MXPA02004727A - Estructuras basadas en acidos nucleicos de orden superior. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a estructuras moleculares basadas en acidos nucleicos que unen a otras entidades moleculares, especialmente entidades aparte de los acidos nucleicos mismos. En particular, la invencion se refiere a estructuras moleculares basadas en acidos nucleicos con actividad farmaceutica a traves de la union a blancos moleculares especificos y de esta manera influenciando los estados de enfermedades. La invencion tambien se refiere a estructuras moleculares basadas en acidos nucleicos con utilidad de diagnostico.

Description

ESTRUCTURAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLEICOS DE ORDEN SUPERIOR Descripción de la Invención La presente invención se refiere a estructuras moleculares basadas en ácidos nucleicos que se unen a otras entidades moleculares, especialmente entidades aparte de los ácidos nucleicos mismos. En particular, la invención se refiere a estructuras moleculares basadas en ácidos nucleicos con actividad farmacéutica a través de la unión a blancos moleculares específicos y de esta manera influyendo los estados de enfermedades. La invención también se refiere a estructuras moleculares basadas en ácidos nucleicos con utilidad de diagnóstico . Existe un gran deseo de proporcionar composiciones de interés que sean capaces de alterar específicamente la actividad de proteínas particulares o modular la expresión de productos de genes particulares. En particular, existe un deseo de moléculas capaces de formar interacciones de unión específicas con otras moléculas y especialmente para que tales moléculas exhiban unión específica dentro del medio in vivo.

Contra estos deseos, se han desarrollado metodologías para permitir la creación de bibliotecas de clases de moléculas de las que se seleccionan tales composiciones de interés. Un ejemplo pertinente es la especificidad perfecta de unión encontrada en la molécula de anticuerpo y existen ahora varias REF. : 137192 tecnologías significativas para el desarrollo de anticuerpos monoclonales y derivados recombinantes de los mismos. Estos han proporcionado un número de fármacos terapéuticos y muchas herramientas de diagnóstico e investigación. Todos estos productos son moléculas de proteínas y como tales sólo pueden producirse usando sistemas biológicos . Se han producido moléculas de unión completamente sintéticas alternativas. Estas son moléculas seleccionadas de una diversa biblioteca de moléculas similares o variantes de la misma clase química, y en general, seleccionadas usando un sistema de cribado que proporciona un sustituto del blanco terapéutico deseado o algún aspecto de su actividad. El cribado de vastas bibliotecas químicas de moléculas pequeñas ha sido una ruta clásica para el desarrollo de farmacéuticos de moléculas pequeñas convencionales, pero las bibliotecas de péptidos sintéticos y moléculas de ácidos nucleicos sintéticos ahora también se criban para terapéuticos potencialmente útiles. Para las bibliotecas de ácidos nucleicos, el método técnico ha sido en general el uso de moléculas de ARN o ADN de hebra simple de longitud de unidad definida. La base de unión a una molécula blanco no se pre-configura y podría ser dependiente de la formación de estructura secundaria dentro de la molécula de ADN (o ARN) misma, facilitando la unión a la otra entidad molecular (Bock L.C. et al 1992 Na ture 355 : 564- 566; Kubrik, M.F. et al 1994 Nucleic Acids Res . 22: 2619-2626) La creación de moléculas de ácidos nucleicos que contienen sitios pre-configurados de estructura secundaria (o de orden superior) para utilidad terapéutica y diagnóstico no se ha tratado previamente, y es el objetivo de la presente invención. La presente invención se refiere a nuevas estructuras de ácidos nucleicos de orden superior y a nuevos usos de tales estructuras . Varios tipos de estructuras de ácidos nucleicos de orden superior se conocen en el arte anterior. Un tipo de tales ácidos se llama aptámeros y difieren de las moléculas de la presente invención con respecto a su tamaño, manufactura y complejidad topológica. Los métodos que involucran ya sea evolución o selección in vi tro de vastas fuentes de bibliotecas aleatorias se han aplicado al desarrollo de ambos aptámeros de ARN y ADN. Las moléculas de ARN capaces de facilitar el proceso enzimático tal como actividad de polinucleótido cinasa se han desarrollado por ciclos iterativos de selección (Lorsch J.R. & Szostak J. . 1994 Nature 371: 31-36) , y las moléculas de ADN de hebra simple cortas se han seleccionado para ser capaces de la inhibición altamente específica de fosfolipasa A2 de humano (Bennett C.F. et al 1994 Nucleic Acids Res . 22: 3202-3209) .

