CZ20021404A3

CZ20021404A3 - Způsob přípravy aromatických diketoderivátů a jejich farmaceutické vyuľití

Info

Publication number: CZ20021404A3
Application number: CZ20021404A
Authority: CZ
Inventors: László Vértesy; Michael Kurz; Erich Paulus
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1999-10-25
Filing date: 2000-08-19
Publication date: 2002-07-17
Also published as: EP1248763A2; JP2003512448A; CA2388957A1; RU2252211C2; EE200200216A; IL149156A0; KR100755730B1; WO2001030736A3; HUP0203129A2; AU7278200A; NO20021812D0; PL205217B1; CN1379752A; AU779352B2; HK1049827A1; HK1049827B; SK5442002A3; CA2388957C; NZ518545A; ZA200203034B

Description

Způsob přípravy aromatických diketoderivátů a jejich farmaceutické využití

Oblast vynálezu

Předkládaný vynález se týká nových aromatických diketoderivátů a jejich farmaceuticky využitelných solí, esterů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů. Tyto deriváty jsou inhibitory glukosa-6-fosfáttranslokázy a mohou se využít při léčbě cukrovky. Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy těchto derivátů a použití těchto derivátů, jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů jako léčiv, zejména pak jejich použití při léčbě cukrovky, a farmaceutických kompozic obsahujících tyto deriváty, jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty.

Dosavadní stav techniky

Obecným rysem cukrovky je zvýšená rychlost produkce jaterní glukosy. Zejména silná závislost mezi hladinou glukosy v plasmě při hladovění a produkcí jaterní glukosy se vyskytuje u cukrovky nezávislé na insulinu (NIDDM). Dvěma cestami, kterými se glukosa v játrech produkuje, je glukoneogeneze a glykogenolýza. Konečné kroky obou cest jsou katalyzovány mikrozomální glukosa-6-fosfatázou, klíčovým enzymem pro homeostatickou regulaci hladin krevní glukosy. Je známo, že hladina tohoto enzymu se zvyšuje jak při experimentální, tak patologické cukrovce. Zásah do účinnosti tohoto enzymu tedy vede ke snížené produkci jaterní glukosy.

Jaterní glukosa-6-fosfatáza je systém skládající se z několika složek, které mají nejméně tři funkce: glukosa-6-fosfáttranslokáza (TI), glukosa-6-fosfátfosfohydroláza a fosfát/pyrofos• to • · · · • · · · · • · to to to to ·· · • · · · to to to to to to · to to • to «toto to·· _2_ ···· ·· · ·· ···· fáttranslokáza (T2). Glukosa-6-fosfáttranslokáza umožňuje transport glukosa-6-fosfátu do dutin endoplazmatického retikula (ER). Fosfohydroláza, jejíž aktivní místo je umístěno na vnitřních povrchu dutin ER, hydrolyzuje glukosa-6-fosfát a uvolňuje glukosu a fosfát do dutiny. Zatímco odvod fosfátu je zajištěn fosfát/pyrofosfáttranslokázou, přesný mechanismus odvodu glukosy není znám.

Glukosa-6-fosfáttranslokáza je vysoce substrátově specifická, a je tedy možným cílem pro farmakologické zásahy při léčbě cukrovky. Z fyziologicky přítomných fosfátů cukrů je tedy jedině glukosa-6-fosfát transportován touto translokázou. Naopak fosfatáza je nespecifická a je známo, že hydrolyzuje řadu organických fosfátesterů.

V literatuře byla popsána řada nespecifických inhibitorů glukosa-6-fosfatázy, např. florrhizin (J. Biol. Chem., 242, 1995

- 1960 (1967)), 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoová kyselina (Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 694 - 699 (1972)), 2,2'-diisothiokyanátostilben a 2-isothiokyanáto-2'-acetoxystilben (J. Biol. Che., 255, 1113 - 1119 (1980). První terapeuticky využitelný inhibitor glukosa-6-fosfatázového systému byl navržen v EP-A-587 087 a EP-A-587 088. Kodaistatiny A, B, C a D popsané v Mezinárodní patentové přihlášce PCT/EP 98/02247 jsou prvními inhibitory glukosa-6-fosfáttranslokázy z mikrobiálních zdrojů.

Podstata vynálezu

Aromatické diketoderiváty dle předkládaného vynálezu se odvozují od sloučeniny nazývané mumbaistatin. Mumbaistatin je popsán v Mezinárodní patentové přihlášce PCT/EP 99/04127. Jedná se o přírodní produkt, který se dá získat kultivací mikroorganismu Streptomyces litmocidini, jehož vzorek je uložen od 4. července 1997 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných struktur (DSMZ) pod přístupovým číslem DSM 11641. Strukturní

-3vzorec mumbaistatinu se nyní určil a je následující:

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že určité deriváty mumbaistatinu mají zvýšenou aktivitu a jsou lépe snášeny v těle savců, než mumbaistatin samotný. Také oddělené diastereomery mumbaistatinu mají určité výhody oproti směsi diastereomerů mumbaistatinu .

Předkládaný vynález proto poskytuje sloučeniny obecného vzorce I kde R₄, R5, Rď a R7 jsou nezávisle na sobiě atom vodíku, hydroxylová skupina, atom halogenu/ popřípadě substituovaná alkylová, arylová nebo acylová skupina, X-alkylová nebo X-arylová skupina, kde X je atom kyslíku, skupina NH, N-alkylová skupina nebo atom síry, K je skupina obecného vzorce II nebo III uvedeného níže:

• · · · · (II)

-4•··· 9«··

X,Ri

R₂X₂

X₇

II⁷

-CH.-C-X₁R₁ (III)

L je skupina obecného vzorce IV nebo V uvedeného níže:

X₄ nebo X₅

7^5 cyklus '

-X₃R₃ (IV)

(V) nebo K a L tvoří, spolu s odpovídajícími atomy uhlíku, ke kte rým se váží, skupinu obecného vzorce VI, VII nebo VIII uvede nou níže:

(VI) • ·

• · • 4 (VII)

(VIII) kde

Ri a R₃ jsou nezávisle na nebo arylová skupina, sobě kation, atom vodíku, alkylová

R₂ je atom vodíku, alkylová, arylová nebo acylová skupina,

Xi, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ a X7 jsou nezávisle na sobě atom kyslíku, NH skupina, N-alkylová skupina nebo atom síry a cyklus je, spolu s atomy uhlíku označenými „c a „d, popřípadě substituovaný nasycený, částečně nenasycený nebo aromatický, karbocyklický nebo heterocyklický, jednoduchý nebo kondenzovaný cyklický systém, s výjimkou sloučeniny, ve které K je skupina vzorce II a L je skupina vzorce IV, ve kterých X_lz X₂, X₃, X₄, X5, Χθ a X7 jsou atomy kyslíku, R_x, R₂ a R₃ jsou atomy vodíku, R₄ je hydroxylová skupina, R₅, R6, a R₇ jsou atomy vodíku, a cyklus je 3,8dihydroxyantrachinon, a sloučeniny, ve které K a L tvoří skupinu vzorce VI, ve které X₂, X₃, X₄, X5, Χδ a X7 jsou atomy kyslíku, Ri je methylová skupina, R₂ a R3 jsou atomy vodíku, R₄

-6• · · · ···· • · * « · · · je hydroxylová skupina, R5, Rě a R7 jsou atomy vodíku a cyklus je 3,8-dihydroxyanthrachinon, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech stereochemických a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.

