CS9002806A2 - Peptides and polypeptides, vaccines and nucleic acids - Google Patents

Description

/6/

WWL/T |^1T1Í!V9 IWU(L,W>· ^ aíJvoSíáí W ©ÓfiAnÁ ΐ, Ziteíá ’U L ’ Ú» | X3r l>aJ - í O Ί ° i ”··.> i fn i c \ :

Feptidy a polypeptidy, vakciny a hukleové"kýšěTiný=r'

Oblast techniký

Vynález se týká peptidů, polypeptidů, vakcin adiagnostických látek pro západní podtyp viru .TBE a nukleo-vých kyselin a bílkovin, vhodných pro použití v těchto vak-cinách a diagnostických činidlech.

Dosavadní stav techniky Západní podtyp viru klíštové encefalitidy (TBE)náleží do čeledi flaviviridae. Jde o RNA viry, opatřené kulo-vitým lipidovým obalem, jak bylo popsáno v Westaway a další,Ihtervirology 24, 183-192, 1985. Prototypem tohoto viru jevirus žluté horečky. Všechny viry z této čeledi jsou serolo-gicky příbuzné, jak je možno prokázat testy na inhibici hem-aglutinace. Při zkřížené neutralizaci je však možno tuto če-led rozdělit na několik podskupin na základě serologickýchkomplexů, jak bylo popsáno v DeMadrid and Portefield, J. Gen.Virol. 23, 91-96, 1974. Tyto skupiny obsahují blíže příbuznéflaviviry na rozdíl od seřólogicky méně příbuzných virů. Vi-rus TBE náleží do skupiny serokomplexu virů, přenášených klíš-.t a t jh v T a t o 3 ku m i i~i« l a Úl n.u je ío v u t? z ví vy iiazy váné Louping lil,Langat, Omsk (hemorhagická horečka), Kyasanur (lesní horečka)a Negishi.

Kmeny viru TBE je dále možno přiřadit k západní-

Imu (evropskému) typu, který je přenášen primárně klíštětem♦ Ixodes ricinus a k dálněvýchodnímu typu, jehož hlavním vekto- rem je Ixodes persulcatus ( Clarke, 1964, Bull. WHO 31, 45-56).

Tato diferenciace na podtypy byla potvrzena kom-petitivni RIA a mapováním peptidů při použití omezené proteo-lyzy odpovídajících strukturních glykoproteinů, jak bylo pop-sáno v Heinz a Kunz, 1981, J. Gen. Virol. 57, 263-274) a také analýzou antigenů při použití monoklonálních protilá.t_e.k___ (Heinz a další,. Virology 126, 525-537, 1983).

Zralé částice viru obsahují pouze 3 strukturníbílkoviny nazývané E, C a M s přibližnou molekulovou hmot-ností 50 až 60 000, 15 000 a 7 000.

Genom flavivirů je tvořen RNA s jednoduchým řetezcems přibližně 11 000 mazemi s pdLaritou mRNAs molekulovou β hmotností 4 x 10 . Spolu s bílkovinou C tvoří tato RNAsférický nukleokapsid, který je obalen lipidovým obalem,spojeným s bílkovinou E i M· Pokusy s čištěnými přípravkybílkoviny E, získanými po solubilizaci viru pomocí smáčedelprokázaly, že bílkovina E představuje virový hemaglutinin,to znamená, že způsobuje hemaglutinaci určitých erythrocytůza příslušných podmínek, což po imunizaci vyvolá inhibicihemaglutinace, neutralizaci a vznik ochranných protilátek atím i imunitu proti nákaze živým virulentním virem, jak bylopopsáno v Heinz a další, Infect. Immun. 33, 250-257, 1981.

Kromě těchto strukturních bílkovin bylo možno prokázatv buňkách, infikovaných flaviviry určité nestrukturní bíl-koviny, specifické pro virus.

Organizace genomu flavivirů byla v poslednído bé stano-vena cDNA-klonováním a analýzou řetězce virů žluté horečky,West Nile a Murray Valley encefalitidy f Rice a další, Scien-ce 229, 726-733, 1985, Dalgarno a další, J. Mol. Biol. 187,309-323, 1986, Castle a další, Virology 147, 22ý-236, 1985,Castle a další, Virology 149, 10-26, 1986, Wengler a další,Virology 147, 264-274, 1985). Podle těchto analýz obsahujeRNA genomu flavivirů jednoduchý dlouhý otevřený řetězec, ob-Sahuiící Dřibližně 1.1 000 nukleotidů, kterv ie kódem nrn všeeh- „ J. # 1 - J - J- * - - - - -- ny strukturní a nestrukturuj bílkoviny.

Pořadí genů, stanovené pro virus YF a potvrzené pro ně-kolik dalších flavivirů je 5; C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 3.C. E a prM(M) označují strukturní bílkoviny,které lze nalézt v nezralých (C, prM, E) a ve zralých (C, MaET~č'ášTnríc h~viTu“Tďězto žbýťěk 'genomu'-j’é“‘koclem proHnešT- ’rukturní bílkoviny. Strukturní a nestrukturní bílkoviny byly 3 stanoveny v korelaci s odpovídajícími segmenty genomu nazákladě aminoterminální analyzy řetězce.

Je možno předpokládat, že translaci virových bílkovinzačíná na prvním kodonu AUG na 5- zakončení RNA a pokračujeaz do stop kodonu na 3 zakončení RNA. Tvorba jednotlivýchbílkovin je tedy provázena radou specifických štěpných po-chodů, jichž:se účastní jak buněčné proteázy, tak proteázy,specifické pro virus. Až dosud bylo zjištěno přibližně 60 různých flavivirůa přibližně 2/3 z nich se přenáší kousnutím infekčními arth-ropody, takže jsou nazývány také viry ARBO (arthropod-borne).Několik z nich je pathogenních pro člověka včetně viru žlutéhorečky, viru ďengue, viru japonské encefalitidy nebo viryjiných, encefalitid { Shope v "The Togaviruses, str. 47-82,Academie Press, New York, 1980).

Virus TBE je endemický v mnoha evropských státech, Rus-ku a Číně. Onemocnění je dobře dokumentováno v některých stá-tech střední Evropy jako jsou Rakousko, Československo a Ma-darsko a každoročně je hospitalizováno několik set nemocných,což představuje vážný zdravotní problém.

Onemocnění je možno účinně zabránit vakcinací pomocívakciny, kterou je vysoce čištěný, formaldehydem inaktivova-ný virus £ Kunz a další, J. Med. Virol. 6, 103-109, 1980),který vyvolává imunologickou odpovéd proti strukturním bíl-kovinám viru. Zásadní nevýhodou této vakciny je skutečnost,že je nutno zacházet s velkými objemy potenciálně nebezpečnésuspenze viru v průběhu její výroby. Je proto nutné zachová-vat. rozsáhlá, a nákladná bezpečnostní opatření.

Byly proto vyvíjeny snahy nalézt způsob výroby vakcinybez svrchu uvedených nevýhod. V E.P 284 791 se tento problémřeší získáním molekuly DNA s obsahem DNA viru západního pod-typu TBE, která je kódem pro alespoň část alespoň jednoho 4 typu strukturní bílkoviny, například ze skupiny bílkovin C,prMi M nebo E nebo západního podtypu viru TBE.

Tato molekula DNA odpovídá RNA s jednoduchým řetězcemzápadního podtypu viru TBE a bylo prokázáno, že je vhodná,pro získání genetické informace při expresi polypeptidu, ato úplné bílkoviny C, prM, M nebo E západního podtypu viruTBE nebo části některé ze svrchu uvedených bílkovin. Takovýpolypeptid je možno užít k diagnostickým'nebo léčebným úče-lům například při výrobě vakciny.

Analýza řetězce rovněž potvrdila, že existuje diferen-ciace proti dálněvýchodnítnu podtypu. Aminokyseliny jednotli-vých řetězců se od sebe liší až ve 14 % ( v závislosti na bilkovině), jak bylo popsáno v publikaci Jamšči kov a Pletnov,Necleic Acid Res. 16, 7750 (1988). Přestože vakcina na bázi jedné nebo většího počtu re-kombinantních strukturních bílkovin, tak jak byla popsána vEP 284 791 může znamenat zlepšení ve srovnání s inaktivova-ným neporušeným virem, jako vakčinou z hlediska výroby, májinak s uvedenou vakčinou stejné nevýhody, že totiž neobsa-huje nestrukturní bílkoviny.-Jíteré mohou přispívat k ochran-né imunologické odpovědi.