Otras se han desarrollado independientemente ya sea aptámeros basados en ARN o ADN capaces de unir e inhibir algunas de las funciones de la trombina humana (Bock L.C. et al 1992 Na ture 355: 564-566; Kubrik, M.F. et al 1994 Nucl ei c Acids Res . 22; 2619-2626) Otros tipos de estructuras de ácidos nucleicos de orden superior incluyen "ADN ramificado' (Horn, T. & Urdea, M.S. 1989, Nucleic-Acids-Res. 17: 6959-6967) por lo que una o más regiones de una molécula de ADN ("sonda") que híbrida a una molécula de ácido nucleico complementaria pueden someterse estas mismas a hibridación a otras moléculas de ADN para amplificar la cantidad de ADN asociado con la sonda de ADN. Sin embargo, los complejos descritos por Horn y Urdea ( ibid) se extienden linealmente, por lo que las moléculas de ácidos nucleicos hibridadas nuevamente no se diseñan para hibridar a moléculas hibridadas previamente sino a otras moléculas nuevas que entran para formar estructuras de ADN ramificadas. En efecto, tales complejos se diseñan simplemente para formar tantas ramificaciones como sea posible para proporcionar- más puntos para la hibridación de una sonda de ácido nucleico de señalización. Otras estructuras geométricas proporcionadas por las propiedades de apareamiento de bases de ácidos nucleicos se han aprovechado en los campos de la ciencia de materiales y nanotecnología (Aliviatos, A.P. et al 1996, Nature 382:609-611; Mao C. et al 2000, Nature 407: 493-496; Yurke, B. et al 2000, Nature 406 : 605-608) . Se han descrito métodos técnicos refinados para la manufactura y análisis de estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior, incluyendo radicales cuadrilaterales, cubos, octaedros y triangulares se multiplican conectados en una red (Chen J. Et al 1989, ". A . Chem . Soc . 111; 6402-6407; Zhang et al. 1994, J. Am. Chem. Soc. 116: 1661- 1669; Pat. US. No. 5,278,051; Pat . US. No. 5,468,851; Pat . US. No. 5,386,020 & Pat. US. No. 6,072,044). Los objetos geométricos son estructuras cerradas fabricadas usando procesos iterativos que involucran enzimas de restricción y ligación de ADN. Los puntos nodales en las figuras podrían fijarse por unión de cruce entre sitios para dar una forma rígida, o más ramificaciones flexibles alcanzadas por los sitios dispares de hibridación cruzada. El arte anterior no incluye estructuras geométricas que no sean cerradas (i.e. extremos ligados) . El arte anterior no incluye estructuras geométricas que incluyan regiones de ácidos nucleicos modificados y no incluye estructuras de ácidos nucleicos geométricas conjugadas a otras entidades moleculares. El arte anterior no incluye el uso de bibliotecas de estructuras de ácidos nucleicos aleatorias o semi-aleatorias -. En relación con nuevos usos de estructuras de ácidos nucleicos de orden superior, se reconoce que el aprovechamiento de ácidos nucleicos de "orden inferior' como moléculas terapéuticas y de diagnóstico per se se conoce en el arte. En particular existen muchos ejemplos de moléculas de ácidos nucleicos con actividad terapéutica potencial y/o real . Estas operan ya sea como moléculas antisentido, reactivos triples o como moléculas de ARN con actividad endorribonucleasa ("ribozimas ' ) . En todos estos casos, la modalidad del ácido nucleico terapéutico es un modulador de la expresión de proteínas por un mecanismo de acción que reduce o bloquea la traducción de proteínas. La especificidad de la unión del blanco en todos estos casos es de ácido nucleico a ácido nucleico. Estas características (modulación de traducción, unión de ácido nucleico a ácido nucleico) están en contraste con la modalidad de la presente invención. Una característica distintiva e inventiva de la presente invención es el uso de una estructura de ácido nucleico de orden superior con actividad de unión hacia una molécula blanco. Otras estructuras de ácidos nucleicos de "orden inferior', especialmente Aptámeros, se han probado como moléculas terapéuticas y de diagnóstico. Ciertas otras moléculas de ácidos nucleicos, especialmente ribozimas, se han identificado como teniendo actividades enzimáticas con importancia farmacéutica potencial. Para las estructuras geométricas cerradas, no se ha considerado utilidad farmacéutica, aunque la Pat. US. No. 5,278,051 especula la posible utilidad como agentes de solubilización o vehículos de liberación controlada para terapéuticos de moléculas pequeñas . Un primer aspecto de la presente invención se refiere a nuevas estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior, particularmente estructuras geométricas abiertas. Además, la invención también se refiere a la utilidad de tales estructuras como agentes farmacéuticos y/o de diagnóstico. La invención también se refiere a estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior que incluyen nucleótidos con modificaciones. La invención también se refiere a estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior que incluyen regiones de nucleótidos aleatorias o semi -aleatorias . La invención también se refiere a estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior conjugadas a otras entidades moleculares, tal como proteínas. Las estructuras de la presente invención aprovechan las reglas de apareamiento de la base de Watson-Crick en las regiones diseñadas de estructura de doble hebra. Las moléculas de ácidos nucleicos de hebra simple tienen la capacidad