CZ15896A3

CZ15896A3 - Process for preparing and isolation of 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid, recombinant dna vector and host cell

Info

Publication number: CZ15896A3
Application number: CZ96158A
Authority: CZ
Inventors: Roelof Ary Lans Bovenberg; Bertus Pieter Koekman; Andreas Hoekema; Der Laan Jan Metske Van; Jan Verweij; Vroom Erik De
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1996-06-12
Also published as: CZ285604B6; US5726032A; BR9407108A; SK282624B6; ATE277187T1; CN1103814C; DE69434023D1; CA2168431A1; WO1995004148A1; CN1128045A; HUT75377A; HU219259B; KR100336174B1; PL312746A1; PL180799B1; SK9796A3; HU9600194D0

Description

Způsob výroby a izolace 7-aminodesacetoxycefalosporanov^ kyseliny, rekombinantní DNA vektor a hostitelská buňka

Oblast techniky

Vynález se týká biosyntetického způsobu výroby a izolace 7-aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny (7-ADCA). Dále se vynález týká rekombinantního DNA vektoru obsahujícího DNA kódující expandaštra hostitelné buňký transformované tímto vektorem.

Dosavadní stav techniky β-Laktamová antibiotika tvoří nejdůležitější skupinu antibioticky účinných sloučenin s dlouhou historií klinického používání. Prominentními typy antibiotik spadajících do této skupiny jsou peniciliny a cefalosporiny. Tyto sloučeniny jsou v přírodě produkovány vláknitými houbami Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum.

Za použití klasických technik zlepšování produkčních kmenů se v posledních desetiletích dramaticky zvýšila úroveň produkce antibiotik v Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum. Zvyšující se znalosti biosyntetických drah vedoucích k penicilinům a cefalosporinům a zavedení technologie rekombinace DNA představují nové prostředky pro zlepšování produkčních kmenů a pro in vivo derivatizaci požadovaných sloučenin.

Byla identifikována většina enzymů podílejících se na biosyntéze β-laktamu a jim odpovídající geny byly klonovány [srovnej např. Ingolia a Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245 až 264 (biosyntetická dráha a enzymy) a Aha2 ronowitz, Cohen a Martin, Ann. Rev. Microbiol., 46 (1992), str. 461 až 495 (klonování genu)].

První dva stupně biosyntézy penicilinu v P. chrysogenum zahrnují kondenzaci tří aminokyselin: L-5-amino-5, karboxypentanové kyseliny (L-a-aminoadipové kyseliny) (A), _ .......L-cyateinu-MCi-a-L-valinu (y) , za vzniku tripeptidu vzorce

LLD-ACV, po níž následuje cyklizace tohoto tripeptidu na isopenicilin N. Tato sloučenina obsahuje typickou β-laktamovou strukturu. Třetí stupeň zahrnuje výměnu hydrofilního postranního řetězce L-5-amino-5-karboxypentanové kyseliny zá hydrofobní postranní řetězec působením enzymu acyltransferasy (AT). Při průmyslovém způsobu výroby penicilinu G se jako postranního řetězce účelně používá zbytku fenyloctové kyseliny (PA). V EP-A-0 532 341 je popsáno použití adipátové (5-karboxypentanoátové) suroviny. Inkorporace tohoto substrátu vede k derivátu penicilinu s 5-karboxypentanoylovým postranním řetězcem, tj. k 5-karboxypentanoyl-6-aminopenicilanové kyselině. Tato inkorporace je důsledkem skutečnosti, že acyltransferasa vykazuje širokou substrátovou specificitu [Behrens et al., J. Biol. Chem. 175 (1948), str. 751 až 809; Cole, Process Biochem. 1 (1966) str. 334 až 338; Ballio et al., Nátuře 185 (1960), str. 97 až 99]. Enzymatická výměnná reakce zprostředkovaná acyltransferasou se uskutečňuje uvnitř buněčné organely, tj. mikrotělesa (viz EP-A-0 448 180).

Cefalosporiny jsou podstatně nákladnější než peniciliny. Jedním z důvodů je, že některé cefalosporiny (jako například cefalexin) se vyrábějí z penicilinů řadou chemických konverzí. Druhým důvodem je, že až dosud bylo možno fermentovat pouze cefalosporiny s D-5-amino-5-karboxypentanoylovým postranním řetězcem. Cefalosporin C, až dosud nejdůležitější výchozí látka pro tyto účely, je velmi rozpustný ve vodě při jakékoliv hodnotě pH, což vyvolává potřebu zdlouhavých a nákladných izolačních postupů, při nichž je nutno používat neobratných a nákladných sloupcových technologií. Cefalosporin C získaný takovým způsobem je nutno převádět na terapeuticky použitelné cefalosporiny .řadou chemických a enzymatických konverzí.

Meziprodukt,7-ADCA se v současné době vyrábí chemickou derivatiziací penicilinu G. Potřebné chemické stupně pro výrobu 7-ADCA zahřríují rozšíření pětičlené kruhové struktury penicilinu na šestičlennou kruhovou strukturu cefalosporinu. Takové rozšíření kruhu může zajistit enzym expandasa z vláknité bakterie Streptomyces clavuligerus.

Po zavedení do P. chrysogenum může tento enzym převést penicilinovou kruhovou strukturu na cefalosporinovou kruhovou strukturu, jak je to popsáno v Cantwell et al., Proč. R. Soc. Lond. B. 248 (1992) str. 283 až 289 a v EP-A-0 532 341 a EP-A-0 540 210. Enzym expandasa byl dobře charakterizován (EP-A-0 366 354) jak biochemicky, tak funkčně, podobně jako jemu odpovídající gen. Byly popsány fyzikální mapy genu cefE (EP-A-0 233 715), sekvence DNA a transformační studie v P. chrysogenum za použití cefE.

Dalším zdrojem vhodného enzymu pro rozšíření kruhu je vláknitá bakterie Nocardia lactamdurans (dříve označovaná názvem Streptomyces lactamdurans). Byly popsány, jak biochemické vlastnosti tohoto enzymu, tak sekvence DNA příslušného genu (Cortés et al., J. Gen. Microbiol., 133 (1987), str. 3165 až 3174? a Coque et al., Mol. Gen. Genet, 236 (1993), str. 453 až 458).