Nestrukturní bílkoviny mají důležité funkce pro život-ní cyklus flavivirů, a to pro dozrávání, proteolytické po-chody a pro replikaci RNA, Přestože bylo.pro kázáno, že jed-na z nestrukturních bílkovin (NS 1) je u virů, odlišných odvirů. TBE schopna vyvolat ochrannou imunologickou odpovéd (Schlessinger a další, J. Gen. Virol. 68 853-857 (1987),Zhang a další, J, Virol, 62, 3027-3o31 (1988) )u pokusnýchzvířat, nehyly k disposici žádné důkazy tohoto typu pro ne-strukturní bílkoviny TBE. 5

Je známo, že subneutralizační koncentrace neutralizač- i «'J1· ' nich protilátek nebo jiných protilátek proti epitopům fla-vivirové bílkoviny E může zprostředkovat na protilátce zá-vislé zlepšení infektivity u buněk,, nesoucích Fc-receptory(Portefield, Cardosa: "Concepts in viral Pathogenesis I",kapitola 17, str. 117), tento poznatek pomáhá objasnit pa-thogenetiku hemorrhagické horečky dengue a syndrom šoku, vy-skytující se u této choroby (Halstead, Science 239, 476-4811988). V některých případech proto může být výhodné se vyva-rovat použití bílkoviny E flavivirů ve vakcinách nebo je do-

L konce možno použít NS 1 jako jedinou složku vakciny a vůbecdo vakciny nevčlenovat strukturní bílkoviny*

Jedna z bílkovin NS-1 západního podtypu viru TBE bylav poslední době identifikována svým řetězcem. Tato bílkovinaje vhodnou složkou vakciny a je možno ji snadno získat pou- : žitím rekombinantní DNA*

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je tedy peptid nebo polypeptid, kte- ; rý obsahuje alespoň část aminokyselinového řetězce bílkoviny _NS-Í západního podtypu viru TBE.___5 t V případě, že peptid nebo polypeptid obsahuje pouze............................část-aminokyselinového řetězce ..bílkoviny ie výhodné. abv šlo -......- - o imunogenní část. Avšak s výhodou má tento peptid nebo póly- I ipeptid řetězec aminokyselin, znázorněný na obr, 4. j

Podstatu vynálezu také tvoří jakékoliv řetězce amino.ky- šelin, které se liší od řetězce aminokyselin přírodního NS-1mutací nebo transposicí,což spadá do běžných přirozených va-riací západního podtypu víru TBE. Tyto řetězce si však stále ' uchovávají podstatné valstnosti (zvláště antigenní) neiruktur- ní bílkovina NS-1 západního podtypu viru TBE. 6 Přestože je výhodné získávat peptidy nebo polypeptidypodle vynálezu expresí příslušných nukleotidových řetězců,je také možno je izolovat nebo s výhodou synthetizovat che-mickým způsobem. Peptidy nebo polypeptidy je tak možno zís-kat v podstatě,v čisté formě, prosté jiných látek, s nimižjsou za přírodních podmínek obvykle smíseny.

Peptidy nebo polypetidy podle vynálezu je možno užítjako takové nebo spolu s jednou nebo větším počtem pomoc-ných látek jako diagnostická činidla a jako složky vakcin. S výhodou se tyto látky zpracovávají na prostředky pro pou-žití v lékařství.

Vynález se rovněž týká vakciny, která obsahuje peptidnebo polypeptid podle vynálezi a jednu nebo větší počet po-mocných složek, přijatelných z farmaceutického hlediska. Ztěchto složek může jít o nosič nebo pomocnou látku pro pep-tid nebo polypeptid. Další vhodnou složkou je například pufr.

Nosičem pro vakcinu může být jakýkoliv vhodný nosič amůže v případě potřeby obsahovat jednu nebo větší počet po-mocných látek. Podle běžné praxe je možno všechny vakciny po-dle vynálezu šieí iiizova i· . Výhodným použitím vakcin s obsíhem antigenních peptidůnebo polypeptidň je příprava specifických imunoglobulinň,například monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, ty-to látky je možno získávat známým způsobem. Tyto protilátkyproti peptidňm a polypeptidům rovněž tvoří součást podstatyvynálezu.

Jak již bylo svrchu uvedeno, je možno použít prostředek s obsdoein jednoho nebo většího počtu peptidů nebo polypeptidň podle vynálezu jako diagnostické činidlo. 7

Vynález se rovněž týká nukleových kyselin, které jsou ; kódem pro peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu, iý

Podstatou vynálezu jsou tedy rovněž nukleové kyselí-ny,které jsou kódem pro alespoň část bílkoviny NS-1 západ- i ního podtypu viru TBE. Tyto nukleové kyseliny, často re- kombinantní, zejména rekombinantní DNA tnohou být kódem pro .<· celou nebo v podstatě celou bílkovinu NS-1 nebo pro jejípříslušnou část. ϊ

Tyto molekuly DNA a RNA jsou použitelné pro získání ? peptidů a polypeptidů podle vynálezu a také pro výrobu ži-vých vakcin. Tyto řetězce DNA se s výhodou spojují s DNAviru Vaccinia, který se často užívá jako živá vakcina.

Kromě svého použití jako živé vakciny mají řetězceDNA a RNA své použití také jako sondy. ..........V současné době nejsou k disposici, žádné spe.cifi.cké....... látky pro léčbu nemocných s nákazou virem TBE. Existuje však í několik potenciálních možností specifické interference s 1 ; životním cyklem viru včetně postupů, které zahrnují použitínestrukturních bílkovin jako je replikace RNA, posttranslač- Ϊ .ní_p.r_o_Le.ol_y_ti.c.ké_p.o.cJwd-y—a—se-S-ta-V-O-V-ani—ú-p-l-né-ho—v-i-r-u-o—Nuk-l-eo--í. vé kyseliny, které jsou kódem pro bílkovinu NS-1 nebo její 'část by mohly být pro tento ucel rovněž použitelné. Kromě -int-e-r-f-er-e-nc-e—s—Γ-unk-č-n-í-m-i—č-i-nnos-tm-i—v-i-r-ov-ýs-h—b-í-l-k-G-v-i-n—i-e—t-a—: ' „ }ke možno blokovat replikační pochody viru při použití proti-smyslné RNA.

Existuje rada cest pro přípravu moleku DNA podle vy-nálezu. Jednou z možností získání molekuly DNA-.je postup,při němž se nejprve extrahuje RNA viru západního podtypuTBE a molekula RNA se čistí, načež se provede transkripcetohoto templátu RNA na molekulu DNA při použití reversní 8 :ί traňskriptázy. Další možností je chemicky synthetizovat mo-lekulu DNA, jakmile byl zjištěn její řetězec.

Ve výhodném provedení zahrnuje vynález DNA, kteráhýbridižuje s molekulami DNA podle prvního provedení a zej-ména s řetězci DNA z obr. 3 a/nebo molekulou DNA, která jekódem pro bílkovinu z obr. 4 za vymezených podmínek, např. v při selekci na alespoň 90% homologii řetězce nukleotidů»Molekuly DNA tohoto výhodného typu mohou stále ještě být * w kódem pro peptidy, vyvolávající jako odpověď tvorbu proti-látek, mimoto jsou tyto molekuly DNA vhodné jako sondy. V jednom z provedení vynálezu jde o nukleovou kyseli-nu, obsahující úplný řetězec genomu divokého západního pod-typu viru TBE, který je kódem pro nestrukturní bílkovinuNS-1 a o molekuly DNA, odvozené od RNA genomu, které jsoukódem pro alespoň část uvedené bílkoviny. Molekuly DNA po-dle vynálezu mohou odpovídat nebo mohou být komplementárník RNA s jednoduchým řetězcem západního podtypu viru TBBÍajsou vhodné pro získání genetické informace, týkající se ex-prese úplné bílkoviny NS-1 nebo její části nebo většího poč-tu j e j í c h č á s t í a jejich použit í. j a k o... slp ž ky v a k c i n y^ p r ·o »1.é-^—čebné a diagnostické účely.

Vynález se výslovně týká všech řetězců DNA, které seliší od molekul DNA, které odpovídají nebo jsou komplemen-tární k přírodnímu řetězci RNA pro NS-1, at již ke zrněnédošlo degenrací genetického kódu a/nebo mutací a/nebotransposicí v rámci běžných přirozených vaří .....-i „ A « J —A L. ~ jLuiyj- umu podtypu viru TBE. Tyto řetězce jsou tedy stále ještě kódempro bílkoviny, kteréjnají^základní vlastnosti (...zejména. zá-kladní antigenní vlastnosti) nestrukturní bílkoviny NS-1západního podtypu viru TBE. 9

Ve výhodném provedení vynálezu je možno tyto řetězceDNA spojovat s dalšími řetězci DNA.

Tyto další řetězce mohou umožňovat replikaci a expre-si molekuly DNA v buněčné, struktuře. Nejdůleřitější řetězceDNA k tomuto účelu jsou řetězce, které mají funkci promoto-ru nebo mohou být pomocnými řetězce, polyadenylačními signá-ly, a signály pro štěpení. Tyto další řetězce je možno spo-jovat s molekulami PNA podle vynálezu standardními postupy. Výhody, které jsou spojeny se svrchu uvedenými mole-kulami DNA platí rovněž stejným způsobem i pro molekuly RNA.

Molekuly RNA podle vynálezu je možno získat izolací a čiště-ním RNA západního podtypu viru TBE nebo rekombinantníra po-stupem při použití RNA/DNA. Podstatu vynálezu tvoří nejenmolekuly RNA, které byly získány řištěním RNA západního pod-typu viru TBE, nýbrž také molekuly RNA, které byly získánytranskripcí izolované a Čištěné RNA viru na DNA působenímreversní transkriptázy s následnou transkripcí takto získané _ DNA zpět do RNA nebo transkripcí RNA, závislou na RNA.