de fijar por calor (hibridar) a otras moléculas de hebra simple en virtud de la complementariedad entre las bases. Mientras que tal hibridación de la base de dos moléculas de hebra simple conduce usualmente a una molécula de doble hebra lineal, pueden producirse otras estructuras, por ejemplo espiras de horquilla en donde una molécula tiene complementariedad y círculos de pares de bases internos, donde ambos extremos de cada molécula de hebra simple tienen complementariedad mutua. Con el diseño estratégico de secuencias de ácidos nucleicos de hebra simple, pueden diseñarse moléculas individuales que pueden hibridar simultáneamente a dos o más de otras moléculas y si, en cambio, estas otras moléculas también pueden hibridar a moléculas adicionales incluyendo moléculas ya involucradas en la hibridación, entonces pueden formarse complejos de ácidos nucleicos . Son bien entendidas las dimensiones y topología globales de la molécula de ADN de doble hebra. El ADN de doble hebra es muy flexible y la hélice es capaz de adoptar un número de conformaciones que difieren en el ángulo de rotación entre los pares de bases adyacentes a lo largo de la hélice. Las moléculas de ácidos nucleicos de hebra simple que se presentan naturalmente tal como ARN, adoptan conformaciones preferidas en solución. La conformación se dicta por las interacciones de apareamiento de bases dentro de la misma molécula conduciendo a la producción de una estructura estabilizada compuesta de tallos de doble hebra y espiras de hebra simple. Las moléculas adoptarán la conformación de energía más baja y esta estructura para una secuencia conocida de ARN es capaz de la predicción por métodos computacionales (Jaeger J.A. et al 1989 Proc. Nati. Acad. Sci USA J36: 7706-7710) . Se han hecho intentos para producir elementos de programación predictivos para plegar ADN y han mostrado algo de éxito (Nielsen D.A. et al 1995 Nucleic Acids Res. 23.: 2287-2291). La comparación dimensional entre las moléculas de ácido nucleico y proteínas ilustra la diferencia muy significativa en el arreglo estructural entre estas dos clases de molécula, pero también soportan el concepto que representa la presente invención. Una proteína globular típica tal como mioglobina con peso molecular de 17 kDa tiene un tamaño en su dimensión más larga de 3 nm. Una proteína globular superior, tal como una albúmina de suero de bovino con peso molecular de 68 kDa es 5 nm en su dimensión más larga (Cohén C, en Wolstenhol e G.E.W. & O'Connor M. (eds), Ciba Foundation Symposium, London, J & A Churchill, 1966). El diámetro de la hélice de doble hebra es de 2 nm y las hebras de ADN de un número pequeño de pares de bases tal como 100, lograría una longitud de contorno que se aproxima a 30 nm. Así, aunque la densidad del ADN o cualquier otra molécula de ácido nucleico es mucho menor que una proteína típica, la topología de la molécula de ADN, aun en su forma nativa más estructurada como una hélice doble, podría cubrir fácilmente partes grandes de la superficie expuesta de casi cualquier proteína. En particular, si la topología del ADN usualmente de monofilamento fuera alterada, el ADN podría ocupar una gran área de espacio de una manera más similar a una molécula de proteína de densidad mucho mayor. Puede reconocerse que el montaje de estructuras de ácidos nucleicos compuestos de hebras interconectadas múltiples cada una solo de regiones de nucleótidos cortas (<50) pueden resultar fácilmente en estructuras con dimensiones globales en el intervalo de 10-500 nm. Es un objetivo particular de la presente invención proporcionar tal formulación de la molécula de ácido nucleico. Las estructuras de la presente invención se basan en la creación de moléculas de ADN o ARN con estructuras secundarias formadas como resultado de la interacción de dos o más moléculas del ácido nucleico o, alternativamente, como resultado de la interacción de segmentos definidos diferentes dentro de las moléculas individuales del ácido nucleico. En la presente invención, el contenido informacional del ADN o ARN se representa no como una entidad de codificación para la expresión de una proteína terapéutica, ni como una entidad bloqueadora para el metabolismo del ácido nucleico y la expresión del gen (anti-sentido) sino para dirigir el montaje de una estructura molecular de una forma particular en tres dimensiones . La presente invención incluye moléculas de ácidos nucleicos, particularmente moléculas de ADN sintético, que forman estructuras moleculares tridimensionales (no planas) por apareamiento de base específica dentro de las moléculas en el grupo. Específicamente, las moléculas de ADN se diseñan para tener 1 o más regiones de secuencia ("dominios') que pueden hibridar a otras moléculas en el grupo para formar finalmente la estructura del ácido nucleico tridimensional. Bajo este esquema, puede formarse una estructura en forma de cubo aproximada mediante la auto-hibridación de 6 moléculas de ADN sintéticas conteniendo cada una 4 dominios de complementariedad, por lo que cada molécula interactúa con otras 4 moléculas y por lo que cada molécula actúa efectivamente como un lado individual de un cubo de 6 caras. La estructura es abierta (no cerrada covalentemente) , flexible y en modalidades adicionales particulares, sensible a la modificación por la adición de otros grupos funcionales o estructurales .