V přihlášce EP-A-0 532 341 je konkrétněji popsáno in vivo použití enzymu expandasy v P. chrysogenum v kombinaci s 5-karboxypentanoylovým postranním řetězcem, jako surovinou tvořící substrát pro acyltransferasu v P. chrysogenum. Přitom vzniká 5-karboxypentanoyl-6-APA, která se převádí enzymem expandasou zavedeným do kmene P. chrysogenu na 5-karboxypentanoyl-7-ADCA. Nakonec se navrhuje odštěpit

5-karboxypentanoylový postranní řetězec za vzniku 7-ADCA, jako konečného produktu.

V patentové přihlášce EP-A-0 540 210 je popsán podobný způsob výroby 7-ACA, který zahrnuje přídavné stupně konverze 3-methylového postranního řetězce kruhu ADCA na 3-acetoxymethylový postranní řetězec ACA.

V posledně citovaných dvou patentových přihláškách však není popsán výkonný a ekonomicky účinný postup, poněvadž nebyl vyřešen především problém včasné exprese enzymu expandasy v buňkách současně s expresí enzymu acyítransfera sy.

Naproti tomu způsob podle vynálezu představuje účinný postup výroby 7-ADCA, při němž se expandasa exprimuje současné s acyltransferasou.

Kromě toho je podle vynálezu navrhován nový prekursor postranního řetězce, tj. 3'-karboxymethylthiopropionová kyselina. Tento prekursor se do odpovídajících penicilinů, jejichž kruh má být rozšířen následným působením enzymu expandasy, velmi účinné zavádí pomocí P. chrysogenum.

Kromě toho nebyl až dosud popsán žádný efektivní způsob izolace derivátů 7-ADCA z fermentační půdy před jeho deacylací. Vynález zahrnuje účinný způsob rozpouštědlové extrakce pro získání derivátu 7-ADCA.

Vynález představuje skutečně účinný integrální způsob výroby 7-ADCA, který zahrnuje reakční stupně, jež dosud nebyly publikovány, ani navrženy v dosavadním stavu techniky.

Za použití tohoto vynálezu lze v analogii k popisu uvedenému v _EP~A-0 540 .210.....vyrábět, účinným.-způsobem._také_—_

7-ACA.

Přehled obr, na výkresech

					·’ .
Na	obr.	1	je	znázorněna	funkční	mapa	plasmidu	pMcTNE.
Na	obr.	2	je	znázorněna	funkční	mapa	plasmidu	pMcTSE.
Na	obr.	3	je	znázorněna	funkční	mapa	plasmidu	pMcTNde.
Na	obr.	4	je	znázorněna	funkční	mapa	plasmidu	pGNETA.
Na	obr.	5	je	znázorněna	funkční	mapa	plasmidu	pGSETA.
Na	obr.	6	je	znázorněna	funkční	mapa	plasmidu	pANETA.
Na	obr.	7	je	znázorněna	funkční	mapa	plasmidu	pASETA.
Na obr. 8 je znázorněna lactamdurans cefE (Coque et al., (spodní řádky) uvedená v zákrytu	sekvence DNA výše uvedená pod sekvencí	Nocardia citace) PCR produktu

(vrchní řádky).

Krátký popis seznamu sekvencí

Sekvence 1 až 13 (SEQ ID NO: 1 až 13) představují oligonukleotidy použité pro konstrukci expresní kazety P. chrysogenum pro geny cefE Streptomyces clavuligerus a Nocardia lactamdurans.

Sekvence 14 (SEQ ID NO: 14) představuje sekvenci DNA cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., výše uvedená citace).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob výroby a izolace 7-aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny, 7-ADCA, jehož podstata.spočívá _; v tom, že se............... . ,,,______________

a) kmen Penicillium chrysogenum transformuje genem expandasy za transkripční a translační regulace expresních signálů vláknité houby?

b) kmen se fermentuje v kultivačním médiu, do něhož se přidá 3'-karboxymethylthiopropionová kyselina nebo její sůl nebo ester vhodná pro získání 2-(karboxyethylthio) acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-6-aminopenicilanové kyseliny, tj. 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-6-APA, přičemž kruh v posledně uvedených látkách se in šitu rozšíří za vzniku 2-(karboxyethylthio) acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA;

c) z fermentační půdy se izoluje 2-(karboxyethylthio) acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA;

d) 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA se deacyluje; a

e) izoluje se krystalická 7-ADCA.

Stupeň e) je přednostně filtračním stupněm.

Exprese genu expandasy je přednostně trankripčně a translačně regulována příslušnými kontrolními prvky AT-genu což zajištuje současnost exprese těchto genů.

Přednostně se 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA izoluje z fermentační půdy extrakcí filtrátu této půdy organickým rozpouštědlem, které je nemísitelné s vodou při pH nižším než asi 4,5 a reextrakcí vzniklého extraktu vodou při pH v rozmezí od 4 do

10.

Předmětem vynálezu je dále také rekombinantní DNA vektor obsahující DNA kódující expandasu, která je funkčně připojena k transkripčním a translačním kontrolním prvkům AT-genu gpdA z P. chrysogenum nebo nebo Á. nidulans. Předmětem vynálezu jsou dále také hostitelské buňky transformované tímto vektorem.

Následuje podrobnější popis tohoto vynálezu.

Vynález se opírá o použití funkčních genových konstruktů v P. chrysogenum pro in vivo rozšiřování kruhové struktury penicilinu v kombinaci s použitím nového substrátu pro biosyntetické enzymy, za účelem získání derivátu klíčového meziproduktu při biosyntéze cefalosporinu, kterým je 7-aminodesacetoxycefalosporanová kyselina, tj. 7-ADCA. Tento derivát má chemické složení umožňující účinnou rozpouštědlovou extrakci, která představuje ekonomicky atraktivní způsob izolace.

Transformace P. chrysogenum může být v zásadě prováděna různými způsoby zavádění DNA, jako je přijímání protoplastů zprostředkované PEG-Ca, elektroporace nebo ostřelování s následující selekcí transformantů [viz například Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, v Aplied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). Bylo též popsáno použití dominantních a nedorainantních selekčních markérů (Van den

Hondel, výše uvedená citace). Byly popsány jak selekční markéry homologického původu (získané z P. chrysogenum), ta selekční markéry heterologického původu (získané z jiných zdrojů než z P. chrysogenum).

Použití různých homologických a heterologických markérů pro-selekci transformantů za přítomnosti nebo nepřítomnosti vektorových sekvencí, které jsou fyzikálně připojeny nebo které nejsou připojeny k neselektovatelné DNA, je při selekci transformantů dobře známo.