Podstatu vynálezu netvoří pouze molekuly DNA a RNA,tak jak byly svrchu popsány, nýbrž také vektory, obsahující včleněnou molekulu DNA nebo _RNA_t-O-hO-t-O_t_y-pu.._R.ods-tat.u_v_y.ná=_:- lezu tedy tvoří také vektory, a to vektory pro expresi nebopro klonování, které obsahují řetězec nuklcové kyseliny uve- ^-d.ej3Áho-^-t-y-p.u-.^-V-ek.t.or-em-mů;ž.e-^býct-nap-ř-ík.l-ad-^-pla-sni.i-d-;—v-i-i-us—(-na·--............. ή příklad živočišný, jako Vaccinia, nebo fág) nebo kosmid. Jakje v oboru známo, tyto vektory obvykle obsahují řetězce, ří-dici replikaci a expresi včleněné RNA nebo DNA. Tyto řídícířetězce mohou obsahovat promotor a mimo jiné různé pomocnéřetězce, usnadňující replikaci a/nebo expresi.

Podstatu vynálezu rovněž tvoří hostitelské buňky s ob·* sáhem svrchu uvedeného vektoru. Buňky mohou tvořit kulturu. 10

Vektory se s výhodou uchovávají v buněčné kultuře, vníž dochází k expresi polypeptidů, pro které jsou kódemřetězce DNA a RNA podle vynálezu, s výhodou jde o buněčnoukulturu savčích buněk. Při použití buněčné kultury savčíchbuněk je' možno dosáhnout nej výhodnějších podmínek pro expre-si polypeptidů, který má být užit jako vakcina pro ochranusavců proti infekcím západním podtypem viru TBE.

Vynález bude nyní popsán pro lepší pochopení v souvis-losti s přiloženými výkresy.

Na obr. 1 je znázorněna fotografie agarozového gelu,na němž byla provedena elektroforéza nerozštěpeného plasmi-du BS 17-6 (dráha b), který obsahuje celý kodový řetězec probílkovinu NS-1. V dráze £ je znázorněn tentýž plasmid po roz-štěpení enzymem BamHI a obě dráhy a. obsahují značení o veli-kosti 0,6 kb, 2 kb a 100 kb.

Na obr. 2. je znázorněn úplný nukleotidový řetězecvčleněné části 17-6 v plasmidu BS 17-6.

Na obr. 3 je znázorněn řetězec RNA. a řetězec aminokyse-lin, pro něž je tento řetězec kódem ( 17-6). Polohy jsoučíslovány podle číslování v úplném genomu viru TBE.

Na obr. 4 je znázorněn řetězec aminokyselin bílkovinyNS-1, odvozené od klonu 17-6. Polohy jsou číslovány od prv-ní aminokyseliny bílkoviny NS-1. •t-

Na obr. 5, který se týká obsahu příkladu 10 je znázor-něn způsob klonování NS-1 v prokaryotickém' vektoru .pro ex-presi pUC19S.

Na obr. 6A a 6B, které se rovněž týkají obsahu přikla-du 10 jsou znázorněny nukleotidové řetězce klonu pNS1387 na 11 5- a 3- zakončeni. Včleněná část NS1 je zařazena ve sprav-e- ném sledu s bakteriálním genem lacZ. Exprese je pod říze-ním lac/Z operátoru/promotoru. Na obr. 6A je znázorněna o-becná organisace uvedené konstrukce.. Na obr. 6B jsou Znázor-něny řetězce DNA a bílkoviny. V této konstrukci má NS-140 přídatných nukleotidů, které odpovídají 14 aminokyseli-nám z genu lacZ s vazným řetězcem pUC19S na jeho 5-zakonče-ní. Na 3-zakončení se nachází 27 přídatných nukleotidů, kte-ré nepatří kNS-1 ( odpovídají 9 aminokyselinám). Polohy nuk-leotidů vzhledem ke genomu TBE (z obr.3) jsou označeny pomo-cí hvězdiček.

Na obr. 7A, který se týká příkladu 11 je znázorněnastrategie klonování NS1 s autentickým 5-^signálním řetězcemv prokaryotickém vektoru pro expresi pUC19S.

Na obr. 7B, který se rovněž týká příkladů 11 jsou znázorněny nukleotidové řetězce klonu ptSNS1791 na 3- a na_ 5- zakončení. Všleněný řetězec NS1 je ve správném sledu s bakteriálním genem lacZ pro expresi pod řízením jeho promo-

TI torového systému. V části I je znázorněna obecně strategiekonstrukce. V části II jsou znázorněny řetězce DNA a bílko-viny.V této konstrukci má NS1 celkem 39 přídatných nukleo-tidů, odpovídajících 13 aminokyselinám z genu lacZ a z vaz-nebo retezce pUC19S na 5- zakončení. Na 3- zakončení se na-chází ještě 30 nukleotidů, jejichž původ není v NS1 a které 12 odpovídají- 10 aminokyselinám na 3-zakončení. Polohy nukleo-tidů relativně ke genomu TBE jsou znázorněny hvězdičkou(TBE genom. je na obr. 3).

Na obr. δΑ,.který se týká příkladu 12 je znázorněnoklonování kódové oblasti NS1 ve vektoru pTKgptFIS pro rekombinaci s virem Vaccinia.

Na obr, 8B, který se týká rovněž příkladu 12 jsou znázorněny nukleotidové řetězce klonu pAPNS1338 na 5- a pna 3-zakončení. NS1 obsahuje 19 přídatných nukleotidů, odpovídajcích 7 aminokyselinám v očekávaném translačním produktu z 4 polyvazné oblasti ·.· na 5-zakončení,30 přídatných nukleotidůodpovídajících 10 aminokyselinám na 3-zakončení. Hvězdičkoujsou označeny polohy nukleotidů vzhledem ke genomu viru TBE(obr. 3).

Na obr. 9A a 9B, které se vztahují k příkladu 13 jsouznázorněny podrobnosti klonování NS1 a jeho putativního signálu reakcí s polymerázou (PCR). Na obr. 8A je znázorněnaobecná strategie PCR, na obr. 8B řetězce chemicky synthcti-zovaných oligonuk.leotidů, užitých jako primery pro amplifi-kaci DNA. Hvězdičkou jsou označeny polohy nukleotidů v ge-nomu viru podle obr, 3. , ,

Na obr. 10, který se rovněž vztahuje k příkladu 13 je 13 znázorněn agarozový gel s fragmentem pomocí PCR. Agarozový gel je obarven tekce DNA se provádí v ultrafialovém fragment s délkou přibližně 1130 bp. NSl, syn thetizovanýmethidiumbromidem. De-světle. Šipka ukazuje

Na obr. 11, který se rovněž týká příkladu 13 je zná-zorněno klonování NSl kodové oblasti s putativním signálnímřetězcem po syntéze pomocí PCR do vektoru pSCll-OrthDELTAQpro rekombinaci s virem vaccinia.

Na obr. 12, který se rovněž týká příkladu 13 jsouznázorněny řetězce klonu pSC3NS1444 na 3- a na 5- zakončení.Autentická kodová oblast NSl včetně signálního řetězce mána svém očekávaném produktu translace 12 přídatných nukleo-tidů, odpovídajících 4 aminokyselinám z oblasti,vazného ře-těžce na 5- zakončení* Dalších 47 nukleotidů ( odpovídají-cích 16 aminokyselinám) se nachází na 3- zakončení* Hvěz- .d.iAko.u_^j.s.o.u_o.znače-n-y—po-l-o-h-y—nu-k-l-eot-i-d-ň—v—genOmu—vřru—ΓΒΕ- (obr. 3).

Na obr. 13, který se týká příkladu 13 je znázorněnaanalýza plasmidu pSCtSNSl444 štěpením příslušnými restrikč-ními endonukleázamiJe znázorněna správná orientace včleně-ného· řetězce NSl do vektoru pSCll-Orth,'rovněž je potvrzenrozměr fragmentů, odvozený od řetězce klonu 17-6. 14 I Na obr. 14, který se týká příkladu 14 je znázorněno klonování NS1 včetně putativního signálního řetězce ve vek-toru pTKgptF3s pro přenos a re kombinaci, s virem vaccinia.

Na obr. 15, který se rovněž týká příkladu 14 je zná-zorněn nukleotidový řetězec plasmidu pTKtSNSl556 na 3- a5- zakončení. V této konstrukci má NS1 navíc 24 nukleotidů,které odpovídají 8 aminokyselinám v příslušném produktu . translace z vazného řetězce na 5- zakončení. Dalších 26nukleotidů, které odpovídají 9 aminokyselinám se nachází na z 3-zakoncení. Hvězdičkami je označena poloha mukleotidů v ge-nomu viru TBE (obr.3).