En una estructura basada en el ácido nucleico de orden superior de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que comprenden cada una 2 o más dominios de secuencia auto-complementaria que permiten que la molécula de ácido nucleico se pliegue en la misma e interactúe una con otra para formar una estructura molecular tridimensional particular por vía de eventos de apareamiento de bases específicos. Para ciertas aplicaciones, se reconoce que la inestabilidad química de moléculas de ADN no modificadas ha sido un problema significativo para los usos tal como terapéuticos. Están disponibles ahora varios métodos para proteger las moléculas de ADN de la degradación por el ataque enzimático. Estos incluyen en general el uso de estructuras de fosfodiéster modificadas (metilfosfonato, fosforotioato, ácidos nucleicos peptídicos) o cubierta 5' y/o termino 3' usando uniones de fosforamedita, fosforotioato o fosforoditioato . Es un objetivo particular de la presente invención aprovechar los ácidos nucleicos modificados o no naturales en las estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior. Además, una características deseada particularmente es la flexibilidad aumentada en la especificidad de unión lograda mediante el uso de química mezclada y estructuras de ácidos nucleicos no naturales alternativas . Las subunidades de ácidos nucleicos de una estructura de ácido nucleico de orden superior de la presente invención podrían ser de naturaleza homotípica o heteróloga, por ejemplo regiones de ADN que contienen ARN. Se conoce que las regiones de ARN dentro de una hélice de ADN alteran el enfriamiento en solución (Wang, A. et al, 1982 Nature, 299: 601-04) . La capacidad de ofrecer diversidad conformacional dentro de un sitio localizado de ácido nucleico podría ser significativa para alterar la especificidad de unión a la proteína blanco, y este fenómeno se conoce en el arte, donde la especificidad de unión de un aptámero de trombina fue dependiente de un sitio corto de la estructura terciaria altamente ordenada (Griffin, L. et al 1993 Gene 137: 25-31) . Adicionalmente, podrían aprovecharse análogos de la estructura de fosfato no naturales para mejorar la estabilidad y también alterar la especificidad de unión a la proteína blanco deseada. Latham et al (Latham, J.A. et al 1994 Nucleic-Acids-Res . 22.: 2817-22) proporcionan un ejemplo en donde el nucleótido modificado, 5- (1-pentinil) -2 ' -desoxiuridina se usó en lugar de timidina en una fuente de oligonucleótidos aleatorios. La presente invención incluye moléculas compuestas de regiones de ácidos nucleicos de hebra simple, mezcladas con regiones de estructura de doble hebra, y otras moléculas quiméricas sintetizadas para contener subestructura química diferente, pero unida aprovechando las reglas de apareamiento de bases convencionales. Tales estructuras también podrían combinar moléculas de ADN y ARN. Las estructuras moléculas de orden superior de la presente invención se montan a partir de moléculas de ácidos nucleicos individuales o múltiples de acuerdo con cualquier esquema presente en el arte y, podrían incluir especies de ácidos nucleicos sintéticos o fragmentos de moléculas más largas, tal como plásmidos recombinantes . Las estructuras podrían construirse siguiendo el auto-pliegue (auto-montaje) o pliegue facilitado de una molécula lineal simple de ADN. El pliegue facilitado podría mediarse por entidades proteináceas (enzimas tal como ligasa, topoisomerasa, endonucleasa, polimerasa) o por vía de la interacción con condiciones fisioquímicas no proteínicas (pH, temperatura, condiciones iónicas) . Alternativamente y/o en combinación con lo anterior, la molécula podría montarse por la interacción con moléculas unidas a una matriz sólida, o mientras el ADN que experimenta plegado en una estructura de orden superior se une o se fija en el espacio durante todo o parte del proceso de montaje. Un segundo aspecto de la presente invención es el suministro de bibliotecas de moléculas de ácidos nucleicos formadas para contener un intervalo de moléculas semi-aleatorias algunas de las cuales podrían poseer una topología deseada capaz de interactuar de una manera específica con una molécula blanco. Se incluyen en este aspecto de la invención bibliotecas de moléculas de ácidos nucleicos que caracterizan un marco de guía para facilitar el montaje de una sub-unidad estructural común. Dentro de cada sub-unidad se incorpora un sitio de manera aleatoria de secuencia que maximiza la diversidad de la biblioteca y la utilidad funcional potencial con respecto a la actividad en una prueba de unión selectiva.