Předkládaný vynález dále zahrnuje sloučeniny obecného vzorce IX

R_c

R_e (IX) kde

M je skupina vzorce X

X_OR

CHj-^-CH-CH^C-X₁R₁ (X) a N je skupina vzorce XI

-X₅R₃ (XI) nebo M a N tvoří, spolu s atomy uhlíku, ke kterým se váží, skupinu vzorce XII, *7

CH_rC—X^ která se váže přes atom uhlíku označený „e,

(XII) • 9 *6 ’^X3^R3

9 9 9 »999 9999 99

9 9 9

9 9

9999

O je skupina vzorce XIII (XIII) a P je skupina vzorce XIV,

-X₅R₂ (XIV) nebo O a P tvoři, spolu s uhlíky, ke kterým se váží, skupinu vzorce XV,

cyklus (XV) která se váže přes atom uhlíku označený „f, a kde Ri až R7, Xi až X₇, cyklus, c a d mají význam uvedený v nároku 1, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech stereochemických a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.

Zde používaný výraz „alkylová skupina značí přímou nebo rozvětvenou, popřípadě substituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, výhodně alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, jako je: methyl, ethyl, n-propyl, ipropyl, n-butyl nebo i-butyl, přímou nebo rozvětvenou, popřípadě substituovanou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, výhodně alkenylovou skupinu obsahující 2 až 4 atomy uhlíku, jako je allyl, přímou nebo rozvětvenou, popřípadě substituovanou alkynylovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, výhodně alkynylovou skupinu obsahující 2 až 4 atomy • · « · 9 4 9 9· ·· • •9« **· 9 9 9 9

9 9999 99 9

9 99 9999949 9 9

9 999 999 _g_ ·*♦· ··*· ** * ·* ··*· uhlíku, jako je allylen.

Zde používaný výraz „arylová skupina značí popřípadě substituovanou benzylovou nebo fenylovou skupinu.

Zde používaný výraz „acylová skupina značí popřípadě substituovanou alifatickou, aromatickou nebo heterocyklickou acylovou skupinu, například alifatickou acylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, jako je acetylová nebo propionylová skupina, aromatickou acylovou skupinu, jako je benzoyl, toluyl, a heterocyklickou acylovou skupinu odvozenou od pětia šestičlenných kruhů s jedním až čtyřmi heteroatomy, jako je nikotinoyl, furyl, pyrrolyl, thienyl, thiazolyl a oxazolyl.

Zde používaný výraz „popřípadě substituovaný značí, že daná skupina je popřípadě substituována jedním nebo více, výhodně jednou, dvěma, třemi nebo čtyřmi shodnými nebo rozdílnými následujícími substituenty: hydroxylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkenylová skupina obsahující 1 až 4 atomy ulhíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkylthioskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxykarbonylová skupina obsahující v alkylové části 1 až 4 atomy uhlíku, karbamoylová skupina, karboxylová skupina, trifluormethylová skupina, kyanoskupina, nitroskupina, aminoskupina, alkylaminoskupina obsahující v alkylové části 1 až 4 atomy ulhíku, dialkylamino skupina obsahující v alkylových částech 1 až 4 atomy uhlíku, amidinová skupina, aryloxyskupina, arylaminoskupina a atom halogenu.

Atom halogenu je atom jódu, bromu, chloru nebo fluoru, výhodně atom chloru nebo bromu.

Výraz „kation představuje neorganický kovový ion nebo organický amoniový ion. Zde zmiňované příklady mohou zejména být farmakologicky přijatelné ionty alkalických kovů nebo ionty kovů alkalických zemin, výhodně sodný, draselný, vápenatý nebo

4 4 4

4

4 • 4

4444 4444

-9horečnatý ion, amonný ion a, z organických amoniových iontů, zejména popřípadě substituovaný alkylovaný amoniový ion, jako je, například triethylamoniový nebo diethanolamoniový ion, stejně jako morfolin, benzylamoniový a prokainový, L-argininový a L-lysinový ion.

« 4 • 4 ·

4 44

4« 44

4 4 ·

4 4

4444

Cyklus, který zahrnuje atomy uhlíku označené „c a „d použité ve vzorcích může znamenat popřípadě substituovaný nasycený, částečně nenasycený nebo aromatický, karbocyklický, heterocyklický, jednoduchý nebo kondenzovaný kruh. Jednoduchý kruh značí monocyklický kruh obsahující 3 až 6 atomů v kruhu a kondezovaný kruh značí kondenzovaný dicyklický nebo tricyklický systém obsahující 6 až 14 atomů v kruhu.

Nasycený karbocyklický systém může představovat kruhový systém se 3 až 14 členy, výhodně jednoduchý 3- až 8-členný kruh jako je cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, výhodněji cykloalkylová skupina obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, například cyklopropylová skupina, cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina nebo cyklohexylová skupina. Může také představovat bi- nebo tricyklický kondenzovaný kruhový systém jako je bicyklo[3.3.1]nonan a tetradekahydrofenantren.

Částečně nenasycený karbocyklický kruhový systém se liší od nasyceného tím, že obsahuje jednu nebo dvě dvojné či trojné vazby. Může tedy představovat 3- až 14-členný kruhový systém, výhodně 3- až 8-členný kruhový systém jako je cykloalken obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, například cyklopentadien nebo cyklooktatetraen, výhodněji cykloalken obsahující 3 až 6 atomů uhlíku nebo cykloalkyn obsahující 5 až 8 atomů uhlíku.

Aromatický karbocyklický jednoduchý nebo kondenzovaný kruhový systém může představovat 5 až 14-členný monocyklický, dicyklický nebo tricyklický kruhový systém jako je fenyl, naftyl, fenantren nebo antrachinon.

• 9 • 9

9« 4 9 4 9 • 949 999 999 9

9 9999 99 4

4 94 4444994 9 9 • 9 444 444

-ίο- ........ ·* * ^M ··**

Heterocyklický kruhový systém může být nasycený, částečně nenasycený nebo aromatický a může to být jednoduchý nebo kondenzovaný kruhový systém definovaný výše. Heterocyklický kruhový systém může představovat karbocyklický kruhový systém definovaný výše, ve kterém jsou jeden, dva, tři nebo čtyři atomy uhlíku nahrazeny následujícími stejnými nebo různými heteroatomy: atom dusíku, atom kyslíku a atom síry. Může například představovat pěti- nebo šestičlenný kruh, který obsahuje jeden až čtyři následující heteroatomy: atom kyslíku, atom síry a atom dusíku, zejména atom dusíku, popřípadě spolu s atomy síry nebo kyslíku jako členy kruhu. Některé příklady hetrocyklických kruhových systémů jsou heteroalkylové skupiny jako je pyrrolidin, piperidin, tetrahydrofuran, oxazolidin a thiazolidin, a heteroarylové skupiny jako je pyridyl, pyrimidyl, furanyl, benzothiazol, benzofuranyl a indolyl.

Výhodně je cyklus skupina vzorce XVI

kde

Rg je atom vodíku, alkylová, arylová nebo acylová skupina,

Rg je kation, atom vodíku, alkylová, arylová nebo acylová skupina,

Rio, Riiz R12 a R13 jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, -XioH nebo -XioR skupina, nebo jsou Ri₀ a Ru a/nebo R₃₂a R13 společně =Xjo skupina,

X₈, X₉ a Χχο jsou nezávisle na sově atom kyslíku, NH skupina, Nalkylová skupina nebo atom síry

-114« «4 «4« 44 44 • ••4 4 4 4 «444

4 4444 44 4

4 44 4444444 · 4

4 444 444

4444 4444 44 4 44 4444

R je alkylová, arylová nebo acylová skupina „------„ značí případnou skupinu a cyklus se váže atomy uhlíku označenými „c a „d.