Na obr. 16, který se týká příkladu 15, je znázorněnaanalýza Southern blot pro NS1- rekombinanty viru vaccinia,varecNS1444 a varecNS1556. Buňky CV-1 vyly infikovány re- * kombinantním'vorem vaccinia při 5 pfu/buňkaT^Dva dny "po in- fekci byla čištěna celková buněčná DNA, materiál byl rozště-pen restrikční endonukleázou HindlII a dělen na 1% agarozovéngelu. DNA byla přenesena na nitrocelulozový filtr a byla pro-vedena hybridizace s radioaktivně značeným plasmidem pSCtNSl . 444 jako sondou pro detekci včleněného fragmentu NS1 a pro sousedící řetězce viru tk^ Srovnáním rekombinantních kmenůvarecNS11556-112, -124, -122 a varecNS1444-121 s divokým ty-pem viru vaccinia (vzorek 4) 'byl prokázán očekávaný posunfragmentu, získaného štěpením HindlII směrem k vyšší mole-kulové hmotnosti. Pouze v případě varecNS1556-222 bylo mož-no prokázat malý pás, odpovídající w.t. fragmentu. To zna- 15 mená, že izolát plaku není homogenníó 1556Ί22 atd, jsourůzné izoláty plaků z téhož rekombinačního pokusu po tro-jím čištění plaků. Jako kontroly a k označení velikostifragmentů byly.užity různé štěpné produkty plasmidu pSCt-SNS1444 ( vzorky 6 a 7).

Na pbr. 17, který se týká příkladu 17 je znázorněnautoradiograf denaturačního SDS-gelu s rekombinantními vi-ry varecNS1444 a varecNS1556, u nichž dochází k expresi bíl-koviny NS1. Bílkovinu s očekávanou moldnlovou hmotností je - možno prokázat,u těchto vírů ( mol. ,hmotnost 48 000), avšaknikoliv u divokého typu varecl342 ( u něhož dochází k ex-presi odlišné bílkoviny v infikovaných buňkách. Velmi silnýpás pro bílkovinu, který přechází přes značku 9-7 000 je β-galaktosidáza ( molekulová hmotnost 116 000), k jejíž ex-presi dochází pod řízením promotoru Pil v rekombinantníchkmenech varecNS1444 a varecl342, odvozených od pSCll-Orth. , Je možno připravit nukleovou kyselinu' podle vynálezu'a stanovit její řetězec následujícími obecnými postupy: Především je možno získat RNA viru extrakcí z buněk,infikovaných západním podtypem viru TBE. Při·použití RNAjako templátu je možno získat cDNA s dvojitým řetězcem, například při použití reversní transkriptázy, Při použití 're-kombinantní tecchniky je možno tuto cDNA uložit do DNA vek-toru, například do plasmidové DNA Escherichia coli, čímžse získá rekombinantní plasmid, Rekombinantní plasmidy jemožno užít k transformaci příslušných hostitelských buněk,například E. coli, kmen ΙΪΒ101 pro amplifikaci plasmidu ne-bo pro expresi odpovídajících bílkovin. Jednotlivé kolonies plasmidy, obsahujícími vloženou DNA je možno identifiko-vat postupem, který byl uveden v publikaci Birnboim a Doly,Nucleic Acids Research 7, 1195-1204, 1979. Řetězec baží 16 DNA, specifický pro západní subtyp viru , přítomný v rekom-binantním plasmidu je možno prokázat postupy pro rychlé sta-nování řetězce DNA, například při použití dideoxyřetězců.

Podrobněji je možno popsat způsob výroby cDNA, rekom-binantních plasmidů, buněk, transformovaných těmito plasmi-dy a způsob stanovení nukleotidového^řetěžce takto:

Nejprve se získá z čuštěného západního subtypu viru TBEvirová RNA. K tomuto účelu se virus pěstuje na primárníchbuňkách kuřecích embryí, koncentruje se pomocí ultraodatře-divky a čistí ve dvou cyklech při odstředění pomocí sacha-rozového gradientu. Po solubilizaci bílkovin pomocí SDS zapřítomnosti proteinázy K a inhibitoru RNazy, například tak,že se materiál inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C se RNAextrahuje například fenolem a sráží ethanolem» Při použitítéto RNA jako templátu se pak získá DNA, komplementární svirovou RNA in vitro působením reversní transkriptázy, na-příklad z viru myeloblastozy ptáků,. například způsobem pod-le publikace Gubler a Hofmann, Gene 25, 263-269, 1983. Připoužití primeřů, například hexanukleotidového typu, získa-ných z telecího brzlíku a jeho DNA se virová RNA inkubujeza příslušných podmínek, například podle příručky " cDNAsynthesis systém", Amersham, Velká Británie při použití re--. versní transkriptázy spolu s deoxyadenosintrifosfátem (dATP),deoxythymidintrifosfátem (dTTP), deoxyguanosintrifoafátem(dGTP) a deoxycytidintrifosfátem (dCTP) jako substrátem.

Takto získaná hybridní cDNA.RNA se zpracovává působením RNazy H za přesně definovaných podmínek za vzniku vypuštěných* #úseků v RNA hybridní molekuly. Pak je možno účinně užítDNA-polymerázu I z E. coli k náhradě řetězce RNSpři použitíRNA s vypuštěnými úseky jako příměru. Takto získaná RNA sdvojitým řetězcem sé deproteinizuje. exprakcí směsí fenolu achloroformu, vysráží ethanolem a zbývající fragmenty RNA seodstraní působením RNazy například v pufru TE 30 minut přiteplotě 37 °C. 1.7

Klonování dsDNA se provádí například při použití syn-thetických vazných řetězců,, K tomuto ucelu se dsDNA zpracu-je při použití Klenowova fragmentu DNA polymerázy I z E. co-li za příslušných podmínek podle publikace Maniatis a další,Molecular Cl.oning,. CSH 1982, aby bylo možno zajistit co nej-větší množství klonovaťeíných zakončení, načež se provádíextrakce fenolem a deproteinizace» Pak se dsDNA inkubuje zavhodných podmínek s vaznými řetězci BamHI za přítomnostiDNA-ligázy. Reakční směs se nanese na 1% agarozový gel a zgelu se vyříznou cDNA s různou molekulovou hmotností a ty sepak dále čistí například elektroelucí. Na druhé straně seDNA plasmidu, který má být užit jako vektor, například plas-mid Bluescript SK- z E. coli rozštěpí restrikční endonukle-ázou BamHI a defo sforylu je při použití bakteriální alkalickéfosfatázy. Po rozštěpení cDNA enzymem BamHI se materiál smí-sí s vektorem, rovněž rozštěpeným enzymem BamHI a směs se in-kubuje za příslušných podmínek pro umožnění hybridizace kom-plementárních přečnívajících řetězců na koncích obou molekulDNA a provádí se vazba působením T4-DNA-ligázy. Rekombinant-ni molekula DNA se užije k transformaci kompetentního kmene 'E. coli, například E. coli XL 1-blue. Rekombinanty, obsahu-jící včleněnou část, specifickou pro virus se identifikujína základě barevně odlišnosti» Plasmidy se izolují podle pub-likace Birnboim a Doly, Nůcleic Acids Research 7, 1195-1204,1979 a rozměry včleněných částí se analyzují pomocí restrikč-ních enzymů při použití enzymu BamHI s následným dělením zí-skaných fragmentů na 1% agarozovém gelu» Řetězec baží v těchto včleněných úsecích se stanovípodle publikace Sanger a další, PNAS ESA 74, 5463-5467,1977»Získaný řetězec se analyzuje na homologii s již známými ře-tězci jiných flavivirů podle publikace Rice a další, Science229, 726-733, 1985, Dalgarno a další, J. Mol. Biol. 187,309-323, 1986, Caštle a další, Virology 147, 227-236,1985,

1S

Castle a další. Virology 149, 10-26, 1986, Wengler a další,Virology 147, 264-274, 1985, Jamščíkov a Pletněv, NucleicAcids Research 16 7750, 1988 při použití počítačových pro-gramů pro stanovení uložení řetězce v celkovém řetězci ge-nomu.RNA, Na.obr» 2. je znázorněn úplný nukleotidový řetězec,a na obr. 3 odpovídající řetězec aminokyselin oblasi NSIzápadního subtypu genomu viru TBE„

Vynález poprvé poskytuje možnost získat nukleotidový z řetězec genu, který je kódem pro bílkovinu NSI západníhosubtypu viru TBE a v důsledku toho také objasňuje řetězecaminokyselin této bílkoviny. Řetězec baží na obr. 2 je výhodným příkladem DNA, z která je kódem pro polypeptidy, charakteristické pro zá-padní subtyp viru TBE, a to pro jeho bílkovinu NSi. Nazákladě degenerace genetického kódu může být kodovým řetěz-cem pro tentýž řetězec aminokyselin také triplet baží, od-lišných od baží, uvedených na obr. 2.

