktuře:

AGTCCCAAGCTGGCT( N ) 13 CTCCATCGTGAAGTCAGCCAGCTTTGGACT

Knihovna B sestává z molekul o struktuře:

'GACTTCACGATGGAGGTCAGAATGTGAATA( N ) 1 oTATTCACATTCTGAC

Tyto sekvence byly zkonstruovány k usnadnění crosshybridizace a představují subjednotky knihovny struktur vytvořené smísením a crosshybridizací různých podjednotek podle schéma vyná1ezu.

·· ···· • « • · toto • · • · >·«· 944

1?

»· *

• · • · · • 4499 • · *«· *« • · to ·

9 · • ♦ · • 44 ·999

Knihovny oligonukleotidů (podjednotek) se syntetizují za účelem maximální stability s fosforot-h i oátovým i vazbami, aby maximalizovaly stabilitu v přítomnosti sérových faktorů a čistí se chromatografií HPLC. Vyčištěné oligonukleotidy se získají od GenoSys Biotechnologies (Cambridge, UK). Knihovna DNA se sestaví použitím jednocyklové crosshybridizace. Knihovny podjednotek A a B se denafcurují, smísí se a hybridizují se při teplotě 3? C v roztoku 50 mM Tris o hodnotě pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA. Subjednotkové knihovny A a B se mísí v ekvimolární koncentraci (1£3M). Při jiných pokusech se mísí s použitím rozdílných molárních poměrů. Sestavení subjednotek se ověřuje gelovou elektroforézou.

Knihovna struktur DNA se skrínuje na struktury schopné vázat zvláštní buněčnou doménu receptoru IL-2 (IL2R). Provede se to pomocí rozpustného rekombinantu IL2R připraveného podle uvedených metod (Meidel M.C. a kol., Biochem Biophys. Res. Commun. 154, str. 372 až 379, 1988; Meidel M.C. a kol., J. Biol. Chem, 264, str. 21097 až 21105, 1989). Rekombinantní

IL2R se kovalentně váže na povrchově aktivované magnetické perly podle protokolů doporučených výrobcem (Bangs Labs. Fishers, IN, USA). Perel IL2R se použije jako afinitního povrchu k selekci vazebních struktur z knihovny struktur DNA. Perly IL2R se nechají reagovat s knihovnou za řady experimentálních podmínek včetně přítomnosti chaotropních solí v řízených reakcích. Koncentrace knihovny (DNA) je přibližně 100 nmol v hybridizačním roztoku jako shora uvedeno- Vazební molekuly se získají polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) přímo z perel po rozsáhlém pracím cyklu roztokem 75 mM Tris HCI, 200 mM NaCl, 0,5 N-oktylglukosid, hodnota pH 8,0. PCR se vede pomocí příměru PRA1 (5 -AGTCCCAAGCTGGCT) k získání složky knihovny A za pomoci standardních reakčních systémů a podmínek. Ve zvláštních reakcích se použije primerů PRB1 (5'GACTTCACGATGGAG) a PRB2 (5 GTCAGAATGTGAATA) k získání složek knihovny B. Produkty PCR se klonují a sekvencují pomocí standardních rekačních syst· ···· e · · • ··· «••to ··· to to to • to * • · to • · · · ·· · ·<·· • · · • to <

toto toto • » to < · ··· to toto·· témů a postupů.

Získá se řada sekvencí a identifikuje se jako pocházející z podjednotkové knihovny A a z podjednotkové knihovny B. Z nich se syntetizuje pár pomocí fosforothioátové chemie jako shora uvedeno. 01igonukleotidy IL2-R1 a IL2-R2 (sekvence na obr. 2) se čistí a spojí jako shora uvedeno a použije se jich jako buněčné zkoušky pro antagonismus IL-2.