Výhodněji je cyklus skupina vzorce XVIA

kde

X₈ a X₉ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo atom kyslíku,

Rg a R₉ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo alkylová skupina,

Rio až R₁₃ jsou atomy vodíku, nebo R_i0 a R_i3 společně a/nebo R_X2 a R_i3 společně jsou skupina =0, a cyklus se váže atomy uhlíku označenými „c a „d.

Cyklická část struktury může být jednou z mnoha různých kruhových struktur. Je však výhodné mít cyklus substituovaný, výhodně hydroxylovou nebo alkoxylovou skupinou. Cyklus je výhodně aromatický kruhová struktura níže uvedeného vzorce XVIB:

c

(XVIB) kde

Rg je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, • 9 «« • 9 « ·

9

9 *

9999 9999

-1299 ··

9 · 9

9 9 9 • 9 9 9

99 9999 *· • 9 a Χθ je atom kyslíku

Výhodné sloučeniny dle předkládaného vynálezu mají následující obecný vzorec XVIII

(XVIII) kde

R_x až R₇, Xi až X₇, cyklus a „c a „d mají shora uvedený význam, s výjimkou sloučeniny, ve které Xi až X₇ jsou atomy kyslíku, R_x, R₂ a R₃ jsou atomy vodíku, R₄ je hydroxylová skupina, R5, R6 a R₇ jsou vodíky a cyklus je 3,8-dihydroxyantrachinon, a její farmaceuticky přijatelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty, ve všech svých steroizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.

Výhodně je na atomu uhlíku označeném hvězdičkou konfigurace S, v tomto případě se neuplatňuje shora uvedená výjimka.

Výhodně jsou Ri, R₂ a R₃ alkylové skupiny obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, výhodně alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, jako je methyl.

Výhodně je jeden nebo více atomů Xi až X₇ atom kyslíku.

Příklad sloučeniny shora uvedeného vzorce XVIII je uveden níže:

-13alkyl

9* ·«

9 w v « · • · 9 · • 9 9 9 9

9 9 « »»99 9999 99 «9 ·· • · · 9

9 9 9

999 99« 9

9 9 9 • 99 9#«9

(XVIIIA)

Další příklad sloučeniny shora uvedeného vzorce je uveden níže:

alkyl

(XVIIIB)

Alkylované deriváty mumbaistatinu vzorce XVIIIA a vzorce XVIIIB se získávají rozpuštěním mumbaistatinu v rozpouštědle, výhodně organické rozpouštědle jako je alkanol, například methanol, a reagováním s alkylačním činidlem jako je diazoalkan, například diazomethan, diazoethan, diarylmethyldiazomethan jako je difenyldiazomethan. Alkylový substituent ve výše uvedených skupinách vzorce XVIXA a vzorce XVIIIB je výhodně alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku. Když je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku například methylová skupina, získávají se methylované deriváty mumbaistatinu reakcí mumbaistatinu v roztoku s methylačním činidlem jako je diazomethan.

V ideálním případě se na mumbaistatin předem působí kyselinou, • ·

-14·· ·

výhodně nízkomolekulární organickou kyselinou, například kyselinou mravenčí, kyselinou octovou nebo kyselinou trifluoroctovou. Reakční se produkt se poté isoluje, výhodně chromatograf icky.

Izolace sloučenin dle předkládaného vynálezu z reakčního média se může provést známými metodami, které závisí na rozpustnosti výsledné sloučeniny.

Další příklad sloučeniny vzorce XVIII je níže uvedený diastereomer:

kde na atomu uhlíku označeném hvězdičkou je konfigurace S.

Diastereomer vzorce XVIIID dle předkládaného vynálezu je uveden níže:

kde atomy uhlíku označené „a a „b ve formě ketalu nebo polo• · · · • •toto · ·

-15» · · ···· ketalu mají nezávisle na sobě konfiguraci S nebo R.

• · · ·· · · «

Další příklad sloučeniny vzorce XVIII je uveden níže:

(XVIIIE)

Některé výhodné sloučeniny vzorce I znázorněné výše mohou být zobecněny jako deriváty hydroxy-diketo-diuhličité kyse-liny.

Vynález se dále týká sloučenin obecného vzorce XIX uvedeného níže:

(XIX) kde Ri až R₇, Xi až X₇, cyklus a „c a „d mají shora uvedený význam, s výjimkou sloučeniny, ve které Ri je methylová skupina, R₄ je hydroxylová skupina, Xi až X₇ jsou atomy kyslíku a cyklus je 3,8-dihydroxyanthrachinon, jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů ve všech svých stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsí v libovolném poměru.

Výhodně je Ri alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku,

-16• · · · · · « jako je methylová skupina, R₄ je výhodně hydroxylová skupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, jaké je methoxyskupina.

Příklad sloučeniny vzorce XIX je uveden níže:

(XIXA)

Další příklad sloučeniny vzorce XIX je uveden níže:

-17·· · ► · · » · · ·

CH, (XIXC)

Další příklad sloučeniny vzorce XIX je níže uvedený diasteromer:

(XIXD) kde na atomu uhlíku označeném hvězdičkou je konfigurace S a na atomech uhlíku označených „a a „b může být konfigurace buď S nebo R.

Jeden ze způsobů přípravy sloučeniny vzorců XIXA, XIXB a XIXC zahrnuje rozpuštění mumbaistatinu v rozpouštědle, výhodně organickém rozpouštědle, například alkanolu jako je methanol, a reakci s methylačním činidlem jako je diazomethan. V ideálním případě předchází reakci mumbaistatinu působení kyseliny jako je kyselina trifluoroctová. Reakční produkt se izoluje, výhodně chromatograficky.

·« · • · · • ··· • · · · · ·

-18• to ► · »· ««toto

Mumbaistatin má omezenou stabilitu v roztoku při pH okolo 6 až 9. Při kyselém pH mumbaistatin podléhá komplexní konverzi, například na shora uvedenou sloučeninu vzorce XIXD. Protože se při přípravě methylovaných sloučenin XVIIIA, XVIIIB, XIXA, XIXB a XIXC uvedených shora mumbaistatin reaguje s diazomethanem v kyselém prostředí, je třeba zajistit, aby se získaly definované, nativní methylační produkty. Zjistilo se, že požadované produkty methylace se získají za chladných podmínek, jako jsou teploty mezi -1 až +3 °C, výhodně 0 °C, a/nebo když se proces provádí za prodloužených reakčních časů. Překvapivě bylo možné vykrystalovat alespoň jeden z produktů methylace použitím směsi vody a acetonitrilu. To umožnilo určení struktury sloučenin rentgenstrukturní analýzou.