Pro selekci transformantů P. chrysogenum se přednostně používá homologického selekčního markéru, aby se omezilo množství heterologické DNA zavedené do Penicillium chrysogenum. Největší přednost se dává použití dominantního selekčního markéru, který lze selektivně odstranit z transformovaného kmene, například genu amdS z A. nidulans nebo jiné vláknité houby (viz evropská patentová přihláška č. 94201896.1). Tyto přednostní vlastnosti selekčního markéru z transformantu Penicillium chrysogenum jsou velmi prospěšné při postupech monitorování procesu a registrace produktu, poněvadž se na nich nepodílejí žádné markéry resistence vůči antibiotikům a nemůže tedy dojít k jejich uvolňování do životního prostředí.

Provedení, kterému se dává největší přednost, zahrnuje selekční markér amdS, který lze selektivně z kmene odstraňovat a který umožňuje donekonečna opakovat transformační cykly za použití stejné dominantní selekce. Okolnost, že nové kmeny P. chrysogenum exprimující expandasu neobsahují selekční markéry, má rozhodující význam pro rychlý vývoj vysoce produkčních kmenů v rámci programu zlepšování průmyslových kmenů.

Enzym expandasa zprostředkující reakci spojenou s rozšířením kruhu se zavádí a exprimuje v P. chrysogenum, například ve kmeni Wisconsin 54-1255. Toto rozšíření kruhu se také provádí v mutantech vykazujících zlepšený výtěžek β-laktamu. Je zřejmé, že v posledně uvedeném případě je zapotřebí podmínky média mírně přizpůsobit pro dosažení účinného růstu.

Kromě toho, gen cefE se umístí pod transkripční a translační kontrolu příslušných kontrolních elementů genu vláknité houby,, předňqsitně získaných z-genu acyltransferasy (AT z P. chrysogenum), což umožňuje jeho expresi v optimálním časovém rámci, přičemž tato exprese je synchronizována se samotným působením acyltransferasy. Tato opatření mají rozhodující význam pro účinnost rozšiřování kruhu v molekule penicilinu.

Kromě synchronizované exprese genů kódujících expandasu a acyltransferasu může být pro vývoj ekonomického produkčního procesu důležitá intracelulární ko-lokalizace části enzymu expandasy s acyltransferasou v mikrotělesech (intracelulární umístění acyltransferasy). Při těchto přednostních provedeních se nesmírně sníží množství penicilinových vedlejších produktů, které nejsou registračními úřady tolerovány ve výsledném produktu 7-ADCA.

V krátkosti lze shrnout, že vynález učí jak lze akvitity enzymu expandasy zavedeného do P. chrysogenum využít k rozšiřování penicilinového kruhu za podmínek synchronizované exprese.

Podle tohoto vynálezu se vyrábějí β-laktamové meziprodukty 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio) propionyl-7-ADCA v P. chrysogenum tak, že se přidá 3-karboxymethylthiopropionová kyselina nebo její sůl nebo ester.

Jako vhodné soli lze například uvést soli sodné a draselné. Tyto látky se účinné regenerují z produkčního média jednodu chou rozpouštědlovou extrakcí, která se provádí například takto:

Půda se přefiltruje a k filtrátu se přidá organick rozpouštědlo, které je nemísitelné s vodou.. Přizpůsobí se , hodnota pH, aby se cefalosporin extrahoval z vodné vrstvy. Hodnota pH musí být nižší než 4,5 a přednostně by měla leže v rozmezí od 4 do 1, zvláště výhodně od 2 do 1. Přitom se cefalosporin oddělí-'ód·-mnoha jiných néčiátot, které jsou přítomny ve fermentační půdě. Přednostně se používá malého objemu organického rozpouštědla, takže vzniká koncentrovaný roztok cefalosporinu. Při tom lze snížit objemové rychlosti průtoku. Druhou možnost představuje úplná extrakce půdy při pH 4 nebo nižší. Přednostně se půda extrahuje při pH v rozmezí od 4 do 1 organickým rozpouštědlem, které je nemísitelné s vodou.

Může se použít jakéhokoliv rozpouštědla, které neinterferuje s molekulou cefalosporinu. Jako vhodná rozpouštědla je možno uvést například butylacetát, ethylacetát, methylisobutylketon, alkoholy, jako je butanol atd. Přednostně se používá 1-butanolu nebo isobutanolu.

Cefalosporin se potom reextrahuje vodou při pH v rozmezí od 4 do 10, přednostně od 6 do 9. Iv tomto případě se drasticky sníží konečný objem. Izolace se může provádět při teplotách v rozmezí od 0 do 50’C, přednostně při teplob okolí.

Na takto získaný vodný roztok cefalosporinu se působí vhodným enzymem, aby se odstranil 2-(karboxyethylthio) acetylový a 3-(karboxymethylthio)propionylový postranní řetězec a aby se získala požadovaná 7-ADCA.

Přednostně se používá immobilizovaného enzymu, aby bylo možno používat enzym opakovaně. Způsoby výroby takových částic a imobilizace enzymů jsou důkladně popsána v EP-A-0 222462. Hodnota pH vodného roztoku je například 4 až 9. Za těchto podmínek je degradace cefalosporinu minimalizována a je optimalizována požadovaná enzymatická konverze. Enzym se tedy přidá k vodnému roztoku cefalospgrinu._za. současného__________ _ udržování hodnoty pH na vhodné úrovni, například přidáváním anorganické báze, jako je roztok hydroxidu draselného nebo za použití katexové pryskyřice. Po skončení reakce se imobilizovaný enzym odfiltruje. Další možnost spočívá v použití imobilizovaného enzymu v koloně s pevným nebo fluidizovaným ložem nebo v použití roztoku enzymu. V posledně uvedeném případě se produkty oddělují membránovou filtrací. Potom se reakční směs okyselí za přítomnosti organického rozpouštědla, které je nemísitelné s vodou.

Vhodné enzymy například pocházejí z mikroorganismu Pseudomonas SY77 (mutace v jedné nebo více poloh 62, 177,

178 a 179). Může se také použít enzymů z jiných mikroorganismů přednostně Pseudomonas SE83, které popřípadě vykazují mutaci v jedné nebo více z poloh odpovídajících polohám 62, 177, 178 a 179 v Pseudomonas SY77.

Po nastavení hodnoty pH na asi 0,1 až 1,5 se oddělí vrstvy a pH vodné vrstvy se nastaví na 2 až 5. Nakonec se krystalická 7-ADCA odfiltruje.

