CS272926B1 - Peptides with properties of hpv-virus protein's antigen determinant and method of their production - Google Patents
Peptides with properties of hpv-virus protein's antigen determinant and method of their production Download PDFInfo
- Publication number
- CS272926B1 CS272926B1 CS33589A CS33589A CS272926B1 CS 272926 B1 CS272926 B1 CS 272926B1 CS 33589 A CS33589 A CS 33589A CS 33589 A CS33589 A CS 33589A CS 272926 B1 CS272926 B1 CS 272926B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- pro
- peptides
- thr
- hpv
- val
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 claims description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 abstract description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 abstract description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Chemical class O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- -1 Boc group Chemical group 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical group C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- KJOZJSGOIJQCGA-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound ClCCl.OC(=O)C(F)(F)F KJOZJSGOIJQCGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;methanol Chemical compound OC.ClCCl WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Vynález se týká peptidu s vlastnostmi antigenní determinanty obecného vzorce I
H-Met-Gly-Thr-Pro-Phe-Ser-Pro-Val-Thr-Pro-Ala-Leu-Pro-Thr-Gly-Pro-Val-NH2 (I) a jeho konjugátu s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu nebo aktivovanými membránami, a způsobu jejich výroby.
Látky podle vynálezu jsou nové a byly u nich prokázány vlastnosti antigenních determinant proteinu kódovaného L-2 oblasti genomů HPV-6 a HPV-11. Peptidy mohou sloužit jako vhodné diagnostikům pro průkaz protilátek u. osob infikovaných těmito typy HPV.
průkazu imunitních reakcí proti HPV byly v minulosti použity různé serologické techniky jako např. imunoagregační test (Almeida J. D., a P. Goffe, 1965, Lancet ii, 1205 až 1207) difúze v agarovém gelu (Cubie H. A., 1972, J. Hyg. 70, 677 až 690), fixace komplementu (Genver J, 1971, Acta Dermato-veneřol 51, 365 až 373), radíoimunostanovení (Hefton J. M. ,,M. Eisinger 1977, J. Gen. Virol. 38, 179 až 182) a neutralizační text (Kienzler J. L. a spol. 1983, Br. J. Dermatol. 108, 665 až 672). Vzhledem k tomu, že HPV nelze kultivovat in vitro, že tedy není možné k přípravě antigénu použít klasické způsoby přípravy virových antigenů na tkáňových kulturách, jediným zdrojem antigenů byly až donedávka přirozené virové leze. Možnosti získat preparativní množství vírových antigenů jsou však omezené. Některé leze vyvolané HPV, jako např. konóyloma accuminatum, obsahující jen velmi málo virových části a v některých zhoubných nádorech spojovaných s HPV jsou prokazatelné pouze virové nukleové kyseliny.
Uvedené nedostatky řeší způsob podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že používá k detekci protilátek vytvořených po infekci viry HPV 6 a HPV 11 syntetický peptid s vlastnostmi antigenní determinanty proteinu kódovaného L-2 oblastí genorau.
Látky podle vynálezu byly syntetizovány způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací jednotlivých aminokyselin se vystaví peptidický řetězec. Potom se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí se.
Peptidy obecného vzorce I byly .připraveny Merrifieldovou metodou syntézy peptidu v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren síťovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými. N-alfa-aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chránící skupinou, s výhodou Boc skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo prováděno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM nebo nasyceným roztokem chlorovodíku.v DCM. Postranní funkční skupiny vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou symetrickými anhydridy nebo HOBt estery. Po .ukončené syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolytícky, s výhodou působením kapalného HP nebo TPMSA ve směsi s TFA a thioanisolem. Surový produkt byl čištěn buď pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou silikagelu, potaženém hydrofobními uhlíkatými řetězci nebo nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptidy byly charakterizovány aminokyselinoo
Vou analýzou a jejich čistota byla ověřena chroraatografickými a elektroforetickými metodami.
Aminokyselinová sekvence peptidu I byla odvozena z oblasti L-2 genomu HPV 6, který je homologní a HPV 11 a zároveň zahrnuje antigenní determinantu proteinu kočovaného genomem L-2. Peptidy mohou sloužit pro diagnostické účely, což bylo prokázáno autory vynálezu a pro produkci monodeterminantních protilátek.