En el segundo aspecto de la presente invención, se aprovecha una modalidad en la que una biblioteca formada de mezclas de n poblaciones separadas (grupos) de moléculas de ADN sintético (sub-unidades) . En este aspecto, el tamaño de la población de las sub-unidades del ácido nucleico sintético es grande y se dicta por el grado de aleatoriedad presente dentro de un segmento variable de la sub-unidad. Además la diversidad de la sub-unidad se incorpora en otras modalidades por variación de la colocación del dominio variable, variación en el número de dominios variables (mezclando con sitios de secuencia fija) y variación en la longitud de cualquier dominio variable. Se prefiere que las n poblaciones separadas de la sub-unidad se mezclen en un ciclo simple de hibridación para crear una biblioteca de múltiples estructuras de ácidos nucleicos y diversidad de secuencia individual . Será obvio que otras modalidades podrían incluir múltiples ciclos de hibridación y múltiples valores del número entero total n . Una característica particular de la biblioteca bajo este esquema es la capacidad de modular el grado de complejidad de la interacción inter-subunidad mediante el diseño juicioso y la colocación de la región de la secuencia complementaria o guía. Un tercer aspecto de la presente invención es la nueva utilidad de estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior, especialmente para el uso farmacéutico y de diagnóstico. En este aspecto, estas estructuras son capaces de unir a una molécula blanco específica, comúnmente una proteína o molécula blanco proteinácea. Cuando la modalidad preferida abarca un blanco de proteína simple, las modalidades adicionales se visualizan, por lo que el blanco es un complejo de proteína comprendido de múltiples sub-unidades de proteínas, tal como un receptor de superficie celular, unido colectivamente a una molécula del primer aspecto de la invención. Otras modalidades del tercer aspecto incluyen la unión a un blanco celular o especie celular identificado mediante una capacidad para unir una molécula del primer aspecto. Las modalidades adicionales incluyen unir a un blanco o complejo blanco que contiene componentes no proteínicos, por ejemplo componentes de carbohidratos o lípidos de la célula y en particular de la superficie celular. Las entidades de proteínas, carbohidratos y lípidos y/o complejos de los mismos podrían ser entidades específicas de la enfermedad o presentarse como componentes normales de un tejido o célula. El blanco o complejo blanco incluiría partículas virales o componentes derivados virales, tal como proteínas de capside o componentes derivados de huéspedes del recubrimiento viral. El blanco o los complejos blanco podrían incluir iones metálicos u otros químicos inorgánicos o grupos químicos en su composición y podrían presentarse naturalmente o introducirse por tratamientos con agentes exógenos . Los receptores blanco podrían incluir aquellos, tales como el receptor IL-2 u otros receptores de citosina tal como receptores para IL-3, M-CSF, GM-CSF y otros numerosos. Igualmente, las moléculas superficiales, tal como el receptor IgE en el que el bloqueo de la unión IgE junto con el bloqueo de un evento de activación de enlace transversal en el receptor sería un resultado altamente deseado. Otras moléculas superficiales que incluyen miembros de la serie de diferenciación del grupo (antígenos CD) son blancos deseados para la modulación de la enfermedad y en particular con respecto a las enfermedades del componente auto- inmune. La invención se diseña para tener aplicación extendida particular en el campo de las moléculas terapéuticas. Las estructuras moleculares de la invención se desean para crear carácter agonista o antagonista de receptores particulares o procesos enzimáticos para beneficio terapéutico, mientras que no contribuyen a ninguna de las desventajas de los terapéuticos de proteínas convencionales, tal como inmunogenicidad. Por lo tanto, la invención se extiende a un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad o condición, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de la estructura molecular. La invención también se extiende al uso de tales estructuras en diagnosis in vivo e in vi tro . Un cuarto aspecto de la presente invención comprende estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior con nucleótidos modificados incluidos en las estructuras. Separado de o además de la diversidad impuesta por el segundo aspecto anterior, se desea particularmente imponer diversidad mediante la derivación de las sub-unidades de la biblioteca y/o por la inclusión de bases modificadas durante su síntesis (bases tioladas, bases biotiladas, bases derivadas epsilon-amino, etc.) . Así, se obtiene una biblioteca altamente diversa con diversidad en el nivel de composición de secuencia y la longitud de secuencia. Tales parámetros pueden fijarse dentro de límites definidos para diferentes bibliotecas y diferentes aplicaciones de blancos diferentes. Las estructuras de ácidos nucleicos de orden superior también contendrán nucleótidos modificados capaces de conferir propiedades deseadas particulares a~ la estructura adicional a las características que proporcionan estabilidad o modulación de unión como anteriormente. Tales modificaciones deseadas adicionales podrían incorporarse bajo el primer y segundo aspectos de la invención e incluyen el uso de regiones hidrofóbicas, la inclusión de grupos psoraleno o acridina, enlazamiento del grupo hapténico, tal como biotina o enlazamiento a diferentes cadenas laterales cargadas, tal como grupos amino o grupos carboxilo, para proporcionar la unión facilitada a una molécula blanco particular. En una modalidad preferida adicional, tales grupos podrían actuar como puntos para la unión de otras moléculas, tal como moléculas de ácidos nucleicos adicionales o proteínas, tal como un anticuerpo o una enzima. Una característica deseada de moléculas de la invención será la estabilidad alta in vi tro e in vivo . La composición química de las estructuras de ácidos nucleicos es altamente influyente, pero también el tamaño físico de la molécula requiere control para minimizar el daño por corte en solución y maximizar la utilidad funcional in vivo . Por esta razón, la preferencia de la invención es para estructuras de ácidos nucleicos de multi-cadena construidas de sub-unidades en general pequeñas (<80 mer) . Alternativamente, el aprovechamiento de una estructura compuesta de sub-unidades más largas (>80 mer) podría desearse e igualmente cae dentro del alcance de la presente invención. Un quinto aspecto de la presente invención comprende estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior 'unidas a otras entidades moleculares. En particular, este aspecto incluye ácidos nucleicos unidos a uno o más sitios específicos a uno o más sitios específicos sobre la otra entidad molecular, por lo que la unión específica al ácido nucleico se facilita por nucleótidos modificados como en el cuarto aspecto de la invención. En particular, este aspecto comprende estructuras basadas en ácidos nucleicos de orden superior unidas a entidades moleculares farmacéutica o diagnósticamente relevantes, por lo que el ácido nucleico une a blancos moleculares específicos que se refieren a la enfermedad y la entidad molecular unida después se usa para combatir o detectar la enfermedad. Las entidades farmacéuticamente relevantes incluirán citosinas, porciones Fe de anticuerpos, otras entidades relacionadas al anticuerpo, toxinas, enzimas, fármacos y profármacos, agonistas o antagonistas receptores, moléculas receptoras mismas (especialmente dominios de unión del ligando) , radioisótopos, ácidos nucleicos farmacéuticament activos, vesículas de transporte de fármacos, tal com liposomas, microorganismos vivos o atenuados, radicales activables por luz y otras entidades moleculares que inducen u efecto de vacunación. Las entidades diagnósticamente relevantes incluirán particularmente radioisótopos, radicales activables por luz, tal como los que producen una señal quimioluminiscente, fluorocromos, enzimas y vesículas de transporte de señal, tal como cuentas. Para resumir, la invención comprende los siguientes objetivos : • Una estructura de ácido poli-nucleico tridimensional, compuesta de múltiples hebras interconectadas de moléculas o segmentos de ácidos nucleicos de la misma, mediante la interacción de apareamiento de base especifica de dos o más moléculas, caracterizada porque la estructura no se cierra covalente ente . • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, caracterizada porque la estructura se forma por dos o más hebras de moléculas de ácidos nucleicos. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, caracterizada porque la estructura se forma por tres o más hebras de moléculas de ácidos nucleicos. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, caracterizada porque la estructura es un cubo o tiene esencialmente la forma de un cubo. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde la estructura en forma de cubo se forma por seis hebras de moléculas de ácidos nucleicos, en donde cada hebra de la molécula actúa como un lado individual del cubo de 6 caras . • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde cada secuencia nucleica comprende dos o más dominios que pueden hibridar a otras moléculas en el grupo. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde cada secuencia nucleica comprende cuatro dominios.

• Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde la estructura incluye moléculas de ácidos nucleicos que están compuestas de regiones del ácido nucleico de hebra simple, mezcladas con regiones de estructura de doble hebra. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en donde cada hebra de ácido nucleico -tiene menos de 80, de preferencia menos de 50, nucleótidos. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde la estructura tiene el montaje (A1+B1+C1) + (A2+B2+C2) como se representa en la Figura 1.

• Una estructura de ácido poli-nucleico como se define anteriormente, en donde la estructura contiene sub- unidades que están compuestas de regiones de secuencia aleatoria variable para obtener moléculas semi-aleatorias o segmentos de las mismas capaces de interactuar con una molécula blanco. • Una estructura de ácido poli-nucleico tridimensional que contiene sub-unidades que están compuestas de múltiples hebras interconectadas de moléculas de ácidos nucleicos o segmentos de las mismas por interacción de apareamiento de base específica de dos o más moléculas, en donde la estructura se cierra covalentemente y contiene sub- unidades que están compuestas de regiones de secuencia aleatoria variable para obtener moléculas semi-aleatorias o segmentos de las mismas capaces de interactuar con una molécula blanco. • Una estructura de ácido poli-nucleico como se define anteriormente, en donde la composición de la secuencia y la longitud de la secuencia es variable. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde la composición de la secuencia variable se logra por una o más modificaciones de nucleótidos dentro de la secuencia. • Una estructura de ácido poli-nucleico como se define anteriormente, en donde la estructura contiene sitios o grupos de ácidos nucleicos que pueden enlazar o unir a otra molécula o una matriz sólida. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde la otra molécula es una proteina, una enzima, una lipoproteína, una proteína glicosilada, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde la otra molécula es un ácido nucleico. • Una estructura de ácido poli-nucleico correspondiente, en donde la molécula es farmacéuticamente efectiva. • Una composición farmacéutica que comprende una estructura de ácido poli-nucleico como se define anteriormente y en las reivindicaciones, opcionalmente junto con los vehículos, excipientes y diluyentes apropiados y/u otros compuestos farmacéuticamente efectivos. • El uso de una estructura de ácido poli-nucleico como agente de diagnóstico. • El uso de una estructura de ácido poli-nucleico como se define anteriormente para el suministro de una biblioteca para afectar una diversidad de topologías específicamente aleatorias para obtener funcionalidades y/o actividades diferentes .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1 Representación del montaje por etapas de una estructura abierta de ácido nucleico en forma de cubo de seis moléculas de hebra simple individuales dadas como Ai, A, B , B;, C- y C . El montaje procede por vía del apareamiento de la base antiparalela convencional entre moléculas de ácidos nucleicos. Se muestran intermediarios diméricos formados entre las moléculas Bx y Ci, también B2 y C2. Se muestran las estructuras triméricas formadas entre las moléculas i, Bi y Ci también A,, B2 y C . El montaje de la estructura en forma de cubo se logra por asociación de los dos radicales triméricos y se representa como la molécula (Ai+Bi+Ci) + (A2+B2+C ) • FIGURA 2 Secuencia de sub-unidades de oligonucleótido IL2R-1 y IL2R-2 que comprende la estructura de ADN con actividad de unión al receptor IL-2.

FIGURA 3 Secuencia de sub-unidades de oligonucleótido TB-R1 y TB-R2 que comprende la estructura de ADN con actividad de unión a la trombina humana.

EJEMPLOS La invención se ilustra por los siguientes ejemplos que no deberían considerarse que son limitantes en alcance.