Deacylace se také může provádět chemicky za použití způsobů známých z dosavadního stavu techniky, například přes tvorbu iminochloridového postranního řetězce (tato reakce se provádí tak, že se přidá chlorid fosforečný při teplotě nižší než 10’C a potom isobutanol při teplotě okolí nebo při teplotě nižší).

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Uvedené příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vvnálezu

........ ______ .. .Ρ ř..í k Lad.......1........ .....

Exprese genů cefE Streptomyces a Nocardia v Penicillium chrysogenum

a. Obecné postupy klonování genu a transformace genu

Při postupu podle vynálezu se používá obvyklých technik klonování genu. Tyto techniky zahrnují řetězové reakce katalyzované polymerasou (PCR), syntézu oligonukleotidu, stanovení sekvence nukleotidů v DNA, enzymatickou ligací a restrikci DNA, subklonování vektoru E. coli, transformaci a selekci transformantů, izolaci a purifikaci DNA, charakterizaci DNA analýzou Southern blot a próbami značenými ³²P, ³²P značení DNA náhodným primováním. Tyto techniky jsou velmi dobře známé v tomto oboru a jsou dobře popsány v mnoha literárních citacích (viz například Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academie Press (1990) a McPherson et al., PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).

Obecné postupy použité při transformaci vláknitých hub a selekci transformantů zahrnují přípravu fungálních protoplastů, přenos DNA a vytvoření podmínek pro regeneraci protoplastů, purifikaci tranformantu a jeho charakterizaci. Tyto postupy jsou všechny dobře známy v tomto oboru a jsou dobře dokumentovány v následujících publikacích; Finkelstein and Balí (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, techno13 logy and products, Butterworth-Heinemann (1992)? Bennett and Lasure (Eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academie Press (1991); Turner, v Púhler (ed.), Biotechnology, druhé úplně přepracované vydání, VCH (1992).

Další specifické aplikace klonování genu a technologietransformace.genu do Penicillium chrysogenum jsou velmi dobře dokumentovány ve výše uvedených citacích Bennett a Lasure; Finkelstein a Balí.

- Syn tet ickej? ligonukleotidy-DNA.se syntetizují za použití obchodně dostupného syntetizátoru DNA (Applied Biosystems, CA, USA) podle instrukcí výrobce.

- PCR se provádí za použití obchodně dostupného automatizovaného přístroje pro provádění PCR (Perkin Elmer, USA) a DNA polymerasy Ultma (Perkin Elmer) podle údajů výrobce.

- Použije se protokolu hGC PCR (Dutton et al. , Nucleic Acid Res. 21, (číslo 12) (1993) 2953 až 2954), aby bylo možno amplifikovat kódující oblasti cefE N. lactamdurans a chromosomální DNA S. clavuligerus.

- Restrikční enzymy a jiné enzymy pro modifikaci DNA pocházejí od firmy BRL (MD, USA) a používá se jich v souladu s instrukcemi výrobce.

- Vektor E. coli, pBluescript^^R^ je získán od firmy Stratagene (CA, USA).

- Jiné použité chemikálie jsou v čistotě p.a. a pocházejí od různých dodavatelů.

- Analýza sekvence nukleotidů v DNA se provádí za použití automatizovaného zařízení pro analýzu sekvence DNA (Applied Biosystems), který pracuje na bázi detekce sekvenčně specifického fluorescentního značení. Pracuje se podle instrukcí výrobce.

b. Kultivace mikroorganismů - .......—

Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 se pěstuje v sojovém nálevu Tryptic soy broth (Difco). Chromosomální DNA tohoto kmene se (použije pro izolaci genu cefE (Kovacevitz et al., J. Bacteriol. (1989) 754 až 760).

Také Nocardia lactamdurans ATCC 27382 se pěstuje v sojovém nálevu Tryptic soy broth (Difco). Chromosomální DNA tohoto kmene se použije pro izolaci genu cefE (Coque et al., výše uvedená citace).

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) se pěstuje v úplném médiu YPD (YPD; 1% kvasinkový extrakt, 2% pepton, 2% glukosa). Chromosomální DNA tohoto kmene se použije pro izolaci 5' a 3' regulační oblasti genu penDE, kterých je zapotřebí pro expresi genu cefE. Jako hostitele pro transformační experimenty s genem cefE se také použije Penicillium chrysogenum ATCC 28089. Jiné kmeny Penicillium chrysogenum, včetně mutantů kmene Winconsin 54-1255, poskytujících zlepšené výtěžky β-laktamu, jsou také vhodné. V závislosti na použitém selekčním markéru pro transformanty se může použít kmenů P. chrysogenum obsahujících mutace v genu pyrG, niaD nebo facA. Tyto mutantní kmeny je možno získat metodami, které jsou dobře známé v tomto oboru (Cantoral, Bio/Technol. 5 (1987), 494 až 497; Gouka et al., J. Biotechn. 20 (1991), 189 až 200; a Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514 až 519).

Kultivace P. chrysogenum za účelem získání protoplastů použitých při transformaci se také provádí v médiu YPD.

V tomto oboru je dobře známo, že postupy .tvorby protoplastů a regenerační postupy se mohou mírně lišit v závislosti na konkrétně použitém kmeni )Penicillium._................

chrysogenum a konkrétním postupu selekce transformantů»

Kultura E. coli WK6 (Zeli and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809 až 1815í,~-XLI-Blue (Stratágefíé) a HB 101 (Boyer and Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459; Bolivar and Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) se udržuje a kultivuje za použití standardního kultivačního média pro E. coli (Sambrook, supra).

c. Konstrukce expresních kazet cefE

Expresní kazety cefE jsou uvedeny v tabulce I, v níž je také vysvětleno názvosloví, kterého bylo použito pro označování těchto plasmidů.

Tabulka I

Seznam zkonstruovaných expresních kazet cefE

Legenda:

^tac = hybridní promotor trp-lac ²gpd = 5'-konec genu gpdA z A.

³AT = 3'-konec genu penDE z P.

