CS91791A3 - Epithelium or epithelium precursors - Google Patents

Description

1

Epitheliny a prekursory epithelinů

Oblast techniky

Vynález se týká epithelinů a prekursorů epithelinů. Jdeo novou skupinu bílkovin, regulujících růst, které je možnoužít k diagnostickým a léčebným účelům. Dosud byly vyčištěnydvě látky, z této skupiny z přírodních zdrojů, a to e.pithelin 1a epithelin 2, byla však izolována cDNA, která je kódem proněkolik různých· epithelinů. Epithelin 1 a epithelin 2 majívelmi podobnou strukuru, jde však o funkčně různé bílkoviny.Epithelin 1 je bifunkční regulátor růstu, schopný stimulovatrůst některých typů buněk a současně způsobit inhibici růstujiných” buněk. Epithelin 2 má podobnou biologickou účinnostjako epithelin 1, pokud jde o inhibici růstu. Avšak zřejměnení schopen vyvolat růst stejně jako epithelin 1 a ve sku-tečnosti antagonizuje účinek této látky.

Dosavadní stav techniky

Buněčný růst a diferenciace buněk jsou zřejmě vyvolávány,podporovány, udržovány a řízeny celou řadou stimulačních, in-hibičnícha sýnergně působících faktorů a hormonů. Poruchaa/nebo rozložení tohoto mechanismu je patrně základní příči-nou chorob, spojených s růstem, včetně nádorů. Růstové faktoryjsou patrně příčinou celé řady fyziologických i pathologickýchpochodů, jako jsou přenos signálu, komunikace mezi buňkami,růst a vývoj, vývoj zárodku, imunologická odpověď, krvetvorba,přežívání buněk a jejich diferenciace, zánět, hojení tkáně ajejich přestavba, atherosklerosa a zhoubné nádory.

Epidermální růstový faktor ÉGF, transformační růstovýfaktor alfa TGFalfa, růstový faktor, odvozený od destičekPDGF, růstový faktor z fibroblastú FGr. růstový faktor z ner-vové tkáně NGF, transformující růstovbý faktor beta TGFbeta,insulinový růstový faktor I a II, UGF I, IGF II, krvetvornérůstová faktory, jako erythropoetin, faktor,“stimulující růstkolonií CSF 1 a 2, interleukinu IL-1 až 8, interferony IFN alfa, 2 <*·*·'*i--· beta a gamma, faktor, působící nekrosu nádorů alfa a beta, TNF alfa a beta, léukoregulin, onkostatin M, amphiregulin AR,a další méně definované růstové a podobné faktory jsou bílkovi-ny, které modulují růst a diferenciaci a jsou produkovány růz- &amp; nými typy buněk za normálních fyziologických podmínek nebo veř formě odpovědi na vnější popudy. Většina těchto faktorů patrně působí autokrinním a parakrinním způsobem. Souhrnné práce op těchto faktorech jsou například Gouštin'a"další, 1986, Cancer '

Res. 46:1015 - 1029 , Rozengurt, 1986 , Science 234:161- - 166, * Pardee, 1987, Cancer Res. 47:1488 - 1491, Sachs, 1956, Sci.

Amer, 254:40 - 47, Harshall, 1967, Cell 50:5 - 6, Melcher aAnderson, 1987, Cell. 30:715 -720, Naraen a další, 1933, 3. Exp.

Hed. 167:988 - 1002, Baggiolini a další; 1989, 0. Clin.Invest. 34: 1045 - 1049, Clemens a Mcl-Jutlan, 1985 , Siochem. 0., 226: 345 - 360, Nathan, 1987, Jí Clin. Invest. 79:319-326, Sporna Roberts, 1986, 0. Clin. Invest. 78:329 - 332, Old, 1987, Nátuře 326:330 - 331, Seutler a Cerami, 19B7, Mew. Engl. 3.

Med., 316:379 - 385 , Weinstein, 1987, 3. Cell. Biochern., 33:213 - 224, Zarling a další, 1987, Proč. Nati. Acad.Sci., USA 83:9739 - 9744, Shoyab a další, 1989, Science 243:1074 -- 1076, Sporn a Todaro, 1985, N. Engl. 3. Med. 303:870 - 880,

Sporn a Roberts, 1^85, Nátuře 313: 745 - 747.

Osou vyvíjeny velké snahy izolovat, charakterizovat a definovat funkční mechanismy faktorů, modulujících růst vhledem k jejich možnému použití při diagnose, prognose a léčbě zhoubných nádorů. Mimoto dobrá znalost těchto faktorů usnadní také porozumění základního mechanismu normálního řízení' růstu a jeho ztráty v nádorových buňkách. * '*· ♦ λ Podstata vynálezu = __=. _

Podstatou vynálezu jsou pitheliny, které jsou novou sku-pinou látek"s'nízkou molekulovou'"hmotností, bohatých na’cys- ς> tein, s bifunkční účinností na řízení růstu. Použití těchto látek se navrhuje zejména k diagnose a léčbě různých chorobu lidí. Řešení se týká rovněž výroby biologicky účinných epi- _____thelinů. Byly identifikovány dvě látky-.z.e_.-5kuo-i-n.v_e.o.i-t.h.e.lln.ů-T_._·._ 3 a to epithelin 1 a epithelin 2., Tyto látky byly identifiková-ny a čištěny, byla stanovena jejich primární struktura, jakoži fyzikální a funkční vlastnosti. Několik dalších členů této —.skupiny bylo. identi.f ikováno .klonováním. cDNA... Epithelin .1 jepolypeptid s obsahem 56 aminokyselin, epithelin 2 obsahuje57 aminokyselin. Oba epitheliny mají homologii 47 % na úrovniaminokyselin a každá z těchto látek obsahuje 12 cysteinovýchzbytků v téže poloze.

Epitheliny je možno získat izolací a čištěním z prírod_nich zdrojů, chemickou syntézou nebo pomocí rekombinantní DNA,Ve zvláštním provedení, které bude dále podrobněji popsáno,je možno epithelin 1 a epithelin 2 izolovat z ledvin krys apak čistit kombinací čištění na gelu a vysokotlaké kapalino-vé chromatograf ie. HPLC. Jak bude dále popsáno, byly obě látkycharakteriz.uvány svojí strukturou a fyzikálními, chemickými afunkčními vlastnostmi.

Vynález bude podrobněji popsán .v souvislosti s přilože-nými výkresy..

Na obr. 1 je znázorněn průběh preparativní HPLC surové-ho extraktu při použití gelu.

Na obr. 2 je znázorněna preparativní HPLC v reversnífázi při' použití frakcí 25 až 2B z obr. 1.

Na obr. 3 je znázorněna semipreparativní HPLC v reversnífázi při použití spojených frakcí 55 až 59 z obr. 2. *

Na obr.’4 je znázorněna analytický HPLC v reverzní fázipři.použití frakce lb z obr. 3.

Na obr. 5 je znázorněna analytická HPLC v reversní fázipři použití frakce 2b z obr. 3.

Na obr. 6 je znázorněna analytická chromatografie nagelu při použití koncentrovaných frakcí 51(A) a 52(3) z obr. 4. 4

Na obr; 7 je znázorněna analytická chromatografie*nagelu při použiti koncentrovaných frakcí 44(A) a 45(0) zobr. 5.

Na obr. 8 je znázorněna semipreparativní HPLC v re-* versní fázi pro frakce 50 až 54 z obr. 2.

Na obr. 9 je znázorněna analytická HPLC v reversnífázi pro frakce 18 až 23 z obr. 8.

Na obr. 10 je znázorněna analytická chromatografie nagelu pro frakce z obr. 9. Chromatografie byla prováděna tak,jak bude dále popsáno při popisu čištění epithelinu z kry-sích ledvin. A: Frakce 36, HPLC. 3: HPLC koncentrované frak-ce 37, C: HPLC koncentrované frakce 38, 0: opakovaná chromá-”tografie spojených frakcí 48 až 49 z A - C po koncentraci.

Na obr. 11 je znázorněna elektroforéza na materiáluTricen-SOS-PAGE pro epithelin 1 a epithelin 2. Postup bylprováděn na proužku 18¾ gelu s rozměrem 0,75 mm x 10 cm xx 7 cm při teplotě místnosti při stálém napětí 90 V celkem 4,5 hodin v přístroji k provádění elektroforézy Bio-Radmini-protein II. Postup byl prováděn tak, že sušené vzorkybyly uvedeny do suspenze v 10 mikrolitrech pufru pro vzorek “ -· “ s' obšahén)T"5'Lř“nM“Třrs o" ρίϊ 6', 8 , 12 '^“giyceroiu, '4’“v bdb', 4_v...... ......... merkaptoethanolu a..0,01. Ss-mnrlři. G, · pak..,hyK, vzorek sinkuhnván 5 minut při’95 UC "a pak nanesen ná.gel. Ke značení "molekulo- ”vé hmotnosti bylo užito pět polypeptidů, získaných štěpenímmyoglobulinu z koňského srdce bromkyanem (Sigma Chem. Co.). A: epithelin 1, B: epithelin 2.

Na obr. 12 je znázorněn‘řetězec aminokyselin pro epi-thelin 1 a epithelin 2, které byly získány čistěním z ledvinkrysy á srovnání těchto řetězců. Pro aminokyseliny byl. užitkod s jediným písmenem: alanin A, Arginin R, asparagin N,kyselina asparagová 0, cystein C, glutamin Q, kyselina glu-tamová E, glycin C, histidin H, isoleucin I, leucin L, lysinK, methionin 14, fenylalanin F, prolin P, serin S, threonin T, 5 tryptofan W, tyrosin Y, a valin V. Řetězce peptidů, užitémpro konstrukci oligonukleotidových primerú a sond jsou pod-trženy. ...... --- . -

Na obr. 13 je znázorněna analýza epithelinu 1 a epithelinu2 hydropathycky podle Kyteho a Dcolittla. Dřímá čáiňuje epithelin 1 a tečkovaná čára epithelin 2.

Na obr. 14 je znázorněna křivka v závislosti odpovědi , 125 na dávce pro epithelin 1 a 2 při inhibici zabudování I--deoxyuridinu do ONA buněk A431. Plná kolečka znázorňujíepithelin 1, prázdá epithelin 2.

Na obr. 15 je znázorněn A: účinek epithelinu 1 a 2 na125 stimulaci zabudování 1-deoxyuridi.nu do DNA buněčné liniemyších keratocytů Balb/MK. Do vyhloubení plotny s 96 vyhlou-beními bylo uloženo vždy 2000 až 4DQ0 buněk v prostředí snízkým obsahem vápníku a s obsahem 5 % dialyzovaného FBS.

Pak byly prováděny zkoušky GSA tak, jak je popsáno v odstav-cích, týkajících se faktorů z krysích ledvin. Plné kolečko jsou_h_odnoty.,p_ro ~ealthe 1 in_ 1_, ...prázdné._p_ro.. e.přth.e.lin._.2._________ B: je znázorněn účinek různých koncentrací epithelinu 2 nazabudování, I-deoxyuridinu do DNA buněk Balb/MK, kterébylo vyvoláno epithelinem 1 v dávce 20 ng/ml. -Na_o.br-__1.6—j.e_zná.zo.r.něn-A.:—úč-inek-epi-thel-inu—1-a- epidermálního růstového faktoru EGF na růst buněk Balb/MK.Pokusy byly prováděny tak, jak bude dále popsáno pro faktory —z^kr^s.íeh^l«dAr-i-R-.^=P-l-né—ko-l-ečkO^j-s-o-u—hodno-t-y— p-r-o—ep-i-t-h-e-1-ί-η^l·—·prázdné pro EGF, B: je znázorněn účinek různých koncentracíepithelinu 2 na růst keratocytů myší, vyvolaný_épithelinem 1v dávce 20 ng/ml.

Na obr. 17 je znázorněn účinek epithelinu i a 2 nátvorbu kolonií buněk NRK-SA6 na měkkém agaru za přítomnostiTGFbeta v dávce 1 ng/ml. Bylo užito zkoušek, popsaných přizkouškách faktorů z krysích ledvin. Pevné sloupky jsou hod-noty pro epithelin 1, tečkovaný sloupek je hodnota pro 6 epidermální růstový faktor. Prázdný sloupek je hodnota proepithelin 2 a šrafovaný sloupek je hodnota pro 20 ng/mlepithelinu 1 s 500 ng/ml epithelinu 2.

Na obr. 18 je znázorněna cDNA pro prekursor krysíhoepithelinu a odvozený řetězec aminokyselin. .Na obr. 19,je znázorněno srovnání prekursoru pro epi-thelin krysy s úplným epithelinem. Každý bod znamená úsekpěti z deseti totožných zbytků.

Na obr. 20 A: je znázorněna sekundární analýza prekur-soru krysího epithelinu, 3: znázorněna je hydropathie pre-kursoru epithelinu krysy. ' . ί * •‘Υ·'

Na obr. 21 A: je znázorněn řetězec, který uvádí srovnání'meziprekursorem epithelinu člověka, krysy a myši podle odvo-zení od klonů cONA. Řetězce jsou znázorněny pomocí kódu sjediným písmenem,totožné zbytky jsou nahrazeny tečkami. Bylo užito vypuštění některých částí řetězce, aby byly zřejmé ana-'legie, vypuštěné části jsou označeny pomlčkou. Signální ře-tězec pro epithelin krysy je podtržen a sedm řetězců, boha-tých na cysteinové zbytky je uzavřeno do rámečků. Každý řetě-zec je založen na analýze cDNÁ a PCR klonů, izolovaných zledvin člověka ;„k_ry.e.y.,nebc myši-,- a-to z-RNA ."--Srpky- uvádějí““^hranice exonu o velikosti 234 bp, což je oblast, která chybí_v=L.c.Q!:'!.A-4sdn-2h c-^-z-^k-řy-s-í-eh^k-ro εc~ámfňókyseíin pro" epitheliny krysy, myši a člověka. C: Totožný úsek s cysteino-vými zbytky, který je uchováván ve všech epithelinech, D: srov-nání C-terminální oblasti aminokyselin 254 až 315 z thiolpro-teázy rajčete Lycopersicon esculentum s oblastí epithelinu 1a 2. . Na obr. .22. je-znázorněn řetězec nukleotidů' a odvozený re-’tězec aminokyselin pro prekursor lidského epithelinu. Řetězcejsou' založeny na PCR klonech RNA z dřeně lidských ledvin. 7

Na obr. 23 je znázorněn řetězec nukleotidů a odvozenýřetězec aminokyselin pro prekursor epithelinu.myši. PCR klo-ny, byly. získány z RNA z ledvin dospělých myší.

Na obr. 24 je znázorněn řetězec nukleotidů a odvozenýřetězec aminokyselin prekursoru epithelinu skotu, znázorněnaje pouze část řetězce. Řetězec je založen na PCR klonech zRNA varlat skotu.