EJEMPLO 1 Método para la inhibición de una línea celular dependiente de IL-2 usando una estructura de ADN seleccionada de una biblioteca de estructura de ADN. Se sintetizaron dos bibliotecas de moléculas de ADN sintéticas, cada una comprendiendo una región de secuencia aleatoria . La biblioteca A comprendió moléculas de estructura: 5'AGTCCCAAGCTGGCT (N) 13CTCCATCGTGAAGTCAGCCAGCTTTGGACT La biblioteca B comprendió moléculas de estructura: 5' GACTTCACGATGGAGGTCAGAATGTGAATA (N) :0TATTCACA CTGAC Estas secuencias se diseñaron -para facilitar la hibridación cruzada y representar sub-unidades de una biblioteca de la estructura formada por mezclado e hibridación cruzada de diferentes sub-unidades de acuerdo con el esquema de la presente invención. Las bibliotecas de oligonucleótidos (sub-unidad) se sintetizaron con uniones de fosforotioato para maximizar la estabilidad en presencia de factores de suero y se purificaron por HPLC. Los oligonucleótidos purificados se obtuvieron de GenoSys Biotechnologies (Cambridge, UK) . Una biblioteca de estructura de ADN se montó usando un ciclo simple de hibridación cruzada. Las bibliotecas de la sub-unidad A y B se desnaturalizaron, mezclaron e hibridaron a una temperatura de 37°C en una solución de Tris 50 mM pH 7.4, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM. El mezclado de las bibliotecas de la sub-unidad A y B se llevó a cabo a concentración equimolar (1 µM) . En otros experimentos, el mezclado se llevó a cabo usando diferentes relaciones molares. El montaje de las subunidades se verificó por electroforesis en gel. La biblioteca de estructura de ADN se cribó para las estructuras capaces de unir el dominio celular adicional del receptor IL-2 (IL2R) . Esto se llevó a cabo usando IL2R reco binante soluble preparado de acuerdo con los métodos publicados (Meidel, M.C. et al 1988 Biochem, Biophys . Res . Común . 154: 372-379; Meidel, M.C. et al 1989, J. Bi ol . . Chem . 264 : 21097-21105) . IL2R recombinante se unió covalentemente a cuentas magnéticas de superficie activada usando los protocolos recomendados por el abastecedor (Bangs Labs, Fishers, IN, USA) . Las cuentas IL2R se usaron como una superficie de afinidad para seleccionar las estructuras de unión de la biblioteca de estructura de ADN. Las cuentas IL2R se hicieron reaccionar con la biblioteca bajo un número de condiciones experimentales que incluyen la presencia de sales caotróficas en las reacciones de control. La concentración de la biblioteca (ADN) fue aproximadamente 100 nmol en la solución hibridada como anteriormente. Las moléculas de unión se recuperaron por reacción en cadena de polimerasa (PCR)~ directamente de las cuentas después de ciclos de lavado extensivos con una solución de Tris. HCL 75 mM, NaCl 200 M, 0.5% de N-octilglucosido pH 8.0. La PCR se llevó a cabo usando el cebador PRA1 (5'-AGTCCCAAGCTGGCT) para recuperar el componente de la biblioteca A usando los sistemas y condiciones de reactivos estándares. En reacciones separadas, los cebadores PRB1 (5' GACT CACGATGGAG) y PRB2 (5'GTCAGAATGTGAATA) se usaron para recuperar el componente de la biblioteca B. Los productos de la PCR se clonaron y secuenciaron usando los sistemas y procedimientos de reactivos estándares . Un número de secuencias se recuperaron e identificaron como originándose de la biblioteca A de sub-unidad y la biblioteca B de sub-unidad. De estas un par se sintetizó usando la química de fosforotioato como anteriormente. Los oligonucleótidos IL2-R1 y IL2-R2 (secuencias proporcionadas en la Figura 2) se purificaron y montaron como previamente, y se usaron en una prueba celular para el antagonismo de IL-2. TALL-104 (ATCC# CRL-11386) es una linea celular de leucemia de células T de humano. Las células crecen en cultivo de suspensión y requieren IL-2 para el crecimiento óptimo. Las células podrían crecer durante período corto sin IL-2, pero su crecimiento se reduce significativamente. Las células se crecieron en medio de Dulbecco modificado con Iscoves (Life Technologies, Paisley, UK) con 50-100 u/ml de IL-2 humano recombinante (Life Technologies, Paisley, UK) y se suplementaron con 10% (v/v) de suero de becerro fetal inactivado por calor. Las células se cultivaron en una atmósfera de 8-10% de C02. Las diluciones de la preparación de ADN de IL2-R1/IL2-R2 fijadas por calor y una muestra de ADN de control que contenía la secuencia aleatoria de la longitud de contorno idéntica se prepararon en medio de cultivo que contenía IL-2. Se preparó una serie de dilución paralela usando medio que carecía de IL-2. La serie de dilución estuvo en el intervalo de ADN 50 µM a ADN 390 uM. Las pruebas se realizaron usando células TALL-104 sub-confluentes colocadas en placas el día anterior en placas de microtitulación de 96 pozos. Las células se colectaron por centrifugación, se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato pre-calentada (37°C) y el medio que contenía ADN se adicionó durante 48 horas. Los tratamientos se llevaron a cabo en cuadruplicado. La proliferación se verificó al final del período de 48 horas en una prueba colorimétrica usando un compuesto de tetrazolio comercialmente disponible y siguiendo las instrucciones proporcionadas por el suministrador (Promega, Southampton, UK) .

Las placas de microtitulación se leyeron a 540 nm. Los resultados mostraron que la preparación del ADN hibridado inhibió el crecimiento de la línea celular TALL-104 bajo condiciones donde se inactivaron los oligonucleótidos sintéticos individuales IL2-RÍ y IL2-R2.

EJEMPLO 2 Método para la selección de una estructura de ADN que une a trombina humana. La Biblioteca descrita en el ejemplo 1 se usó para seleccionar una estructura de ADN capaz de unir a trombina humana. La biblioteca se cribó usando una preparación de trombina humana (Sigma, Poole, UK) unida a cuentas magnéticas de superficie activada según el ejemplo 1. Las cuentas de trombina se leyeron con la biblioteca de estructura de ADN como para el ejemplo 1, excepto que el lavado de post unión se llevó a cabo en una solución de acetato de Tris 20 mM, pH 7.4, NaCl 140 mM, KC1 5 m , MgCl2 1 mM. Las moléculas de unión se recuperaron directamente de las cuentas por reacciones usando PCR y grupos de cebadores según el ejemplo 1. Los productos de la PCR se clonaron y secuenciaron usando los sistemas y procedimientos de reactivos estándares. Se recuperaron e identificaron un número de secuencias como se originaron de la biblioteca de sub-unidad A y la biblioteca de sub-unidad B. De estas, un par se sintetizo usando la química de fosforotioato como anteriormente. Los oligonucleótidos TB-Rl y TB-R2 (secuencias proporcionadas en la Figura 3) se purificaron y montaron. El complejo TB-Rl /TB-R2 se usó en una prueba de inhibición de trombina. El tiempo de coagulación se midió usando un fibrómetro a 37 °C y el plasma de humano de adulto se preparó frescamente de un donador saludable. El grado de la inhibición de trombina se determinó usando una curva estándar de trombina graficando el tiempo de coagulación contra la concentración de trombina. El tiempo de coagulación se midió sobre tres logaritmos de la estructura de ADN en la prueba. Los resultados mostraron la inhibición de la actividad de coagulación en presencia del complejo de ADN TB-R1/TB-R2.