4AT = 5'-konec genu penDE z P. chrysogenum nidulans chrysogenum

Plasmid	Promotor	Gen	Mikrotělesa -zacílení ..·	Terminátor
pMCTSE	tac¹	S.cla cefE		FdT
pMCTNE	tac	N.lac cefE		Fdt
pGSE	gpd²	S.cla cefE		-
pGNE	gpd	N.lac cefE	zacílení	- m-3 ------- - -·
pGNETA	gpd	N.lac CefE
pGNEWA	gpd	N.lac cefE	Wt	AT
pANETA	AT⁴	N.lac cefE	+ zacílení	AT
pANEWA	AT ' A.	N.lac cefE	Wt. - _	AT
pGSETA	gpd	S.cla cefE	+ zacílení	AT
pGSEWA	gpd	S.cla cefE	Wt	AT
pASETA	AT	S.cla cefE	+ zacílení	AT
pASEWA	AT	S.cla cefE	Wt	AT

Pro zhotovení syntetických oligonukleotidů, jejichž seznam je uveden v tabulce II se použije publikovaných nukleotidových sekvencí: genu cefE z S. clavuligerus (Kovacevitz, výše uvedená citace), genu cefE z N. lactam“· durans (Coque, výše uvedená citace), genu gpdA z A. nidulans (Punt et al., Gene 69 (1988), 49 až 57) a genu penDE z P. chrysogenum (Barredo et al., Gene 83 (1989) 291 až- 300);

Diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572 až 576.

Tabulkall

Oligonukleotidy použité pro konstrukci expresních kazet P. chrysogenum pro gen cefE z N. lactamdurans a S. clavuligerus

1.	5'-GCT GAA GGA GCT	GAG CCG	CAT ATG ACC-3'	ACG
GAC	GCG	ACC	GTG
2 .	5'-CCC	GGG	TCT	AGA	TCT	AGA	TCA	CCG
	GGC	GGC	GGC	GGT	CTT	CCG	GAT	GTT-3'
3 .	5'-GAT	CAG	TGA	GAG	TTG	CAT	ATG	GAZ
--....... -	-ACG	.ACG	GTG	CCC	ACC	TTC	AGC	CTG-3'
4.	5 ' -CCC	GGG	TCT	AGA	TCT	AGA	CTA	TGC - .
	CTT	GGA	TGT.	GCG	GCG	GAT	GTT·	-3 ^z
5.	5^Z—GAG	CTC	TGT	GAA	TTC	ACA	GTG	ACC '
	GGT'	GAC	TCT	TTC·	-3^Z
6.	5^z-GGG	AGC	CAT	ATG	GAT	GTC	TGC	TCA
	AGC	GGG	GTA	GCT-	-3 ·
7.	5'-AGA	ACG	GAT	TAG	TTA	GTC	TGA	ATT
	CAA	CAA	GAA	CGG	CCA	GAC-	-3 ·
8.	5'-GAC	AGA	GGA	TGT	GAA	GCA	TAT	GTG
	CTG	CGG	GTC	GGA	AGA	TGG·	-3'
9.	5'-ACA	TCA	ACA	TCC	GGA	AGA	CCG	CCG
	CCG	CCC	GGT	GAA	GGC	TCT	TCA	TGA-3'
10.	5'-GGA	CTA	GTG	TCG	ACC	CTG	TCC	ATC
	CTG	AAA	GAG	TTG-	-3'
11.	5'-ACA	TCA	ACA	TCC	GGA	AGA	CCG	CCG
	CCG	CCC	GGC	TTT	GAA	GGC	TCT	TCA-3^Z
12.	5'-TTC	GAT	GTC	AGC	CTG	GAC	GGC	GAG
	ACC	GCC	ACG	TTC	CAG	GAT	TGG	ATC
	GGG	GGC	AAC	TAC	GTG	AAC	ATC	CGC
	CGC	ACA	TCC	AAG	GCA	TGA	AGG	CTC
	TTC	ATG	ACG-	-3 ^z
13 .	5'-GAT	GTC	AGC	CTG	GAC	GGC	GAG	ACC
	GCC	ACG	TTC	CAG	GAT	TGG	ATC	GGG
	GGC	AAC	TAC	GTG	AAC	ATC	CGC	CGC
	ACA	TCC	AAG	CTA	TGA	AGG	CTC	TTC
	ATG	ACG-	-3 '

cl. Konstrukce expresních plasmidů cefE E. coli (pMCTSE a pMCTNE)

PCR, 1: N. lactamdurans cefE

Při první řetězové reakci PCR za použití chromosomální DNAz N. lactamdurans a oligonukleotidů 1 a 2 se získá otevřený čtecí rámec N.lactamdurans cefE ve formě 0,9kb PCR produktu obsahujícího jedinečné restrikční místo Ndel u 5'konce a jedinečné restrikční místo Xbal u 3'-konce.

PCR, 2: S. clavuligerus cefE

Při druhé řetězové reakci PCR za použití chromosomální DNA z S. clavuligerus a oligonukleotidů 3 a 4 se získá otevřený čtecí rámec S. clavuligerus cefE ve formě 0,9kb PCR produktu také obsahujícího jedinečné restrikční místo Ndel i u 5'- konce a jedinečné restrikční místo Xbal u 3'-konce.

Pro účely exprese genů cefE v E. coli a charakte- ΐ rizace PCR produktů DNA sekvenční analýzou se PCR produkty 1 a 2 klonují do vektoru pMCTNde, což je derivát pMC-5 (Stanssens et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Plasmid pMCTNde je odvozen od pMC5-8 (Evropská patentová přihláška č. 0351029) inserci fragmentu kódujícího promotor tac a potom místa RBS a klonovacího místa Ndel (obr. 3).

PCR produkty 1 a 2 se rozštěpí Ndel a Xbal a ligují do Ndel Xbal rozštěpeného vektoru pMCTNde. Ligační smési se použije pro transformaci E. coli WK6. Transformanťy se selektují na resistenci vůči chroramfenikolu. Těchto transformantů se použije pro izolaci plasmidové DNA. Vložená expresní kazeta cefE se nejprve analyzuje štěpením restrikčním enzymem a izolací předvídaných restrikčních fragmentů. Plasmidy obsahující předvídaná místa pro štěpení restrikčním enzymem se nakonec analyzují automatizovanou DNA sekvenční analýzou.

Sekvence DNA otevřeného čtecího rámce S. clavuligerus cefE v plasmidu pMCTSE (viz obr. 2) je ze 100 % identická s publikovanou sekvencí (Kovacevitz, výše uvedená citace)·.

Sekvence DNA (obr. 8) všech analyzovaných klonů obsahujících otevřený čtecí rámec N. lactamdurans cefE je odlišná od publikované^sekvence (Coque, výše uvedená citace) .