TALL-104 (ATCC#CRL-11386) je buněčná linie lidské T-buněčné leukemie. Buňky rostou v suspenzní kultuře a potřebují IL-2 k optimálnímu růstu. Buňky se mohou nechat růst krátkou dobu bez IL-2, jejich růst je však významně snížen. Buňky se nechají růst v Iscoves modifikovaném mediu Dulbeccosa (Life Technologies, Paisley, UK) s 50 až 100 u/ml rekombinantni lidské IL-2 CLife Technologies, Paisley, UK) a doplní se 10% (objemově) tepelně inaktivovaným telecím zárodečným sérem. Buňky se pěstují v prostředí s 8 až 10 % oxidu uhličitého. Zredění hybridizované IL2-R1/IL2-R2 DNA preparace a kontrola vzorku DNA obsahujícího nahodilou sekvenci identické konturní délky se připraví v kultivačním prostředí obsahujícím IL-2. Připraví se paralení serie zředění s použitím prostředí prostého IL-2. Roztoky jsou od 50QM DNA do 390 nM DNA. Zkoušky se provedou se subspojenými buňkami TALL-104 nanesenými předchozího dne na 96-důlkové mikrotitrační destičky. Buňky se shromáždí odstředěním, promyjí se předehřátou (37 C) solankou pufrovanou fosfátovým pufrem a DNA obsahujícím mediem přidaným po 48 hodinách. Pokusy se provádějí čtyřnásobně. Proliferace se posuzuje na konci 48-hodinové prodlevy kolorimetrickou zkouškou za použití obchodně dostupné tetrazoliové sloučeniny a podle instrukcí dodavatele (Promega, Southampton, UK). Mikrotitrační destičky se čtou při 540 nm.

Výsledky ukazují, že hybridizované prostředky DNA inhibují růst buněčné linie TALL-104 za podmínek, kdy byly syntetic• · ké oligonukleotidy IL2-R1 a IL2-R2 neaktivní.

Příklad 2

Způsob selekce struktury DNA vázající se na lidský trombin

Knihovny popsané v příkladu 1 se použije k selekci struktury DNA schopné vazby na lidský trombin. Knihovna se skrínuje za použití liského trombinového prostředku (Sigma, Poole, UK) vázaného na povrch aktivovaných magnetických perel jako v příkladu 1. Trombinové perly se nechají reagovat s knihovnou struktur DNA jako v příkladu 1 s tou výjimkou, že povazební promytí se provede roztokem 20 mM Tris acetátu, hodnota pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM KC1, 1 mM MgClž. Vázané molekuly se získají přímo z perel pomocí PCR použitím reakcí a příměrových souborů jako v příkladu 1. Produkty PCR se klonují a sekvencují standardními reakčními systémy a postupy.

Získá se řada sekvencí a identifikuje se jako pocházející ze podjednotkové knihovny A a z podjednotkové knihovny B.

Z nich se syntetizuje pár pomocí fosforothioátové chemie jako shora uvedeno. 01igonukleotidy TB-R1 a TB-R2 (sekvence na obr. 3) se čistí a spojí. Komplexu TB-R1/TB-R2 se použije při zkoušce inhibice trombinu. Srážíivost se měří fibrometrem při o

teplotě 37 C u plasmy čerstvě připravené od zdravého dárce. Rozsah inhibice trombinu se stanoví pomocí standardní křivky vynesené srážíivosti v závislosti na koncentraci trombinu. Srážíivost se měří přes tři log struktury DNA ve zkoušce.

Výsledek ukazuje inhibici srážíivosti v přítomnosti TB-R1/TB-R2 DNA komplexu.

Příklad 3

Způsob selekce struktur DNA vázajících se na rekombinantní ·· ·· • « · · • · · • · · • · · ·· ···· • · • · ·

rozpustné CD4

Knihovny popsané v příkladu 1 se použije k selekci struktury DNA schopné vazby na rekombinantní rozpustné prostředky CD4 CrsCD4). Struktura DNA se skrínuje pomocí prostředku CD4 CBioDesign, Saco, ME, USA) imobi1izovaného na aktivovaných magnetických perlách jako shora uvedeno. Skrínování knihovny, promytí a selekce pomocí PCR se provádí podle příkladu 2. Syntetizují a spojují se jednotlivé oligonukleotidové páry pocházející ze subjednotkových knihoven A a B. Struktury se popužije k inhibici vazby anti CD4 monoklonální RPAT4 CSerotech, Abingst-on, UK) v enzymu vázaného imunoabsorbantovou zkoušku CELISA).