Do oboru.vynálezu spadají také řetězceť pozměněny mutací, transposicí nebo degradací, / ,, h 4 Λ Λ X - J- i _ J _ - 1 J . 1- < J uuu twuvin υ ··! C UG£CV OHUDUft Vír; 1111. ft. Ltt i V 2> kladní antigenní vlastnosti bílkoviny NSI. které jsouavšak přestou u ϊ ιο v a v a' z a —

Mimoto se vynález netýká pouze přesného řetězce ami-nokyselin z obr. 3, který je pouze příkladem možného řetěz-ce bílkoviny NSI přírodního západního podtypu viru TBE. Jeznámou skutečností, že genomy virů RNA jsou podrobeny čas-tějším mutacím než genomy DNA virů nebo buněčných genů, ato vzhledem k většímu výskytu chyb v činnosti RNA polymeráza nedostatkům kontrolních a řídících mechanismů, jak bylouvedeno v publikacích Hollanda další, Science 215, 1577-1585, 1982, Reanney, Ann. Rev. Microbiol. 36, 47-73,1982. V závislosti na vlastnostech viru mohou tyto mutace dát 19 .vznik novým typů virů vzhledem k posunu antigenních vlastrností, tak jako tomu bylo v případě chřipkového viru podlepublikace Both a další, " Origin of Pandemic Influenza Vi-ruses", W.G.Laver íed«), Elsevier, 1983« Na druhé straněmohou byť RNÁ viry: anťigenně stálejší za přírodních ekolo-gických podmínek, pravděpodobně v důsledku přírodníchfunkčních omezení, která nedovolují rozsáhlejší strukturnízměny v antigenně aktovních bílkovinách. Je však přesto za-potřebí brát v uvahu určitou míru variace, jak je možnoprokázat srovnáním řetězců různých přírodních izolátů. .

Toho je možno dosáhnout například tak, že se analyzujřetězec RNA z různých izolátů při použití dideoxyřetězcň nazakončeních a při použití synthetických oligonukleotidů ja-ko primerů. Tyto řetězce se připraví podle prototypového řetěžce izolátu z obr. 2» Všechny řetězce, které mají ve srovnání s řetězcemprototypu drobné variace, například takové, které byly nalezeny v dalších přírodních izolátech západního subtypuviru TBE jsbu do vynálezu zahrnuty. Tyto variace jě možnozískat také modifikací nukleové kyseliny in vitro. Vynálezproto zahrunuje všechny řetězce, které hybridizují za omezených podmínek, například při selekci na alespoň 90¾ homolo-gii řetězce s řetězcem podle vynálezu nebo jeho částí akteré jsou s výhodou kódem pro bílkoviny nebo peptidy s pod ^_s_t.a.t.n.ý.mj_^anf_Tg.en.nim.i^d.e.t.e.r-m.i.nu-ji.C-ími.^.v-l.a.sť.n-o;sťmi^z.á.p.ad.ní.ho-;subtypu viru TBE, tj. jeho strukturních bílkovin.

Uložení nukleotidového řetězce, který je kódem probílkovinu, například pro NS1 do příslušného vektoru nebovektorů a do hostitelské buňky k expresi této bílkoviny vevelkém množství je učinnou technologií pro studium struktu-ry a biologických funkcí bílkovin. Systém, užitý k expresivždy závisí na určitých vlastnostech molekuly, např. naposttransTaČní modifikaci zkoumané molekuly bílkoviny. 20

Expresi je možno uskutečnit v prokaryotickém neboeukaryotickém buněčném systému. V případě glykoproteinů,jako jsou bílkoviny typu NSl je k expresi vhodnější ouka- í? ryotická hostitelská buňka, protože tato buňka je lépe schopna provést glykosylaci. ' Výhodným systémem pro expresi je virus vaccinia abuňky primátů, které rostou v kontinuální kultuře. Tímtozpůsobem je možní zajistit, nebo napomoci zajištění správnéposttranslační modifikace a vysoké úrovně syntézy.

Mimoto je zřejmě možno prokázat, že řídíd řetězce viru vaccinia jsou schopny řídit syntézu téměř kterékoliv cizorodé bílkoviny buď při použití promotořu pro " pozdní fázi" nebo při použití " konstitutivního" promotoru, který je činný v průběhu časné i pozdní fáze replikace viru, jak bylo. popsáno v Moss a Flexner, Ann. Rev. Immunol. 4, 305- 324, 1987. Byly však podávány i zprávy o tom, že stálost1 cizorodých bílkovin, k jejichž expresi došlo v buňkách, in-fikovaných virem vaccinia je silně ovlivněna promotorem,.. ' který řídí expresi příslušného genu, jak bylo popsáno vCoupar a další, Eur. J.. Immunol. 16, 1479, 1986 a Townsenda další-, J. Exp. Med. 168, 1211-1224, ’ 1988/

Konstrukce příslušného plasmidu pro expresi s obsahemřetězce, specifického pro NSl vyžaduje extensivní manipula- ci ci s DNA. Je nutno brát v uvahu, že NSl je částí polypro- teinu, který je posttranslačně zpracováván na jednotlivé -3 bílkoviny proteázami viru a buňky, jak bylo popsáno v Mandl a další, Virology 173, 291-301, .1989, V průběhu přírodnívirové infekce zahrnuje syntéza N’S.l vnitřní signální reté- ... · zec n'a aminótenuinálním zakončení. Signální řetězec směru- je vznikající polypeptidový řetězec do endoplasmatickéhoretikula, což je nezbytné pro správnou posttranslační modi-fikaci, například pro glykosylaci. Aby bylo možno získat 21 správně zpracovaný produkt exprese je nutné, aby tento sig-nální řetězec nebo heterologní signální řetězec byl zahrnutv rekombinantní molekule.

Mimoto vzhledem k tomu, že NS1 je částí polyproteinu,neobsahuje kodony přo počátek ani stop kodon pro translaci.Tyto kodony je zapotřebí zajistit specifickou manipulací re-kombinantní DNA.

Hydrofobní řetězec 5- a řetězec 3- jsou zařazeny vklonu 17-6 ( obr. 3). Vzhledem k tomu, že nejsou k disposicimísta štěpení restrikčními endonukleázami, není možno přímoklonovat ŇS1 s jejím " přírodním" signálním řetězcem ve vekto-ru pro včlenění. Z tohoto důvodu je možno syntheti zovat na-příklad delší řetězec 1200 bp, obsahující signální řetězecNS.l a řetězec pro uplnou bílkovinu NS1, například při pou-žití polymeráza (PCR). Tato technika také umožňuje zařazenípřípadných míst štěpení restrikční cndonukleázou na oboustranách ainplifikované DNA a řetězců pro počátek a ukončení.

Specificky. kontruo.vaný pár primerů,pro amplifikacidává vznik řetězci NS1, který má na každé straně místo pů-sobení restrikční endonukleázy EcoRI. Při použití tohoto po-stupu je možné zaměnit· autentický signální řetězec jakýmko-liv signálním řetězcem, přírodně se vyskytujícím nebo syn-tetíským signálním řetězcem, jak bylo popsáno v Meinje, NAR 14, 4683-4690, 1986. Všechny plasmidy, specificky vyvinuté pro expresi mo-lekuly je možno transponovat do viru vaccinia ( kmen WR ne-bo oslabený derivát tohoto kmene 1 homologní rekombinací vhostitelské bunccj, například, v buňkách primátů rimentalní postup pro získání rekombinanntní.hoje znám a není jej proto nutno blíže popisovatdalší, JRL Press:DNA cloning II, Ed.DM Glover, CV-1. Expe- .viru vaccinia(M a ck e 11 a191-211,1985. 22

Vynález se rovněž týká syntézy molekul NS-1 v bakte-riálním hostiteli. Glykoproteiny, k jejichž expresi došlov bakteriální buňce obvykle nejsou glykosylovány stejným-způsobem jako produkty, získané v eukaryotických buňkách.Přesto může být syntéza NS-l.i v neglykosylované formě u-žitečná pro různé účely. Jako příklad je možno úvést, žederiváty obalového glykoproteinu (gp) 160 HIV-1, k jejichžexpresi došlo v bakteriální buňce podstatně přispěly k dia-gnostice HIV a experimentální vakcinaci.

Analogicky jako zkonstruovaný plasmid pro rekombinacis virem vaccinia byl syntetizován také řetězec pro NS-1včetně autentického signálního řetězce pomocí PGR a bylklonován například v plasmidu pUC-19, Je možné nahraditTBE sgnální řetězec prokaryotickým signálním řetězcem zaúčelem dosažení účinné sekrece molekul NS-1 z bakteriálníbuňky.Bakteriální signální řetězec totiž může zabránit a-gregaci NS-1 a tvorbě inklusních tělísek, která je pak nut-no rozpustit pomocí smáčedel nebo jinými solubilizáČnímiprostředky. z

Kromě syntézy úplné bílkoviny NS-1 je možno tento ex-perimentální postup aplikovat také na, zkrácenějiormy mole- .. kuly NS-1. Tyto zkrácené molekuly je možno použít k vyvolá-ní imunologické odpovědi, namířené proti specifickým místůmbílkoviny. Tyto formy jsou rovněž cenným nástrojem pro takzvanou " sérologii, namířenou proti specifickým místům".Imunologicky relevantní epitopy v bílkovině NS-1 je možnovčlenit do nosných molekul jako pomocné úseky (napříkladčástice HB jádra) nebo do imunostimulačního komplexu ÍISCOM) podle publikace Morein a další, Immunology today S (11),333-333, 19S7. ~ ;

Jakákoliv z molekul NS-1, syntetizovaných v prokaryo- tických a eukaryotických systémech pro expresi popsaných v 23 průběhu přihlášky představuje molekulu, vhodnou jako složkaNS-1 vakciny, molekulu je možno užít jako takovou nebo vá-zanou na rekombinantní glykoprotein E viru TBE {EP 284791)nebo je možno tyto. molekuly přidávat do existující vakcinys obsahem inaktivovaného viru TBE.