Odvozená aminokyselinová sekvence publikovaného genu cefE z N. lactamdurans obsahuje prolin v aminokyselinové poloze 41 (viz SEQ ID NO: 14). Tento prolinový zbytek chybí v klonech, které byly získány při PCR 1. Získaný plasmid je označen názvem pMCTNE (viz obr. 1).

c2. Konstrukce expresních plasmidů P. chrysogenum cefE

PCR, 3: gpdA promotor

Při této třetí PCR za použití DNA z plasmidu pAN7-l (Punt et al., Gene 56 (1987), 117 až 124), který obsahuje gen hph z E. coli pod kontrolou promotoru gpdA z A. nidulans a oligonukleotidy 5 a 6, se získá promotor gpdA ve formě 0,9kb PCR produktu obsahujícího jedinečné restrikční místo EcoRI u 5'-konce a jedinečné restrikční místo Ndel u 3'konce.

PCR, 4: AT promotor

Při čtvrté řetězové reakci PCR za použití chromosomální DNA z P. chrysogenum a oligonukleotidů 7 a 8 se získá l,5kb fragment promotoru AT také obsahující jedinečné restrikční místo EcoRI u 5'-konce a jedinečné restrikční místo Ndel u 3'-konce.

PCR, 5: AT terminátor a 3'-konec genu cefE z N. lactamdurans

Při páté PCR se získá 0,5kb oblast penDE (AT)____ terminátoru za použití chromosomové DNA z P. chrysogenum a oligonukleotidů 9 a 10 či 11 a 10. Tyto PCR produkty tedy obsahují 3'-terminální sekvence genu cefE se signálem pro zacílení mikrotělés'nebo bez ného, které se skládají z Cterminální aminokyselinové sekvence ARL (Muller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210 až 213).

Tyto oligonukleotidy se zkonstruují tak, aby se jedinečné místo BspEI zavedlo k 5'-konci PCR produktu a jedinečné místo Spěl k 3'-konci PCR produktu.

PCR, 6: AT terminátor a 3'-konec genu cefE z S. clavuligerus

Při šesté PCR se získá 0,5kb oblast penDE (AT) terminátoru za použití chromosomové DNA z P. chrysogenum a oligonukleotidů 12 a 10 či 13 a 10. Tyto PCR produkty tedy obsahují 3'-terminální sekvence genu cefE S. clavuligerus se signálem pro zacílení mikrotělés nebo bez něho, které se skládají z C-terminální aminokyselinové sekvence SKL (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657 až 669).

Tyto oligonukleotidy se zkonstruují tak, aby se jedinečné místo BglI zavedlo k 5'-konci PCR produktu a jedinečné místo Spěl k 3'-konci PCR produktu.

Aby se dosáhlo exprese genů cefE v P. chrysogenum, liguje se fragment promotoru gpdA a fragment promotoru AT k fragmentům cefE z plasmidů pMCTNE a pMCTSE. Tyto ligované fragmenty se klonují do vektoru pBluescript II KS.

Produkt PCR 3 se štěpí EcoRI a Ndel. Plasmidy pMCTNE a pMCTSE se štěpí Ndel a Xbal. Tyto restrikční fragmenty se oddělí elektroforézou na agarosovém gelu. 0,9kb Fragmenty kódující cefE se purif ikují_.na agarosovém. gelUL. Promotorovy fragment EcoRI“Ndel se liguje s fragmenty cefE Ndel-Xbal do vektoru pBluescript II KS štěpeného EcoRI-Xbal. Tak se získají plasmidy pGSE a pGNE.

Pro dosažení optimální exprese genů cefE v P. chrysogenum byl zvolen přístup, při němž se AT terminační signální sekvence klonuje za geny cefE v expresních plasmidech Penicillium uvedených výše.

pGNETA-pGNEWA

Produkty PCR 5 se štěpí BspEI a SpEI a ligují do vektoru pGNE rozštěpeného BspEI a SpEI. Ligačních směsí se použije pro transformaci E. coli HB101. Transformanty se selektují na základě resistence vůči ampicilinu. Plasmidy izolované z těchto transformantů se charakterizují analýzou restrikčních fragmentů a později DNA sekvenční analýzou. Tak se získají plasmidy pGNEWA a pGNETA (obr. 4).

pGSETA-pGSEWA

Produkty PCR 6 se štěpí BglI a SpEI a ligují do vektoru pGSE rozštěpeného BglI a SpEI. Ligačních směsí se použije pro transformaci E. coli HB101. Transformanty se selektují na základě resistence vůči ampicilinu. Plasmidy izolované z těchto transformantů se také charakterizují analýzou restrikčních fragmentů a později DNA sekvenční analýzou. Tak se získají plasmidy pGSEWA a pGSETA (obr. 5).

pANETA, pANEWA a pASETA a pASEWA

Plasmidy pGNETA, pGNEWA a pGSETA a pGSEWA se štěpí EcoRI a Ndel. Restrikční fragmenty se oddělí elektroforézou na agarosovém gelu s z gelu se purifikují 4,5kb fragmenty.

Produkt PCR A se štěpí _EcoRL,3L_NdeI.. a _liguj.e_ s purif ikovanými fragmenty uvedenými výše. Po transformaci ligačních směsí do E. coli HB101 se transf ormanty selektují na základě resistence vůči ampicilinu.

Transformanty se nechají růst a jejich plasmidy se izolují a charakterizují analýzou restrikčních fragmentů a nakonec DNA sekvenční analýzou. Tak se získají požadované konstrukty pANETA (obr. 6), pANEWA, pASETA (obr. 7) a pASEWA.

d. Transformance P. chrysogenum

Použije se Ca-PEG zprostředkovaného postupu transformace protoplastů.

Za použití postupů popsaných ve výše uvedených publikacích Cantoral; Gouka et al. (J. Biotechn., viz výše) a Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., viz výše) se použije celého plasmidu nebo purifikované expresní kazety cefE (neobsahující sekvence vektoru E. coli) pro transformaci kmenů P. chrysogenum s geny pyrG, niaD, facA nebo amdS (Beri et al., Curr. Genet. 11 (1987) 639 až 641), jako selekčními markéry.

Za použití homologických selekčních markérů pyrG, niaD nebo facA v purifikované formě, tj. bez obsahu sekvencí vektoru E. coli, se získají transformované kmeny Penicillium chrysogenum, které neobsahují geny bakteriální resistence.

- 23 V evropské patentové přihlášce č. 94201896.1 je popsán způsob získávání rekombinantních kmenů bez selekčního markerového genu. Tohoto způsobu bylo s úspěchem použito u transformantů P. chrysogenum obsahujících jako dominantní selekční markér gen amdS z A. nidulans.