Destičky ELISA s 96 důlky se pokryjí přes noc 0,2 mg/ml roztoku rsCD4 v povlékacím pufru CO,OSM karbonát-bikarbonátový pufr, hodnota pH 9,0) při teplotě 4 °C. Destičky se promyjí intenzivně pomocí TBS-T Ctris-pufrovaná solanka o hodnotě pH 8,0, objemově 0,05 % Tveenu 20) a testované a kontrolní struktury DNA se zředí Cl:2) na destičce v TBS z výchozí koncentrace 100 DM. Destičky se inkubují 40 minut při teplotě 3?

o

C a promyjí se TBS. Přidá se k destičce 100 ng/ml přípravku protilátky RPAT4 v PBS a inkubuje se 40 minut při teplotě 37 o

C. Destičky se promyjí a navázaný RPAT4 se zjistí pomocí alkalického fosfatázou značeného ovčího, protimyšího prostředku CSigma, Poole, UK) a Sigma Fast OPD CSigma, Poole, UK) jako barevného substrátu. V některých zkouškách se DNA společně inkubuje s monoklonálním RPAT4. Barevná intenzita se odečítá deskovým čtecím zařízením a signál se porovnává mezi testovanými a kontrolními důlky. Výsledky ukazují významnou inhibici vazby RPAT4 na reCDE4 v přítomnosti struktury DNA.

Průmyslová využitelnost

Struktury na bázi nukleových kyselin vysokého řádu pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčení a diagnostiku nemocí.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1- Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny sestávající z mnoha propojených řetězců molekul nukleové kyseliny nebo jejich segmentů specifickou párovací interakcí bází dvou nebo několika molekul, přičemž struktury nejsou kovalentně uzavřené.
2. 2. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 tvořená dvěma nebo několika řetězci molekuly nukleové kysel iny.
3. 3. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 2 tvořená třemi nebo několika řetězci molekuly nukleové kysel iny.
4. 4. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 3 tvaru krychle nebo v podstatě tvaru krychle.
5. 5. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 3 tvořená šesti molekulovými řetězci, přičemž každý molekulový řetězec působí jako samostatná hrana šestiboké krychle.
6. 6. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 5, přičemž každou nukleovou sekvenci tvoří dvě nebo několik domén, které mohou hybridizovat k jiným molekulám souboru .
7. 7. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 6, přičemž každá nukleová sekvence sestává ze čtyř domén.
8. 8. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 7 zahrnující molekuly nukleové kyseliny, které sestávají z traktů jednořetězcové nukleové kyseliny, proložených trakty dvojřetězcové struktury.

   • · φ

   φφφφ • · · • ·
9. 9. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 8, přičemž každý řetězec nukleové kyseliny má méně než 80 nukleotiů.
10. 10. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 9, přičemž každý řetězec nukleové kyseliny má méně než 50 nukleotiů.
11. 11. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 10 mající sestavu CA1 + B1 + Cl) + CA2 + B2 + C2), jak je vyznačeno na obr. 1,
12. 12. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 11 obsahující podjednotky sestávající z rozmanitě náhodných sekvenčních traktů k vytvoření jejich semináhodných molekul nebo segmentů schopných interakce s cílovou molekulou,
13. 13. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny obsahující podjednotky sestávající z řady navzájem spojených řetězců molekul nukleové kyseliny nebo jejich segmentů specifickou pérovací interakcí bází dvou nebo několika molekul, přičemž je každá struktura kovalentně uzavřená a obsahuje podjednotky, které jsou složeny z rozmanitě nahodilých sekvenčních traktů k získání jejich semináhodných segmenů v interakci s cílovou molekulou,
14. 14. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 13 proměnlivého složení a délka sekvence.
15. 15. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 14, přičemž složení proměnlivé sekvence se dosahuje jednou nebo několika modifikacemi nukleotidů uvnitř sekvence.
16. 16. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 15 obsahující místa nebo skupiny nukleových kyselin, • 9 • 9 ♦

    99 9999 » 9 ··«

    9 9 9 9 9· které se mohou vázat nebo připojovat k jiné molekule nebo k pevné matrici,
17. 17. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 16, přičemž uvedenou druhou molekulou je protein, enzym, lipoprotein, glykosylovaný protein, immunoglobulίn nebo jeho fragment.
18. 18. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 16, přičemž druhou molekulou je nukleová kyselina.
19. 19. Trojrozměrná struktura polynukleové kyseliny podle nároku 16 až 18, která je farmaceuticky účinná.
20. 20. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje trojrozměrnou strukturu polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 19 případně s vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly a/nebo s jinými farmaeeuticky účinnými sloučeninami.
21. 21. Použití trojrozměrné struktury polynukleové kyseliny podle nároku 1 až 18 jako diagnostického činidla.
22. 22. Použití trojrozměrné struktury polynukleové kyseliny podle nároku 12 nebo 13 k pořízení knihovny pro ovlivňování rozmanitosti specieficky nahodilých topologií k získání různých funkčností a/nebo činností.