Na obr. 25 je znázorněn řetězec nukleotidů a odvozenýřetězec aminokyselin prekursoru epithelinu kuřete, znázorně-na je část řetězce. Řetězec je založen na PCR klonech z RNAvejcovodů kuřete.

Na obr. 26 je znázorněna exprese rekombinantního epithe-linu v buňkách CD5. A: znázorněny jsou výsledky pro superna- 35 , tanty z buněk COS, značené S-cysteinem po transfekci ná-sledujícími konstrukcemi pro expresi, založenými na cDM8:dráha. 1, crEPN1.6 s obsahem kódové oblasti pro úplný epi-thelin krysy, dráha 2, crEPN1.4 s obsahem isoformy cDNA proepithelin.krysy bez exonu o 234 bp, dráha 3, kontrola sesimulovanou transfekcí. B: supernatanty, značené ^^s-cýgtei-nem.z buněk CD5 po transfekci konstrukcemi pro expresi, za-loženými na cDM8. Dráha 1, cbetarEPNl s obsahem signálníhořetězce TGF-betal opice, který předchází kódový řetězec pro __úplný krysí epithelin 1, dráha 2 cbetarRPN2, podobný plasmid, na bázi epithelinu 2 krysy. . ............ .. ..Na obr, 27 je znázorněn dendrogram analýzy mezi úseky - -- epitheli-nu, bohatými na- cysteinové zbytky , zdrojem, byla . kry-. sa, myš a^člověk. Znázorněn je i. diagram prekursoru epitheli-nu se znázorněním poloh sedmi úseků v prekursoru. 23 úseků,bohatých na cystein bylo srovnáváno na počítači PCGENE(Intsllignetics, lne. Mountain View, CA) při použití srovná-vacího programu pro větší počet prvků CLUSTAL. Výsledky, tý-kající se podobnosti řetězců byly transformovány do matrice, 8 která pak byla analyzována Nardovou metodou (SPSS/Pc+, Chicago,IL). Tento postup využívá čtverců vzdáleností k umístění bodůrozvětvení..

Vynález se tedy týká nové skupiny bílkovin, regulujícíchrůst, které se nazývají epitheliny. Jde o několik látek s vel-kou homologií struktury. Dvě látky z. této skupiny, epithelin1 a epithelin 2 byly čištěny z přírodních zdrojů a mimoto by-la izolována cDNA, která je kódem pro tyto dvě a několik dal-ších látek z této skupiny, izolace bylá prováděna napříkladz krysy, člověka, skatu, myši a kuřete.

Vynález se tedy týká látek typu epithelinu, jejich de-rivátů a analogů, nukleovýcn kyselin, které jsou kódem proepitheliny, například cDNA, DNA genomu, RNA, RNA proti smys-lu řetězce a podobně. Vynález se rovněž týká výroby epitheli-nu obvyklým způsobem a pomocí rekombinantní DNA, rekombinant-ních vektorů pro expresi epithelinů a jejich použití k diag-nostickým a/nebo léčebným účelům. Vynález se rovněž týká pre-kursorů epithelinů, protilátek proti epithelinúm a receptorůpro epitheliny. Výroba epithelinů - — Jstínotli ve- cpitnclluy jy siiužno z i ska t" rů zným způsobemvčetně izolace z přírodních zdrojů, syntézou peotidůna pev-,.·*. .né^i^zi”^" s^poúžTťí"^Těk^ďinanfňí DNA.“

Izolace a čištění epithelinů z přírodních zdrojů

Bylo zjištěno klonováním DNA, že k expresi mRNA, kteráje kódem pro různé epitheliny, dochází v řadě různých buněč-ných typů z různých druhů. Je tedy pravděpodobně možno tytolátky izolovat zcelé řady orgánů, tkání s/ne’bo "‘jiných buněč-ných zdrojů. Epitheliny je možno od sebe oddělit a čistitrůznými izolačními a čisticími postupy, které jsou známé, 9 včetně chromatógrafie, například kapalinové chromatografievc reversní fázi, chromatografie na gelu, na iontoměniči,‘afinitní chromatografií, chromatografií, kterou je možnotřídit molekuly podle velikosti a podobně, dále je možnoužít odstřelování, elektrofořezu, diferencovanou rozpust-nost a podobně.

·- rT ve specifickém provedení vynálezu, které bude dále po-drobněji popsáno, je možno izolovat dvě látky z uvedené sku-piny, epithelin 1 a 2 z tkáně krysích ledvin a čistit jemimo jiné kombinací chromatografie na gelu a HPLC v reversnífázi. Epitheliny 1 a 2, čištěné tímto způsobem jsou polypep-tidy, které obsahují 56 a 57 zbytků aminokyselin a jsou sistrukturou velmi podobné. Funkčně je epithelin 1 skutečným,bifunkčním modulátorem růstu, který je schopen způsobit sti-mulaci i inhibici buněčného růstu. Epithelin 2 specifickyantagonizuje účinek epithelinu 1 pokud jde o stimulaci bu-něčného růstu. Stejně jako epithelin 1 je epithelin 2 rov-něž schopen potlačit růst buněk, i když v menší míře. Bylystanoveny funkční, strukturní, fyzikální a další vlastnostitěchto látek, které budou dále popsány. Bude rovněž popsánzpůsob čištění těThtó”I’átek7i’Tkťeřý'“šě'přčfv“á‘3‘I v^šěstí'"slup-nich a jeho modifikace. Tento postup je možno užít i pro jinélátky z téže skupiny. * Chemická syntéza epithelinu

Jednotlivé látky ze skupiny epithelinu je možno získat_ _________________ při použití chemických postupů pro syntézuodpovídajících - řetězců aminokyselin·, je možno získat celou, látku.nebo je- jí část. Je napríéklad možno užít syntézy na pevné fázipodle publikace Stewart a Young, Solid Phase Peptide Syn-thesis, 2. vydání, 1984. Čištění a/nebo zařazení do biolo-gicky účinných struktur je pak možno provést známým způsobem.Řetězec aminokyselin takto vyrobených epithelinů je možnoověřit analýzou aminokyselin. - 10 -

Syntéza epithelinu při použiti rekombinantní DNA •í

Biologicky účinný úplný epithelin a jeho prekursor je.možno získat expresí DNA, která je kódem pro tento epithe-lin v rekombinantní hostitelské buňce. Obecný postup proizolaci řetězce genu,, pro konstrukci vektoru pro řízení .syntézy bílkovin a pro expresi ..a/nebo sekreci, biologicky ú-činných rekombinantníchbílkovin je znám. Výrobu epithelinu s použitím rekombinantní DNA je mož-no pro snadnější vysvětlení rozdělit do čtyř stupňů: 1. Izolace nebo tvorba kódového řetězce, tj. genu proprekursor nebo pro úplnou farmu epithelinu. 2. Konstrukce vektoru pro expresi, schopného říditsyntézu požadovaného epithelinu. 3. Transfekce nebo transformace příslušné, hostitelskébuňky, schopné replikace a exprese genu pro epithelina/nebo zpracování produktu genu na požadovaný epithelin. 4. Identifikace a čištění takto získaného požadova-ného epithelinu. . . Klonování prekursoru pro epithelin ,krvsv ..LJŤeho_expre--^ --··-· -i * ‘ - f ' ' * ** 1 _ ... ___________—- __ . r —i—— --—i — ——— se a exprese úplného epitTušlinu 1 a 2 krysy bude dále popsá-no v příkladové části.

Izolace nebo tvorba genů pro epithelin

Nukleotidový kódový řetězec pro různé jednotlivé epi-theliny nebo jejich funkční ekvivalenty je možno užít kekonstrukci rekombinantních vektorů‘’pro~exprěsi, které bu-"dou řídit expresi požadovaného epithelinu. Kódové nukleo-tidové řetězce je možno získat z různých buněčných zdrojů, - 11 - které produkují epithelin nebo podobné látky nebo mRNA,která je kódem pro epithelin. Byla zjištěna celá řadavhodných zdrojů u .člověka ! myši, například placenta,tlusté střevo, ledvina, varlata, nadledvinky, mléčnážláza, vaječník , dvanáctník, brzlík a plicní tkáň. Kódový řetězec pro epithelin je možno získat klonovánímcDNA z RNA, izolované a čištěné z uvedených zdrojů nebo klo-nováním genomu. Je možno připravit sestavy cDNA nebo-genomupři použití známých způsobů a pak provést sériové zkoušky napřítomnost DNA, která je kódem pro epithelin pomocí nukleoti-dových sond, odvozených od známých řetězců aminokyselin epi_thelinu 1 nebo 2 a/nebo sond, komplementárních s jakoukolivčástí genu pro epithelin. Úplné :klony, tj. ty, které obsahu-jí celou kódovou oblast pro prekursor nebo úplný epithelinje možno vybírat pro konstrukci vektorů pro expresi.

Je také možno postupovat tak,· že se. DNA, která je kó-dem pro epithelin syntetizuje zcela nebo z části chemickousyntézou obvyklým způsobem.

Vzhledem,k^běžne degeneraci nukleotiďovýčh kódových"řetězců'.je možno prakticky při provádění způsobu pode vy-nálezu užít také jiných řetězců DNA, které jsou kódem prov podstatě stejný nebo funkčně ekvivalentní řetězec amino-kyselin. Tyto změny nukleotidových řetězců pro epithelinzahrnují vypuštění, přidání nebo náhradu různých nukleotidůza vzniku řetězce, který je kódem pro tentýž nebo funkčněekvivalentní projdukt genu._ Tento produkt může rovněž obsa-hovat vypuštěné, přidané nebo nahrazené, zbytky aminokyselin,. .přesto však může jít o tak zvané tiché změny, jejichž výsled-kem je přesto biologicky účinná látka. Aminokyseliny je mož-no nahradit na.Základě podobnosti jejich polarity, náboje,rozpustnosti,' hydrofobnosti, hydrofilnosti a/nebo amfot.hermnípovahy zbytku. Například aminokyselinou s negativním nábojemje kyselina asparagová a glutamová, pozitivní náboj má lysina arginin bez náboje nebo s podobnou hydrofilnosti jsou leucin,isoleucin, valin, dále glycin . afalanin, asparagin a glutamin,šeřin a threonih.. nebo fenylalanin a tyrosih. 12

Konstrukce vektoru pro expresi epithelinu

Aby bylo možno dosáhnout exprese biologicky účinné,úplné nebo prekursorové formy různých epithelinů, je nutnovolit systém vektoru pro expresi a hostitele, který zaručujenejen vysokou úroveň transkripce a translace, nýbrž' takésprávné zpracování produktu genu. To může být zvláště důler žité při použití celého kódového řetězce pro prekursor epi-thelinu v konstrukcích pro expresi vzhledem k tomu, že úplnéformy epithelinů jsou patrně odvozeny od větších prekursorůa jsou zpracovávány v buňkách.

Je možno užít celou řado systémů hostitele a vektorupro expresi, tj. vektorů, které obsahují nutné prvky pro ří-zení replikace, transkripce a translace kódového řetězce proepithelin v příslušném hostiteli. Může jít například o vektorpro expresi z viru a hostitele z buněk savce, například o vek-tor z cytomegaloviru, viru vaccinia, adenoviru a podobně, dá-le může jít o systém vektoru pro expresi z hmyzího viru ahmyzích buněk, například vektoru z baculoviru nebo o systémpro expresi s promotorem nevirového původu, odvozený od buněksavce, například metallothioninový promotor myši. Vhodnýmihostitelskými buňkami jsou například buňky savců. Přechodnéexprese bílkovin savců je možno dosáhnout například v buněč- nóm- hnc + 1 +D1 i PflC τ c Ψ π 1ά σ vnnnn i — k*. o _4· í + ň .1. <· L· «Λ λ l·* . . h· < A I > Ά «-»<-* -f’* LI Π w>< t-—> « μ w* ww a -— w'- « W .fc-w - w « —· » · Uf i_i~b X"'b t f Ui ť t---U U'i'< I W U I 1' ' ů I CIJ1 t ==^^^ΓΊ· v ky^pr o^ěxpr e s-χ^ν^ο v é’d e ný č n^ve kťoŤác h^sO^m^í^p-oúčinnosti a specifičnosti. V závislosti na použitém systémuhostitele a vektoru je možno užít jakýkoliv z celé řady vhod-ných prvků pro transkripci a translaci. Například při klonová-ní v buněčném-systému savce je možno užít promotoru z genomusavce, jako metallothioninový promotor myši nebo z virů, kte-ré rostou v těchto systémech, jako promotor 7,5 K z viru vacci-nia nebo dlouhý terminální promotor z viru myšíhu sarkomu Mo-·-loney. Je možno užít také promotory, získané pomocí rekombi-nantní DNA nebo synteticky k dosažení transkripce..včleněnýchřetězců. 13 K dosažení dostatečné translace uložených kódových řetěz-ců pro bílkoviny, je nutno užít také specifických signálů proiniciaci. Tyto signály zahrnují iniciační kodon ATG a při- -lehlé řetězce. V případě, že se ukládáído příslušného vektorupro expresi celý gen pro epithelin, včetně vlastního iniciač-ního kodonu a přilehlých řetězců, nemusí být zapotřebí užítdalších řídících signálů pro translaci. Avšak v případech,kdy je do vektoru uložena pouze část kódového řetězce, je nut-no zařadit také exogenní signály pro řízení translace", včetněiniciačního kodonu ATG. Mimoto .tento iniciační kodon musí býtuložen ve správné fázi pro odečtení kódového řetězce pro epi-thelin, aby mohlo dojít- k translaci celého uloženého řetězce.Tyto exogenní signály pro řízení translace a iniciační kodonymohou být různého původu a mohou být jak přírodní, tak synte-tické. Účinnost exprese je možno zvýšit zařazením řetězců,podporujících transkripci a podobně. K získání vektoru pro expresi, který obsahuje gen propožadovaný epithelin a příslušné řídící signály pro trans-kripci a translaci je možno užít jakýkoliv postup pro uložení.f r a g mentu _DN A_, do . vektoru.,r.Ty to .postupy noho u ..za h r no v a t_ p,o - _užití rekombinantní DNA in vitro, syntetické postupy a re-,kombinaci in vivo.

Například v případě, že se jako virus pro expresi užije-adeno-v-ir.us-,—je-mož-no—n.a-v.á.z.a-t_kódo.v-ý_ř.e-t.ě.z.e.c_p.r.o_e.p.i.t.h.e.l.i.n_n.a_komplex adenoviru pro řízení transkripce a translace, napří-klad promotor a trojdílný signální řetězec. Získaný chimérní pak-^maž-no-^u-i-0-ž-i-t^d:G—genemu^ad€P.o-v-i-r-u-^r-ekom.b.i^.ac.í^i:n^—vitro nebo in vivo. Uložení této oblasti, "nepodstatné pro vi-rus do genomu-viru má za následek, že virus'si zachovává svouživotnost a dochází v něm k expresi epithelinu v infikovanémhostiteli. Podobným způsobem je možno užít také promotor 7,5Kviru vaccinia.