Jedinými elementy heterologické povahy jsou potom 0,9kb oblast kódující cefE a popřípadě 0,9kb oblast promotoru gpdA.

e. Analýza transformantů

Transformanty P. chrysogenum se purifikují opakovanou kultivací na selekčním médiu. Jednotlivých stabilních kolonií se použije pro přípravu šikmých agarů, za účelem produkce spor a za účelem screeningu na transformanty obsahující expresní kazetu cefE. Vařením fragmentu čerstvého mycelia z transformantů na misce s agarem se získá dostatečné množství templátové DNA pro efektivní selekci několika stovek transformantů na přítomnost genu cefE za použití PCR techniky [Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (199.1), Abstract v Fungal Genetics Newsletter 38, 55]. Přitom se odhadne účinnost transformace.

Screening transformantů se také provede bioesejem. Transformanty se nechají růst na agarovém médiu obsahujícím zvolený prekursor postranního řetězce. Jako indikátorové bakterie v převrstvujícím agaru se použije E. coli ESS2231. Tato vrstva agaru obsahuje také Bacto penasu, aby byla schopna diskriminovat mezi produkcí penicilinu a cefalosporinu v souladu s postupy známými v tomto oboru a popsanými například v Guttiérez et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56 až 64.

Spór se použije pro inokulaci kultivačního média P. chrysogenum, které je popsáno v části d. Po 72 hodinách kultivace při 25’C se z mycelia izoluje chromosomová DNA. Tato DNA se rozštěpí restrikčním enzymem s 6bp rozpoznávací sekvencí, jako EcoRI nebo Pstl.

Fragmenty DNA se oddělí elektroforézou na agarosovém gelu a blotují se na nylonové membrány Gene screen (New England Nuclear). Bloty Southern se hybridizují s ³²P-značeným produktem PCR 2, jako próbou pro sekvence genu cefE. ³²P značení puřífikovaného produktu PCR 2 se provádí náhodným značením pomocí primování za přítomnosti a³²P dCTP za použití obchodně dostupné soupravy pro značení (Boehringer Mannheim).

Transformanty obsahující sekvenci kódující cefE se zkoušejí na expresi produktu genu cefE, která je zde označována názvem aktivita expandasy.

Selektované transformanty se kultivují v médiu pro produkci penicilinu (viz příklad 2).

V experimentu, při němž se sleduje průběh fermentace v závislosti na čase, se odebírají vzorky média po 48, 72 a 96 hodinách. Vyrobí se extrakty mycelia a v surových extraktech se stanoví aktivita expandasy v podstatě způsobem popsaným v Rollins et al., Can. J. Microbiol., (1988), 1196 až 1202. Transformanty vykazující aktivitu expandasy se také zkoušejí na aktivitu acyltransferasy způsoby popsanými v Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675 až 1682.

Na základě těchto analýz se selektují transformanty s různou úrovní acyltransferasové a expandasové enzymatické aktivity pro fermentační produkci derivátů 7-ADCA.

Příklad 2

Fermentační produkce 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA a jejich izolace

Kmen P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) se transformuje jedním z konstruktů DNA popsaných v příkladu 1 a inokuluje v koncentraci 2 x 10® konidií/ml do očkovacího média, které obsahuje následující látky (koncentrace v g/litr jsou uvedeny v závorce) ; glukosa (30); síran amonný (10), dihydrogenfosfořečnan draselný (10 ) ;*-roztok stopových prvků I (10 ml/litr) [heptahydrát síranu hořečnatého (25); heptahydrát síranu železnatého (10); pentahydrát síranu mědnatého (0,5); heptahydrát síranu zinečnatého (2); síran sodný (50); monohydrát síranu manganatého (2); dihydrát chloridu vápenatého (5)]. Hodnota pH před sterilizací je 6,5.

Očkovací kultura se inkubuje 48 až 72 hodin při teplotě 25 až 30°C a potom se jí použije pro inokulaci 10 až 20 objemů produkčního média, které obsahuje následující látky (koncentrace v g/litr jsou uvedeny v závorce) : laktosa (80); maltosa (20); síran vápenatý (4); močovina (3); heptanhydrát síranu hořečnatého (2); dihydrogenfosforečnan draselný (7); chlorid sodný (0,5); síran amonný (6); heptahydrát síranu železnatého (0,1); 3'-karboxymethylthiopropionová kyselina (5); roztok stopových prvků II; (10 ml/litr) [pentahydrát síranu mědnatého (0,5); heptahydrát síranu zinečnatého (2); monohydrát síranu manganatého (2); síran sodný (50)]. Hodnota pH před sterilizací je 5,5 až 6,0. Potom se v inkubaci pokračuje dalších 96 až 120 hodin.

Na konci produkční fermentace se mycelium oddělí centrifugací nebo filtrací a 2-(karboxyethylthio)a.cetyl26 a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA se analyzuje vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na sloupci s obrácenými fázemi. Použije se zařízení pro HPLC Beckman System Gold, které se skládá z programovatelného rozpouštědlového systému model 126, automatického sběrače frakcí model 507, diodového detektoru model 168 a systému pro zpracování dat System Gold (5.10). Jako stacionární., fáze.se_ použije dvou patronových kolon Chromspher C18 (100 x 3 mm, Chrompack), které jsou zapojeny v sérii. Mobilní fáze se skládá z lineárního gradientu od 100 % 0,07M fosfátového pufru o pH 4,8 do kombinace 25 % acetonitrilu a 75 % fosfátového pufru o pH 4,8, během 15 minut při průtokové rychlosti 0,5 ml/min. Produkce 2-(karboxyethylthio)acetyla 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA se kvantifikuje při 260 nm za použití syntetické 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA, jako referenční látky.

Identita píků se potvrdí porovnáním UV a NMR spekter (v systému on line).

Půda se přefiltruje a k filtrátu se přidá asi 0,1 objemu 1-butanolu. Hodnota pH směsi se nastaví zředěnou kyselinou chlorovodíkovou na 2 a vzniklá směs se 5 minut míchá při teplotě místnosti. Organická vrstva se oddělí a bud se odpaří nebo se jí dále použije na chemickou deacylaci (příklad 3). Také se může reextrahovat 0,33 objemu vody o pH 8 (přičemž vzniklého extraktu se potom může použít při enzymatické deacylaci (příklady 4 a 5).