EJEMPLO 3 Método para la selección de las estructuras de ADN que unen a CD4 soluble recombinante. La biblioteca descrita en el ejemplo 1 se usó para seleccionar una estructura de ADN capaz de unir a una preparación CD4 soluble recombinante (rsCD4). La biblioteca de estructura de ADN se cribó usando una preparación CD4 (BioDesign, Saco, ME, USA) inmovilizada a cuentas magnéticas activadas como previamente. El cribado, lavado y selección de la biblioteca por PCR fue como se describió para el ejemplo 2. Se sintetizó y montó un par de oligonucleótido simple que se origina de las bibliotecas de la sub-unidad A y B. La estructura se usó para inhibir la unión de RPAT4 monoclonal anti-CD4 (Serotech, Abingdon, UK) en una prueba inmuno absorbente enlazada de enzima (ELISA) . Se recubrieron placas ELISA de 96 pozos durante toda la noche con solución de 0.2 mg/ml de rsCD4 en amortiguador de recubrimiento (amortiguador de carbonato-bicarbonato 0.05M pH 9.0) a 4°C. Las placas se lavaron extensivamente usando TBS-T (solución salina amortiguada con tris pH 8.0, Tween 20 0.05 (v/v) ) y las estructuras de ADN de control y prueba se diluyeron (1:2) a través de la placa en TBS de una concentración inicial de 100 uM. Las placas se incubaron durante 40 minutos a 37 °C y se lavaron con TBS. Se adicionó una preparación de 100 ng/ml del anticuerpo RPAT4 en PBS a la placa y se incubó durante 40 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron y RPAT4 unido se detectó usando una preparación anti-ratón de cordero marcada con fosfatasa alcalina (Sigma, Poole, UK) y Sigma Fast OPD (Sigma, Poole, UK) como un sustrato de color. En algunas pruebas, el ADN se co-incubó con RPAT4 monoclonal. La intensidad de color se leyó usando una placa lectora y la señal se comparó entre los pozos de prueba y control. Los resultados mostraron inhibición significativa de RPAT4 que se une a rsCD4 en presencia de la estructura de ADN. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una estructura de ácido poli-nucleico tridimensional, compuesta de múltiples hebras interconectadas de moléculas o segmentos de ácidos nucleicos de la misma, mediante la interacción de apareamiento de base específica de dos o más moléculas, caracterizada porque la estructura no se cierra covalentemente .

2. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la estructura se forma por dos o más hebras de moléculas de ácidos nucleicos.

3. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la estructura se forma por tres o más hebras de moléculas de ácidos nucleicos.

4. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la estructura es un cubo o tiene esencialmente la forma de un cubo .

5. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la estructura en forma de cubo se forma por seis hebras de moléculas de ácidos nucleicos, en donde cada hebra de la molécula actúa como un lado individual del cubo de 6 caras.

6. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque cada secuencia nucleica comprende dos o más dominios que pueden hibridar a otras moléculas en el grupo.

7. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque cada secuencia nucleica comprende cuatro dominios.

8. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque la estructura incluye moléculas de ácidos nucleicos que están compuestas de regiones del ácido nucleico de hebra simple, mezcladas con regiones de estructura de doble hebra.

9. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque cada hebra de ácido nucleico tiene menos de 80 nucleótidos .

10. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque cada hebra de ácido nucleico tiene menos de 50 nucleótidos.

11. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque la estructura tiene el montaje (A1+B1+C1) + (A2+B2+C2) como se representa en la Figura 1.

12. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque la estructura contiene sub-unidades que están compuestas de regiones de secuencia aleatoria variable para obtener moléculas semi-aleatorias o segmentos de las mismas capaces de interactuar con una molécula blanco.

13. Una estructura de ácido poli-nucleico tridimensional compuesta de múltiples hebras interconectadas de moléculas de ácidos nucleicos o segmentos de las mismas por interacción de apareamiento de base específica de dos o más moléculas, caracterizada porque la estructura se cierra covalentemente y contiene sub-unidades que están compuestas de regiones de secuencia aleatoria variable para obtener moléculas semi-aleatorias o segmentos de las mismas capaces de interactuar con una molécula blanco.

14. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque la composición de la secuencia y la longitud de la secuencia es variable.

15. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la composición de la secuencia variable se logra por una o más modificaciones de nucleótidos dentro de la secuencia.

16. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque la estructura contiene sitios o grupos de ácidos nucleicos que pueden enlazar o unir a otra molécula o una matriz sólida.

17. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada perqué la otra molécula es una proteína, una enzima, una lipoproteina, una proteina glicosilada, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.

18. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la otra molécula es un ácido nucleico.

19. Una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-18, caracterizada porque la molécula es farmacéuticamente efectiva.

20. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 19, opcionalmente junto con los vehículos, excipientes y diluyentes apropiados y/u otros compuestos farmacéuticamente efectivos.

21. El uso de una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1-18 como agente de diagnóstico .

22. El uso de una estructura de ácido poli-nucleico de conformidad con la reivindicación 12 o 13 para el suministro de una biblioteca para afectar una diversidad de topologías específicamente aleatorias para obtener funcionalidades y/o actividades diferentes.