Základem diagnostické reakce je vytvoření komplexu syntetických peptidů podle vynálezu s protilátkami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem HPV 6 nebo
CS 272 926 Bl
HPV 11. Při praktickém použití lze s výhodou použít např. enzymoimunologický test (ELISA). Syntetický peptid byl konjugován s bílkovinným nosičem (např. BSA) pomocí glutaraldehydu a po navázání antigenu na mikrotitrační ELISA dističku, opláchnutí pufrem a vysycení neobsazených míst 1% roztokem BSA byla aplikována vyšetřovaná séra. Po inkubaci a promytí pufrem byla přidána prasečí protilátka proti lidskému IgG značená peroxidázou. Pokud byly ve vyšetřovaném séru protilátky proti zvolené antigenní deterr minantě viru HPV 6 či HPV 11 , peroxidázou značená protilátka se navázala na komplex antigen-lióská protilátka. Množství navázaných protilátek je úměrné jejich koncentraci ve vyšetřovaném séru. Detekce peroxidázové aktivity se provádí oxidací o-fenýlendiaminu kyslíkem, který se uvolňuje z peroxidu přítomného v substrátovém roztoku. Hodnoty absorbancí u pozitivních vzorků se pohybovaly od O.L. 1,2 AV do 2.612 A.V. (74 vyšetřených vzorků), hodnoty pro negativní séra nepřevýšily 0,5 A.V. (250 stanovení).
Získané výsledky ukazují, že peptidy podle vynálezu je možno použít jako diagnostika k průkazu specifických protilátek a přicházejí v úvahu při produkci monodeterminantních protilátek.
Následující příklady provedení látky a způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale nikterak neomezují.
Příklad 1
Do průtokového reaktoru (vnitřní objem 1 ml) bylo umístěno 100 mg benzhydrylaminové kopoly (styren-1% divinylbenzen)ové pryskyřice (obsah aminoskupin 0.4 meg/g)i o Syntéza byla provedena na manuálně ovládaném syntetizátoru vlastní kontrukce, autorské osvědčení č. 262081, kontinuální průtokovou metodou, viz autorské osvědčení č. 255089. Jeden syntetický cyklus obsahoval tyto kroky: (1) štěpení Boc chránících skupin, 40% TFA v DCM, 30 min (3 min promývat, 27 min v klidu); (2) promývání, DCM, do slabě kyselého efluentu, (kontrolováno navlhčeným pH papírkem); (3) neutralizace, 5% N-ethyl-N, N-diisopropylamin v chloroformu, 3 min; (4) promývání, DMF, do neutrálního efluentu;
(5) kondenzace: chráněná aminokyselina, 0.4 meg v DCM (nebo DCM : DMF, 4:1, je-li třeba), přidat HOBt, 0.4 meg v DMF, přidat DCC, 0.4 meg v DCM, 30 min při 20 °C, odfiltrovat N, N-dicyklohexylmočovinu, promýt DCM, odpařit DCM za sníženého tlaku (t 25 °C), naředit DMF, zfiltrovat, promýt DMF, doplnit DMF na koncentraci 0.2M, nastříknout do průtokového reaktoru, ponechat reagovat doi:ineutrální reakce na ninhy*· dřin; (6) promývání, DCM, 5 min. Průtok během promývacích cyklů byl cca 20 až 30 ml/min, přetlak inertního plynu 20 až 50 kPa. Syntéza byla ukončena odštěpením gOC chránící skupiny z poslední kondenzované aminokyseliny (krok (1)) a peptidy1-pryskyřice byla promyta DCM a metanolem a vysušena proudem dusíku. Surový peptid byl získán po štěpení peptydyl-pryskyřice kapalným fluorovodíkem. Po odstranění HF byl produkt a pryskyřice suspendovány v etylacetátu, zfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20% kyseliny octové a lyofilizovén. Výtěžek 49,5 mg. Surový peptid byl čištěn na koloně (2.6 x 13 cm) obsahující jako stacionární fázi silikagel potažený hydrofóbními uhlíkatými řetězci, mobilní fáze 50 % metanolu, 50 % vody obsahující 0.1 % TFA. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPCL (Rt 3.3 min, mobilní fáze 60 % MeOH, 40 % vody obsahující 0.1% TFA), chromatografií na tenké vrstvě (Rf 0.21 v soustavě n-butanol : kyselina octová : voda - 4 : 1 : 1) a elektroforéze na papíru při pH 2,5- Výtěžek 18,2 mg H-Met-Gly-Thr-Pro-Phe-Ser-Pro-Val-Thr-Pro-Ala-Leu-Pro-Thr-Gly-Pro-Val-NH2.