Příklad 3

Deacylace 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA

Ke směsi 3 g (8 mmol) 2-(karboxyethylthio)acetyla 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA se při teplotě okolí přidá 3,5 ml (36 mmol) N,N-dimethylanilinu, 13 ml methylenchloridu a 2,6 ml (21 mmol) trimethylchlorsilanu. Směs se 30 minut míchá a potom se ochladí přibližně na -50’C, načež se k ní najednou přidá 1,8 g (8,5 mmol) chloridu fosforečného. Teplota reakčn í směs i se. ,_2. Jio.diny^udržuje ..na· ..-4.Q.LC. A_patom_·-.-se směs ochladí na -65’C. Dále se k této směsi přidá 12 ml (137 mmol) isobutylalkoholu. Tento isobutylalkohol se přidává takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi nepřestoupila -40’C. Rožtok se dále 2 hodiny míchá α potom se nalije do 15 ml vody a bezprostředně nato se ke vzniklé směsi přidá 5 ml 4,5N roztoku amoniaku. Pomalým přidáváním pevného hydrogenuhličitanu amonného se hodnota pH nastaví na

4. Směs se ochladí na 5’C, přefiltruje a krystalická 7-ADCA se promyje 5 ml vodného acetonu (1 : 1) a izoluje.

Příklad 4

Enzymatická deacylace 2-(karboxyethylthio)acetyla 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA za použití acylasy z mutantu Pseudomonas SY77

Konverze 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio )propionyl-7-ADCA se provádí v jediném enzymatickém stupni za použití specifické acylasy, která byla získána místně orientovanou mutagenesí z acylasy Pseudomonas SY77. Konstrukce a identifikace mutantní acylasy Pseudomonas SY77 se zlepšenou aktivitou vůči 2-(karboxyethylthiojacetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionylovému postrannímu řetězci byla popsána v EP-A-0 453 048. V tomto mutantu je tyrosin v poloze 178 v α-podjednotce acylasy Pseudomonas SY77 nahrazen histidinem. Mutantní acylasa je produkována v E. coli. Buňky se sklidí centrifugací a resuspendují se v 10mM fosfátovém pufru o pH 7,4 s obsahem chloridu sodného (l40mM). Potom se buňky rozbijí ultrazvukem. Zbytky buněk se odstraní a izolují se supernatanty vykazující acylasovou aktivitu. Další purifikace acylasy se provádí v sérii chromatografických stupňů: 1. ionexová chromatografie na sloupci Q-Sepharose fast flow při pH 8,8;

2. hydrofobní interakční chromátografie na Phenyl-Sepharose a 3. gelová permeační chromátografienasloupciSepha-_ cryí S200HR.

Purifikovaná acylasa se imobilizuje na částicích skládajících se ze šměšT želatiny a chitosanu. Těsně před přidáním enzymu se na částice působí glutaraldehydem.

Konverse 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA se provádí v reaktoru typu míchané nádrže. Do reaktoru se nejprve přidá vodný roztok cefalosporinu. Potom se teplota roztoku za konstantního míchání zvýší na 30^eC a hodnota pH se hydroxidem draselným upraví na 8. Potom se přidá imobilizovaný enzym, čímž se zahájí konverse. V průběhu konverse se kontinuálně zaznamenává hodnota pH v reaktoru a udržuje se na 8. 3'-Karboxymethylthiopropionová kyselina, která se uvolňuje během této reakce, se titruje hydroxidem draselným. Množství přidaného hydroxidu draselného se integruje a zaznamenává. Konverze se sleduje odběrem vzorků z reaktoru a analýzou na 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA a 7-ADCA za použití HPLC popsané v příkladu 2.

Po dokončení reakce se imobilizovaný enzym odfiltruje a hodnota pH filtrátu obsahujícího butylacetát se upraví na 1. Oddělí se vrstvy a pH vodné vrstvy obsahující 7-ADCA se upraví na 3. Potom se krystalická 7-ADCA odfiltruje.

Příklad 5

Enzymatická, deacylace 2-(karboxyethylthio)acetyla 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA za použití acylasy

Pseudomonas SE83

Konverze 2-íkarbqxyethylthio)acetyl“· a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA se provádí způsobem popsaným v příkladu 4, tentokrát však za použití acylasy Pseudomonas SE83. Dosáhne se stejných výsledků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby a izolace 7-aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny, 7-ADCA, vyznačující se t í m , že se

a) kmen Penicillium chrysogenum transformuje genem expandasy za transkripční a translační regulace expresních signálů vláknité houby;

b) kmen se fermentuje v kultivačním médiu, do něhož se přidá 3'-karboxymethylthiopropionová kyselina nebo její sůl nebo ester, vhodná pro získáni 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-6-aminopenicilanové kyseliny, tj. 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-6-APA, přičemž kruh v posledně uvedených látkách se in šitu rozšíří za vzniku 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA;

c) z fermentační půdy se izoluje 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethylthio)propionyl-7-ADCA;

d) 2-(karboxyethylthio)acetyl- a 3-(karboxymethyl thio)propionyl-7-ADCA se deacyluje; a

e) izoluje se krystalická 7-ADCA.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že se kmen Penicillium chrysogenum transformuje genem expandasy za transkripční a translační regulace expresních signálů acyltransferasového genu.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že stupněm e) je filtrační- stupeň.
4. Způsob podle některého z předchozích nároků, vyznačující se tím, že stupněm c) je filtrační stupeň, přičemž filtrát půdy se extrahuje organickým rozpouštědlem, které je nemísitelné s vodou, při pH pod asi 4,5 a potom se provede jeho reextrakce vodou při pH v rozmezí od 4 do 10.
5. Způsob podle některého z předchozích nároků, vyznačující se tím, že gen expandasy pochází ze Streptomyces clavuligerus nebo Nocardia lactamdurans. ~
6. Rekombinantní DNA vektor obsahující DNA kódující expandasu, která je funkčně připojena k C-terminálnímu signálu pro zacílení mikrotělesa a transkripčnímu a translačnímu regulačnímu expresnímu signálu vláknité houby.
7. Rekombinantní DNA vektor podle nároku 6, v němž je DNA kódující expandasu funkčně připojena k transkripčnímu a translačnímu regulačnímu signálu exprese AT genu.
8. Rekombinantní DNA vektor podle nároku 6 nebo 7, kde DNA kódující expandasu pochází ze Streptomyces clavuligerus nebo Nocardia lactamdurans.
9. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle některého z nároků 6, 7 nebo 8.