Dalším použitelným systémem pro expresi, který je možnoužít k expresi epithelinu, je systém hmyzu. V jednom z těchto 14 systémů se jako vektor pro expresi cizorodého genu užije vi-rus nukleární polyhedrosy Autographa californica (AcNPV).Virus roste na buňkách Spodoptera frugiperda. Kódový řetě-zec pro epithelin je možno klonovat v nepodstatných oblas-tech viru, například v polyherinovém genu pod řízením pro-motoru AcNPV, například polyhedrinového promotoru. Úspěšnéuložení kódového řetězce pro epithelin bude' mít za následekinaktivaci polyhedrinového genu a produkci neuzavřeného viruto znamená viru, který nebude mít bílkovinný obal, pro nějžje kódem polyhedrinový gen. Tyto rekombinantní viry se pakužijí k infekci buněk Spodoptera frugiperda, v nichž docházík expresi uloženého genu.

Vektory z retrovirů dovolují vysokou účinnost expresev různých typech buněk. Postup dovoluje zpracování v buňkách,,řízení i funkci uloženého kódového řetězce pro bílkovinu.

Mimoto je možno užít kmen hostitelských buněk, kterýponěkud mění expresi uloženého řetězce nebo modifikuje azpracovává produkt genu v požadovaném smyslu. Expresi při .použití určitých promotorů je možno ještě zvýšit přítomnostíindukčních látek, jako iontů zinku a kadmia v případě metallo-thioninových promotorů. Je tedy možno expresi geneticky zkon-struovaných 'epithelinú řídit. To je důležité v případě, žebílkovinný produkt klonovaného cizorodého genu působí uhynu-

Jc m o ž n é 2 t a k é ~ pru váuč t^podif ikace které jsou důležité pro funkci bílkoviny, jako je glykosyla-ce nebo zpracovávat produkt, například štěpením. Různé hos-titelské buňky mají charakteristické a specifické mechanismypro posttranslační zpracování a modifikaci' bílkovin. Je pro-to možné volit vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémytak, aby bylo možno dosáhnout správné modifikace a zpracová-ní cizorodé bílkoviny, k jejíž expresi dochází. - 15 -

Identifikace buněk po transfekci nebo transformaci, u nichždochází k expresi epithelinového genu -- Hostitelské buňky,-které obsahují· rekombinantnř kódovýřetězec a v nichž dochází k expresi biologicky účinného úpl-ného produktu, je možno identifikovat alespoň čtyřmi obecný-mi postupy, a to a) hybridizací DNA-DNA, ONA-RNA nebo RNÁ-RNA proti smysluřetězce, b) přítomností nebo nepřítomností značícího genu, c) průkazem úrovně transkripce expresí transkriptů mRNA proepithelin v buňkách hostitele, d) . detekcí úplného ,p.roduktu genu imunologickou zkouškou a jeho biologickou účinností. Při prvním postupu je možno prokázat přítomnost kódové-ho řetězce pro epithelin ve vektoru pro expresi průkazemhybridizace DNA-DNA při použití sond, obsahujících nukleoti-dové řetězce, které jsou homologní s kódovým řetězcem proepithelin. Při druhém postupu je možno identifikovat systém re-kombinantního vektoru pro expresi a hostitele a provést se-lekci na přítomnost nebo nepřítomnost funkcí, jejichž příči-nou je gen, užitý ke značení-, jde například o účinnost typu thymidinkinázy, odolnost proti antibiotikům, odolnost proti methotrexátu, transformaci fenotypu, tvorbu inklúzních tělí-sek,u baculoviru a podobně. Například v případě, že kódovýřetězec pro epithelin je uložen do značícího genu, ztrácejírekombinanty s jeho obsahem funkci značícího genu a je možnoje identifikovat. 3e také možno uložit značící gen do jednéřady s epithelinovým genem pod řízením téhož nebo odlišnéhopromotoru k řízení exprese kódového řetězce pro epithelin.Exprese značícího genu po indukci nebo selekci je pak takédůkazem exprese epithelinového genu. 16 Při provádění třetího postupu je možno stanovit trans-kripci kódové oblasti pro epithelin pomocí hybridizace. Jenapříklad možno izolovat polyaděnylovanou RNA a analyzovatji metodou Northern blot při použití sondy, homologní s pří-slušným kódovým řetězcem epithelinu nebo jeho částí. Je takémožno extrahovat nukleové kyseliny hostitelské buňky a pro-vést hybridizaci při použití uvedených sond. Při provádění čtvrtého postupu je možno expresi úplnébílkoviny prokázat imunologicky, například metodou Western i blots, dále imunologicky pomocí radioimunologického srážení,pomocí enzymu a podobně. Nejprůkaznější je detekce produktuepithelinového genu, který má biologickou účinnost. V přípa-dě, že hostitelská buňka vylučuje produkt genu, je možnosledovat bezbuněčné. prostředí, v němž jsou buňky pěstoványna účinnost typu epithelinu. V případě, že produkt genu nenívylučován, je buňky nutno rozrušit. Ve všech případech jemožno užít biologické zkoušky na inhibici nebo stimulacibuněčného růstu.

Deriváty a analogy epithelinu

Vynález se rovněž týká způsobu výroby derivátů a analo-gů epithelinu a.příbuzných pjpJŤdů_.-T_vtomlátky._které__maiítaké účinek na "změny růstu jako různé epitheliny, je možnoΓΟνΠΖΖί OÓU žŤ t . nrnlrli a nrin 71"t.ňrnnniÍ7.i 1— g -Í.éčhJ-'~'-Š-i-r-Cké—Š-.k-é-Vy-^nádorů adalších onemocnění, souvisejících s poruchami bu-něčného růstu. Tyto látky mohou mít vyšší nebo nižší biolo-gický účinek ve srovnání s přírodními epitheliny, a/nebomohou rozšiřovat nebo omezovat buněčné linie,"citlivé na'inhibiční účinek epithelinu (GIA). Podobně je možno získatderiváty, analogy .a příbuzné peptidy, které mají nižší nebovyšší stimulační účinke na.růst (GSA) a/nebo rozšiřují,nebo.omezují oblast buněk, citlivých na tento účinek epithelinu.Tímto způsobem je možno získat látky, které lze užít napří-klad pro rychlejší hojení různých poranění a spálenin. - 17 -

Deriváty a analogy epithelinu a příbuzné peptidy jemožno získat celou řadou známých způsobů. Postupy a manipu-lace na genetické úrovni a na úróýii bílkovin spadají do roz-sahu vynálezu.

Na úrovni bílkovin je možno uskutečnit různé chemickémodifikace za vzniku derivátů a analogů epithelinů nebo pří-buzných peptidů.známým způsobem, jako je acetylace, formyla- ce, oxidace, specifické chemické štěpení endopeptidázarni, ja-ko bromkyanem, trypsinem, chymotrypsinem, proteázou V8 apodobně- nebo exopeptidázami a podobně.

Protilátky proti, epi-thelinú

Vynález se rovněž týká způsobu výroby polyklonálních amonoklonálních protilátekproti epithelinům nebo příbuznýmbílkovinám.

Polyklonální protilátky proti epitopům epithelinu jemožno získat známým zpsůobem. K výrobě těchto protilátek jemožno imunizovat injekcí"'épitherinu^ňěbó 'podobně' lá'ťRý’"r'ůzh'éživočichy, jako králíky, myši, krysy a podobně. Ke zvýšeníimunologické Odpovědi je možno v závislosti na druhu hosti-tele užít různé pomocné látky, jako Freundsovo kompletnínebo nekompletní adjuvans, minerální gely, například hydroxidhlinitý, povrchově aktivní látky, jako lysolecithin, polyoly,polyanionty, olejové emulze, hemocyaniny, dinitrofenol a po-tenciálně použitelné látky u lidí,jako BCG, tj. bacillus ....... Calme.tte-Gu.erin a.Corynebacterium parvum. ř- fe- v, l .

Monoklonální protilátky k epiťopu epithelinu je možnopřipravit jakýmkoliv způsobem, kterým je možno vyvolat pro-dukci protilátek u kontinuálních buněčných linií v kultuře.Jde například o techniku s použitím hybridomu, původně po-psané v publikaci Kohler a Milstein, 1975, Nátuře 256, 495 -497 a novější technikou s použitím hybridomu lidských ís 8-buněk podle publikace Kosbor a další, 1983, ImmunologyToday 4:72 a také s použitím EBV-hybridomu podle publika-,ce Cole a další, 1985, MOnoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan, R. Liss, lne., str. 77 - 96.

Fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp molekulyje možno získat známým způsobem. Tyto fragmenty zahrnujínapříklad F(ab fragment, který je možno získat rozštěpe-:ním molekuly protilátky působením pepsinu. Fragment Fab' jemožno získat redukcí disulfidových můstků fragmentu FCab'^a dva fragmenty Fab, které je možno získat tak, že se.na mo-lekulu protilátky působí papainem a redukčním činidlem .

Protilátky proti epithelinům je možno užít ke kvanti-tativní detekci úplných epitheinů a jejich prekursorů ačástí, k čištění epithelinů a k osvětlení biosyntézy epi-theinů a jejich metabolismu a funkce. Tyto protilátky jemožno užít také k diagnostickým a léčebným účelům.

Biologický profil epithelinů

Počáteční klonování cDNA ukazuje, že patrně existujecelá rada strukturně příbuzných látek typu epithelinů súčinkem na růst, Mimoto mRNA, která je kódem,pro.epithelin .se nachází v různých typech tkání u obratlovců a docházík- iejí.-.expresi.—Pokud.jde :.p· geny-p.ro -epithslin-z --těchto ...==.obratlovců, je tento gen na místě a zůstává konstantní ale-spoň 250 milionů let. Různé epitheliny jsou pravděpodobněbílkoviny s nízkou molekulovou hmotností a jednoduchým ře-tězcem. Žádný z řetězců epithelinů nemá podstatnou homologiis žádnou z dříve známých bílkovin. Je zajímavé, že některéepitheliny obsahují oblast, která je homologní s účinnouoblastí fosfolipázy A2. . . ........ , . .. , .... .... . . .

Epithelin 1 a 2, tak jak byly čištěny z tkáně krysíchledvin jsou bílkoviny s 56 a 57 aminokyselinami a 47¾ ho-mologií řetězce aminokyselin a s 12 identicky uloženými 19 cysteinovými zbytky. To znamená, že přibližně pětina zbytků aminokyselin-v obou epithelinech -jsou eyste-inové zbytky . -Polo-ha těchto dvanácti cysteinových zbytků napovídá, že v průběhutvorby bisulfidových můstků mezi těmito zbytky došlo k tvorbě C t Τ' π 1/ Ψ ι I 1* u L· 4 τ* '"í *τ i*t 4 'Π x i π íM q o 4 ή L· π i j η μ ι ι 4 o τ* γ» π __ ) ri k. C x u 4. u wi vd v a £.oviiuvavaiiO) j c u i a r\ z. v □ »« u u i g i L· i srní strukturu. Zatím není známa žádná další bílkovina, kteráby měla obdobnou nebo příbuznou strukturu. Tato struktura cys-teinových 'zbytků se nachází pouze v primární struktuře čiště-ných epithelinů 1 a 2, a také v odvozených strukturách, proněž jsou kódem příslušné cDNA a klony PCR. Jde patrně o jedi-nečný systém, který odlišuje skupinu epithelinů od jiných bíl-kovin a je základem jejich účinnosti. Kromě této struktury jev obou čištěných epithelinech totožných ještě přibližně 15 dal-ších zbytků aminokyselin.

Byla izolována cDNA, která je kódénrpro úplný prekursorepithelinů krysy a nukleotidový řetězec a odvozený řetězecaminokyselin pro tuto látku je znázorněn na obr. 18. Prekur-sor pro epithelin krysy obsahuje polypeptid s 589 zbytky ami-noky_selin_nichž...17 „zbytků na. „am.ino_terfíii.n.á.lní m. .zakončení..je...signální peptid. V genu pro prekursor epithelinů krysy je pa-trně zakódováno alespoň sedm úplných a od sebe poněkud odliš-ných epithelinů. Vysoká homologie řetězce mezi epitheliny, proněž je kódem cDNA pro prekursor epithelinů krysy je znázorněno-n.a_ob.r-.—1.9-,—kde—je—u-v-edeno—s-r-o-v-naní—v-ni-tř-ní—homo-lo-g-ie—ř-e-tě-z-ce—prekursaru epithelinů krysy. Složitá sekundární struktura ahydropathická analýza prekursoru jsou znázorněny na obr. 20A^3^.2-QS-.—δτ-Ό-ν-ηέη-ί^&amp;εΦδ-ζ-ε-ε-θη^-ηΘ-ίΐ-γ-ΞΌ-Ι-ϊ-η^ρτ-ε^υτ-ΞΘ-Γ-υ-ορ-ί-ΐ-η-εΙτΐηυ-^---^krysy, ‘myši"a člověka je znázorněno na obr. 21A.

Byly rovněž izolovány řetězce DNA pro úplný prekursorepithelinů Člověka, myši á"krysy. Srovnání těchto řetězců jeznázorněno na obr. 21A. Mimoto bylo získáno větší množstvíklonů PCR, které jsou kódem pro různé epitheliny Skotu a"ptá-ků; jak je znázorněno na obr. 24 a 25. Analýza různých řetěz-ců ukazuje, že epithelinům je společné v různém stupni urči-tá struktura, definovaná vysoce uchovávaným řetězcem s oúsa- 20 hen cysteinových zbytků, který je znázorněn na obr. 21C.

Tento řetězec je obecně uchováván v celé skupině epithelinů,jde zejména o skupinu CCXgCCXgCCx^CC, která je téměř úplněuchovávána ve všech dosud známých epithelinech bez ohleduna jejich původ. Výjimky zahrnují první úplné opakování pre-kursoru epithelinů krysy v němž se nachází substituce a uve-dená skupina má tedy strukturu SCXgCCx^SCxjCC·. Mimoto je pa-trně uchováván také hystidinový zbytek v poloze 25 tohoto ře-tězce. Jde patrně o význačnou vlastnost všech epithel-inú avynález proto zahrnuje všechny bílkoviny, které mají tutostrukturní vlastnost. Ha obr. 21B je znázorněno srovnáníúplného epithelinů člověka, krysy a myši. Z každé skupoiny jesrovnáváno sedm epithelinů. řetězec, znázorněný na obr. 21Cje uchován úplně v epithelinech 2 až 7 těchto tří druhů.Řetězec epithelinů 1 se jen nepatrně odlišuje.