Tabulka 1:

Krystalová data a upřesnění tin (vzorec XVIIIA) Identifikační kód Empirický vzorec Molekulová hmotnost Teplota

Vlnová délka

Krystalová soustava

Prostorová skupina

Rozměry jednotkové cely

Objem

Z

Hustota (vypočtená) Absorpční koeficient F(000)

Velikost krystalu struktury pro trimethylmumbaistash608

C33H27NO11

613,56

293(2) K [19, 85(18,85) °C]

0,71073 Á

Monoklinická

P2(l) a = 12, 907 (4) Á _α = 90° b = 11,253(5) Á β = 96,56(2)° c = 20,003(6) Á γ = 90 °

2886,2 (17) Á³

1,412 Mg/m³0,107 mm^-11280

0,04 x 0,1 x 0,2 mm³

-19····

Rozsah theta pro sběr dat Rozsahy indexů Počet sebraných odrazů Nezávislé odrazy Úplnost k theta = 20,83° Absorpční korekce Zpřesňovací methoda

Data/restrikce/parametry Vhodnost proložení F²Konečné R ukazatele (> 2 σ(1) ) R ukazatele (všechna data) Absolutní strukturní parametry Extinkční koeficient Největší dif. pík a jáma

Tabulka 2

2,08 až 20,83°

-12<h<12, -ll<k<ll, -19<1< 19 9796

5833 [R(int) = 0,0447]

98,7 % maximum: 0,862, minimum: 0,632 matr. metoda nejmenších čtverců na F²

5833/1/822

1,064

Rl = 0,0510, wR2= 0,0966 Rl = 0,0981, wR2 = 0,1171 1(2)

0,0035(4)

0,194 a -0,174 e-Á³

Chemické posuny tetramethylmumbaistatinlaktondispiroketonu (vzorec XIXC v CDC1₃ při 280 K)

	A^a	B^a)	A	B
		^XH	¹³C	^iJC
1	—	-	159,50	159,51
1-OMe	3,87	3,87	56,28	56,28
2	7,26	7,26	118,27	118,27
3	7,67	7,67	134,57	134,57
4	7,85	7,85	119,32	119,32
5	-	-	134,44	134,44
6	-	-	183,27	183,24
7	-	-	139,57	139, 57
8	-	-	124,51	124,50
9	-	-	180,29	180,26
10	-	-	122,56	122,50
11	7,88	7,88	110,55	110,58

-20♦ · • · • · 4 • 99 9 ··♦·

4

4444

	A^a)	B^a)	A	B
12	-	-	160,33	160,33
12-OMe	4,21	4,20	57,00	57,00
13	-	-	121,33	121,28
14		-	149,95	149,81
15	-	-	164,43	164,15
16	-	-	111,33	111,33
17	-	-	126,62	126,34
18	-	-	153,44	153,39
18-OMe	3,54	3,54	55,52	55,52
19	6,76	6,77	110,97	110,92
20	7,46	7,47	132,15	132,23
21	7,12	7,09	114,38	114,32
22	-	-	141,76	142,18
23	-	-	119,28	119,58
24	2,74 / 2,58	2,70 / 2,63	36, 05	35,22
25	2,41 / 1,92	2,41 / 1,97	30,36	29, 87
26	4,77	4,77	77,64	76,54
27	2,90 / 2,63	2,86 / 2,63	41,46	40,15
28	-	-	171,74	171,21
28-OMe	3, 67	3, 71	51,72	51,78

a) A a Β odpovídá oběma diastereomerním formám (poměr A:B je asi 1,2:1,0).

Tabulka 3

Porovnání aromatických protonů ve vzorcích XVIIIA a XVIIIB

Pozice	Vzorec XVIIIA	Vzorec XVIIIB
2	7,29	7,26
3	7,59	7,67
4	7,85/7,84	7,85
11	7,97/7,90	7,88
19	6,92	6,76/6,77

·4 ·

4 4 • 4

4

4 4 4 *· 4 ·

-2144 *

444 4

Pozice	Vzorec XVIIIA	Vzorec XVIIIB
20	7,68/7,67	7,46/7,47
21	6, 92	7,12/7,09

Tabulka 4

Chemické posuny mumbaistatinlaktondisprioketalmonomethylesteru (vzorec XIXA) v DMSO při 300 K

Pozice	XIXA	XIXA
	^XH	u_c
1	-	161,38
1-OH	13,26	-
2	7,18	123,82
3	7,62	135,15
4	7,57	117,95
5	-	132,68
6	-	183,53
7	-	138,70
8	-	117,91
9	-	183,09 (š)
10	-	116,48
11	7,16 (š)	~ 122,1 (š)
12	-	153,87 (š)
12-OH	(š)	-
13	—	a)
14	-	a)
15	-	166,45 (š)
16		110,11
17	-	124,64, 124,51
18	-	151,14, 151,09
18-OH	9,51, 9,52	-
19	6,68	115,32
20	7,26, 7,27	130,72, 130,78
21	6,97, 6,95	112,45

• · • « ·

Pozice	XIXA	XIXA
22	-	143,49, 143,68
23	-	117,93, 118,01
24	2,53/2,45, 2,59/2,37	-35,8 (š), -34,9 (š)
25	2,26/1,74, 2,22/1,85	-29,8 (š), -29,4 (š)
26	4,60, 4,54	76,84, 75,91
27	2,68, 2,63	41, 09, 39, 88
28	-	170,97, 170,86
28-OMe	3,59, 3,61	51,22, 51,28

a) u těchto jader nebyl ve ¹³C NMR spektru pozorován žádný signál

Tam, kde se pozorují dvě sady signálů (v poměru asi 1,1 : 1,0), odpovídají oběma diastereomerním formám. Obě hodnoty jsou odděleny čárkou v případě, že diastereomery vykazují různé chemické posuny (první hodnota odpovídá hlavní složce).

Vynález se dále týká sloučenin obecného vzorce XX:

kde Ri až R₇, X_x až X₇, cyklus a „c a „d mají shora uvedený význam, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a dalších chemických ekvivalentů, ve všech stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsí v libovolném poměru.

*

9 4

9 9 1

999*

-23»99 9999

Výhodně jeden nebo více atomů Χχ až X7 jsou atomy kyslíku.

Vynález se dále týká sloučenin obecného vzorce XXI:

(XXI) kde

Ri až R₇, Χχ až X₇, cyklus a „c a „d mají shora uvedený význam, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů, ve všech stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsí v libovolném poměru.

Výhodně jeden nebo více atomů Χχ až X7 jsou atomy kyslíku.

Vynález se dále týká sloučenin obecného vzorce XXII

(XXII) kde

Rx až R₇, Xi až X₇, cyklus a „c a „d mají shora uvedený význam, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů, ve všech stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsí v libovolném poměru.

Výhodně jeden nebo více atomů X_x až X₇ jsou atomy kyslíku.

Příklad sloučeniny vzorce XXII je uveden níže:

O (XXIIA)

4 ·♦

4444

-25Způsob přípravy sloučeniny vzorce 22a zahrnuje rozpuštění mumbaistatinu v rozpouštědle, výhodně organickém rozpouštědle jako je alkanol, a reakci se zdrojem amidu jako je roztok amoniaku. Příprava se provádí za chladu, výhodně při teplotě -1 až +3 °C, výhodněji při 0 °C. Reakční produkt se poté isoluje.

4 4

4

4444 4444

4 ·

4 4 ·

4 4444

4 4

4

4 ·

4

Vynález se dále týká sloučenin obecného vzorce XXIV:

(XXIV) kde

Rx až R₇, Χχ až X₇, cyklus a „c a „d mají shora uvedený význam, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů, ve všech stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsí v libovolném poměru.

Výhodně jeden nebo více atomů Χχ až X₇ jsou atomy kyslíku.

Sloučeniny dle předkládaného vynálezu jsou tautomery, ve kterých se otevřené a uzavřené formy vyskytují v rovnováze.

Uzavřené struktury vzorců XIX až XXIV uvedených shora se mohou převést na otevřené strukturu vzorce XVIII reakcí s vhodnou bází. Vhodné báze, použitelné pro reakci, mohou být anorganické nebo organické báze. Mohou se tedy použít uhličitany • 9

-26·♦·· 9999

9 • 9 9

9 9 · « · 99*9 9 · ·

9· · ··

9 9 9 · *

9·9 9 9 9

9999 terciárních aminů a alkalických kovů, jako je uhličitan sodný, hydrogenuhličitan sodný, hydrogenuhličitan draselný, uhličitan draselný a uhličitan lithný.