Příklad 2
K roztoku 26 mg (0.37 ^uM1) BSA ve 2.6 ml fyziologického roztoku bylo přidáno
6.3 mg (3.7 /UM - 10ti nás. molární přebytek) peptidu v 1,3 ml fyziologického roztoku. Ke směsi bylo za intenzivního míchání při laboratorní teplotě pomalu přikapáno 0.39
CS 272 926 Bl ml 1% roztoku glutaraldehydu a směs byla ponechána při laboratorní teplotě v temnu 16 hodin. Potom byl roztok přenesen do dializaěního střeva a dialyzován 4 hodiny proti 0.5 M roztoku etanolaminu pH 7.2 a přes noc proti fyziologickému roztoku s 0.05% azidera sodným. V roztoku konjugátu byla stanovena koncentrace bílkovin a po rozplnění byl uložen při -20 °C.
Příklad 3
Polystyrénová mikrotítraění destička byla inkubována s 100 /Ul roztoku konjugátu syntetického peptidu s BSA v uhličitanovém pufru (0.015 M NagGO^, 0.03 M NaHCO,
0.003 M NaN^j pH = 9.6) 16 h při 37 °C (koncentrace antigenu 0.0625 /Ug/ jamku). Vysycení volných míst v jamce bylo provedeno inkubaci se 100 /Ul 1% roztoku kravského sérového albuminu v uhličitanovém pufru 1 h při 20 °C. Jamky byly vypláchnuty fosfátovým pufrem (0.034 M KaCL, 0.002 JI KOI, 0.001 M KHgPO^ 0.006 M Na2HP04, 2 HgO, pH = 7-2) s přídavkem O.1£ neionogenního detergentu (Tritonu X-100). Potom bylo do jamek aplikováno 100 /Ul vyšetřovaného séra ředěného fosfátovým pufrem pH = 7.2, s 0.1% přídavkem neiontového detergentu (Triton X-100) a obohaceném 10 % bovinního sera (BS). Po inkubaci (20 °C, 60 min) a opláchnutí fosfátovým pufrem pH 7.2 s 0.1% detergentera bylo do jamek přidáno 100 /Ul roztoku peroxidázou značené prasečí protilátky proti lidskému imunoglobulinu G ve fosfátovém pufru pH = 7.2, s 0.1% neiontového detergentu (Triton X-100) a obohaceném 10 % BS. Po inkubaci (20 °C, 60 min) a promyti 5krát fosfátovým pufrem, Ikrát citrátovým pufrem byla provedena detekce peroxidázové aktivity přidáním 100 yUl 0.04% roztoku o-fenylendiaminu v citrátovém pufru (0.066 M Na^HPO^ . 2H20 a 0.034 M roztoku kyseliny citrónové o pH = 5·0) a obohaceném 0.006 % HgOg.
Reakce byla ukončena přidáním 100 /Ul 2 M kyseliny sírové a zbarvení vyhodnocené kvantitativně při 492 nm. Peptidu s vlastnostmi antigenních determinant proteinu kódovaného L-2 oblastí genomu HPV-6 a 11 bylo použito k otestování více než 400 lidských sér. Zatímco méně než 15 % sér od zdravých jedinců vykazovalo přítomnost specifických protilátek, většina sér (52 %) od pacientů s condyloma accuminatum (onemocnění způsobené papillomaviry typu 6 a 11) s antigenem specificky reagovalo. Příprava syntetického peptidu podle vynálezu umožňuje zavedení typově specifického serologického testu nezbytného při studiu úlohy papillomavirů v patogeneze lidských onemocnění.
Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu:
| HPV | lidský papillomavirus |
| ELISA$ | enzymoimunologický test |
| BSA | bovinní sérum albumin |
| O.D. | optická densita |
| HPLC | vysokoúčinná kapalinová chromatografie |
| TEA | kyselina trifluoroctová |
| DCM | dichlormetan |
| MeOH | metanol |
| TEMSA | kyselina trigluormetansulfonová |
| HOBt | N-hydroxybenzotriazol |
| TEA | trietylamin |
| Bac | t-butyloxykarbonyl |
| Tos | p-toluensulfonyl |
| Bzl | benzyl |
| For | formyl |
Claims (2)
1. Peptidy s vlastnostmi antigenní determinanty bílkoviny viru HPV vzorce I
H-Met-Gly-Thr-Pro-Phe-Ser-Pro-Val-Thr-Pro-Ala-Leu-Pro-Thr-Gly-Pro-Val-NH2 (I)a jejich konjugátů s biologicky inaktivními nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů', zejména latexu, spheronu a polystyrenu nebo s aktivovanými membránami.
2. Způsob výroby peptidů vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na polyměrní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo henzhydrylaminovými skupinami zakotví karbox:yterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec, načež se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče, přečistí se a naváže se na makromolekulám! bílkovinný nosič, s výhodou bovinní sérový albumin, pomocí glutaraldehydu nebo rozpustného karbodiimidu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS33589A CS272926B1 (en) | 1989-01-18 | 1989-01-18 | Peptides with properties of hpv-virus protein's antigen determinant and method of their production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS33589A CS272926B1 (en) | 1989-01-18 | 1989-01-18 | Peptides with properties of hpv-virus protein's antigen determinant and method of their production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS33589A1 CS33589A1 (en) | 1990-06-13 |
| CS272926B1 true CS272926B1 (en) | 1991-02-12 |
Family
ID=5335283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS33589A CS272926B1 (en) | 1989-01-18 | 1989-01-18 | Peptides with properties of hpv-virus protein's antigen determinant and method of their production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS272926B1 (cs) |
-
1989
- 1989-01-18 CS CS33589A patent/CS272926B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS33589A1 (en) | 1990-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1220420A (en) | Method of determining antigenically active amino acid sequences | |
| AU667578B2 (en) | Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues | |
| CA1250100A (en) | Pre-s gene coded peptide hepatitis b immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers | |
| CA1246054A (en) | Synthetic st toxin, process for its preparation and its use as a vaccinating agent | |
| JP2774872B2 (ja) | Ｈｃｖペプチド抗原とｈｃｖの同定方法 | |
| US4833072A (en) | Antigentic peptides and process for their preparation | |
| JPH0751598B2 (ja) | Ｈｔｌｖ‐１感染検出用合成ペプチド抗原 | |
| JPH03503047A (ja) | ポリマーおよびポリマー‐ペプチド複合体 | |
| KANDA et al. | Synthesis of polyamide supports for use in peptide synthesis and as peptide‐resin conjugates for antibody production | |
| US4761470A (en) | Immunogenic synthetic peptide capable of eliciting herpes simplex virus neutralizing antibody | |
| JP3851761B2 (ja) | Ｈｉｖ抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物 | |
| JP2598245B2 (ja) | Ｈｔｌｖ−ｉｉｉ／ｌａｖウイルス関連ペプチドに対する抗体 | |
| AU664828B2 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
| US5674676A (en) | HCV peptide antigens and method of determining HCV | |
| JPH11242028A (ja) | Ｄ−アミノ酸からなるペプチドによる診断方法の干渉の 排除 | |
| JPS61246199A (ja) | 免疫原性ｈａｖペプチド | |
| CS272926B1 (en) | Peptides with properties of hpv-virus protein's antigen determinant and method of their production | |
| DE69106998T2 (de) | Mit Antikörper gegen Hepatitis-Virus non-A, non-B immunochemisch reagierende Peptide. | |
| JP2001519800A (ja) | グループｏ ｈｉｖ−１ウイルスによる感染検出用の生物学的アッセイに有用な合成ペプチド | |
| CA1293188C (en) | Composition of matter and method of immunizing against viral causative agents of aids and arc | |
| Urbès et al. | C-terminal glyoxylyl peptides for sensitive enzyme-linked immunosorbent assays | |
| CS258289B1 (cs) | Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby | |
| RU2304146C2 (ru) | Способ стабилизации петлеобразной структуры синтетических пептидов с помощью n- и c-концевых модификаций | |
| CS258288B1 (cs) | Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby | |
| CS258290B1 (cs) | Peptid s vlastnostmi antigennlch determinant a způsob jeho výroby |