Byla analyzována RN-Λ z velkého počtu tkání člověka amyši a buněčné linie tohoto původu na přítomnost transkrip-tů pro epithelin. Získané výsledky jsou shrnuty v následujícítabulce I. 21

Tabulka I

Distribuce tránskriptů pro'expresi epithelinů vrůzných 'tkáních a buňkách člověka a myši člověk silně + slabě + negativní (krysí sonda) placenta vaječník mozek tlusté střevo dvanáctník kůže dřeň ledvin brzlík játra S<ůřa ledvin plíce hypofýza varle ledvina amnion nadledvinka kostní dřeň mléčná žláza mozeček CRL 7386 HfiLlOO Caki-1 HEPM HC'F-7 CRL 155Ό CRO 1572 ' HTB27 Caki-2 HT3132 T47D ~HUiF~' "ΌΈΑΆ-Γ"...... ....... CCL 137 HSB2 U937 karcinom mléčné žlázy HTB131 Wilnisův nádor BT474 HTB36 22

Tabulka I - pokračování myš silně + slabě + negativní fetální střevo srdce placenta vaječník ledvina brzlík slinivka mozek (kůra) muzeček plíce embryo dl5embryo D6játra tlusté střevodvanáctníkkosterní svaly CCL51 CCL51 (ΤΡΛ)

Biologické vlastnosti čištěných.epithelinů 1 a 2 jsoudále podrobněji popsány. Obě bílkoviny jsou stálépo půso-bení^ll-i. kyseiiny^octové .. 1M hydroxidu ..amonného 4M.-fnnftnwiny..,.10mM methajodistanu sodného a po zahřívání 30 minut na tep-lotu 56 °C. Biologická účinnost obou bílkovin může být naru-šena proteolitickými enzymy, redukčními látkami a podobně. 3e zřejmé, že-alespoň některé disulfidové můstky ve struktu-ře' epithelinů jsou nezbytné pro biologickou účinnost. Zdáse, že ani oligosacharidové, ani lipidové skupiny nejsou pod-statné pro účinnost epithelinů 1 nebo2.

Epithelin 1 a epithelin 2 způsobují například inhibicibuněk lidského epidermoidního karcinomu. Epithelin 1 je všakpatrně účinnějším inhibitorem buněčného růstu. Například vy-počítaná specifická účinnost čištěného epithelinů 1 je při-bližně desetinásobkem účinnosti epithelinů 2, mimotu je - 23 - epithelin 1 přibližně 36krát účinnější než epithelin 2 přiinhibici růstu buněk A431. Mimoto v alespoň jedné zkoumanébuněčné linii, kterou byla buněčná linie karcinomu lidskéhotlustého střeva-nebylí epithelin'1- 2 schopen vyvolat účinek,pozorovaný při použití epithelinu .1. Dále bylo možno pozorovar rozdíl v účinku obou epithelinupři stimulaci růstu buněk. Je možno prokázat, že epithelin 1kromě inhibiční účinnosti je schopen stimulovat růst buněkněkolika buněčných linií, takže je patrně skutečným bifunkč-ním modulátorem růstu. Naproti tomu epithelin 2 nebyl schopenvyvolat stimulační účinek na růst alespoň jedné zkoumané bu-něčná.linie. , ,

Patrně nejzajímavějším poznatkem je skutečnost, že epi-thelin 2 specificky antagonisuje stinulační účinek, vyvolanýepithelinem 1 . Přestože prozatím není možno porozumět funkč-ním vztahům mezi těmito a/nebo dalšími epitheliny, je možné,že epithelin 2 má kontrolovat stimulační účinek, vyvolanýepithelinem 1. Může jít o-agonistický/antagonistický funkční 11 vzťa'h"“niez‘i"“epi’th'elineni’l''a‘ eprťh'e líném7 2""a'/nebo—dalšími ‘ kami z této skupiny, takže dochází k potlačování nebo jinémuovlivňování rovnováhy normálního růstu a vývoje buněk. Ztohoto hlediska může být tato rovnováha porušena nebo zcelaodstraněna ztrátou kritické funkce některého z těchto epi-thelinů a může tak dojít například k neomezenému růstu ně-kterých buněk. Je tedy zřejmé, že by patrně bylo možno obno-vit tuto rovnováhu léčebným použitím epithelinů, protilátek proti epithelinúm a/nebo receptorú pro epitheliny.

Schopnost exprese jednotlivých částí prekursoru epi-thelinu může usnadnit stanovení, zda při diferenciálnímzpracování dochází k uvolnění jiných, účinných molekul. Abybylo možno zjistit některé efektory nebo blokátory, bylysrovnány Jseky řetězce, bohaté na cysteinové zbytky, takjak j.e znázorněno na obr.21A a výsledky byly analyzovány. 24 Výsledky jsou uvedeny v dendrogramu na obr. 27. Ve všechpřípadech je možno nalézt alespoň podobný řetězec v téžepoloze prekursoru dalších dvou druhů. Pravděpodobně je ta-to situace důkazem, že původní gen pro epitheliny byl sedm-krát replikován před rozdělením na geny pro člověka a prohlodavce. Tato analýza také ukazuje, že páté opakování pre-kursoru epithelinu je nejpodobnější epithelinu 1 a bude mítpatrně účinek na stimulaci růstu. Mimoto je druhé opakovánínejpodobnější epithelinu 2 a bude pravděpodobně mít antago-nistický účinek na rnitogenní účinek epithelinu 1,

Epithelinové geny mají několik zvláštních vlastností.Skutečnost, že k. expresi genu může dojít v podstatě ve všechtkáních ukazuje na to, že látka hraje svou úlohu v udržovánínormálního růstu epitheliálních buněk na rozdíl od· dříve po-psaných molekul, jejichž distribuce byla daleko více omezena.Struktura, bohatá na cysteinové zbytky v prekursoru epithe-linu je novým řetězcem, který je v průběhu vývoje udržován.Mimoto je možno alespoň dva z těchto řetězců proteolytickyzpracovat na účinné regulátory růstu. Tato konfigurace jepodobná konfiguraci propiomelanokortinu (P0I4C), což je prohormon, zpracovávaný ve tkáních specifickým způsobem zauvolnění rady biologicky účinných peptidů, jak bylo popsánov „publikaci Smith a Funder. 1 ?83. Fndncr_. Rsv_. 9 ? 1 59-79 s; _

Opačný účinek epithelinů 1 a 2 na růst epitheliálních bu-něk připomíná jiné systémy, v nichž přírodně se vyskytující,strukturně příbuzné molekuly jsou antagonisty nebo supresoryúčinku původní molekuly. Příkladem mohou být IL-lra, antago-nista receptářů interleukinu 1 popsaný v Hannum a další, 1990, Nátuře 343:336 - 40 a Eisenberg a další, 1990, Nátuře343:341 - 46, Krev-1, popsaný v Kitayarna a další, 1989, 56:77až 84, bílkovina,, která, potlačuje transformaci, vyvolanouras a inhibin, popsaný v Ling a další,.1985, Proč. Nati. Acad.5ci. USA 32:7217 - 21 , gonadový. protein, který potlačuje bio-logický účinek activinu, popsaného v Ling a další, 1986,. >w 25 Nátuře 321:779 - 82. Je zapotřebí dalšího sledování k inden-tifikaci buněčných receptorů pro epithelin 1 a 2, aby bylomožno zjistit, jak je zprostředkován opačný signál těchtolátek. Nabízí se myšlenka, že oba účinky jsou produkty téhožtranskriptu. Řízení může být zprostředkováno specifickým zpra-cováním ve tkáni v prostoru nebo čase.

Použití epithelinů, nukleových kyselin, které jsou kódem pro tyto látky, protilátek proti epithelinům a epithelinových receptorů

Je zřejmé, že svrchu uvedené látky by mohly mít širokédiagnostické a/nebo léčebné použití. Jde o epitheliny, jejichanalogy a deriváty, o nukleové kyseliny, jejichž řetězec jekódem pro uvedené látky, dále je možno využít také protilátkyproti epithelinům a epithclinové receptory.

Epitheliny, jejich analogy a deriváty t - -.......E-p-i-thel-i-ny-,- jej ich- analogy-a-der.i.váty. .a ..pros-tře.dk.y.- s.. jejich obsahem je možno užít jako takové, ve směsích a/nebospolu s dalšími biologicky účinnými růstovými faktory, in-hibitory nebo imunomodulačními látkami k řízení růstu a/nebovývoje buněk obratlovců in vivo a in vitro. K dosažení různých léčebných účinků je možno užítrůzných epithelinů a prostředků s jejich obsahem. Vzhledemk—růzTréúů—úíTnkutTšpTthOllmíj—i^á^Z^jO—naiiTQ—ty-tO-Wě-1-á-ťky—užítk různým účelům. Avšak přes uvedené rozdíly je možnoobě uved.ené látky užít k potlačení”růstu nádorů vzhledemk tomu,že obě'potlačují růst nádorových buněk, přesto žez obou látek je patrně epithelin 1 účinnější. Zvláštní kom-binace epithelinů a/nebo dalších faktorů budou záviset na,typu cílových buněk a na dalších faktorech. 26 Při použití in vivo je možno prostředky s obsahem uvede-ných látek podávat různým způsobem, například ve formě injek-ce, infuse nebo místně. Je možno použít nosič, přijatelný z ’ fyziologického hlediska, například"fyziologický roztok chlo- ridu sodného, obsahující fosfátový pufr, fyziologický roztok v*» .. jako takový, sterilizovanou vodu a podobně. Epitheliny a pří-buzné molekuly je také možno uzavřít do liposomů a vázat je í-I1 na protilátky, které rozeznávají a váží se na antigeny, spe-cifické pro nádorové buňky, čímž je možno zajistit, že pro-středky dosáhnou cílové tkáně.

Epitheliny mohou být použity in vivo také k vyvoláníterminální diferenciace nádorových buněk. Tyto buňky totižvybočily z běžné diferenciace a jsou proto schopné kontinuál-ního růstu. Normální buňky jsou naprotitomu diferencovány nabuňky, které se za'běžných okolností již dále nedělí. Toznamená, že v případě, že se působením epithelinu podařídosáhnout znovu normální diferenciace v nádorech, dojde ta-ké k zastavení růstu nádoru.

Epitheliny a podobné deriváty a analogy a jejich pepti-dové části je možno užít jako takové nebo spolu s látkami,které potlačují růst, jako jsou interferon, TFG-beta, fak-tor, způsobující nekrosu nádorů a.podobně při. léčbě nádorů.· ___λγλ— j.::- - . -, - . —atacj.-- - - ·*«- t "i /-♦••Τ' - - -r- ' a jiných chorob, spojených s růstem buněk. Karcinomy je mož-no potlačit také,tak, že se vyvolá produkce epíthelinů přímov nádorových buňkách. • Uvedené látky je možno užít také in vitro k innibici růstu buněk nebo buněčných linií, citlivých na epithelink odlišení od buněk, které citlivé nejsou. Tímto způsobem jemožno zbavitr heterogenní směs buněčných linií od nežádoucíchbuněk, citlivých na inhibiční účinnost epithelinu. Je napři-*klad možno in vitro odstranit zhoubné buňky z kostní dřeněpro autologní transplantaci kostní dřeně a odstranit zhoubnébuňky v krvi před jejím vstřiknutím zpět. 27 ' IJejúčinně jší koncentraci epithelinu k inhibici prolife-race dané buňky je možno stanovit tak, že se přidávají k těm-to nádorovým buňkám "různé koncentrace epithelinu a sleduje' še''inhibice růstu buněk. IJejúčinně jší koncentrace kombinací jemožno stanovit sledováním produkce epithelinu v buňkách kar-cinomu.

Stimulaci růstu buněk je možno vyvolat epithelinem 1,příbuznými molekulami a pravděpodobně i jinými látkami z té-že skupiny. Tímto způsobem by bylo možno například urychlithojení ran a regeneraci tkáně. Mimoto by bylo možno neutrali-zací inhibičního účinku těchto látek pomocí protilátek rovněžurychlit hojení ran a regeneraci tkáně, a to za současnéhopodání nebo bez podání epithelinu 1 a podobných látek.

Prostředky s obsahem uvedených látek by bylo možno po-užít také v léčbě kožních chorob, při nichž je možno dosáhnoutrůstu normálních buněk, například při lupence. Přesto že pří-čina vzniku lupenky není dosud známa, je zřejmé, že při one-mocnění dochází k rychlému růstu epitheliálních buněk a jejich .........“'"rychle "změně''n'a‘-'zr'ohO'vě'l'é'' buňky; "T'ato—rych±á -kera-tinisace-má--·-

I za následek ztluštění kůže a je pro nemoc charakteristická.Vzhledem k tomu, že epithelin 1 podporuje růst uvedených bu-něk a jejich kera.tinisaci, mělo by být možné inhibici jehó“účinku potlačit vznik a vývoj této choroby. K uvedenému úče-lu by tedy mě"lo být mož?íé~užTt prosťr^člky,, Ičťěře-potTaČLTjiabnormálně vysokou hladinu epithelinu 1. Bylo také prokázáno,že epithelin 2 působí inhibici stimulace růstu epithelovýchbuněk účinkem epithelinu 1. Z tohoto hlediska by měl”bytpro léčbu lupenky vhodné prostředky s obsahem epithelinu 2.Podobně by mělo být možné také protilátky, schopné neutrali-zovat účinnost epithelinu 1.

Epitheliny a podobné molekuly by měly být použitelnétaké k jiným-léčebným účelům, například pro úpravu angiogenese- 28 a k regeneraci ledvin, k resorpci kostní tkáně, úpravě imu-nologické odpovědi, funkce synaptických a neuronových efek-torů, metabolismu kyseliny arachidonové a funkce pohlavníchžláz s reprodukční funkcí.

Je zřejmé, že by bylo možno užít epitheliny a příbuznémolekuly také k diagnostickým účelům; Při praktickém prove-dení je možno uvedené.polypeptidy označit, například radio-isotopem, enzymem, fluorescenční látkou, chemiluminiscenčnílátkou, fragmentem enzymu, určitou částicí a podobně. Tytoznačící látky je pak možno užít ke zjištění počtu epitheli-nových recepturu v buňce. Identifikace epithelinových recep-turu je ukazatelem potenciální schopnosti buňky odpovědětna biologické účinky epithelinů a příbuzných molekul. Tytolátky je tedy možno užít k detekci epithelinů v prostředí,zejména ve fyziologickém prostředí. Jinak je možno užít ši-rokou škálu diagnostických zkoušek. Přítomnost a koncentrace epithelinů v tělesných tekuti-nách a tkáních může být přímo nebo nepřímo úměrná přítomnostia agresivitě některých zhoubných nádorů a jiných onemocnění,spojených sjooruchami růstu. Zkoušky, jimiž je.možno prokázata/nebo kvantitativně prokázat"epitheliny budou použitelné vdiagnose a prognose uvedených chorob.

Mimoto je možno prokázat zhoubné buňky, u nichž docházík expresi epithelinových receptorů při použití značených epi-thelinů nebo příbuzných molekul pomocí zkoušek na vazbu recep-toru nebo použitím protilátek k samotnému receptorů epithelinů.Buňky je možno od sebe odlišit podle přítomnosti a hustotyepithelinových receptorů, čímž je možno získat prostředek propředpověď citlivosti těchto buněk na biologické účinky epi-thelinov.ých látek. 29

Nukleové kyseliny, které jsou kódem pro epitheliny

Molekuly nukleových kyselin, které,jsou kódem pro.. ep.itherliný nebo fragmenty těchto molekul mohou.být užity jako sondyk detekci a kvantifikaci mRNA, která je kódem pro epithelihy.Zkoušky, při nichž se užívá nukleových kyselin jako sond kdetekci řetězců, obsahujících celý gen nebo jeho'část jsouv oboru dobře známé. Úroveň mRNA pro epithelin může znamenat ,že se-tvoří a/nebo je přítomen zhoubný nádor nebo že‘vznikáa/nebo je v progresi jiné onemocnění, například lupenka'. Uve-dené zkoušky mohou tedy být cennou diagnostickou metodou.

Molekuly RNA pro epithelin proti smyslu řetězce je mož-no léčebně využít"k inhibici translace mRNA, která je ‘kódempro epithelin v případě, že je z léčebných důvodů žádoucívyloučit přítomnost tohoto epithelinu. Například RNA protismyslu řetězce epithelinu 1 může být užito jako látka, anta-gonizující epithelin.1 v případě, že jde o onemocnění, kteréje epitheiinem 1 způsobeno. Mimoto je RNA proti smyslu řetěz-ce epithelinu využít k osvětlení mechanismu působení epitheli-nu.

Molekuly nukleových kyselin, které jsou kódem pro epi-theliny mohou být využity také k získání rekombinantníchbílkovin typu epithelinu a příbuzných molekul, jak již bylosvrchu uvedeno.

Praktické provedení vynálezu bude osvětrleno následují-cími. příklady-. Tyto._priklady...popisu.j.i„výhodná..provedení . Je.však možno navrhnout- ještě další modifikace těchto provedenía jiná provedení, takže -uvedené příklady nemají sloužit -komezení rozsahu vynálezu. 30 Příklady provedení vynálezu Příklaďl 1. Příprava čištěného epithelinu 1 a epithelinu 2 z ledvin krysy '1.1. Čistící postupy 1.1.1. Extrakce ethanolem a kyselinou

Krysí ledviny byly získány od Pel-Freeze (Rogers, Arkan-sas). 430 g vlhké hmotnosti zmrazených krysích ledvin bylouvedeno do suspenze ve 2370 ml extrakčního pufru, tvořeného93¾ methanolem v množství 2343 ml, ethanol obsahoval 19 mlkoncentrované kyseliny chlorovodíkové, 31,5 mg fenylmcthyl-sulfonylfluoridu a 2,3 ml aprotininu s účinností 23 TlU/mlz plíce skotu (Sigma Chemical Co,).Tkán byla rozmrazována4 až 6 hodin při teplotě 4 °C a pak byla homogenizována vzařízení iJaring. Pak byla směs míchána přes noc při teplotě4 °C, odstředěna při 9000 ot/min 40 minut v rotoru SorvallGS-3 a opatrně bylo odstraněno 2200 ml supernatantu; K su-pernatantu bylo přidáno 2200 ml vody a 220 ml okyselené vody í (375 ml vody + 7,5 ml koncentrované HC1), směs byla 1 hodinuenergicky míchána a pak odložena při teplotělmístnosti k roz-dělení na dvě fáze. Horní vodná fáze byla opatrně oddělenaa dialyzována proti 17 litrům 0,1 M kyseliny octové při 4 °Cv dialyzační trubici Spectropore č. 3, oddělující molekulovouhmotnost od přibližně 3000. Dialyzační pufr byl v průběhudvou dnů třikrát vyměněn. Materiál byl lyofilizován, bylozískáno 4,55 g surového extraktu, který byl skladován přiteplotě -20 °C do dalšího použití. - 31 - 1.1.2. Preparativní chromatografie na gelu

Sloupec..Bio-Síl, TSK-250 ,s rozměrem .21.,5 x.6.00,mm(Bio Rad) byl připojen na systém pro vysokotlakou kapalinovouchromatografii HPLC (Waters). Surový extrakt s obsahem 25 mgextraktu/ml byl rozpuštěn v 50% acetonitrilu ve vodě s 0.1 %kyseliny trifluoroctové TFA. Podíl 3 ml této směsi byl nanesenvstřiknutím do sloupce, eluce byla prováděna isokraticky, jakomobilní fáze byl užit 50% acetonitril ve vodě s 0,1 %“ TFA.Rychlost průtuku byla 4 ml/min, rychlost záznamu byla nasta-vena na 0,25 cm/min. Byly odebírány frakce po 6 ml. Chromato-grafie byla prováděna při teplotě místnosti. Pudil každé frak-ce byl odpařen a zkoušen ve trojím opakování na. inhibiční úči-nek' na růst' (GIA) "na buňkách lidského epidermoidního karcinomuA431, jak bude dále popsáno v úseku 1.2.1. Výsledek je znázor-něn na obr. I.

Vrchol s obsahem frakcí 25 až 23 obsahoval hledanou látku.Frakce 25 až 2B z 57 podobných zkoušek byly spojeny, odpařenya l.yofilizovány. Lyofilizovaný materiál měl hmotnost 473 mg aúčinnost přibližně 1,1 x 1CT jednotek'GIA. 1.1.3. HPLC frakcí TSK-250 v reversní fázi

Lyofilizované frakce byly'rozpuštěny ve 240 ml 0,1% TFA -v-e—vodě—směs—by-l-a—ods-t-řed&amp;na—a—supeT-na^-a-n-t—by-1—opa-t-rně—od--- dělen. Celkový objem byl přibližně 250 ml. 125 ml této smě-si bylo vstřiknuto do preparativního sloupce Partisil 10"QD:S-^-3—s^pTům ě-r'em-^č-á-šiTC^l-O^mi-k r OmetT ů^-á-^roz m ěr ech-^-2—2-^x—2-5-c:m v-(Whatman), sloupec byl připojen na systémHPLC. Rychlost'prů-toku byla r4 ml/min. Jakmile vzorek přešel do sloupce, bylsloupec promyt 150.ml,· 0,1¾ TFA ve vodě. Pak byl vytvořenradiální gradient mezi primárním rozpouštědlem, kterým byla0,1%. TFA ve vodě asekundárním rozpouštědlem, obsahujícím 0,1%TFA v acetonitrilu. Bylo užito gradientu 0 až 45’% v průběhu270 minut a pak 45'až 100 % v průběhu 45 minut. Byly odebírány 32 frakce po 14 ml a podíl každé frakce byl analyzován na GIA.Jak je znázorněno na obr. 2, bylo možno pozorovat čtyři ši-roké vrcholy. Druhý pokus byl proveden stejným způsobem. f Dva časně se vymývající vrcholy, a a b obsahovaly epithelin 2 a epithelin 1 a materiál z těchto vrcholů byl dále čištěna charakterizován. Další Čištění těchto látek bude dále od-děleně ppsáno. ( 1.1.4. Další čištění epithelinu 1 HPLC a chromatografiína gelu

Frakce 55 až 59 ze dvou provedení, znázorněné na obr. 2,byly spojeny a zředěny na dvojnásobný objem přidáním 0,1¾ TFAve vodě. Směs byla nanesena na-semipreparativní sloupecyU-Bondapak-013 s rozměrem 7,3 x 300 mm (Uaters), rychlostprůtoku byla 2 ml/min při teplotě místnosti. Sylo užito li-neárního gradientu mezi primárním rozpouštědlem, tj. 0,1¾ TFAve vodě a sekundárním-írozpouštědlen, kterým byla 0,1¾ TFA vacétonitrilu, a to 0 až 13 Vv průběhu 1,3 minut, 18 až13 % v průběhu 20 minut, 13 až 34 % v průběhu 240 minut a34 až 100 ¾ v průběhu 10 minut. Rychlost průtoku v průběhugradientu byla 2 ml/min, byly odebírány frakce s objemem7 ml. Byly odebírány podíly frakcí a zkoumány na GIA. Bylomožno pozorovat dva vrcholy účinnosti_při koncentraci ace-tanitrilu přibližně 24 až 25 jak je znázorněno na obr. 3.

Frakce 30 až 34 byly spojeny a ke spojeným frakcím bylopřidáno 45 ml vody s 0,1 ¾ TFA. Směs byla nanesena isokra- . - ticky na sloupec /U-Bondapak-CH s rozměrem 3,9 x 300 mm (Uaters), rychlost průtoku byla 1 ml/min při teplotě míst- • nosti. Bylo užito gradientu 0 až 10 % v průběhu 1 minuty, 10 až 10 v průběhu 19 minut, 10 až 30 ?í v průběhu 200 mi-nut, 30 až 100¾ v průběhu 7 minutr Rychlost průtoku byla0,5 ml/min, byly odebírány frakce po 1,5 ml. Většina· zkouma- " né látky byla ze sloupce vymyta při koncentraci acétonitrilu 21,5 eí, jak je zřejmé z obr. 4. 33

Frakce 36 až 43 byly spojeny a zředěny 0,1¾ TFA ve voděna konečný objem 115 ml a chromatografovány přesně jako frak-ce 30 až 34 svrchu. Většina hledané látky byla ze sloupce vy-myta ve dvou vrcholech při obsahu přibližně 22,5 a 23,5 aceto-nitrilu, jak je zřejmé z obr. 5.

Frakce 51 a 52 z obr. 4 byly jednotlivě koncentroványna běžném koncentračním zařízení (Savant),'na objem přibliž-ně 70 mikrolitrů, pak byl přidán stejný objem 0,1¾ TF-A vacetonitrilu. Získaný vzorek pak byl nanesen na dva sloupceBio-Sil TSK-250 s rozměrem 7,5 x 303 mm (Bio Rad), zařazených,v sérii. Eluce byla provedena isokraticky, jako mobilní fázebyl užit 50¾ acetonitril ve vodě s 0,1 ¾ TFA při teplotě míst-nosti. Rychlost průtoku byla 0,4 ml/min, rychlost záznamu,·0,25 cm/min. Byly odebírány frakce po 0,4 ml, podíly frakcíbyly podrubeny zkouškám na GI.A. Chromatografické charakteris-tiky frakcí 51 a 52 jsou znázorněny na obr. 6A a-6B.

Frakce 44 a 45, znázorněná na obr. 5 byly jednotlivězahuštěny na objem 70 mikrolitrů apak podrobeny chromatogra-fii na gelu svrchu uvedeným způsobem. Chromatografická charak-teristika těchto, frakcí je uvedena.na obr.. 7. 1.1.5. Další čistění epithelinu 2 pomocí HPLC v revershífázi a chromatografií na gelu

Frakce 50 až 54 ze dvou zkoušek, znázorněné na obr. 2byly spojeny a zředěny na dvojnásobný objem přidáním 0,1¾ ^-^-T-F-A—v:e—vodě-r^Smšs-pak—by-l-a—n-3;R:e-s;ena=-n:a—se:m-i-p-r-ep-a-r;a-t-i-v;n-í "-------- sloupec /U-9onďapak-C18 s rozměrem 7,8 x 30 iiim/ (watěrš),rychlost průtoku‘byla 2 ml/mih. Bylo užito lineárního gradien-tu mezi primárním rozpouštědlem, kterým byla 0,1¾ TFA ve voděa sekundárním rozpouštědlem, 0,1¾ TFA v acetonitrilu. Byloužito Q až 18 v průběhu 1,8 minut, 13 až 18 v průběhu20 minut, 18 až 34 -í v průběhu 240 minut a 34 až 100 ¾ vprůběhu 10 minut. Rychlost průtoku v průběhu gradientu byla 34 2 ml/min. Odebírají .se frakce po 7 ml. Podíly frakcí se zkou-ší na GIA. Chromatografická charakteristika je znázorněna naobr. 8. Hlavní vrchol se vymývá přibližně při koncentraciacetonitrilu 20,5

Frakce 18 až 23 se spojí a zředí 0,1¾ TFA-ve vodě nakonečný objem 110 ml. Směs se nanese na^sloupec ^u-Bondapak-CH s rozměrem 3,? x 303mm, (Waters) při rychlosti průtoku1 ml/mirí při teplotě místnosti. Užije se gradientu 0 *až 10 %v.průběhu 1 minuty, 10 až 10 % v průběhu 19 minut, 10 až 30 Λv průběhu 200 minut a 30 až 100 % v průběhu 7 minut. Rychlostprůtoku byla 0,5 ml/min, byly odebírány frakce po 1,5 ml.Materiál byl vymýván ze sloupce při koncentraci acetonitrilupřibližně 10 jak je znázorněno na obr. 9.

Frakce 36 až 3S z obr. 8 se jednotlivě zahustí na objemypřibližně 70 mikrolitrů, přidá se stejný objem 0,1¾ TFA vacetonitrilu. Vzorek se nanese na dva sloupce 3io-Sil iTSK-2.50s rozměrem 7,5 x 300 mm (3io-Rad), zařazené v sérii. Eluce 7se provádí isokraticky, jako mobilní fáze se užije 50¾ ace-tonitril ve vodě s obsahem 0,1 % TFA. Rychlost průtoku byla0,4 ml/min, byly odebírány frakce po 0,4 ml a jejich podílybyly zkoušeny na GIA. Chromatografická charakteristika frakcí36, 37 a.38 je znázorněna na obr. 10A, 103 a 10C.

Frakce 48 a'49 z obr. 10A až 10C byly spojeny a zahuště-ny na objem přibližně 70 mikrolitrů a pak chromatografoványna gelu svrchu uvedeným způsobem. Charakteristika při rechro-matografii je uvedena na obr. 100. 1.2. Biologické zkoušky 1.2.1. Inhibiční účinnost na růst buněk při použití DNA se125 značeným I-deoxyuridinSm 35

Zkoušky na inhibiční účinnost na růst buněk GIA bylyprováděny na plotnách s plochým dnem s 96 vyhloubenímiFalcon 3072. Jako zkušební buňky pro. DIA byly..užity. buňkyepidermoidního karcinomu vulvy A431. Oo všech vyhloubenís výjimkou periferních vyhloubení bylo uloženo 3,5 x 10^buněk v 50 mikrolitrech prostředí k provádění zkoušek, -kte-ré obsahovalo prostředí DUEM, doplněné 5 % fetálního sera Sko-tu FB5, inaktivovaného teplem, penicilín a streptomycin PS aglutamin. 'Do periferních buněk bylo uloženo 50 mikroritrúPBS. Po 3 hodinách bylo do každého vyhloubení uloženo ještě50 mikrolitrů zkoumaného vzorku, kdežto kontrolní vyhloubeníobsahovala pouze prostředí k provádění zkoušek. Pro každoukoncentraci vzorku byla užita tři vyhloubení. Desky byly in- kubovány 2 až 3 dny při“teplotě 37 °C. Pak bylo přidáno 10D*12 5 1 o 5 mikrolitrů roztoku I-jod-2"- ^I-tíeoxy.uridinu, tj. 125 I-IUdR, 4Ci/mg až 0,5 mCi/ml, 2/Ul/nl v prostředí k prová-dění zkoušek do každého vyhloubení a plotny byly inkuboványpři teplotě 37 °C. Po 4 až 6 hodinách bylo prostředí z vy-hloubení. odstraněno a vyhloubení byla promyta 200 mikrolitryPBS. Pak bylo do každého vyhloubení přidáno 200 mikrolitrůmethanolu a plotny byly inkubovány 10 minut při teplotě míst-nosti, načež byl mé.thanol odstraněn odsátím. Pak bylo~dokaždého vyhloubení přidáno 200 mikrolitrů 1M hydroxidu sod-ného a plotny byly inkubovány 30 minut při teplotě 37 °C.

Pak byl hydroxid sodný odstraněn při použití tamponů (Flow

Labs). Tampony byly přeneseny do zkumavek z plastické hmoty_ s rozměrem 12 x 75 mm a radioaktivita byla odečtena na počí-tači gamma záření, aby bylo možno zjistit množství I-IUdR,.včleněného ,:do„ buněk.— —- —. ~ 1.2.2. Inhibice a stimulace růstu buněk při použití myších.keratocytů

Buňky Balb/HK byly úloženy do vyhloubení ploten Costars 24 vyhloubeními v množství 1 x 10 4 buněk v jednom vyhlou-bení v 1 ml prostředí s nízkým obsahem vápníku, složení je 36 153:279 - 282. Pakpři teplotě- 37 °C.různou koncentrací

Plotny7 byiý-írikdbovány při teplotě"c37" '“Cs obsahem vzduchu a 5 % oxidu uhličitéhotány bez fixace a barvení, počet koloniídny 7 a 10. Kolonie byly definovány jako uvedeno v publikacích Weissroan a Aaronson, 1983, Cell 32: :599 - 606, Carpenťer a Zendegut, 1985, Anal. Biochem. byly plotny inkubovány 4 až 6 hodinProstředí bylo odstraněno a nahrazenozkoumané látky vždy v trojím opakování.

Kontrolní vyhloubení obsahovala pouze prostředí. Plotny by-ly inkubovány 4 dny při teplotě 37 °C, pak bylo prostředíodstraněno, vyhloubení byla dvakrát omyta vždy 1 ml fyzio-logického roztoku, chloridu sodného s fosfátovým pufrem,pak byly buňky rozloženy trypsinem s EDTA a počítány.

Buňky Balb/MK byly taká užity jako indikátorové buňky v plotnách s 96 vyhloubeními ke zjištění inhibiční účinnosti* na růst CIA nebo stimulační účinnosti na růst CSA při použi-125 tí včlenění I-deoxyuridinu do ONA, jak bylo popsáno Svrchu.. -k; 1.2.3. Zkoušky na koloniích na měkkém agaru 0,33 ml základní vrstvy, 0,5¾ agaru (Agar Noble, DifcoLaboratoires, Detroit; Michigan) v DMEM s obsahem 10 % FBS,inaktivovaného teplem bylo přidáno do ploten Costar se 24 Ί vyhloubeními. Pak bylo na základní vrstvu agaru navrstveno0,38 ml, 0,3¾ agaru s obsahem téže směsi prostředí a FBS, dá-le 6 až 12 x 10^ buněk a zkoumaná bílkovina v různé koncentraci. ve vlhké'átmosféřeKolonie byly počí-byl odečítán mezishluk alespoň osmi buněk. 1.3. Stanovení primární struktury 1.3.1. Redukce a S-pyridylethylace _ _ _ ..... - 37 - 10 až 20 mikrogramů bílkoviny'bylo usušeno v polypro-pylenové zkumavce do mikroodstředivky s objemem 1,5 ml, , .. uved_eno do suspenze ve jlOO mikrolitrech 3M močoviny v0,05 Ní tris-HCl o pH 7,5. Pak byly ke směsi přidány, 4 mikro-litry 2-merkaptoethanolu, obsah byl promíchán·,· propláchnutdusíkem a inkubován při 25 °C. Po 2,5 hodinách bylo ke smě-sii.pridáno ještě 4,5 mikrolitrů čerstvě destilovaného 4-vi-nylpyridinu, zkumavka byla znovu propláchnuta dusíkem a in-kubována ještě 2 hodiny při teplotě 25 °C. Pak byla sbiěs oky-selena na pH 2,0 přidáním 10¾ TFA. S-pyridylethylovaný pro-tein byl čištěn HPLC v reversní fázi pří použití sluupcePartisil 5 005-3 s rozměrem 4,6 x 100 mm (dhatman}. Koncen-trace acetonitrilu byla postupně zvyšována rychlostí 1 % zaminutu’ celkem 55 minut při rychlosti průtoku 1 ml/min. Pri-márním rozpouštědlem byla 0,1¾ TFA ve vodě. S-pyridylethylo-vaný epithelin 1, SPE-epithelin 1 a SPE-epithelin 2 bylyvymývány při koncentraci acetonitrilu 25 a 23 jde o kon-centrace, vyšší o 2 až 3 se ve srovnání s čistými epitheliny. 1.3.2. Enzymatické štěpení SPE-epithelinu 1 a SPE-epithelinu 2 Štěpení endopeptidázou Lys-C a TPCK-trypsinem bylo pro-váděno v 60 mikrolitrech Ό,ΙΜ tris-pufru s kyselinou octovouo pH 7,0 celkem 16 hodin při teplotě 25 °C. Poměr enzymu ksubstrátu byl 1 : 5, šlo o hmotnostní poměr. Štěpení endo- —pep-t-i-d-á-z-eu—Ατ-g—a—V-3—z-e—S-—a-u-r-eu-s—b-y-l-o—p-r-o-vá-děno—v— 80—mi-kr-oli-t-rech 0,05M tris-HCl o pH 8,0 s 0,1 t-1 hydrogenuhličitanem amon-ným 16 hodin při teplotě 37 °C. Opět bylo užito hmotnostního i · —pdmčTÍi^e;nz-y;mu—k—su-b-s-t-ré-t-u-M.—-—- --- ——- 1.3.3. Izolace peptidu

Peptidy byly izolovány HPLC v reverzní fázi při použitísloupoce CIO s rozměrem 4,6 x 100 mm (Uhatman), připojenéhona HPLC systém (Uaters). Vzorek, okyselený na pH 2,0 bylnanesen na sloupec v rovnovážném stavu s 0,1¾ TFA jako - 38 - primárním rozpouštědlem při rychlosti průtoku 1 ml/min asloupec byl dále promýván 15 ml 0,1% ΤΓΑ. Pak byl užit li-neární gradient mezi primárním a sekundárním rozpouštědlem,kterým byla 0,1% TFA v acetonitrilu. Bylo užito gradientu -0 až 50 % v průběhu 125 minut a rychlosti průtoku 0,5 mlza minutu. 1,3.4. Analýza aminokyselin

Sušené vzorky byly hydrolyzovány 5,7M kyselinou chloro-vodíkovou- (Pierce)· s obsahem 1 % objemového fenolu za sníže-ného tlaku ve skleněné baňce pro provádění hydrolýzy, utěsně-né teflonem (Pierce) 16 hodin při teplotě 105 °C. Hydrolyzátbyl usušen v koncentračním zařízení Speed Vac (Savant Instru-ments) a pak byl přidán fenylisothiokyanát na 20 minut při ,teplotě místnosti. Vzniklé fenylthiokárbamylové derivátyaminokyselin byly analyzovány HPLC v reversní fázi na sloup-ci Octadecyl s rozměrem 4,5 x 250 mm (IBM). Bylo užito li-neárního gradientu mezi primárním rozpouštědlem, kterým byl0,15M actan sodný o pH 6,4 s 0,05 % triethylaminu, titrova-ného na pH 6,4 kyselinou octovou a sekundárním rozpouštědlem,kterým byl 60% acetonitril, rychlost průtoku byla 1 ml/minpři teplotě 38 °C. 1.3.5. Stanovení řetězce aminokyselin Řetězec byl stanoven při použití analyzátoru v plynnéfázi Applied Biosystem model 475, popsaného v publikaciHewick a další, 1981, 3. Biol. Chem. 256:7990 - 7997. Přednanesením vzorku'byly vždy provedeny tři předběžné cyklyEdmanovy degradace. K převedení triazolinových derivátů nafenylthiohydantionové deriváty aminokyselin byla užita 25%TFA. Identifikace fenylthiohydantoinových derivátů amino-kyselin byla prováděna na analyzátoru Model 120A PTH(Applied Biosystem) podle publikace Hunkapiller a Hood,19B3, Scince 219:650 - 659. - 39 - 1.3.6. Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s tricinem a dodeey1síraném sodným Bílkoviny byly analyzovány na polyakrylamidovém gelus tricinem, dodecylsíranem sodným ve formě normálního sy-stému nebo :mínisystému (Bio-Rad) podle publikace Schagera Gebhard, 1987, Biochem. 166:368 - 379. Bílkoviny bylyprokazovány barvením stříbrem podle publikace Wray a další, 1981, Anal. Biochem. 118:197 - 203. *1 1.4. Vlastnosti epithelinů 1 a 2 1.4.1. Fyzikální a chemické vlastnosti

Epithelin 1 a epithelin 2 jsou odolné proti působení. 1M kyseliny octové, 1M hydroxidu amonného, 6M močoviny, . 0,01 M methajodistanu sodného, proti zahřívání 30 minutna 56 °C a proti, působení různých glykosidáz nebo lipáz. Účinnost je však narušována redukcí a působením 4-vinylpyridi-nu a také štěpením proteinázami, jako jsou trypsin a endo- .p.r.o_t.e.i.n.áz.y. .Lys.-C„,a. _.Ty_to ...v.ýsl.edky,.ukazu jí., „..že________________________ jde o bílkoviny s obsahem cysteinových zbytků a disulfidovýchmůstků mezi těmito zbytky, které jsou podstatné pro biologic-kou účinnost. Bílkoviny neobsahuji zbytky oligosacharidůa/nebo lipidů, nezbytné pro biologický účinek. 1.4.2. Čištění epithelinů a některé fyzikální vlastnosti

Shrnutí čistících postupů je uvedeno v náTlěďljjíčí^htabulkách I a II. Oba faktory byly čištěny až do homogenityv Šesti stupních. Původní frakce*obsahují řadu faktorů, ,inhibujících růst buněk A431. Epithelin 1 a 2 tvoří jenvelmi malý. podíl celkové GIA v časných frakcích, takže jevelmi obtížné zjistit specifickou účinnost. Pro epithelin 1je tato účinnost 2,1 x 1θ\ pro epithelin 2 3,8 x 10^ jedno-tek/mg bílkoviny. j 40 -

Tabu l^k a II Čištění epithelinu 1 (GIA) frákčě bílko^ /□9 /ina GIA ,jednotky specifickáúčinnost/mg výtěžek % surový extrakt 4 550 000 1 283 1002 282 - Prep ΤΞΚ-250 473 000 112 2002 237 • - Prep. ODS (b) 17 600 14 100 601 100 Semi Prep. C18 lb 1 510 2 080 1 377 14,8 2b 33 460 5 460 1 578 38,7 Anal. Cyano lb 60 713 11 889 3,4 2b 73 1 190 16 301 8,4 Anal. Tsk-250 Ί lb 41 845 20 609 6,0 2b 62 1 305 21 048 9,3

Jedna jednotka GIA je množství faktoru, jehož je zapotřebí125 k 50¾ inhibici I-znaČeného deoxyuridinu do buněk A431. V těchto frakcích jsou patrně přítomny ještě další inhibič-ní faktory. Uvedeně hodnoty zahrnují všechny faktory, pří-tomné v surovém extraktu a v první frakci po počátečnímčištění. Λ 41 - Tabu 1 k a III Čištění epithelinu 2 (GIA) frakce bílkoviny GIA 1 1 specifická výtěžek /ug jednotky účinnost j mg % surový extrakt 4 550 000 1 2B3 1002 282 Prep TSK-250 473 000 112 2OO2 237 - Prep. ODS (b) 24 500 3 567 432 100 Semi Prep. CIS 4 760 1 190 250 12,4 Anal. Cyano 169 460 2 741 4,8 Anal TSK-250 37 141 3 810 1,5 □edria jednotka GIA je množství .faktoru, jehož je zapotřebí125 pro 50.¾ inhibici I-značeného deoxyur.idinu do buněk A431. -------těCh10- f rakc£-ch“jsou -pa tr ně přít omny~ještě'-daiší‘“lnhib ič- ní faktory. Uvedené hondoty zahrnují všechny, faktory, pří-tomné v surovém extraktu a v první frakci po počátečnímčištění.

Molekulová^hmotnost epithelinu 1 a epithelinu 2 bylastanovena chromatografií na gelu TSK-250, molekulová hmot-nost je přibližně 4500 a 3700, jak je znázorněno na obr. 6, 7 a -10-. SPE-epithelin 1 nebo 2 má molekulovou hmotnost při-.,bližně 13 000 při téže chromatografii.

Na obr. 11 je znázorněna analýza epithelinu 1 aepithelinu 2 na 18.¾ polya.krylamidovém gelu za redukčníchpodmínek. Tyto látky se v gelu pohybují jako jednotlivé pá-sy se střední molekulovou hmotností přibližně 5500 a 6000.Podobných výsledků bylo dosaženo při elektroforéze za ne- 42 redukčních podmínek. To znamená, že epitheliny jsou bílkovinys jednoduchým řetězcem a nízkou molekulovou hmotností. 1.4.3. Chemická struktura epithélinu 1 a epithelinu 2 ' i’ Řetězec aminokyselin epithelinu 1 a epithelinu 2 bylodvozen od analýzy- S-pyridylethylovaných bílkovin a fragmen-ty byly získány působením endoproteinázy Lys-C, V8 za Sta-phylococcus aureus a trypsinu TPCK. Řetězec aminokyselin proobě uvedené látky je znázorněn na obr. 12. Řetězec bílkovin epithelinu 1 a epithelinu 2 byl srov-náván s řetězcem všech bílkovin, jejichž řetězce jsou ^Loženyv National Biomedical Research Foubdation(skupina 22), vGenetic Sequence Oata Bank (Bolt Beranek and Newman, LosAlamos National Laboratory, skupina 61) a European Molecular...Biology Laboratory (skupina 20). Tyto výzkumy s pomocí počí-tače prokázaly, že obě bílkoviny jsou nové a nejsou v podsta-tě homologní s žádnou bílkovinou z uvedených tří souborů.

Epithelin la epithelin 2 jsou polypeptidy s 56 a 57zbytky aminokyselin, vypočítaná molekulová hmotnost je 6060a 6094. Obě látky mají 47¾ homologii na úrovni aminokyselin.Obě obsahují 12 cysteinových zbytků, 4 dvojité cysteinovézbytky. To^znamená’ že přibližné 2Ϊ7% zbytku aminokyselin 'v obou bílkovinách jsou cysteinové zbytky. Mimoto jsou od-stupy těchto zbytků a jejich místo uložení totožné v oboulátkách. Přestože počet nebo poloha disulfidových můstkůuvnitř řetězce těchto bílkovin není dosud znám, je pravděpo-dobné, že uložení těchto struktur je rovněž totožný. Oběbílkoviny také obsahují přibližně 13 % hydroxyamihokyselin,to znamená šeřinu a threoninu. Srovnání řetězce obou látekje znázorněno na obr. 12. Je zřejmé, že kromě cysteinovýchzbytků jěobžma~látkám společný ještě 15 dalších zbytkůaminokyselin. - 43 -

Hydropathická analýza epithelinů 1 a 2 je znázorněnana obr. 13. Obě látky sd chovají při této analýze velmi po-dobně, až na to, že epithelin 2 je o něco hydrofilnější nežepithelin 1. 1.4.4. Biologické vlastnosti epithslinu 1 a epithelinů 2 los

Inhibice včlenění I-deoxyuridinu do DNA buněk lid-ského epidermoidního karcinomu A431 působením různých kon-centrací čištěného epithelinů 1 a 2 je znázorněna na obr, 14,50¾ inhibici syntézy DNA je možno pozorovat u množství epi-thelinu 1 12,8 ng/vyhloubení a u epithelinů 2 v množství450- ng/vyhloubení. To znamená, že k 50¾ inhibici docházíu epithelinů 1 při koncentraci přibližně 21 nM a u epitheli-nu 2 v koncentraci 0,75 ^uM. To znamená, že epithelin 1 jepřibližně 36x účinnější. 125

Byl zkoumán také vliv epithelinů na včlenění I--deoxyuridinu do DNA různých nádorových i nenádorových bu-něčných linií a do několika buněčných linií jiného než lidské-ho původu. Epithelin I v ,fpax_ifnálni dávce 20 ng/ml způsobil -mírnou inhibici růstu buněk karcinomu lidského tlustéhostřeva HCT 116, kdežto epithelin 2 v maximální zkoumanédávce 270 ng/ml neprokázal žádný účinek na tuto buněčnou linii. Obě látky statisticky významně potlačovaly včle- 225 ' 1 ·* ‘ · ně.ní__I^.d.e.o.x.y.u.r.id.i.n.u_do_D.N.A_b.uně.k_p.l.í.c.e_no.r.k.a_C.C.I__6^_a_d.o_ buněk opičích ledvin COSI. Ani jedna z uvedených bílkovinneměla prokazatelný účinek na lidské fibroblasty a některé d.al.š.í^-buňk-y^llds.k-ý.e h-^n ádo rO—v-^m a^x-im ál.nrí ^.zk .o u m.an.é^d.á -v-c.e -r—------- 20 ng/ml epithelinů 1 a 270 ng/ml epithelinů 2. Účinek různých koncentrací obou látek na včlenění 125 I-deoxyuridinu do DNA keratocytů myši Balb/MK je uvedenna obr. 15A. Epithelin 1 podporoval včlenění uvedena látkyv závislosti na dávce, kdežto epithelin 2 neměl žádný pro-kazatelný účinek. Na druhé straně však působil epithelin 2inhibici včlenění I-deoxyuridi nu do buněk Balb/MK, vyvo-lané epithelinem .1,. jak je zřejmé z obr. 15B. Při této zkoušce 44 bylo možno pozorovat 50% inhibici uvedeného pochodu při kon-centraci epithelinu 2 přibližně 21 nM. To znamená, že v tom-to systému antagonizuje epithelin 2 účinek epithelinu 1..

Kontinuální růst buněčné linie myších keratocytů,Balb/MK závisí na EGF, TGFalfa nebo na amphiregulinu AR.

Buňky. Balb/MK neproliferují v nepřítomností EGF nebo epitheli-nu 1, jak je zřejmé z obr. 16A, kdežto epithelin 2 neměl žád-ný prokazatelný účinek na růst těchto buněk. Epithelin 2 všakzpůsobil inhibici růstu buněk Balb/MK, vyvolaného epithelinem1 v závislosti na dávce, jak je zřejmé z obr. 16B. 50% inhi-bici bylo možno pozorovat při koncentraci přibližně 7 nMepithelinu 2. EGF nebo TGFalfa indukují nezávislý růst buněkkrysích ledvin NRK-5A6 za přítomnosti TGF.beta, jak bylo po-psáno v publikaci Roberts a další, 1981, Proč. Natl.Acad. Sci.USA 78:5339 - 5344. Stejně jako EGF, vyvolává také epithelin 1 nezávislý růst buněk NRK v závislosti na dávce, jak je zřej-mé z obr. 17, kdežto epithelin 2 tento účinek,nemá. Epithelin 2 v koncentraci přibližně 85 nM působí-přibližně 50% inhibicitvorby kolonií na měkkém agaru, vyvolané epithelinem 1. Mimo-;to působí epithelin 1, avšak nikoliv epithelin 2 mitogenníaktivitu buněk NRK v jednoduché vrstvě.

Ani epithelin 1 ani epithelin 2 neovlivňují statistickyvýznamně vazbu 1Ai,Í^EGF na receptory této látky, což naznaču-je, že biologický účinek epithelinů není zprostředkováván přesreceptory EGF. - 45 - Příklad 2

Klonování cDNA pro pr-ekursor epithelinu a přechodnáexprese prekursoru i úplné formy 1 1/1 η η n <5 λ 4 πΠ.ΜΑ nnmor»/ P Γ* f? x* i\x μ » i w v «3 11 x upun mwíiiwwx » uu

Byly: syntetizovány dvě skupiny degenerovaných oligo-nukleotidů na bázi peptidových řetězců KTQCPDD a HCCPQDT zepithelinu 2, jedna ze skupin obsahovala 256 a druhá 128degenerovaných oligonukleotidů ve smyslu a proti smysluřetězce. Tyto oligonukleotidy byly užity jako primery ve40 cyklech amplifikace PCR při použití templátu, kterýmbyla cDNA s jednoduchým řetězcem, odvozená od RNA krysíledviny po použití řetězce XSCT17 jako primeru. Jde o oligo-nukleotid s obsahem řetězce T·^ na 3'-zakončení, tato látkabyla popsána v publikaci Plowman a další, 1990, Proč. Nati.Acad. Sci. U.S.A. 87:4905 - 06. Oligonukleotidová sonda na bázi řetězce KYGCCPMP epithelinu 2, s obsahem 256 nukleoti-32 dů byla označena gamraa- P-ATP a užita k sériovému vyšetření__pra.djjktjL_PC.R_·_______________________......_______________________

Hybridizace této sondy při zkoušce Southern blot 'pro-duktu PCR prokázala dva hlavní pásy o 120 bp a 600 bp a malýpás o 325 bp. Tyto fragmenty; byly subklonovány a jejich řetě—zec-b-y-1—anal-y-z-o-ván-,—čí mž-b-y-lo-z jištěno-,_že_vse.c.h.n.y_f.r.a.gmen.t.y. měly. společné 5'-zakončení, které je kódem pro epithelin 2.Malý fragment o 325 bp měl řetězec, který byl kódem jak pro —e p-i-the-l-i-n^1^—ta k—pr-o—s p-i-t hel-tn—2-,—kd ež-ΐ o-p ás-o-60 Q-b p^zsse—hoval dále ke 3 -zakončení a obsahoval další kopii řetězce,bohatého na cysteinové zbytky. Epithelin 1 a 2 jsou tedypatrně produkty jediného transkriptu, v němž jsoo 'zařazenyza sebou. Tytéž primery PCR byly užity k izolaci podobnýchfragmentů, prekursorů epithelinu a dDiJA člověka, skotu, myšia kuřete, což znamená, že v průběhu vývoje došlo k uchovánířetězce, bohatého na cysteinové zbytky. 46 Úplná cDNA pro epitheliny byla získána z krysy, myšia člověka při použití PCR za izolace 5'- a 3'-zakončení přiznáméím středovém řetězci a při sledování sestav lambdagtlO.Bylo užito PCR s primery pro epithelin, orientovanými ve smě-ru 3- a 5- v kombinaci s primery, které jsou schopny se vá-zat na přírodní poly(A) zakončení nebo na syntetický poly(A)řetězec, navázaný na cDNA, prodlouženou ve směru 5', jak by-lo uvedeno v publikaci Plowman a další, 1990, Proč. Nati.

Acad. U.S.A. 87:4905 - OB. Sestava cDNA buněk z krysích led-,viň byla konstruována^v lambdagtlO podle publikace Plowman adalší, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:1969 - 81 a cDNA epithelinu . krysy s plnou délkou řetězce byla izolována vyšetřením 2,0 x5 x 10 rekombinant pomocí sond, získaných PCR. Tyto sondy by-ly také užity k získání myšího genu pro epithelin ze sestavymyšího genomu T-buněk (Stratagene, La Oolla, CA). Byly analy-zovány řetězce několika klonů, získaných-PCR, klonů cDNA kry-sy a klonů myšího genomu při použití T7-polymerázy a oligo-nukleotidových příměrů podle publikace Tábor a Richardson 1987,,Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 84:4767 - 71.

Složený řetězec cDNA pro epithelin krysy, znázorněnýna obr. 18 má délku 2150 bp, což se velmi blíží transkriptuo 2,3 kb, který byl zjištěn analýzou northern blot při použi-tí mRNA z krysí ledviny. V tomto řetězci se nachází preproteins 589-zbytky_5-5,^-nepřen.espnnu^nhiaAtí n 30'hn-a 3^nepřensíšat-nou oblastí o 343 bp. První AUG je následován N-terminálnímhydrofobním signálním peptidem s obsahem 16 aminokyselin a pak573 aminokyselinami prékursoru úplného epithelinu s molekulo-vou hmotností 61 597. Tento prekursor nemá transmembránovouoblast, obsahuje tři potenciální N-vázané glykosylační skupi-ny a 88 cysteinových zbytků. Jeho řetězec se opakuje, jak jeznázorněno na obr. 19 a obsahuje sedm za sebou zařazených ko-pií řetězce s 55 až 57 aminokyselinami: τ 47 - VXCX. ,CXcCCXQCCXrCCXDXQHCCPX.CXc ,CX„.5-6 586 2 4 5-6 2

Dvě opakování representují známé aktivní molekuly, to znamenáepithelin 1 a 2. Předpověděný řétězec aminokyselin pro prekur-sory epithelinu myši a člověka obsahuje 589 a 593 zbytků av případě myši je totožný na 86 °í a v případě člověka na 75 %s toutéž látkou u krysy, jak je znázorněno na obr. 21A. Mohouexistovat ještě další -isoformy epithelinu vzhledem k tomu, žejeden z klonů cDNA krysy má vypuštěný řetězec, jak je zřejméz obr. 21A, kde chybí 234 bp v rozmezí aminokyselin 398 až475. Tím vzniká chimérní řetězec. Toto vypuštění je patrnědůsledkem odlišného štěpení, vzhledem k tomu, že ohraničenívypuštěné části přesně odpovídá umístění spojení mezi exonema intronem v genu pro epithelin myši.

Srovnání řetězce apithelinu se skutečnou bílkovinoua s databasemi, týkajícími se řetězců DNA prokazuje tři ob-lasti homologie se známými bílkovinami. Prvních 41 aminokyselinza signálním řetězcem prekursoru pro epithelin obsahuje šestcysteinových zbytků, které tvoří řetězec, obdobný N-terminál- ______________„ní . p.o.l.o.v.in.ě...d.al.š.í c.b__.s.e.dmi~ř.e.tězc.ů.,F. b.o.h.a.týc.h...n.a; c.y.s.t.eino.vé.;___________ v„......... ... zbytky. Řetězec CPDGQFCPVACC je zcela totožný v epithelinechčlověka, krysy a myši,' což odpovídá například uchovávání řetěz-ce v jedech hadů, jak bylo popsáno v publikaci Dufton 1984, 3. Mol. Evol, 20:128 - 3.4. Druhá oblast homologie existuje -ve—tř-ech—ř-e-tě-z-G-í-ch-,—boha-t-ých—ns—c-y-s-te-i-no-vé—z-b-y-tk-y—v—k-r-y-s-í-m—;—- epithelinu, jde o řetězec CCX2KX2C, který odpovídá řetězciv bezprostřední blízkosti účinného řetězce fosfolipázy A2, ~ : — j-ak^byl-o^pop s-áno—v-publ-i-k-aci—G ome-z^a--d^l-š-i~l-9O9^3^E-uT-^3-;— - --

Biochem. 186:23 33. Konečně existuje rozšířená homologie mezi řetězci s dvanácti cysteinovými zbytky "epithelinu a C--terminální řídící oblasti pro thiolprodieázu rajčete, jak je.

•M znázorněno na obr. 21D. Tato nekatalytická oblast patrně řídíúčinnost proteázy vazbou na těžké kovy. Střídající se cystei-nové a histidinové zbytky v prekursoru epithelinu upomínajína oblasti pro vazbu kovu v různých bílkovinách, přestože 48 řetězec epithelinuínení totožný s žádném ze známých řetězcůpro vazbu kovu. Při analýze Northern block je možno prokázat,že dochází ve všech buňkách k transkripci epithelinového ře-tězce o 2,3 kb, tento řetězec převažuje v dospělé, ledvině,placentě, srdci, dvanáctníku, tlusném střevu a mozkové kůře.Mimoto je přítomen v celé řadě buněčných linií epitheliálníchnádorů. Analýzou Southern block je možno prokázat, že kódempro prekursór epithelinu je jediná kopie genu. Výsledky ukazují pravděpodobně na post-transkripční mechanismus vzniku účinné molekuly z prekursoru epithelinu.·

2.2. Exprese v buňkách COS

Biochemické vlastnosti krysího epithelinu byly stano-veny tak, že úplný kódový řetězec pro tuto látku byl uložendo vektoru pro expresí pod řízením promotoru cytomegaloviru -podle publikace Seed a Aruffo, 1987, Proč. Nati. Acad. Sci.USA, 84:3365 - 69. Postupuje se tak, že se fragment o 1,6 kbs obsahem úplného kódového řetězce pro krysí epithelin uložído vektoru na bázi cDM8, čímž vznikne vektor pro expresicrEPNl.6. Podobná konstrukce, crEPN1.4 byla připravena tak, -že byl uložen fragment o 1,35 kb z cDNA epithelinu s jediným'vypuštěním exonu, tj. aminokyselin, 398 až 475. Plasmidy pro‘sekreci, cbetarEPNl a cbetarEPN2 byly zkonstruovány tak, že ki t t "} η n i. X *τ X n í* , i a + λ + ΐ « !? ΐ r-i XI n + T ΓΪ C, _ l··» *1 . · r-» *“* j x i ju « u t- m i » w /' i 4 * w v χ'ύ ' Vj-·^ uj x y i iUXi ιχ x u v k-r x. O- w Η» x w w tzi " ' w w v u x “ — — oligonukleotidy hppsglrllpll5' AGCTTCTGCAGGGGCGGGGCCTCCCCC ATGCCGCCCTČCGGGCTGCGGCTGCTGCCGCTGCTG3' AGACGTCCCCGCCCCGGAGGGGG TACGGCGGGAuGCCCGACGCCGACGACGuCGACGAí. L- PLLWLLV LTPSRPA ACTACCGCTGCTGTGGCTACTGGTGCTGacgcCTAGCCGGCCGGCCGC 3'GATGGCGACGACACCGATGACCACGACTGCGGATCGGCCGGCCGG 5' 49 a PCR získané fragmenty SacII-Xbal s obsahem kódového řetězcepro epithelin 1 a 2 byly uloženy do cDMSSII, rozštěpenéhoHindlII a Xbal. cDM8SII je modifikovaný vektor cDM8, v němžbylo jediné místo štěpení Sadí odstraněna Klenowovým frag-mentem. Nové místo působení SacII ukládá konečný zbytek gly-cinu signálního peptidu do správného směru odečítání s kódo-vým řetězcem pro epithelin. Plasmidy pro expresi byly pěstová-ny v bakteriích MC1061/F5 a pak uloženy do buněk COS-1 při po-užití postupu s užitím DEAE-dextronu podle publikace -Seed aÁruffo, 1987, Proč.. Nati. Acad.Sci., USA, 84:3365 -69. Po48 hodinách po transfekci byly buňky promyty fyziologickýmroztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem a značeny 16hodin v prostředí ΜΕΜζ prostém sera v množství 4 ml na plotnus průměrem 100 mm, prostředí bylo doplněno žíO/uCi/ml^S-cy-steinu (1100 Ci/mmol, New England Nuclear). Značené superna-tanty byly dialyzovány proti 0,1 N kyselině octové, sušeny aekvivalenty po 1 ml byly podrobeny analýze na 10¾ nebo 15¾SDS-polyakrylamido.vém gelu. Bílkovina, k jejíž expresi na přechodnou dobu došlobyla prokazována analýzou supernatantů, značených ^g_CyS-te£_nem na SDS-PAGE. Rekombinantní bílkovina měla molekuívoouhmotnost přibližně 75K, poněkud vyšší než předpokládanouhodnotu 62K, pravděpodobně v důslekdu glykosylace, jak jezřejmé z dráhy 1 na obr. 26A. Podobná konstrukce, která jekódem pro isoformu epithelinu, avšak nemá exon v'C-termiňáÍ-ní oblasti se pohybuje s průměrem 68K, což odpovídá vy-puštění 78 zbytků aminokyselin. Nebyl podán žádný důkaz zpra- cováníprekursorů na kratší formy. Aby bylo možno dosáhnoutexprese úplných-rekombinantních epithelinů 1 a 2, byly je-·jich kódové řetězce uložena do vektoru pro expresi za synte-tický řetězec pro signální peptidy cbetarEPNl a cbetarEPN2,čímž došlo k sekreci bílkovin o 6K z.buněk COS, jak je zřej-mé z obr. 268. Buňky po transfekci těmito konstrukcemi rostlypomalu a jejich morfologie byla poněkud odlišná, řada buněkměla prstencový tvar ve srovnání s neporušenými buňkami, u‘nichž byla provedena pouze simulovaná transfekce. Supernatant, 50 získaný z buněk po transfekci cbetarEPNl byl částečně čištěnna sloupci Bio-Sil TSK-250 podle publikace Shoyab a další,1990, 87:4905 - 09 a frakce byly zkoumány na schopnost in-hibice GIA na buňkách A4311 Tyto buňky vylučovaly účinnýepithelin 1, přibližně 25 jednotek GIA na plotnu s průměrem100 mm, kdežto supernatant z buněk po simulované transfekcineměl žádnou prokazatelnou účinnost. Jedna'jednotka GIA od-1povídá množství látky, jehož je zapotřebí k 50¾ inhibicirůstu buněk.

Epithelin 1 má inhibíční účinek na buňky A431 a působíjako mitogen u několika normálních epitheliálních buněčnýchlinií, jak bylo uvedeno v příkladu 1. Mimoto může epithelin1 vyvolat nezávislý růst fibroblastů krysí ledviny zu; pří-tomnosti transformujícího růstového faktoru beta, jak jezřejmé z obr. 17. Naproti tomu nemá epithelin 2 žádný vlivna růst keratocytů a fibroblastů hlodavců a potlačuje mitho-genní účinek epithelinu 1 v závislosti na dávce v obou těch-to systémech, jak je zřejmé z obr. 17. Nezpracovaný prekursorepithelinu neměl při těchto zkouškách žádný účinek; Je možné,že neporušený prekursor hraje zcela jinou úlohu než zpraoova- I- né formy, jako je tomu například u chelatovaných kovovýchiontů nebo při. řízení proteázy a fosfolipázy.

Claims (43)

1. 51 - PATENTOVÉ NÁROKY ' 1. Prekursor lidského epithelinu s řetězcem aminokyselin, znázorněným na obr. 22 v rozsahu zbytků aminokyselin 1 až 593. .
2. 2. Lidský epithelin i s řetězcem-’aminokyselin, znázor- ? něným na obr.. 22.v rozsahu zbytku aminokyselin 2B2 až 337.
3. 3. Lidský epithelin 2 s řetězcem aminokyselin, znázor-něným na obr. 22 v rozsahu zbytku aminokyselin 206 až 262.
4. 4. Lidský epithelin s řetězcem aminokyselin, znázor-něným na obr. 22 v rozsahu áytků aminokyselin 59 až 114*
5. 5. Lidský epithelin s řetězcem aminokyselin, znázor-něným na obr. 22 v rozsahu zbytků aminokyselin 124 až ISO.
6. 6. Lidský epithelin s řetězcem aminokyselin, znázor-něným na obr. 22 v rozsahu zbytků aminokyselin 364 až 418. , * —__7.„l_-i-dsk-ý-epl-the-l-in-s-řetězcem-aminokyselin-,- -zná-zorněným —--------------- na obr. 22 v rozsahu zbytků aminokyselin 442 až 497.
7. 8. Lidský epithelin s řetězcem; aminokyselin, znázorněnýmna obr. 22 v rozsahu zbytků aminokyselin 519 až 574.
8. 9. Molekula nukleové kyseliny, vyznačujícíse. tím, že' je kódem přo prekursor lidského epithelinu “ano bsa n ďje^nii kTěutíd Wý^řWěYďčT^žífáToTh ě'ný^n;a~o bTT^Ž^-v”-rozsahu nukleotidů 41 až 1819.
9. 10. Molekula ribonukleové kyseliny proti smyslu řetězce,vyznačující se tím, že je komplementární kmolekule nukleové kyseliny podle nároku 9.
10. 11. Prekursor epithelinu krysy s řetězcem aminokyselin/znázorněným na obr. 18 v rozsahu zbytků aminokyselin 1 až 589. 52 X2. Epithelin krysy 1 s řetězcem aminokyselin, znázorně-ným na obr. 18 v rozsahu zbytků aminokyselin 250 až 335.
11. 13. Epithelin krysy 2 s řetězcem aminokyselin, znázorně-ným na obr. 18 v rozsahu zbytků aminokyselin 205 až 261.
12. 14. Epithelin krysy s řetězcem, aminokyselin, znázorně-ným na obr. 18 v rozsahu zbytků aminokyselin 59 až.114.
13. 15.. Epithelin krysy s řetězcem aminokyselin, znázorně-ným na obr. 18 v rozsahu zbytků aminokyselin 123 až 179.
14. 16. Epithelin krysy s řetězcem aminokyselin, znázor.ně_ným na obr. 18 v rozsahu zbytků aminokyselin 362 až 416.
15. 17. Epithelin krysy s řetězcem aminokyselin, znázorně-nýmna obr. 1B v rozsahu zbytků aminokyselin 440 až 449.
16. 18. Epithelin krysy s řetězcem aminokyselin, znázorně-ným na obr. 18 v rozsahu zbytků aminokyselin 515 až 570. * 19. Molekula nukleové kyseliny, vyznačujícíse tím ,že je kódem pro prekursor epithelinu a je tvo-řena nukleotidovým řetězcem z obr. 1B v rozsahu nukleotidů 71 ^ί·1ΤΟ7- ...< . ,,_________________ .. ______, ... · ..........
17. 20. Molekula ribonukleové kyseliny proti smyslu řetězce’,vyznačující se tím,, že je komplementární kmolekule nukleové kyseliny podle nároku 19.
18. 21. Prekursor myšího epithelinu s řetězcem aminokyselin,znázorněným na obr. 23, v rozsahu zbytků aminokyselin 1 až 589, " 22. Epithelin myši 1 s řetězcem aminokyselin, znázorně- ným na obr. 23 v rozsahu zbytků aminokyselin 280 až 335. *· 1 53 -
19. 23. Epithelin myši 2 s řetězcem aminokyselin, znázorně-ným na obr. 23 v rozsahu aminokyselin 2D5 až 261.
20. 24. Epithelin myši s řetězcem aminokyselin;, znázorněnýmna obr. 23 v rozsahu aminokyselin 59 až 114.
21. 25. Epithelin myši s řetězcem aminokyselin., znázorněnýmna obr. 23 v rozsahu aminokyselin 123 až 179.
22. 26. Epithelin myši s řetězcem aminokyselin, znázorněnýmna obr. 23 v rozsahu aminokyselin 362 až 416.
23. 27. Epithelin myši s řetězcem aminokyselin, znázorněnýmna obr. 23 v rozsahu aminokyselin 440 až ,495 .
24. 28. Epithelin myši s řetězcem aminokyselin, znázorněnýmna obr. 23 v rozsahu aminokyselin 515..až 570.
25. 29. Molekula nukleové kyseliny, vyznačujícíse t í m , že je kódem pro prekursor epithelinu myši a __________ ________její nukleotidový řetězec je z_názorněn na_obr. 23 v rozsahu^ nukleotidů 8 až 1774. %
26. 30. Molekula ribonukleové kyseliny proti smyslu řetězcevyznačující se tím, že-je komplementární k —_,_mo.l.ek.ul.e_n.u.k.le.o.v.é_ky.s.e.l.i.ny_p.o.d.l.e._o.á r.oJí.u_2 9_.___
27. 31. Polypeptid s řetězcem aminokyselin obecného vzorce ·. X2CX5_6CX5CCX8CCX6CCXDX2HECPX4CX-5_6CX2' kde c znamená zbytek cysteinu, 0 znamená zbytek kyseliny asparagové, H znamená zbytek histidinu,í P znamená zbytek prolinu a X znamená zbytek jakékoliv aminokyseliny. 54
28. 35. Polypeptid s řetězcem aminokyselin.obecného vzorce ccx0ccx6ccx5cc ' kde C znamená zbytek cysteinu a X znamená zbytek jakékoliv aminokyseliny.

    34. Farmaceutický prostředek pro potlačení růstu neo-plastických buněk, vyznačující se tím, žejako svou účinnou složku obsahuje alespoň jeden epithelin.

    35. Farmaceutický prostředek podle nároku 34, vy-značující se tím, že jako svou účinnou složkuobsahuje epithelin 1.
29. 36. Farmaceutický prostředek podle nároku 34, vy-značující se tím, že jako svou účinnou složkuobsahuje epithelin 2. 55 - ·* ··*··Z?,
30. 37. Farmaceutický prostředek pro léčbu neoplašií, v y-značující s e_ . t í m, že jako .svou pčinnou složkuobsahuje alespoň jeden epithelin v množství, účinném pro po-tlačení růstu neoplastických buněk.
31. 38. Farmaceutický prostředek podle nároku 37, vy-zná č u j í cí set í m, že jako svou účinnou složkuobsahuje epithelin 1.
32. 39. Farmaceutický prostředek podle nároku 37, vy-značující se tím, Že jako svou účinnou slož-ku obsahuje epithelin 2.
33. 40. Farmaceutický prostředek k urychlení hojení ran,vyznačující setím, žé jako svou účinnousložku obsahuje alespoň jeden epithelin v množství, stimulu-jícím proliferaci epitheliálních buněk.
34. 41. Farmaceutický prostředek podle nároku 40, vy-značují c: í se tím, že jako svou účinnou slož-ku obsahuje epithelin 1. ,42. Farmaceutický prostředek k urychlení hojení .ran,v y z na č u jící s e t í m , že jako svou účinnousložku obsahuje antagonistu epithelinu 2 v množství, účin-ném k antagonizaci antagonizujícího účinku epithelinu 2 naepithelin 1.
35. 43. Farmaceutický prostředek podle nároku 42, vy-značující se tím, že prostředek obsahujeještě alespoň jeden epithelin.
36. 44. Farmaceutický prostředek podle nároku 43, v y - z n ač u j í c í se t í m , že jako epithelin obsahujeepithelin 1.
37. 45. Farmaceutický prostředek podle nároku 42, vy-značující se tím, že jako antaganistu epithe-linu 2 obsahuje protilátku proti epithelinu 2.
38. 46. Farmaceutický prostředek podle nároku 45, vy-značující se tím, že obsahuje ještě alespoňjeden epithelin.
39. 47. Farmaceutický prostředek podle nároku 46, vy-značující se tím, že jako epithelin obsahujeepithelin 1.
40. 48. Farmaceutický prostředek pro^použití při léčbělupenky, vyznačující se tím, že jako svouúčinnou složku obsahuje látku, schopnou způsobit inhibici’:.stimulačního účinku epithelinu na růst.
41. 49. Farmaceutický prostředek podle nároku 48, vy-značující se tím, že jako svou účinnou složkuobsahuje antagonistu epithelinu 1.
42. 50. Farmaceutický prostředek podle nároku 49, vy- značující setím, že jako antagonistu epithelinu 1 obsahuje epithelin 2. , ---
43. 51. Farmaceutický prostředek podlé nároku 49, vy-značující se t í m , že jako antagonistu eputhe-linu 1 obsahuje protilátku proti epithelinu 1. i