Příklad tautomerů dle předkládaného vynálezu, nacházejících se v rovnováze, jsou sloučeniny vzorce XXIIIA a XXIIIF uvedené níže:

(XXIIIA) (XXIIIF)

Sloučeniny dle vynálezu se mohou převést na farmaceuticky použitelné soli a zřejmé chemické ekvivalenty jako jsou estery a ethery, které předkládaný vynález také zahrnuje. Vynález dále zahrnuje všechny soli a zřejmé chemické ekvivalenty předkládaných sloučenin, které sami o sobě nejsou vhodné jako léčiva, ale mohou se použít jako meziprodukty při přípravě farmaceuticky přijatelných solí a derivátů. Vynález zahrnuje předkládané diketoderiváty a jejich soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech steroizomerních a tautomerních formách. Soli těchto derivátů (např. sodné, draselné, amonné soli) se mohou připravit standardními, obecně známými postupy. Soli, jako například sodné nebo draselné soli, se mohou připravit působením vhodné sodné nebo draselné báze na předkládané sloučeniny.

99

9 9

9

9999 9 999 «· ····

-2799 9

9 9

9 9 9

9 99 9

9 9

9

Estery se mohou například připravit reakcí předkládaných sloučenin s karboxylovými kyselinami za přítomnosti činidel jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC), nebo působením acylačních činidel jako jsou chloridy kyselin na tyto sloučeniny. Další metody pro přípravu esterů jsou uvedeny v literatuře, například v J. March, Advanced Organic Chemistry, 4^th Edition, John Wiley & Sons, 1992.

Ethery se mohou například připravit z mumbaistatinu reakcí s alkylačním činidlem za bazických podmínech. Další metody pro přípravu etheru jsou uvedeny v literatuře, například v J. March, Advanced Organic Chemistry, 4^th Edition, John Wiley & Sons, 1992.

Další zřejmé chemické ekvivalenty zahrnují produkty redukce nebo oxidace nebo adiční produkty jako jsou hydráty. Antrachinonová skupina mumbaistatinu se může například redukovat redukčním činidlem na hydrochinon. Výsledný produkt je účinným inhibitorem glukosa-6-fosfáttranslokázy s IC₅o = ~ 5 nM.

Aktivita glukosa-6-fosfáttranslokázy byla prokázána v několika biochemických testovacích systémech na mumbaistatin. Výtěžek mumbaistatinu z filtrátu kultury Streptomyces litmocidinu je však extrémně nízký, což brzdí další rozvoj této sloučeniny. Navíc, až do teď nebylo možné upřesnit strukturní vzorec mumbaistatinu kvůli počteným faktorům včetně nemožnosti krystalizace a nestálosti v roztoku.

Objevil se však způsob, který umožňuje isolaci mumbaistatinu z extraktu v poměrně vysokém výtěžku. Předkládaný způsob proto poskytuje způsob izolace mumbaistatinu, který zahrnuje extrakci filtrátu kultury obsahující mumbaistatin za použití iontoměničové chromatografie při pH 5 až 8, výhodně 6 nebo 7. Přestože použití iontoměničové chromatografie je obecně zmíněno v PCT/EP99/04127, je zřejmé, že použití iontoměničové chromatografie za účelem zvýšení výtěžku nebylo rozpoznáno. To

44

4 4 4

-28444« 4444

44

4 4 · ♦ ·

4 4

4444 je vidět z příkladů ve shora uvedené patentové přihlášce PCT/ EP99/04127, kde iontoměniče nejsou použity pro izolaci mumbaistatinu a kde se ze 730 litrů filtrátu kultury získá pouze 70 mg čistého mumbaistatinu. Způsob dle předkládaného vynálezu umožňuje isolaci a obohacení mumbaistatinu a mumbaistatinu příbuzných sloučenin za použití iontoměničového procesu, kterým se dosáhne výtěžku alespoň 50 %, obvykleji více než 70 %. Mumbaistatin získané způsobem dle předkládaného vynálezu má vylepšený IC50 = ~ 5 nM ve srovnání s mumbaistatinem získaným dle PCT/EP99/04127.

Ve způsobu izolace mumbaistatinu dle předkládaného vynálezu se mohou použít různé iontoměniče. Příkladem jsou QAE-, DEAE- a THAE- měniče aniontů. Výhodně jsou na zvolené matrici neseny substituované nebo nesubstituované aminoskupiny. Výhodněji je použití DEAE- měničů aniontů jako DEAE ©Sepharose Fast Flow nebo ©Fractogel EMD DEAE. Měniče aniontů se používají známým způsobem. V pufrovém systému se může použít obsah organického rozpouštědla 5 až 85 %. Je však výhodné použití vysokého obsahu organického rozpouštědla v pufrovém systému, výhodné je proto použití obsah 10 až 40 % organického rozpouštědla ve vodném roztoku pufru. Příkladem vohndých organických rozpouštědel jsou organická rozpouštědla mísitelná s vodou, jako jsou nižší alkoholy, aceton, acetonitril, glykol, dioxan, dimethylsulfoxid, formamid a podobně. Výhodná rozpouštědla jsou methanol, ethanol, isopropanol a aceton.

Popsaným způsobem se získává mumbaistatin o čistotě vyšší než 99 % a sloučenina se může obohatit na výtěžek vyšší než 70 %. Výsledný obohacený mumbaistatin se může čistit prostým způsobem, například chromatografií na molekulárních sítech nebo s reverzní fází.

Sloučeniny dle předkládaného vynálezu inhibují krysí jaterní mikrozomální glukosa-6-fosfáttranslokázu. Tyto sloučeniny jsou

·· • to • toto

-29• · • > ···· ···* *· · • · » < · · to • « «··· to·* *· to • to ·* • ·· · ··· · ·«· ·« ···· proto použitelné jako farmaceuticky aktivní substance, zejména při léčbě cukrovky, a obecněji při léčbě nebo profylaxi onemocnění způsobených nebo spojených se zvýšenou aktivitou glukosa-6-fosfát translokázy, nebo onemocnění, při kterých je účelné snížit aktivitu glukosa-6-fosfáttranslokázy. Sloučeniny dle předkládaného vynálezu a jejich farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty se mohou podat zvířatům, výhodné savcům, a zejména lidem, jako samostatná léčiva, jako vzájemné směsi nebo ve formě farmaceutických kompozicí, které dovolují enterální nebo parenterální podání.

Předkládaný vynález se proto týká aromatických diketoderivátů a jejich farmaceuticky použitelných solí, esterů, etherů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů pro použití jako léčiva a použití derivátů a jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a dalších zřejmých chemických ekvivalentů pro výrobu léků snižujících aktivitu glukosa-6-fosfáttranslokázy, zejména pro výrobu léku na léčbu cukrovky. Předkládaný vynález se dále vztahuje na farmaceutické kompozice, které obsahují účinné množství těchto derivátů a/nebo jedné nebo více farmaceuticky přijatelných solí, esterů, etherů a/nebo jejich zřejmých chemických ekvivalentů spolu s farmaceuticky použitelným nosičem.

Sloučeniny dle vynálezu se mohou podávat orálně, intramuskulárně, intravenózně nebo dalšími způsoby podání. Farmaceutické kompozice, které obsahují předkládané sloučeniny nebo jejich farmaceuticky použitelné soli nebo jejich zřejmé chemické ekvivalenty samostatně nebo v kombinacích, se mohou připravit dle standardních technik smísením sloučeniny nebo sloučenin s jednou nebo více farmaceuticky použitelnými přísadami a/nebo pomocnými látkami, jako jsou například plnidla, emulgátory, lubrikanty, maskovací vůně, barviva nebo pufrovací látky, a přeměnou směsi na vhodnou lékovou formu, jako jsou

9

9 9 • *»·· • · ·· «« > * «

-30například tablety, potahované tablety, kapsule nebo suspenze nebo roztok vhodné k enterálnímu nebo parenterálnímu podání.