Mimoto může být analýza imunologické odpovědi protitěmto nestrukturním bílkovinám nebo jejich částem, kritic-ká pro porozumění pathogeniá.týj, viru TBE a dalších členůSkupiny flavivirů.

Do genomu živých virů je rovněž možno zařadit cizoro-dé řetězce DNA nebo RNA, čímž vzniknou rekombinantní viry,které je možno užít jako živou vakcinu. Shrnutí, této možnos-ti bylo popsáno v publikaci Mackett a Smisth, J. Gen. Virol.67, 2067-2082, 1986.

Také kombinace různých genů, například odvozených odrůzných virů je možno zpracovat genetickou technologií tak,že je možno dosáhnout jejich exprese a použít pro vakcinaci(Perkus a další, Science,.229, 981-984, 1985). Vynález pros-to zahrnuje jakékoliv kombinace řetězců, uvedených v průběhupřihlášky s dalšími řetězci, jako jsou geny, které jsou ko-dem pro odlišné bílkoviny nebo řetězce, které přispívají kexpresi bílkovin jako jsou promotory, podpůrné řetězce, po-lyadenylační nebo štěpné signály.

Jeznámo, že k imunizačním nebo diagnostickým účelůmnení bezpodmínečně nutné použít uplnou přírodně se vyskytu-jící bílkovinu ( Lerner, Nátuře 299, 592-596, 1982, Arnon,TIBSll, 521-524, 1986). Bílkoviny nebo části bílkovin, jichž je možno užítjako vakcin nebo diagnostických činidel je možno získat re-kombinantní svrchu popsanou technologií s použitím DNA, ře-tězce podle ýynálezu je však rovněž možno užít k získání in-formací, které lze využít při syntéze oligopeptidň. 0 tomto 24 předmětu je k disposici rozsáhlá literatura. Peptidy, synte-tizované pomocí řetězců DNA byly připraveny a použity prořadu učelu například pro biologické a imunologické studie,jak bylo popsáno v Lerner a další, Cell, 23, 309 až 310,.'.1981, Lerner, Ne ture 299 , '592-596, 1982. Použití pro vak-cinaci bylo popsáno v Shinnick'a další, Ann."Réví Micro- " biol. 37, 425-446, 1983, DiMarchi a další, Science 232,639-641, 1986. Obecná příprava peptidů nebo kombinace peptidňje tedy známa? Dále je známo použití nukleových kyselin a řetězců,získaných pomocí těchto kyselin pro přípravu hybridizačníchsond, například pro použití při průkazu virové RNA u klíš-tat nebo v krevním séru ( Meinkoth á Wahl, Anal.Biochem 1.38,267-284, 1984, Kulski a Norval, Arch. Virol. 83, 3-15,1985.Tyto sondy je možno připravit bud technologii při použitirekombinantní DNA nebo chemickou syntézou oligonukleotidů'na základě požadovaného řetězce.

Vanález bude osvětlen následujícími příklady. Není-livýslovně uvedeno jinak, provádí se jednotlivé postupy způ-sobem, který je sám o sobě znám. Tyto postupy je možno na- lézt v radě standardních publikaci včetně publikace Sam"—brook, Fritsch a Maniatis " Molecular Cloning: A Laborato-ry Mánual" (2. vydání), Cold Spring Barbor Laboratory Press,1989. ' Příklad y p r o v ed cní vy ná 1 ezu Příklrd 1

Propagace a čištění viru TBE 10% suspenze viru ZQE ve formě .infikovaných mozkuinfantilních myší byla užita k infekci primárních buněkkuřecích embryí ve jedné vrstvě, udržovaných na minimál-ním základním prostředí uMEM) s přísadou pufru 13 míi He-pes a. 15 mM EPPS o pH 7,6» Po 40 hodinách inkubace při te-plotě 37 °C byl supernatant vyceren odstředěním při10 000 g po 30 minut při teplotě 4 °C a virus byl usazenultraodstreděním při 50 000 g po dobu 3 hodiny při teplotě4 °C. Pak byl virus znovu uvteden do suspenze v ošíslušnémobjemu pufru TNA ( 0,05 M triethanolaminu, 0,1 M chloridusodného o pH 8,0) a pak byl materiál podroben zonálnímuodstředění v sacharozovém gradientu.5 až 20 % .hmotnostních'při'17 777 g.celkem 110 minut při teplotě 4 °C. Největší ·koncentrace viru byla pak stanovena sledováním garientupři .254 nm, načež byl materiál znovu odstředěn ve 20 až50% .sacharozovém gradi entu k dosažení rovnovážného stavu18 hodin při -teplotě 4 °C a při 15 000 g. Pak byl virus d i a 1 y z o v án pro ťi-ρΰϊ řu~T"A"N~ř ιΊΠΊ'δγΟ-k—oďs-tTa-n-č-ní—př e-by-t- 1* ku sacharozy,' Příklad 2 ............'”...... *...... Příprava RNA viru 100 /iig čištěného viru se zředí na 400 /U.l přidáním pufrupro reakci s·proteinázou K ( 10 mM tris o pil 7,8m 5 mMEDTA, '0,5 % SDS), Proteináza K se přidá do konečné kon-centace 200 ,ug/ml. a směs se hodinu inkubuje při teplotě37 °C. Pak se roztok deproteinizuje tak, že se dvakrát ex- 26 trahuje stejným objemem ( 400 ^ul) fenolu a pak ještě jed-5 nou chloroformem a isoamylalkoholem v poměru 24 : 1„ pak se,přidá 26 ^-ul 2M roztoku octanu sodného a RNA se vysrážíλ přidáním 2,5 objemů ethanolu. Před dalším použitím se po- díl RNA deriatii.ru je. glyoxalem a pak sc podrobí e lektro.f'oře-ze na agarozovém gelu ke kotrole výtěžku a kvality.získa-ného materiálu. Příklad 3 . .

Syntéza cDNA s dvojitým řetězcem 5 /Ug RNA, vysrážené ethanolem se znovu uvede do sus-penze ve 40/ul pufru pro syntézu prvního řetězce ftmersham,UK) s obsahem 5 ^ug náhodně volených oligonukleotidovýc-hpříměrů, směs se zahřeje na 70 °C na 1 minutu a pak se ne-chá pomalu zchladnout na teplotu místnosti. Pak se přidajívšechny čtaři deoxy nuk.leotidtrifosfáty do konečné koncent-race 1 mM. Mimoto se ke směsi přidá 5 jednotek inhibitoru 3 2 ribonukleázy z lidské placenty a 10 ^uCi α- P dCTP, Syn-téze prvního řetězce se zahájí přidáním 100 jednotek reversní transkriptázy ( Amersham) a reakce se nechá probíhat 2 _ hod i nv při teplotě 42 . Pak se^ reakční smě s u loží d o ledu a reakční složky pro tvorbu druhého řetězce se přidají v tomto pořadí: 93,5 /Ul pufru pro syntézu druhého řetězce(Amersham, UK), 4 jednotky ribonukleázy H, 23 jednotek DNA-polymerázy z E. coli a voda do konečného objemu. 250 ^ul.Syntéze druhého řetězce se provádí následnou inkubací při12 °C a při 22 °C ( dvě hodiny pokaždé) a pak se zastaví » „ I, Λ l· í „ „ t.. ___A ... J ..... ... i__Ί t. . . T í\ θ r» .. I. ... _ X, cm i ti L· x lil J U 4. V U. Λ U U <t i V i H .1 <1 U. i * <1 L· v jdi U t u IV v o i fl li 3 f u rt s dvojitým řetězcem rozštěpí, pů - ober ím 10 jed»tek T4 DNA- polymerázy 30 minut, při ..'teplotě 37 V.C pru vznik.vhodných zakončení. Pak se cDNA čistí extrakcí fenolem a chloroformema vysráží dvěma objemy ethanolu. 27 Příklad 4

Vazba pomocí vazných řetězců

Syntetické 5-fosfórylované vazné řetězce BamHI · (New ·England Biolabs) se přidají k cDNA a reakce se nechá probí-hat přes noc při teplotě 12 °C„ Reakční směs obsahovala vkonečném objemu 200 ,ul pufru pro uskutečnění vazby ( 50mM tris o pH 7,5, 5 mM MgCl^, 5 mM DTT, 1 mM AfP) přibliž-ně 1 ,-ug cDNA, 1 ,ug vazné DNA a 1 ,ul T4 DNA-l.igázy (NewEngland Biolabs}. Příklad 5

Francionace cDNA podle velikosti cDNA byla frakcionová na na 1% agarozovém gelu,

France S různpu velikostí byly z gelu. vyříznuty a DNA by-la extra-ho vánu z agarozy · el-ektroelucí v analytickém zaříze-ní. pro tenot. uče 1. .(IBI) . podle., pokynů výrobce. Přes o, že.množství DNA' bylo velmi' malé, takže je bylo jen s obtíže-mi možno prokázat barvením ethidiumbromídem, bylo možnoextrřikci snadno sled.ovyt vzhledem k radioaktivnímu značení -DNA-;—F-raA-cl-o-nnr/ni- síruycň-j'c—tedy-p-ncrs-treTiicem-ρττ>—zí_s"kám- velkých fragmentů cDNA vhodných pro selektivní klonování a v <* také umožňuje cDNA úplně oddělit od nenavázaných vazných'řvrfiŤzců ," ’........'""'......' "....... .......... Příklad 6