• · ···· #· »*

V» 99

9 9 · • · ♦

9 9

9999

Příklady pomocných látek a/nebo přísad, které se mohou zmínit, jsou škrob, tragakant, laktosa, talek, agar-agar, polyglykoly, ethanol a voda. Pro parenterální podání jsou vhodné a výhodné suspenze nebo roztoky ve vodě. Je také možné podat aktivní substanci jako takovou bez pojivá nebo ředidla, ve vhodné formě, například v kapsulích. Farmaceutické kompozice obsahující zřejmé chemické ekvivalenty mohou obsahovat další farmaceuticky aktivní složky.

Jak je obvyklé, galenické přípravky, způsob jejich podání a rozsahy dávkování vhodné v daném případě závisí ne léčeném druhu a za stavu příslušných podmínek nebo nemocnění, a mohou se optimalizovat obecně známými metodami. V průměru se denní dávka sloučeniny dle vynálezu pacientu o hmotnosti 75 kg pohybuje mezi nejméně 0,001 mg a nanejvýš 100 mg, výhodně nanejvýš 10,0 mg.

Kromě použití jako farmaceuticky aktivní substance a jako intermediáty při přípravě derivátů se mohou předkládané sloučeniny a jejich soli a zřejmé chemické ekvivalenty použít jako pomocná činidla pro diagnostické účely, například při in vitro diagnózách, a pro výzkumné účely v biochemickém výzkumu, ve kterém je požadována inhibice glukosa-6-fosfáttranslokázy.

Následující příklady blíže ilustrují překládaný vynález, ale nijak neomezují rozsah jeho provedení.

Příklady provedení vynálezu

Zkratky: MeOH methanol, DMSO diemthylsulfoxid, TFA trifluoroctová kyselina

Příklad 1 ·

9 9

9 9 9 • 9 9999

9 9 • 9 9 ·· ·· w 9 » · • · • * • 9 >··· 9999

-31Udržování kultury Streptomyces litmocidini, DSM 11641 ··

9« 9

9 ·

9·»

9 9 •9 9949

Kultura DSM 11641 se udržuje v následujícím médiu

Sladový extrakt 10,0 g

Kvasnicový extrakt 4,0 g

Glukosa 4,0 g

Agarový prášek 13,0 g

Demineralizovaná voda 1,0 litru pH 7,0

Po řádném rozpuštění výše uvedených přísad zahříváním se roztok rozdělí do zkumavek a sterilizuje při 121 °C po 20 minut. Zkumavky se pak ochladí a ponechají ztuhnout ve svažující se poloze. Šikmý agar se poté pruhuje růstem kultury Streptomyces litmocidini, DSM 11641, smyčkou drátu a inkubuje se při 28 °C (± 1 °C) až do pozorování dobrého růstu. Dobře vyrostlé kultury se uloží do lednice při 8 °C.

Příklad 2

Fermentace kultury Streptomyces litmocidini, DSM 11641 ve fermentorech

Část 1: Příprava inokulační kultury v třepačkách

Složení inokulačního média:

Glukosa 15,0 g

Sojová moučka 15,0 g

Kukuřičný výluh 5,0 g

NaCl 5,0 g

CaCO₃ 2,0 g

Demineralizovaná voda 1,0 litru pH 7,0

Shora popsané inokulační médium se rozdělí po 160 ml množstvích do 11 Erlenmeyerových baněk a umístí na 20 minut do autoklávu při 121 °C. Baňky se pak ochladí na teplotu míst-32- .............

nosti a každá baňka se inokuluje jednou plnou smyčkou výše uvedené dobře vyrostlé kultury v příkladu 1 a třepe se na rotační třepačce 72 hodin při 240 ot. · min^-1 při 27 °C (± 1 °C) za vzniku inokulační kultury.

Složení výrobního média:

Glukosa

Sojová moučka

CaCO₃

Chlorid kobaltu Demineralizovaná voda pH

20,0 g 10,0 g 0,2 g 0,001 g 1,0 litru 7,0

Část 2: Příprava inokulační kultury ve fermentorech litrů shora popsaného inokulačního média se sterilizuje in šitu po 45 minut při 121 °C ve 100 litrovém Marubishiho fermentoru, ochladí na 27 °C ± 1 °C a inokuluje 4,5 litry výše uvedené inokulační kultury.

Fermentace probíhá	s následujícími	parametry:
Teplota	27	°C (± 0,5 °C)
Agitace	80	ot. · min¹
Provzdušňování	50	1 · min”¹
Doba sběru	24	hodin

Část 3: Fermentace ve velkém měřítku

700 litrů shora popsaného výrobního média se sterilizuje in šitu po 45 minut při 121 °C v 1000 litrovém Marubishiho fermentoru s přídavkem 150 ml ©Desmophenu (polypropylenoxid) jako činidla potlačujího pěnění, ochladí na 27 °C ± 1 °C a inokuluje 75 litry inokulační kultury z části 2.

Fermentace probíhá s následujícími parametry: Teplota 27 °C (± 0,5 °C) • ·

Třepání

Provzdušňování

Doba sběru ot. · min 450 1 · min'¹40 až 44 hodin

Tvorba sloučeniny se monitoruje měřením inhibice glukosa-6fosfáttranslokázy. Když se fermentace přeruší, pH zákvasu je 6,0 až 7,0. Zákvas se po sběru centrifuguje a mumbaistatin, inhibitor glukosa-6-fosfát translokázy, se izoluje z filtrátu kultury postupem popsaným níže v příkladu 3.

Příklad 3

Izolace mumbaistatinu aniontovou výměnou

Sebere se přibližně 200 litrů zákvasu a oddělí od mycelia (12 kg) odstředěním. Požadovaná sloučenina mumbaistatin se přimárně nalézá ve filtrátu kultury. Filtrát kultury (180 litrů se 120 mg mumbaistatinu) prochází přes sloupec naplněný adsorpční pryskyřicí ©MCI GEL CHP20P (20 cm průměr x 45 cm výška, obsah 14 litrů). Sloupec se eluuje gradientovým způsobem od 120 litrů 0,1% fosfátového pufru, pH 6,3, do 120 litrů 45% roztoku isopropanolu ve vodě. Největší množství mumbaistatinu (102 mg ve 12 litrech) se nachází ve frakci neobsahující sůl, která se eluovala krokem gradientu od 25 do 28 % isopropanolu ve vodě. Výsledný aktivní eluát prochází přes 3 litrový sloupec naplněný DEAE-®Sepharose Fast Flow, který se ekvilibroval na pH 7,0 fosfátovým pufrem. Mumbaistatin se eluoval gradientovým způsobem s 20 % isopropanolu v 0,1% fosfátovém pufru obsahujícím fosforečnan sodný, pH 7,0 jako Apufr a 20 % isopropanolu v 0,1% fosfátovém pufru a 0,25 % NaCl jako B-pufr. Za použití průtoku 50 ml / min se sebere 100 frakcí. Frakce 72 až 74 obsahují 81 mg vysoce obohoaceného mumbaistatinu a frakce 75 dalších 18 mg, které jsou méně čisté. Frakce se spojí a vakuově zahustí. Látka se dále čistí procházením přes sloupec naplněný ®Nucleosil 100-10 CigAB (2,1

-34• · · · · • · · · ♦ · • · · · · · • · · ····· • · · · • ···· ·· * cm χ 25 cm) a eluován při pH 6,3 za použití krokového gradientu 5 až 35 % acetonitrilu v 0,05% pufrovacím roztoku octanu amonného. Sublimační sušení čistých frakcí poskytuje celkem 86 mg (73 + 13 mg) čistého mumbaistatinu ve formě amonné soli.

Sodná sůl mumbaistatinu se připraví rozpuštěním 40 mg amonné soli v 10 ml vody (pH 6,4) a zvýšením vodivosti roztoku chloridem sodným na 12 mS/cm². Výsledný vodný roztok prochází sloupcem ©MCI GEL CHP20P (1 cm široký x 9 cm vysoký) . Eluce probíhá gradientově v systému voda/40 % acetonitril s gradientem vody, průtok eluentu je 5 ml za minutu a objem frakcí je 10 ml. Ve frakcích 16 až 19 se nachází sodná sůl a vyčištěný roztok má pH 8,5. Po sublimačním sušení se získá 32 mg sodné soli mumbaistatinu o čistotě 99 % (měřeno HPLC).

UV maxima, roztok v methanolu:

219	nm,	ε = 33	000,
257	nm,	ε = 19	500,
285	nm,	ε = 19	000,
414	nm,	ε = 5	100.

Inhibice glukosa-6-fosfáttranslokázy z mikrozomů krysích jater vykazuje IC50 5 nM. Inhibice mikrozomální glukosa-6-fosfatázy v 10 μΜ roztoku: aktivita nebyla pozorovatelná. ·

Příklad 4

Produkty methylace mumbaistatinu mg mumbaistatinu získaného dle příkladu 3 se rozpustí v 50 ml vody, ochladí na 0 °C a pH se upraví na 2,8 studenou trifluoroctovou kyselinou (TFA). Ihned poté výsledná směs prochází sloupcem (1 cm x 8 cm) naplněným 5,2 ml ®MCI GEL, CHP20P (75 až 150 μπι) za použití gradientu 0,01 % TFA do 30 % acetonitrilu v 0,01 % TFA jako eluentu. Průtok je 2,5 ml/min. Eluá• · ty se ochladí a frakce obsahující mumbaistatin se přímo zmrazí na -40 °C a lyofilizuje.

Produkt vysušený sublimací (15 mg) se rozpustí v methanolu a methyluje diazomethanem. Po vakuovém zahuštění se reakční směs, obsahující více než deset různých produktů methylace, dělí na sloupci ©LiChrosorb RP18, lOu (velikost 1 cm šířka x 25 cm výška). Jako eluent se používá acetonitrile ve vodě, 5 až 55 %. Frakce se spojí, ochladí a udržují v chladu až do následného zpracování. Frakce se vakuově zahustí. Frakce 19 obsahuje mumbaistatin monomethylether dimethylester vzorce XVIIIA, který má molekulovou hmotnost 590. Charakteristická NMR data jsou uvedena výše v tabulce 3. Inhibice glukosa-6fosfáttranslokázy 3 μΜ roztokem: 42 %.

Sloučenina vzorce XIXB se získá z frakce 34 po vakuovém zahuštění za chladu. Rentgenstrukturní data jsou uvedena výše v tabulce 1. Existují diasteromery S,R,R a S,S,S uvedené výše. Inhibice glukosa-6-fosfáttranslokásy: IC50 > 100 μΜ.

Frakce 26 po uskladnění obsahuje tetramethylderivát mumbaistatinu vzorce XIXC. Odpovídající ¹H a ¹³C NMR data jsou ve výše uvedené tabulce 2.

Příklad 5

Mumbaistatinhemiketalamid (Vzorec 23a) ml koncentrovaného vodného roztoku amoniaku se po kapkách v argonové atmosféře přidá při 0 °C za míchání k roztoku 10 mg mumbaistatinu v 1 ml methanolu. Směs se míchá při této teplotě hodiny a roztok se poté vakuově odpaří. Získá se 10 mg mumbaistatin amidu ve formě béžového prášku. Molekulová hmotnost (548, M+H⁺) se určí electron spray hmotnostní spektrometrií odpovídá chemickému vzorci C28H21NO11.

^XH NMR (500 MHz, DMSO-d₆) : 5 = 7,8 (d, 1 Η) , 7,75 (t, 1 Η) , • 9 ···· ··· · • · · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9

7,35 (m,	1	H), 7,25 (s, 1 H), 6,85 (t, 1 Η) , 6,55	(d, 1	Η) ,
3,85 (m,	1	H), 2,2 až 2,35 (m) , 2,05 (m, 1 Η) , 1,8	(m, 1	h),
1,2 až 1,	4	(m) ppm.

Mumbaistatin amid vzorce 23a inhibuje glukosa-6-fosfáttranslokázu s IC₅o = ~ 1 μΜ.

Příklad 6

Výroba mumbaistatinlaktondiketalmonomethylesterů mg mumbaistatinu získaného v příkladu 3 se rozpustí v 1 ml absolutního methanolu, reaguje s 0,1 % vodnou TFA a ponechá se stát při teplotě místnosti 5 hodin. Produkt reakce se čistí preparativní chromatografií dle popisu v příkladu 3 a po sublimačním sušení aktivní frakce obsahují 7 mg mumbaistatin lakton monomethylesteru (vzorec XIXA). Molekulová hmotnost sloučeniny byla 544 Da (ESI-MS).

Claims

JSX>D

-37- • · *· • · · · 9 9 9 9 • · * · • · · • * · e ·· · · ·· * ·· ·· • · · · · · • · · · · * ····«·· · · • · · · · ·· · ······ P A Τ E N T c V É N Á R O K Y 1. Sloučenina obecného vzorce I ^Kh Λ ty ^6 Λ R4 (I) kde R₄, R₅, Rg a R7 jsou nezávisle na sobě atom vodíku, hydroxylové skupina, atom halogenu, popřípadě substituovaná

alkylová, arylová nebo acylová skupina, X-alkylová nebo Xarylová skupina, kde X je atom kyslíku, NH skupina, N-alkylová skupina nebo atom síry,

K je skupina obecného vzorce II nebo III uvedeného níže;

x₅ x_?r₂ x₇

II⁵/ X I^{2 2} II⁷ c-t-CH4t- ch-Cbk-C-X.R.

51 \ 53 4 Z 64 56 Z 57 11 (II) r₂x₂

-CH_rC—X₁R₁ (III)

L je skupina obecného vzorce IV nebo V uvedeného níže:

X. nebo X_fiIi4 5 γν-ηcyklus

-X₃R₃ (IV) (V) • · 4 • 4 4

4 4 4 4 • · ·· • * · ·

4 4

4· 4444

-38• 44

4· · nebo Κ a L tvoří, spolu s odpovídajícími atomy uhlíku, ke kte rým se váží, skupinu obecného vzorce VI, VII nebo VIII uvede nou níže:

(VI) (VIII) kde

Ri a R₃ jsou nezávisle na sobě kation, nebo arylová skupina, atom vodíku, alkylová

R₂ je atom vodíku, alkylová, arylová nebo acylová skupina • 9

9999 99··

-3999 · ·· ·· « * · 9 9 9»

9 9 9 9 9 · ·

9 9 9999 ♦ 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • 9 9 99 9999

Xi, X₂, X3, X₄, X5, X₆ a X7 jsou nezávisle na sobě atom kyslíku, NH skupina, N-alkylová skupina nebo atom síry a cyklus je, spolu s atomy uhlíku označenými „c a „d, popřípadě substituovaný nasycený, částečně nenasycený nebo aromatický, karbocyklický nebo heterocyklický, jednoduchý nebo kondenzovaný kruhový systém, s výjimkou sloučeniny, ve které K je skupina vzorce II a L je skupina vzorce IV, ve kterých Xi, X₂, X3, X₄, X5, Χβ a X7 jsou atomy kyslíku, R_x, R₂ a R3 jsou atomy vodíku, R₄ je hydroxylová skupina, R5, Rg, a R? jsou atomy vodíku, a cyklus je 3,8dihydroxyantrachinon, a sloučeniny, ve které K a L tvoří skupinu vzorce VI, ve které X_x, X₂, X₃, X₄, X₅, Xg a X₇ jsou atomy kyslíku, Ri je methylová skupina, R₂ a R₃ jsou atomy vodíku, R₄je hydroxylová skupina, R₅, R₆ a R₇ jsou atomy vodíku a cyklus je 3,8-dihydroxyanthrachinon, a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.
2. Sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce IX

FL

FL (IX) kde

M je skupina vzorce X *⁷ ^CH24r^CH“^CH2“^C-^X1^R1 (X) * · * to · • · · · to

-40a N je skupina vzorce (XI)

-X₅R₃ nebo M a N tvoří, spolu s atomy skupinu vzorce XII, »· »·«· (XI) uhlíku, ke kterým se váží, (XII) která se váže přes atom uhlíku označený „e,

O je skupina vzorce XIII *6 (XIII) (XIV) ke kterým se váží, skupinu

Λ Λ cyklus ' a P je skupina vzorce XIV,

-X₅R₂ nebo O a P tvoří, spolu s uhlíky, vzorce XV, x_c (XV) která se váže přes atom uhlíku označený „f, a kde Ri až R₇, Χχ až X₇, cyklus, c a d mají význam uvedený v nároku 1, a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další

-41· ·· ·♦ « · · « » t » • 9 « · · · * * · ·»···*· · · • · · ♦ · » «· · ···«·♦ • · ·· • ♦ * · • · • · • · • * · * * · « · zřejmé chemické ekvivalenty ve všech stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.

Sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce XVIII (XVIII) kde R_x až R₇, Xi až X₇, cyklus, c a d máji význam uvedený v nároku 1 a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech svých stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.
4. Sloučenina obecného vzorce I definovaná podle nároku 1 nebo sloučenina obecného vzorce XVIII definovaná podle nároku 3, kde Ri, R₂ a R₃ jsou alkylové skupiny.
5. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce XVIII definované v nároku 4, vyznačující se tím, že se reaguje sloučenina vzorce XVIII, kde Ri, R₂ a/nebo R₃ jsou atomy vodíku, s alkylačním činidlem a izoluje se reakční produkt.
6. Sloučenina definovaná v nároku 1 nebo v nároku 2 obecného vzorce XIX

42• 9

9 99 9 9999

X.

R, ‘6 cyklus (xix) kde

Ri, R₄ až R₇, Xi áž X₇, cyklus, c a d mají význam definovaný v nároku 1, a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech svých stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.
7. Sloučenina obecného vzorce XIX definovaná v nároku 6, kde Ri je alkylová skupina a R₄ je hydroxylová skupina nebo alkoxyskupina .
8. Způsob přípravy sloučeniny definované v nároku 6, vyznačující se tím, že se reaguje roztok sloučeniny vzorce XIX, kde Ri je atom vodíku a R₄ hydroxylová skupina, s alkylačním činidlem a izoluje se reakční produkt.
9. Způsob přípravy sloučeniny definované v nároku 7, vyznačující se tím, že se reaguje roztok sloučeniny vzorce XIX, kde Ri je atom vodíku a R₄ je hydroxylová skupina, v alkylalkoholu s kyselinou a izoluje se reakční produkt.
10. Sloučenina obecného vzorce XX definovaná v nároku 1 nebo v nároku 2

9 9

99 ·· • 9 9 9

9 9

9 9 9

9 ·

9999 9999 • · · · 9 (XX) kde Ri až R₇, Χχ až X₇, cyklus a c a d mají význam uvedený v nároku 1, a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech svých stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.
11.

Sloučenina obecného vzorce XXI definovaná v nároku 1 (XXI) kde

Ri až R₇, Χχ až X₇, cyklus, c a d mají význam uvedený v nároku 1, a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech svých stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.
12. Sloučenina obecného vzorce XXII podle nároku 1 • ·

4 4 »44· 4444

44 44 • 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 (XXII) kde Χχ až X₇, R_x až R₇, cyklus, c a d mají význam uvedený v nároku 1, a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech svých stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.
13. Sloučenina obecného vzorce XXII definovaná v nároku 12, kde Ri až R₇ jsou atomy vodíku, X₃ je NH skupina a R₄ je hydroxylová skupina.
14. Sloučenina definovaná v nároku 1 nebo nároku 2 obecného vzorce XXIV kde (XXIV) • 9 4

4 9 4 • » « 4 * ·

44 4444

4 9 * 4 · · 4 9 4

Ri až R₇, Xi až X₇, cyklus, c a d mají význam uvedený v nároku 1, a její farmaceuticky použitelné soli, estery, ethery a další zřejmé chemické ekvivalenty ve všech svých stereoizomerních a tautomerních formách a jejich směsi v libovolném poměru.
15. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce XVIII, XXII nebo XXIV definovaných v nárocích 3, 12 nebo 14, kde -X3R3 je -NH₂ skupina, vyznačující se tím, že se reaguje sloučenina vzorce XVIII, XXII nebo XXIV, kde -X3R3 je hydroxylová skupina, se zdrojem amidu.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že sloučeninou vzorce XVIII je mumbaistatin.
17. Sloučenina definovaná v kterémkoli z nároků 1 až 4, 6, 7, 10 až 14, kde jedna nebo více skupin Χχ až X₇ jsou atomy kyslíku.
18. Sloučenina definovaná v kterémkoli z nároků 3, 4, 6, 7, 10 až 14, 17, kde na atomu uhlíku označeném hvězdičkou je konfigurace S a neuplatňuje se výjimka uvedená v nároku 1.
19. Sloučenina definovaná v kterémkoli z předcházejících nároků, kde cyklus je vybrán z následujících skupin: popřípadě substituovaný fenyl, benzyl, naftyl, fenantren nebo antrachinon.
20. Sloučenina definovaná v nároku 19, ve které cyklus je popřípadě substituován jednou nebo více hydroxylovými skupinami, alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku, -0alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 3 atomy uhlíku, aminoskupinami, nitroskupinami, atomy halogenů, -NH-alkylovými skupinami obsahujícími v alkylové části 1 až 4 atomy uhlíku, karboxyskupinami nebo kyanoskupinami.
21. Sloučenina definovaná v nároku 19 nebo 20, kde cyklus je 3,8-dihydroxyantrachinon.

4 4 4

4 4 • 4

4 « »

4 4 4 4

4 4444 4 4 • 4

4 4 4*44
22. Sloučenina definovaná v kterémkoli z přecházejících nároků nebo její farmaceuticky použitelná sůl pro použití jako léčivo
23. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny definované v kterémkoli z nároků 1 až 4, 6, 7, 10 až 14, 17 až 22 nebo její farmaceuticky použitelné soli, a farmaceuticky použitelný nosič.
24. Sloučenina definovaná v kterémkoli z nároků 1 až 4, 6, 7, 10 až 14, 17 až 22 nebo její farmaceuticky použitelná sůl pro použití jako inhibitor glukosa-6-fosfáttranslokázy.
25. Sloučenina definovaná v kterémkoli z nároků 1 až 4, 6, 7, 10 až 14, 17 až 22 nebo její farmaceuticky použitelná sůl pro použití při léčbu cukrovky.