Klonování.. v . buk teriál ním plasmidu cDNA byla rozštěpena působením 10 jenotek restrikčníendonukleázv BainlII, reakce trvala 1 hodinu při t eplotě 37 0Po extrakcí fenolem a chloroformem byla DNA vysrážena 2 ob-jemy ethanolu a znovu uvedena do suspenze v malém objemu vo 28 cly. Pak bylo 20 až 30 ng cDNA smiseno s 50 ng fagemidůBluescript SK- (Stratagene), který byl linearizován roz-štěpením enzymem BamHÍ ( výraz Bluescript je obchodníznačka). Tyto dvě složky byly na sebe..navázány, působenímT4 DNA-iigázy v 10 zul svrchu, uvedeného pufru pro vazbupřes noc při 16 °C. Následujícího rána byla směs zahrátana 5 minut na 05 °C, zředěna 100 x vodou a užita k trans-formaci buněk E. co.li XL1 (Blue). Kompetentní bakterie by-ly získány od firmy Stratagene a transformovány ve 3 ^ulzředěné stnasi pro vazbu přesně podle návodu výrobce,. Bak-terie byly naneseny na LB agarové plotny s obsahem ampici-linu', tetracyklinu, 1PTG a X-Gal» Příklad 7

Identifikace fagemidů s obsahem včleněného řetězce V systému Bluescript nabývají fagemidy se včleněnýmřetězcem bílého zbarvení bakteriálních kolonií, kdežtonavzájem vázané fagemidy poskytují modře zbarvené kolonie.Tyto bílé kolonie byly izolovány a použity k naočkování2 ml prostředí LB s obsahem ampicilinu a.byly pěstoványpřes noc při 37 °C na třepěčce při 220 otáčkách za minu-tu. Následujícího dne byl rychle připraven plasmid stan-dardním způsobem při použití varu podle publikace Birn-boim a DoLy, Nucleic Acids Research 7, 11.95-1204, 1979»

Plasmid,y byý rozštěpeny restrikěním enzymem BamHÍ a analy-zovány na 1% agirozovém gelu. Jeden, z klonů, který byl tím— □ C 1 Ί . R I - /· .. ~ X ( " V/ P i\. L· X j in; o v délce přibližné%.agarozovém gelu. v č 1 e n é n o u2,000 bp,

m ·, /1 η n 4· Ί í1 i · 1,- z·» w » o »-i l·’ , r 1 f* >··. <r /·. *vi ·» zl(J Í X u < · L l V X x l\. V * U. k έ -J ] .i. 1 íl^UHUU část, specifickou pro virus,Na. obr., 1 . j.e znázorněn, na. 1 takto připravený plasmid BD 17-6 jak v cirkulární formě, tak ve formě po rozštěpení enzymem BamHÍ. 29 Příklad 8

Analýza řetězce včleněné částí v klonu BS 17-6 DNA s jednoduchým řetězcem klonu BS 17-6 byla připra-vena přidáním pomocného fágu.VCS (Stratagene) v poměru20 : 1 k exponenciálně rostoucí kultuře Bakterií E. coliXLl(Blue) s obsahem BS 17-6«, Směs se energicky míchá 16hodin při teplotě 37 °C a puk ze ze supernat.antu čistíssDNA známým způsobem. DNA s jednoduchým řetězcem se ana-lyzuje v. celé oblasti včleněné, části postupem pod lc, bu.bli -kace Sanger a další, PNAS USA 74, 5463-5467, 1977 při po-užití enzymu Sequanázy ( United States Biochemicals) a re-akčních činidel, dodaných výrobcem. (Výraz Sequenáza jeobchodní název). Oligonukleotidy, specifické pro virus apro ve.ktor byly užity jako primery pro analýzu řetězce,úplný řetězec včleněné části 1.7-6 je znázorněn na obr. 2. Příklad 9 ....... ....... " "............'.......

Odvození řetězce aminokyselin bílkoviny NS1

Translace nukleótidového řetězce klonu BS ' 17-6 ve všech směrech objevila pouze jedinou možnost správné trans- v .láce delšího řetezce.Řetězec aminokyselin, odvozeny tímtozpůsobem, byl'srovnáván*s řetězci pro další flaviviry.kte- ré byly726-733,C h a m b c i sa na1yzy

Sexe n c e 229, 69 1-21,1965, 1959. Pro tyto(verse 4,0) uvedeny v . publikacích íiice a další,1955, Coxa a další, J. Gen. Virol.a další, Virology 169, IDU.až 109,

byl užit software Beckman iilCROGEME na IBM osobním· počítači . Výraz SiCROG!''XIE je obchodní ná-·zev. Analýza prokázala, že klon 17-6 obsahuje úplný kodo- ' t vy řetězec, pro bílkovinu NS-1 a části kodového řetězce probílkovinu E a NS2A, které ohraničují gen NŠ1 proti gen omuflaviviru. 30

Na obr. 3 je znázorněn řetězec ΚΝΛ a řetězec ami-nokyselin, pro které je tento řetězec kódem, odvozený odklonu 17-6. Aniinoterminální' zakončení NSl je patrně uvol-něno buněčnou signalázou, karboxyterminů lni zakončení enzy-mem, podobným signaláze. Delší ;íorma bílkoviny'NS-1·, která-obsahuje také aminoterminální zakončení bílkoviny NS2A by-la pozorována Masonem a dalšími ( Virology 158, 361-372,1987). Karboxyterminální formu této bílkoviny NSl je možnouvolnit pro virus specifickou proteázou nebo buněčnou sig-nalázou podle publikace Rice a další, Science 229, 726-733^1985. Aminoterminální zakončení a tři možná karboxyterminální zakončení jsou znázorněna na obr, 3» Karboxyterminálnízakončení, uvolněná enzymem, podobným signaláze ( Chambersa další, Virology 169, 100-109, 1988) je popsáno jako"COOH-Terminus 1", karboxyterminální zakončení, které jepravděpodobně tvořeno pro virus specifickou proteázou jeoznačeno "COOH-Terminus 2" a potenciální karboxyterminálnízakončení, uvolněné buněčnou signalázou je znozorněno jako"COOH-Terminus 3". Čísla poloh, uvedená na obr. 3 odpoví-dají plné délce genomu viru TBE,

Na obr. 4 je znázorněn řetězec aminokyselin bílkovi-ny " NSiy odvozeiiý od řetězce klonu Ι7-ί5._ Možná C001Í-termi-nální zakončení jsou označena stejně jako na obr. 3. Čí-selné označení polohy je počítáno od první aminokyselinybílkoviny NSl. Na obr. 4 je rovněž znázorněno umístění třípotenciálních míst pro N-glykosylaci, která jsou přítomnav bílkovině NSl viru-.· Příklad 10

Klonování oblasti, která je kódem pro NSl v prokaryotickémvektoru pro expresi l

Nukleotidový řetězec, který je kódem pro bílkovinu N.S_l_s.e_p.o.d.no.b:í_.S-u.b.k.io.n.o_ván.í-_z—klO-nu_17-2i6—do—p-l-asmiriu-- 31 pUC19S. Vektor pUC19S je derivát plasmídu pUC19, který ob-sahuje stop-vazný řetězec s obsahem stop kodonu TAG vevřech třech řetězcích, klonovaných v místě štěpení BamHI.Řetězec pro. NS1, který obsahuje mal.ou část řetězce pro.bílkovinu NS2a na svém 3-termináln'íin zakončení se vyjmepůsobením restrikcní endonukleázy Cfol a zakončení se upra-ví působením Sl-nuklcázy. Vektor pUC19S pro klonování selinearizuje v polyvazné oblasti působením Sáli a zakončeníse vyplní T4-DN A*-polyinerázou { obr. 5). Vazba vektoru avčleněného řetězce dává vznik místu působení enzymu Sáli atím se váže řetězec pro bílkovinu NS1 na gen lacZ ve správ-ném pořadí ( Obr. 6a a 6B). Na 3-terminálním zakončení jeřetězec pro bílkovinu NS1 ohraničen prokaryotickými stop-signály pro transkripci a translaci, které jsou obsaženyve vektoru, plasmid je označen pNS1387» Příklad 11

Klonovaní kódové oblasti pro NS1 včetně'5- proximálního zá-'končení hydrofobního signálního řetězce.při použití PC-fí

Aby bylo možno konstruovat indukovatelný prokaryotic- z ký plasmid pro exnresi s obsahem Rodové oblasti pro NS1včetně autentického signálního řetězce byl přenesen fragmentplasmídu pSCtSNS1444 po štěpení enzymem Sáli {Příklad .13)do plasmídu pUC19S, čímž. byl získán klon ptSNS1682. Aby bylomožno uložit gen pro NS1 do správné polohy vzhledem ke genulacZ byl klon ptSNS16S2 rozštěpen enzymem HíndlII, zakon-čení byla upravena pomocí 31-nukleázy a znovu navázána zavzniku klonu ptSNS.1791 s vypuštěnými 4 nukleotidy, jak jeznázorněno na obr. 7a a 7b. Příklad 12

Konstrukce plasmídu pro rekombinaci ve viru vačcinia: řetě-zec přo bílkovinu NS1 pod řízením promotoru VV-pll(L) 32

Kotlová oblast pro bílkovinu NSl, například z příkladu10 se podrobí subkl.onování v místo štěpení enzymem Sáliplasmidu pTKgptFls ( Falkner G.F. a Moss R., J. Virol 62,1549-1851, 1968. Řetězec pro NSl se uloží ve správném smys-lu 'vzhledem ke "kodonu AŤG pro počátek translace ve vektoru.Translacní stop signál je rovněž obsažen ve vektoru. Poly-vazná oblast vektoru je příčinou přidání 7 aminokyselin na5- zakončeni a 10 aminokyselin na 3- zakončení. Strategieklonování a hraniční oblasti bílkoviny jsou znázorněny naobr. 8a a 8b. Plasmid byl označen pAPNS1338, Příklad 13

Konstrukce plasmidu pro rekombinaci ve viru vaccinia: řetě-·zcc pro bílkovinu NSl s přírodním signálním řetězcem podřízením promotoru VV-p7.5(E/L) Řetězec nukleotidů s obsahem kodové oblasti pro bíl-kovinu NSl s jejím signálním řetězcem se šyntetrizuje pomo-cí PCR při použití klonu. 17-6 jako. templátu. Chemicky se synthetizují dva oligonukleotidy se štěpnými místy pro rest-rikční endonukleázy EcoRI^a Sallrna 5-zakončení a Sáli aHpal na 3-zakončení, tyto oligonukleotidy se užijí jako pří-měry při PCR ( obr, 9A a 9R). Amplifi kovaný fragment NSl sečistí na agarozovém gelu ( obr. 10) po štěpení Sáli a pakse klonuje v místě štěpení Sáli vektoru pSCll-Orth po ma-lých. modifikacích. Plasmid pSCll-Orth byl. uložen ve veřejnésbírce D.S.M., Braunschwcig, SRN pod číslem DSM 5734 dne15. ledně 1990. Strategie klonování a řetězce na 3~ a 5-. za-končení nové konstrukce jsou uvedeny na ohr. 11 a 12. Ana-lýza restrikčních fragmentů klonu na agarozovém gelu potvr.-,zuje správnou orientaci včleněné části, jak je zřejmé z obr. 13. Plasmid byl označen pSCtSNS1444. 33 Příklad 14

Konstrukce plasmidu pro re kombinaci ve viru vaccinia: -v Řetězec pro bíJkovinu NSl. s původním. signálním řetězcempod řízením promotoru VV-pll(L)

Plasmid pTKtSNS1556 je výsledkem subklonování ře-tězce pro NS1 z klonu pSCtS.NSl-444 ve vektoru pTKgptF3s(Falkner a tóoss, J. Virol. 62, 1849-1854, 19S8). Řetězecpro NS1 se vyjme při použití enzymu Sáli a včlení se domísta štěpení enzymem Sáli v plasmidu pTKgptF3s. Strategieklonování a řetězec nukleotidů pro plasmid pTKtSNS1556 jeznázorněn na obr. 14 a .15» Všechny plasmidy se pěstují při použití selekce am-picilinem v množství 100 zug/ml v E. coli, kmenech DK1, . BH101 nebo JM jako v hostiteli ( JM105, JM83). Příklad 15 , ’ ......

Vytvoření rekombinantů viru vaccinia pro expresi bílkovinyNS1 RFkomfrinanťňí viry se získají standardním způsobem{Mackett Kl., Smith G. a Moss B.: DNA Cloning: A PracticalApproach, str. 191-121,ed. D.M, Glover, Oxford: IRL Press),DNÁ plasmidu pŠCtSNS1444 a plasmidu pTKtSNS1556 se podrobítransfekci v buňkách CV-1, infikovaných virem, vaccinia, di-vokým typem» Rekombinant varecNS!444, odvozený od plasmidupSCll-Orth se podrobí, selekci na RuDR v buňkách l43tk. Re-kombínant varecNS1556, odvozený od pTK.gptFs se izoluje se-lekcí gpt v buňkách CV-1, Všechny rekombinanty byly čiště- ny ... 1 1..°-p i. a tv 1 j

Spiávná organizace rekombinantů byla zjištěna analýzou Southern b.lot ( Obr. 16). Příklad 16

Exnrese bílkoviny NS1 v buňkách CV-1, infikovaných rekonibi-nan.ty viru vaccinia . v ---# WRIJI IV R. r^. . u. «

Buňky CV-1 se infikují rekoinbinanty varecN31444 avarec NS1556 viru vaccinia» Dva dny po infekci se buňkyoznačí methioniném, značeným S po dobu 4 hodin» Bílkovi-ny se oddělí na 12% SDS-polyakrylamidovém gelu s denaturač- * mm účinkem a identifikují autorad.iograficky, Pás bílkovi-ny, odpovídající očekávané molekulové hmotnosti přibližně48 SSS je možno oddělit. Tento pás není obsažen v buňkáchdivokého typu viru nebo v rekombinantcch viru typu varec1342, jak je znázorněno na- obr. 17o —'Τ'.. .'Vv.

Claims (16)

1. 35 P A r E N I O v E N Λ K O K Y

   /

   • 1, Peptid nebo 'polypeptid, v y z n a- dují c í ' . s p*'tím, že obsehuje alespoň část řetězce aminokyselin bíl-koviny NS-1 západního subtypu viru TBE.
2. 2. Peptid nebo polypeptid podle nároku 1, vyzna-čující se' tím, že obsahuje řetězec amino-kyselin, znázorněný ne obr. 4,
3. 3. Bílkovina NS-1 západního subtypu viru TBE.
4. 4. Bílkovina nebo polypeptid,v yznačující setím, že obsahuje řetězec aminokyselin, který se lišíod řetězce přírodní bílkoviny NS-1 na základě mutace a/nebotransposice v rámci běžných variací západního subtypu viru . TBE. 5Bílkovina., peptid nebo polypeptid podle: nároku 1 až4 pro použití v lékařství. -6-.—V-a-kc-i-na-,-v—y—z_n—č—u_j_í_c_í-s_e-t_í_m_,—.—ž_ e. obsahuje peptid, polypeptid nebo bílkovinu podle nároků 1až 4 a- jednu nebo větší počet dalších složek, přijatelných-z—Pa-pm-aG-e-íÍ-t-i-í^k-é-tÍ-o—l-i-l-e-d-l-slš-a-o—- - ...........................- ---------~ -----------------.....
5. 7. Diagnostické činidlo, v y z n a č u j í c í s e.t í m , ž e obsahuje peptid, polypeptid nebo bílkovinupodle nároku 1 až 4. S. Nukleová kyselina,v yznačující se z tím, ž e je kódem pro peptid, polypeptid nebo bílko- vinu podle nároků 1 až 4. 36 «r
6. 9. Živá vakcina, vyznačující se tí m.,že obsahuje nukleovou kyselinu podle bodu 8.
7. 10. Sonda, vyznačující se t í m , žeobsahuje nukleovou kýšéllnu podle nároku S.
8. 11. Nukleová kyselina,, vyznačující setím, že hy.bridizuje s řetězcem DNA, znázorněným naobr. 3. 12» Nukleová kyselina, vyznačující. setím, že o b s ah u j e řetězec z nároku 8
9. 13. Nukleová kyselina, vyznačující setím, že její řetězec se liší od řetězce molekulyDNA, které odpovídají nebo jsou komplementární s přírodnímřetězcem DNA pro bílkovinu NS-l v důsledků degenerace gene-tického kódu a/neho mutace a/nebo transposice v rámci běž-ných variací západního subtypu viru TBEo
10. 14. Nukleová kyselina podle nároků 8 až 13, vy z n aču j í cí se tím, že je vázána na další re-r _ .. —* . 7— - A -λγ- l i. -- - — .·. ,*£ ^m·)—' ‘ : vV.r.# - - xf. těžce'núkleových kyselin,
11. 15. Nukleová kyselina podle nároku 14, vyzna-čující s é t í m , že jde o DNA, přičemž pří-datné řetězce umožňují replikaci a expresi molekuly DNA v buněčné kultuře a $ výhodou obsahují řetězce, které majífunkci promotoru, podpůrného řetězce, polyadenylačního Sig-nálu a/nebo signálu pro štěpení,
12. 16. Vektor, například plasmid, virus nebo Cág, vy-značující se tím, že obsahuje nukleo-vou kyselinu podle nároků 8 až 15. 37
13. 17. Vektor podle nároku 16, vyznačující se tím, že je odvozen od viru vaccinia.
14. 18. Vektor podle nároku 16, vyznačující se tím, že je odvožen oií bakteriálního plaštiiidu 0
15. 19. Hostitelská buňka, vyznačující setím, že obsahuje vektor podle nároku 16, 17 nebo 18„
16. 20. Kultura buněk, vyznačujíc í se t i m , . z e .„.obsahu j.e hostitelské buňky podle nároku 19.= 2.1. „ Kultura buněk podle nároku 20, vyznačují-cí se tím, že jde o buněčnou kulturu savčíchbuněk o Zastupuje: